Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptides
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptides der Formel
EMI1.1
<tb> <SEP> 1 <SEP> l <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 71 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> H-Cys- <SEP> Ser-Asn- <SEP> Leu <SEP> - <SEP> Ser-Thr-Cys-Val-Leu- <SEP> Ser 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-G ly-Pro-Glu-Thr-Pro- NHo, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.
Das bisher unbekannte Polypeptid - kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Aminosäureteilsequenz 1 bis 7 und vor Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt.
Beim Aufbau des neuen Polypeptids hat sich für die Blockierung der y-Carboxylgruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert. Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert. -amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.
Für die Blockierung der ct)-Aminogruppe des Lysin- restes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C kann eine tert.-Alkoxy-carbonylgruppe, vorzugsweise die tert.-Butoxy-carbonylgruppe, verwendet werden.
Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyl oxycarbonyl)-3,4,5,6-tetrachlorobenzoylgruppe, verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.
Zum Schutz der Sulfhydrylgruppe in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz F1 und F2 kann z. B.
die Benzyl-, die p-Brombenzyl- oder die p-Methylbenzylgruppe verwendet werden. Das neue Polypeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxyoder 2-Acetoxy-benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerb- säure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B.
Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige vom ZinkS3 in Frage.
Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptids können, sofern sie nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.
Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel, senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.
Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfall von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschild drüsen.
Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw.
Phosphat. Die biologische Prüfung der neuen Verbindung ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht.
Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m.
verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.
Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden.
Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.
Die neue Verbindung und ihre Salze kann auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy NOs = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Lys = L-Lysyl
Phe = Il-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycol
Met = L-Methionyl
Cys = L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Teilsequenz A
L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y-tert.-butyloxy L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
Man löst bei-5 134 g Z-Thr-NH-NH2 in 2 Liter in Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-ProNH. hydro- chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Athylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 1480, [a] 2D = -720 in 95 0 Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 Liter Dioxan und 260 ml in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH,-HCI, Smp. 2160, [a] D0 = -640 in 95% Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben.
Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther. Man erhält Z-Glu(OTB) Thr-Pro-NH, Smp. 650 (Zers.), [a] 20D = -18 in Dimethylformamid.
Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH.' erhalten wird, Smp.
650 (Zers.), [0] D0 = -280 in Dimethylformamid. Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, abfiltriert, im Vakuum eingedampft und mit Athylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Athylacetat/Äthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 vom Smp. 1200 (Zers.), [a] 20D = -660 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst.
Man gibt 30 g Palladiumkohle (10%) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man flitriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro- Glu(OTB)-Thr-Pro- NH-2, Smp. 1530 [a] 2D = -79 in Dimethylformamid.
Teilsequenz B
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl L-methionyl-glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L-Methionyl-glycin-äthylester-hydrochlorid (H-Met-Gly-OEt.HCl)
Man löst 65 g BOC-Met-OH in 900 ml Chloroform, kühlt auf -10 , gibt 30 ml N-Methylmorpholin und 35,6 g Chlorameisensäureisobutylester zu. Nach 10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 30 g Glycin äthylester in 200 ml Chloroform hinzu und lässt bei 200 eine Stunde reagieren. Man extrahiert mit 0,5n Ammoniumhydroxid, dann mit 0,2n Schwefelsäure, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-Gly-OEt; Smp. 490, [cz] 20D=-19 in Äthanol.
Man löst es in 750 ml 4n HCl/Äthanol, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet bis zur Gewichtskonstanz. Man erhält das H-Met-Gly-OEt. HCl in Form eines Öles.
b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-OEt)
Man löst 12,5 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-serin in100 ml Chloroform und gibt 6,1 g N-Methylm.orpholin dazu; danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50 ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak, dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft.
Man erhält BOC-Ser-Gly-OEt als Öl, [a]20D = -30 in Dimethylformamid.
c) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
Man löst 19,4 g BOC-Ser-Gly-OEt in 270 ml Äthylalkohol, gibt 48,6 ml Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Methylalkohol/Athyläther-Gemisch (1:3). Man erhält BOC-Ser-Gly-NHNH2, Smp. 1570, [a] D0 = -5 in Dimethylformamid.
d) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl L-methionyl-glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
Zu 200 ml Dimethylformamid werden 25 ml einer 4n Chlorwasserstofflösung in Äthyläther gegeben und darin bei -10 11 g BOC-Ser-Gly-NHNH2 gelöst. Anschliessend tropft man bei 10 5,4 ml tert.-Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung zuerst 18 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 12 g H-Met-Gly-OEt. HCl in 100 ml Dimethylformamid und 6,2 ml Triäthylamin bei.
