CH515215A

CH515215A - Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates

Info

Publication number: CH515215A
Application number: CH557168A
Authority: CH
Inventors: Stephan Dr Guttmann; Janos Dr Pless; Sandrin Edmond; Pierre-Alin Dr Jaquenoud; Bossert Heinz; Willems Hans
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1968-04-16
Filing date: 1968-04-16
Publication date: 1971-11-15

Description

Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates der Formel
EMI1.1
seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.

Das bisher unbekannte Polypeptidderivat kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, indem man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren und Mercaptopropionsäure unter Bildung von
CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 6 und vor Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese in die Amidgruppe überführt und gege benenfalls die Säureadditionssalze herstellt,

indem man das Polypeptidderivat der obigen Formel durch Um setzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

Beim Aufbau des neuen Polypeptidderivates hat sich für die Blockierung der r-Carboxylgruppe, beispiels weise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert.-Butyl-oxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen. wie die Methoxy-, die Athoxy- die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgrnppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Isopropyl oxycarbonyl)3,4,5, 6-tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.

Das neue Polypeptidderivat lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Athansulfon- säure, Hydroxyäthansulfonsäure. Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit organischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z.

B. derjenige vom Zink in Frage.

Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptidderivates können, sofern sie nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.

Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Galciumplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Cal ciumbilanz im Knochen bewirkt.

Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels envünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyrealcalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.

Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesonders zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.

Die biologische Prüfung der neuen Verbindung ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einhei tenmg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht.

Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.

Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Venvendung finden.

Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.

Die neue Verbindung und ihre Salze kann auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.

Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trit = Trityl-Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxv
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy
NO2 = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Met = L-Methionyl
MCP = ss-Mercaptopropionyl
Cys = L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Teilsequenz A: L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-v-tert.-butyloxy
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
Man löst bei -50 134 g Z-Thr-NH-NH2 in 2 Liter in Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Athylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH2-hydro- chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 25 stehen.

Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 1480, [a] 2D = -720 in 95 % Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 Liter Dioxan und 260 ml In Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.

Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH2 - HC1; Smp. 2160, [a] = -640 in 95 % Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g ZGlu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther. Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 650 (Zers.); [a] 2E)0 = -180 in Dimethylformamid.

Man löst 80 g ZGlu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators.

Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu (OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 650 (Zers.), [a] 2D = -280 in Dimethylformamid. Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, abfiltriert, im Vakuum eingedampft und mit Athylacetat versetzt.

Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus i6Lthylacetat/Sithyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH,.

Smp. 1200 (Zers.). [a] 2D = - 660 in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst.

Man gibt 30 g Palladiumkohle (10,0g) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB) Thr-Pro-NH,; Smp. 1530 [o]20 = - 790 in Dimethylformamid.

Teilsequenz B: N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl- glycin (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH) a) L-Methionyl-glycin-äthylester-hydrochlorid (H-Met-Gly-OEt HC1)
Man löst 65 g BOC-Met-OH in 900 ml Chloroform, kühlt auf - 10, gibt 30 ml N-Methylmorpholin und 35,6 g Chlorameisensäureisobutylester zu. Nach
10 Minuten fügt man langsam eine Lösung von 30 g Glycin-äthylester in 200 ml Chloroform hinzu und lässt bei 200 eine Stunde reagieren. Man extrahiert mit 0,5n Ammoniumhydroxid, dann mit 0,2n Schwefelsäure, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und engt ein. Nach Umkristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Met-Gly-OEt; Smp. 490, {o] 2D = 190 in Äthanol.

Man löst es in 750 ml 4n HCl/Athanol, lässt 1 Std. bei 250 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und trocknet bis zur Gewichtskonstanz. Man erhält das H-Met-Gly-OEt HCl in Form eines Öls.

b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-OEt)
Man löst 12,5 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-serin in 100 ml Chloroform und gibt 6,1 g N-Methylmorpholin dazu; danach tropft man 8,2 g Chlorameisensäureisobutylester hinzu. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 6,6 g Glycin-äthylester in 50 ml Chloroform hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit verdünntem Ammoniak, dann mit Salzsäurelösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und die organische Phase abgedampft.