Es wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, nach 12 Stunden filtriert und eingedampft. Den Rückstand löst man in Chloroform, wäscht nacheinander mit verdünnter Ammoniak- und Salzsäurelösung, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält BOC-Ser Gly-Met-Gly-OEt, [o] 2D0 = -140 in Dimethylformamid.
e) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl L-methionyl-glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
Man löst 24 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan, gibt 75 ml in Natronlauge zu, rührt 1 Stunde bei 250, behandelt mit 150 ml Dowex-50 (H+-Form), filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester, Diäthyläther. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH, Smp. 870 (Zers.), [a] 20D= -170 in Dimethylformamid.
Teilsequenz C Na,Nimid Ditrityl-L-histidyl-tert.-butyloxy-carbonyl
L-lysyl-L-phenylalaninhydrazid (Trt)-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2 a) Z-Lys(BOC)-Phe-OMe
94,8 g H-Phe-OMe HCl werden in 1 Liter Ather und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.
144 g Z-Lys(BOC)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit dem oben erhaltenen H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf -20 abgekühlt und eine Lösung von 90,8 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben.
Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit In Sodalösung, Wasser, 1n Schwefelsäure, Wasser und gesättig- ter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft. Nach Umkristallisieren aus Essigester/Pe- troläther erhält man Z-Lys(BOC)Phe-OMe; Smp. 102 bis 1050, [a] = 70 in Methanol, -120 in Dimethyl- formamid.
b) H-Lys(BOC)-Phe-OMe HCl
29 g Z-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 500 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 53 ml In HCl/ Methanol in Anwesenheit von Palladiumkohle hydriert.
Nach Filtrieren und Eindampfen wird der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.
c) ZHis-Lys(BOC)-Phe-OMe
45 g H-Lys(BOC)-Phe-OMe HCI werden in einem Gemisch von 300 ml Acetonitril und 50 ml Dimethylformamid gelöst, danach eine Lösung von 40 g Z-His-Ns in 150 ml Essigester und 20 ml Triäthylamin zugegeben und das Ganze 4 Stunden bei 0 stehengelassen. Nach Abfiltrieren wird das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.
Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei Z-His Lys(BOC)-Phe-OMe (hellbeiger, amorpher Schaum) erhalten wird. [a]2D = 110 in Dimethylformamid.
d) H-His-Lys(BOC)-Phe-OMe HCl
96 g Z-His-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 2000 ml Methanol gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktivkohle in 120 ml ln Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10,0 Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80 % der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-Hys-Lys(BOC)-Phe-OMe HCl in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.
e) Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe
144 g H-His-Lys(BOC)-Phe-OMe HCI werden in 3000 ml Pyridin gelöst. Bei etwa + 50 werden 122 ml Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 207 g Tritylchlorid in 1000 ml Pyridin während 15 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 24 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig ln Salzsäure auf pH 4 gestellt.
Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein. Der Rückstand wird mit Ather gelöst, mit Petroläther gefällt und anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe erhalten wird.
[α]20D=-26 in Dimethylformamid.
f) Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2
134 g Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 1000 ml Methanol gelöst und mit 60 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/n-Butanol (9:1) und wäscht zweimal mit Wasser. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert. Er besteht aus Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe NH-NH2 vom Smp. 1250 mit Zers., [a] 2ODCC = + 100 in Dimethylformamid.
Teilsequenz D
1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat) a) 1-(N-tert.-Butyloxyxarbonyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei 5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH2 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.
Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC Phe-NH-NH-Z vom Smp. 1170, [a] D = -5 in Dimethylformamid.
b) 1 -(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.
Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910, [rij 2r)0 = + 26,40 in Dimethylformamid.
Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2100, [o]D0 = -lo in Dimethylformamid.
c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.
Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn Asn-Phe-NH-NH-Z, Smp. 2400, [a] 20D = -280 in Dimethylformamid.
d) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)-
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NSI-Z vom Smp. 2100, [aJ 20 = -340 in Dimethylformamid.
e) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), [a] = = ¯34 in Dimethylformamid.
f) 1 -(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat)
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH- NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z.-Trifluoracetat, Smp.
2420, [a] 2D= - 220 in Dimethylformamid.
Teilsequenz E
Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginin-hydrazid (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido)-N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg(NOs)-OMe HCI, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 1 6 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Ather aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NO,)-OMc vom Smp. 1300, [a] 2D0 = -220 in Dimethylformamid.
b) N-tcrt.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NOs)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OM3 in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Ather verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und.
8 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen. Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Ather BOC-Tyr-Trp-Arg(NO. - OMe isolieren; Smp. 1300, [a] 20D = -110 in Dimethylformamid.
c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NOO)-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NOo)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1200 (Zers.), [aj 2D0 = -120 in Dimethylformamid.
d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO )-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N3, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab.
Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Di äthyläther. Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg(NO2)-OMe; Smp. 135 (Zers.), [α]D= -15 in Dimethylformamid.
e) Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginin hydrazid (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2)
Man löst 13,2 g von dem obigen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10%ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man abfiltriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 250 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 200 stehen, dampft ab und löst in 250 ml Pyridin auf.
Danach gibt man 7 ml Triäthylamin zu, kühlt auf 00, gibt 9,5 g Triphenylchlormethan zu und lässt 16 Stunden bei 0 stehen. Man dampft zur Trockne ein, löst in Essigester und wäscht mit einer 5 %igen NaCl-Lösung.
Man trocknet, dampft ab, wäscht den Rückstand mit einem Gemisch von Diäthyläther-Petroläther (2:1) und löst in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Man dampft ab, wäscht den Rückstand bis zur Neutralität mit Wasser und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure.
Man erhält Trt-Ser-Ala- Tyr-Trp-Arg-NHNH-, Smp.
1530, [a] 2D0 = -60 in Dimethylformamid.
Teilsequenz Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl L4eucinmethylester. hydrobromid (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe-HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus EssigsäureäthylesterlDiäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, [a] D0 = -280 in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.
Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyl äther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. HBr, Smp. 1680 [ < i]20 = + 140 in Dimethylformamid.
b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0 geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigsäureäthylester/Wasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu- OMe, Smp. 2080, [a] 2D = -270 in Dimethylformamid.
Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essig- ester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-I eu-OMe- 1,3 HBr, Smp. 202 , [r±] 20D = -100 in Dimethylformamid.
TeZlsequenz F2 tert .-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl
L- seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp. 1900, [aJ D0 = -240 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.
Man erhält H-Asn Leu-Ser-OMe HCl, Smp. 1800, [a]D = -230 in Dimethylformamid.
b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350 [aj 20D = -220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.
Man erhält H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCI, Smp. 1550 (Zers.), [a] 20D = -150 in Dimethylformamid.
c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl und 18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25,1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser OMe, Smp. 182 , [α]20D= -17 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Di äthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)- Ser-Asn-Leu- Ser-NHNH-, Smp.
2240, [α]20D = -130 in Dimethylformamid.
Teilsequenz F tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl
L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucin-hydrazid (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
NHNH2)
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach
10 Minuten bei 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24,8 g H-Thr-Cys(BzU-Val-Leu-OMe. 1,3 HBr (Teilsequenz Fl) zu und rührt 16 Stunden bei 250.
Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit heissem lilethanol durchgewaschen. Man erhält BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe, Smp. 212-244 , [α]20D = -25 in Di methylformamid, das man bei 60 in 100 ml Dimethylformamid löst. Man gibt l0 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 60 stehen; das entstandene Nonapeptidhydrazid kristallisiert aus. Man wäscht mit Di äthyläther, Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid.
Man erhält Nonapeptidhydrazid vom Smp. 260 (Zers.), [a] r) = -33 in Dimethylformamid/Wasser (3:1). Man suspendiert das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiatreaktion durch die Lösung geleitet. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit Wasser und Aceton
I durch. Nach Trocknen erhält man BOC-Cys-Ser-Asn Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-NHNH2, Smp. 298 (Zers.), [α]20D= -20 in Dimethylformamid/Wasser (3:1).
Teilsequenz ABC L-Histidyl-#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-
L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl
L-threonyl-L-prolinamid.Triacetat (H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.3CH3CO2H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid.Hydrochlorid (H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr
Pro-NH2.HCl)
Man löst 6,7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teilsequenz B). 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro NH2 (Teilsequenz A) in 50 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril auf, kühlt auf 0 , gibt 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und lässt 16 Stunden bei 0 stehen. Man dampft das Lösungsmittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyläther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um.
Man erhält BOC Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 Smp. 121 (Zers.), [α]20D= -47 in Dimethylformamid, das man in 250 ml einer Lösung von 8n Chlorwasserstoff in Dioxan löst. Man rührt während 2 Stunden bei 25 , dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyläther. Man erhält H-Ser-Gly-Met-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr.Pro-NH2.HCl [Smp. 130 (Zers.), [α] r) = -48 in Dimethylformamid].
b) L-Histidyl-#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-
L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl
L-threonyl-L-prolinamid.Triacetat (H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe Gly-Pro-Gly-Thr-Pro-NH2. zu 3 CHsCOOH)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NHNH2 (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid kühlt auf-20 , gibt 15 ml Dioxan/HCI 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20 , gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.HCl zu, rührt 4 Stunden bei 0 , filtriert und dampft zur Trockne ein.
Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essig estcr/Methanol (8: 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 [Smp. 150 (Zers.), [a]D = -48 in Dimethylformamid], das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8: 2) löst.