Man erhält BOC-Ser-Gly-OEt als Öl; [a]2D = - 30 in Dimethylformamid.

c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycin-hydrazid (BOC-Ser-Gly-NHNH2)
Man löst 19,4 g BOC-Ser-Gly-OEt in 270 ml Äthyl- alkohol, gibt 48,6 ml Hydrazinhydrat hinzu und lässt 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Anschliessend dampft man die Lösung ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Methylalkohol/Athyläther-Gemisch (1: 3). Man erhält BOC-Ser-Gly-NHNH2, Smp. 1570, [a] r > = - = 50 in Dimethylformamid.

d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl glycin-äthylester (BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt)
Zu 200 ml Dimethylformamid werden 25 ml einer 4n Chlorwasserstofflösung in Äthyläther gegeben und darin 11 g BOC-Ser-Gly-NHNH2 gelöst. Anschliessend tropft man bei -10 5,4 ml tert.-Butylnitrit hinzu, fügt der Lösung zuerst 18 ml Triäthylamin und dann eine Lösung von 12 g H-Met-Gly-OEt HC1 in 100 ml Dimethylformamid und 6,2 ml Triäthylamin bei. Es wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, nach 12 Stunden filtriert und eingedampft. Den Rückstand löst man in Chloroform, wäscht nacheinander mit verdünnter Ammoniak- und Salzsäurelösung, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met Gly-OEt, [a] D = - 140 in Dimethylformamid.

e) tert.-Butyloxyvarbonyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl- glycin (B OC-Ser-Gly-Met-Gly-OH)
Man löst 24 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OEt in 250 ml Dioxan, gibt 75 ml in Natronlauge zu, rührt 1 Stunde bei 250, behandelt mit 150 ml Dowex-50 (H+-Form), filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester/Diäthyläther. Man erhält BOC Ser-Gly-Met-Gly-OH, Smp. 870 (Zers.), [a]4D0 = - 170 in Dimethylformamid.

Teilsequenz C: Na,Nimjd. Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenyl alaninhydrazid HCl) [(Trt)-His(Trt)-Ärg-Ph
NHNH2 HCl] a) ZArg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe HCl werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.

67,6 g Z-Arg(NO2)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf 200 abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit 1n Natronlauge, Wasser, ln Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft.

Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man ZArg(NOo)-Phe-OMe; Smp. 131 bis 1330, [a] r) = - 70 in Methanol, -40 in Dimethylformamid.

b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 H-O 1,2 HBr
20 g ZArg(NOO)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40%ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 200 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165-1670 mit Zers., cfl 20 - + D [a] D = + 18 in Methanol, l 14 in Dimethyl- formamid.

c) Z-His(Z) -Arg(NOr)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 HG 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eis wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert.

Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 mi Pyridin zugesetzt. danach das Ganze auf -200 abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: l0 Oige Kaliumcarbonatlösung (pH zur 10), Wasser. gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung.

Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester- Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Atherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet; man erhält Z-His(Z)-Arg(NOe)-Phe-OMe (amorpher Schaum) [a] 2E0 = - 80 in Methanol, - 80 in Dimethylformamid.

d) H-His-Arg-Phe-OMe 4 HCl
25 g Z-His(Z)-Arg(NO )-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10W Palladium auf Aktivkohle in 200 ml 1n Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10 Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist.

Hierbei werden etwa 80% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Ka.alysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His Arg-Phe-OMe .4 4 HCl in Form eines amorphen Schau- mes erhalten wird.

e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe.4 HCl werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa +50 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig 1n Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.

Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe OMe HCl erhalten wird.

f) Trt-His(Trt) -Arg-Phe-NH-NH.2 HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroform-Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt) Arg-Phe-NH-NH HCl; Smp 1580, [a] r) = -90 in Dimethylformamid.

Teilsequenz D:
1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl- hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z. CF:sCOOH) a) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)-
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei -5 26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH3 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.

Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Phe-NH NH-Z vom Smp. 1170, [a] 2r0 = -5 in Dimethylformamid.

b) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L- phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.

Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 1910 [a] 20 = + 26,40 in Dimethylformamid.

Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn-ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2100, [a]D = - 180 in Dimethylformamid.

c) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin) -2-benzyloxycarbonyl hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 200 stehen.

Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z; Smp. 2400, [a] D0 = - 280 in Dimethylform- amid.

d) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxyvarbonyl - hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2100, [u] 2D = - 340 in Dimethylformamid.

e) 1 -(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asp araginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Ather kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.), [o] eD = - 340 in Dimethylformamid.

f) l-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl hydrazid trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z . Trifluor acetat)
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z. Trifluoracetat; Smp. 2420, [a] 2D = - 220 in Dimethylformamid.

Teilsequenz E: tert. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl- L-tryptophanyl-L-arginyl--hydrazid. acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2 CH3COOH) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl (guanido)N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NOs)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe HCl, 63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 3100 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus.

Dabei kristallisiert BOC-Trp Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1300, [o] 2D0 = -220 in Dimethylformamid.

b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl- (guanido)N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp-Arg(NOw)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(N02)-OMe in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [cc]u = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.

Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NOO)-OMe iso
20 lieren; Smp. 130 , [a] 20D = - 110 in Dimethylformamid.

c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-(guanido)N-nitro-L-argininmethylester (B OC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2) -OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO,)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, filtriert ab, löst in l00 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 30 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr Trp-Arg(NO-)-OMe; Smp. 120 (Zcrs.), [o] - 120 in Dimethylformamid.

d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin- methylester (E OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO -)-OM e)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockene ein, wäscht den Rück stand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N3, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyläther.

Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NOs)- OMe; Smp. 135 (Zers.), [a] 2E0 = - 150 in Dimethylformamid.

e) tert. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginin hydrazidacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH3 CH3COOH)
Man löst 13,2 g von dem oben erhaltenen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10%ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf, dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu beseitigen. Anschliessend löst man den Rückstand in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 400 stehen. Nach Zugabe von 260 ml Diäthyläther filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht mit Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2.

CH0COOH; Smp. 1820, [e]E = - 80 im Dimethylformamid.

Teilsequenz Fl
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin- methylester hydrobromid (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr) a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val Leu-OMe-HCl in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu. lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 1600, [ol D0 = -280 in Di- methylformamid, das man in 210 ml einer 40 ;; igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.

Man lässt 1 Std. bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. HBr, Smc i68 * [¯] -D = + 140 in Dimethylformamid.

b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 203. gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0- geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von EssigsäureäthylesteriWasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OMe; Smp. 2080, [r] 2D = - 270 in Dimethylformamid.

Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure-Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OMe . 1,3 HBr; Smp. 2020, [a] D0 = - 100 in Dimethylformamid.

Teilsequenz F2: tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl-
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCl und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu Ser-OMe, Smp. 1900, [o] 2D = - 240 in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.

Man erhält H-Asn-Leu Ser-OMe HC1; Smp. 1800, [a] D20 = - 230 in Dimethylformamid.

b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NHNH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200, gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert. Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350, [a] 2E0)= -220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.

Man erhält H-Ser Asn-Leu-Ser-OMe HCl, Smp. 1550 (Zers.), [&alpha;] r) = - 150 in Dimethylformamid.

c) Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HC1 und 13,5 g Bzl-MCP-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Tri äthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Äthanol um. Man erhält 21,3 g Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp.

193 ; [a]D = - 170 in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/ Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene Bzl MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH-, Smp. 2510, [a] D'0 = - 16 in Dimethylformamid.

Teilsequen F: ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl-L- leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-
L-leucin-hydrazid
EMI6.1

Man löst 16,2 g Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH (Teilsequenz F7) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf -200, gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butyinitrit zu. Nach 10 Minuten bei - 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24,8 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. 1,3 HBr zu und rührt 16 Stunden bei 250. Danach wird filtriert, die Lösung abgedampft und der Rückstand mit heissem Methanol durchgewaschen.

Man erhält 24,1 g Bzl-MCP-Ser-Asn Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 2440, [a] 20 = - 220 in Dimethylformamid, das man bei 600 in 100 ml Dimethylformamid löst, gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 600 stehen. Das entstandene Octapeptidhydrazid kristallisiert aus. Man wäscht mit Diäthyläther, Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid.

Man erhält 15,1 g Octapeptidhydrazid, Smp. 2650, [a] 2rg = - -350 in Dimethylformamid/Wasser (3 1).

Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu.

Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiatreaktion durch die Lösung geleitet. Man dampft zur Trockne ab und wäscht den Rückstand mit Wasser und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man
EMI7.1
Smp. 278U, [e] vD - - 19U in Dimethylformamid/Wasser (3 1).

Teilsequenz ABC:
Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-
L-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly- Pro Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3CO2H) a) L-Seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-Lphenylalanyl- glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid (H-Ser-Gly-Met-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHe HC1)
Man löst 6,7 g BOC-Ser-Gly-Met-Gly-OH (Teilsequenz B), 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 (Teilsequenz A) und 2,1 g Hydroxysuccinimid in 50 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril auf, kühlt auf 00, gibt 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu und lässt
16 Stunden bei 0 stehen.

Man dampft das Lösungsmittel ab, wäscht den Rückstand mit Wasser, Diäthyl äther und Essigester und kristallisiert aus Chloroform um. Man erhält BOC-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 1210 (Zers.), [a] D = - 470 in Dimethylformamid, das man in 250 ml einer Lösung von 8n Chlorwasserstoff in Dioxan löst. Man rührt während 2 Stunden bei 250, dampft zur Trockne ein und verarbeitet den Rückstand in Diäthyläther. Man erhält H-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu - Thr - Pro NH.2 HCl, Smp. 1300 (Zers.), [a]2D = -480 in Di- methylformamid.

b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly- Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 - 3 CH:3COOH)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NHNH; HCl (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend
1,6 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei - 200, gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2- HCl zu, rührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.

Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/Methanol (8 : 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf
100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält Trt-His (Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 [Smp. 1680 (Zers.), [o] D = -430 in Dimethylform- amid], das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst.

Man lässt 3 Stunden bei 400 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Späne. Man erhält H-His (Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro- Glu-Thr-Pro-NH2- 3 CH3COOH, Smp. 1820 (Zers.), [o]20 - 560 in Essigsäure.

Teilsequenz DE:
N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin- hydrazid diacetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-NHNH2 2 CH3COOH) a) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L- tyrosinyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparagmyl-L-phenyl- alanyl)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid diacetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-NH-NH-Z 2 CHBCOOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf - 200 C, gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g <RTI

ID=7.52> BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2- acetat (Teilsequenz E). Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei -200 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester und wäscht mit verdünnter Phosphorsäure und Ammoniaklösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das
B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z 2 CH3COOH vom Smp. 1750, [a] D0 = - 19,50 in Dimethylformamid.

b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alanin hydrazid diacetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn
Asn-Phe-NHNH2 2 CH3COOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CH:3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10Sig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Athanol kristallisiert.

Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNHa 2 CH3COOH vom Smp. 2650 [a] 2E0 - 570 in Dimethylformamid.

Teilsequenz ABCDE: L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl
L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-methionyl-giycyl-
L-phenylalanyl-glycyL-glutamyl-L-threonyl-
L-prolinamid hexatrifluoracetat (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg,-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-
Thr-Pro-NH2 6 CFUCOiH).

Man löst 15,2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-PheNHNH; Diacetat (Teilsequenz DE) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf - 200 gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei - 200. Man gibt
14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidacetat zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberiit-IRA-41 0 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/ Wasser um.

Man erhält das BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His (Trt)-Arg -Phe-Ser - Gly - Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NHO - acetat, Smp. 1450 (Zers.), [a] r, - - 670 in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst.

Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyl äther. Man abfiltriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH-Späne erhält man das H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-
His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu- Thr-Pro-NHo - 6 CFbCOaH,
Smp. 1300 (Zers.), [a] 2i} = - 420 in Essigsäure.

Beispiel ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl- L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-L- seryl-L-al anyt-L-tyrosyl-L-tryptoph anyl-L-arginyl-L- asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L- phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl-L seryl-fycyl-L-methionyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl- L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid Hexaacetat Octahvdrat.
EMI8.1

NHo Hexaacetat Octahydrat)
Man löst 1,05 g Octapeptid-Hydrazid (Teilsequenz
F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und
1,2 ml DioxanlHCl 2n bei -20 . Man gibt 0,116 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20 , gibt
1,4 ml Triäthylamin und 3,1 g Tricosapeptid-Hexatri fluoracetat (Teilsequenz ABCDE) und 5 ml Wasser zu und rührt 16 Stunden bei O'. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe Peptidderivat, das man in 100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Am berlit-IRA-4 10 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n
Ammoniumhydroxyd hinzu.

Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 X 100 cm), die mit einer 0,1 5n Ammoniumacetatpuffer-Lösung equilibriert wurde.

Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrationsund pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid erhalten, werden 3mal lyophilisiert, der Rückstand wird mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxyd im Hochvakuum getrocknet. Man erhält
EMI8.2
Smp. 2200 (Zers.). [o] = 560 in Essigsäure ln.

Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Stunden): Alar. Arg.'0, Ans5,9, Cys/21.0, Gluto, Gly30, His1.1,
Leu2,9, Met0, Phe3,0, Pro2., Sers.s, Thrlu, Tyrso, Val09 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie).

Claims

PATENTANSPRÜCHE

I. Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates der Formel EMI8.3 und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren und Mercaptopropionsäure unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1-6 und vor Einbau der eine Methionylgruppe enthaltenden Teilsequenz zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt,

indem man das Polypeptidderivat der obigen Formel durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

II. Verwendung des nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I hergestellten Polypeptidderivates der Formel EMI8.4 zur Herstellung von Schwermetallkomplexen. dadurch gekennzeichnet. dass man das Polypeptidderivat obiger Formel durch Umsetzung mit Schwermetallsalzen in die entsprechenden Schwermetailkomplexe überführt.

UNTERANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptidderivates nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man EMI9.1 nach Umwandlung in das entsprechende Azid mit 9 10 Ii 12 13 14 15 16 17 18 19 Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr 31 Pro-NH2 kondensiert.