Man lässt 3 Stunden bei 40 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Di äthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH Spänc, Man erhält H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-Nh2.3CH3COOH, Smp.
201 (Zers.), [α]20D = -53 in Essigsäure.
Teilsequenz DE
Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylaianin-hydrazid.diacetat (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2- 2 CHSCOOH) a) 1-(N-Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid-diacetat (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH-Z diacetat) blan kühlt 320 ml Dimethylformamid auf -20 C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in dioxan zu und löst darin 72 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 (Teilsequenz E). Anschliessend versctzt man mit 12 ml tert. Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei -20 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu.
Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triälhylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Sodalösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-Z.2 CH3COOH vom Smp. 168 , [α]20D= -19 in dimethylformamid.
b) Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin.hydrazid.diacetat (Trt-Ser-Als-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NHNH2- zu 2 CH3COOH)
Man löst 90 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CHsCOOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10 %ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol, enthaltend 1 % Essigsäure, kristallisiert. Man erhält Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH- 2 CH3COOH vom Smp. 215 , [α]20D= -53 in Dimethylformamid.
Teilsequenz ABCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-#-tert.- butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-seryl glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid.Hexaacetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-pro-NH2.6CH3CO2H) Man löst 15,2 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-Asn-Phe-NHNH2. Diacetat (Teilsequenz DE) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 15 ml Dioxan HC1 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei 200.
Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,9 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidacetats in Dimethylformamid zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein. ian wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-41(} (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um. Man erhält das
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-
Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-pro-NH2.Acetat, Smp. 128 (Zers.), [α]20D= -40 in Dimethylformamid, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml 80%iger Essigsäure löst.
Man lässt 1 Stunde bei 450 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyläther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH-Späne erhält man das H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly
Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.6CH3CH2H, Smp. 130 (Zers.), [α]20D= = 48 in Essigsäure.
Beispiel 1 tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl
L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl L-tyros,vl-L-tryptophanyl-L-arninyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanyl-L-histidyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl
L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl L-threonvl-L-prolinamid Hexaacetat Hydrat
EMI8.1
<tb> (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 6 Acetat Hydrat)
Man löst 1,05 g Nonapeptid-Hydrazid (Teilsequenz F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 1.2 ml 2n Dioxan/HCl bei -200.
Man gibt 0,116 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -200, gibt 1,4 ml Triäthylamin und 3,1 g Tricosapcptid-Hexaacetat (Teilsequenz ABCDE) und 5 ml Wasser zu und rührt 16 Stunden bei 00. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. löst in Trifluoressigsäure, lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft ab und wäscht mit Essigester.
So erhält man das rohe Dotriacontapeptid, das man in 100 ml 0.3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA410 (Acetat) behandelt und anschliessend 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzugibt. Man stellt das pH auf 6.5 ein und schichtet di erhaltene Lösung auf eine Carboxvmethvlcellulosesäule (10 X 100 cm), die mit einer 0,1 5n Ammoniumacetatpuffer-Lösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet.
Man erhält
EMI8.2
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly
Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH 6 CH3CO2H 10 ff2O, Smp. 2200 (Zers.), [α]20D D0 = -58 in Essigsäure In.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.): Ala1.1, Arg1.0, Asn3.0, Cys/21.6, Glu1.2, Gly3.0, His1.1, Leu2.9, Lys1.1, Met1.0, Phe3.0, Pro2.1, Ser3.8, Thr1.9, Tyr1.0, Val0,0 (Trpt 0 durch Spektrophotometrie).
Beispiel 2
L-Hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl
L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl
L-histidyl-L-lysyl-L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl
L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-prolyl-L-glutamyl-L-thyreonyl-L-prolin amid 10.Acetat 10 Hydrat
EMI8.3
<tb> (H-Cvs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- <SEP>
<tb> Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe His-Lys-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2.10 Acetat.10 Hydrat) Man löst 3.3 g
EMI8.4
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Met-Gly
Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.Hexaacetat unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure,
lässt 15 Minuten bei 200 stehen und dampft zur Trockne ein. Man löst in 300 ml 0,2n Essigsäure, behandelt mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat), lyophilisiert, wäscht mit Diäthyläther und trocknet über Kaliumhydroxid im Hochvakuum. Man erhält
EMI8.5
<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Lys-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2.10CH3CO2H.10H2O,, Smp. 2200 (Zers.), [α]20D - 520 in Essigsäure 1n.
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.): Ala1.1, Arg1.0, Asn3.9, Cys/21.6, Glu1.2, Gly3.0, His1.1, Leu2.9, Lys1.1, Met1.0, Phe3.0, Pro2.1, Ser3.8, Thr1,9, Tyr1,0, Val0,9 (Trp1,0 durch Spektrophotometrie).