CH508592A - Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates

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CH508592A
CH508592A CH1079568A CH1079568A CH508592A CH 508592 A CH508592 A CH 508592A CH 1079568 A CH1079568 A CH 1079568A CH 1079568 A CH1079568 A CH 1079568A CH 508592 A CH508592 A CH 508592A
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Janos Dr Pless
Stephan Dr Guttmann
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Sandoz Ag
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Description


  
 



  Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates der Formel
EMI1.1     

  <SEP> 
<tb>  <SEP>    ¯    <SEP>    2 <SEP>    3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP>    61 <SEP>     <SEP> 7 <SEP>    3    <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>   MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-S <SEP> er-Ala-    <SEP> 
<tb>  <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP>    13    <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP>    20    <SEP> 21
<tb>   Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Lys-    <SEP> 
<tb>  <SEP>    23    <SEP>    23 <SEP>     <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP>    28    <SEP> 

   29 <SEP> 30 <SEP> 31
<tb>   Ser-Gly-Nle <SEP> -Gly-Phe <SEP> -G    <SEP>    ly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2,    <SEP> 
<tb>  seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.



   Das bisher unbekannte Polypeptidderivat kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren und Mercaptopropionsäure unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 6 zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt.



   Beim Aufbau des neuen Polypeptidderivates haben sich für die Blockierung der   v-Carboxylgruppe,    beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.



   Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo - tert. - butoxy-, die Carbo - tert. - amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.



   Für die Blockierung der   co-Aminogruppe    des Lysinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C kann eine tert.-Alkoxy-carbonylgruppe, vorzugsweise die tert.-Butoxy-carbonylgruppe, verwendet werden.



   Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die
2-(Isopropyloxycarbonyl)-3 ,4,5,6-tetrachloro benzoylgruppe verwendet werden.



   Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.



   Zum Schutz der Sulfhydrylgruppe in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz   F1    und F2 kann z. B. die Benzyl-, die p-Brombenzyl- oder die p-Methylbenzylgruppe verwendet werden.



   Das neue Polypeptidderivat lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure,   itthansulfon-    säure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z.

  B. derjenige vom Zinks in Frage.



   Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des neuen Polypeptidderivates können, sofern sie nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Metho  den erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.



   Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.



   Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfall von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.



   Die neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder   Inaktivität    usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie   ins-.   



  besondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw, Phosphat. Die biologische Prüfung der neuen Verbindung ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid.



   Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht.



   Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m.



  verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.



   Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden.



  Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen - Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die.neue Verbindung kann auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.



   Die neue Verbindung und ihre Salze kann auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.

 

   Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl = Benzyl
BOC =   tert.-Butyloxycarbonyl   
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy
OEt =   Äthoxy       NOe    = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Lys = L-Lysyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl    Nle    = L-Norleucyl
MCP =   ss-Mercaptopropionyl   
Cys = L-Cysteinyl
In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.  



   Teilsequenz A   
L-Phenylalanyl-,lycyl-L-prolyl-y-tert.-butyloxy-
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid     (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2)
Man löst bei   -5     134 g   Z-Thr-NH-NHa    in 2 Liter in Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter in Natrium nitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Athylacetat extra hiert und eine Lösung von 80 g   H-Pro-NH2. Hydro-    chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über
Nacht bei 250 stehen. Die restliche Lösung wird im
Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat ge löst, mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wäss rigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Na triumsulfat getrocknet.

  Man verdampft im Vakuum, löst in warmem   Athylacetat    und kühlt ab. Man erhält    Z-Thr-Pro-NH2;    Smp.   1480      []2O    = -72  in 95 %
Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in
2 Liter Dioxan und 260   ml    in Salzsäure und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palla diumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält   H-Thr-Pro-NH2 HCl,    Smp.   2160,      Lal 2D0    =    -640    in   95 S;    Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Di methylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetra hydrofuran zugegeben.

  Man lässt über Nacht bei 200 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den
Rückstand mit Äthyläther. Man erhält Z-Glu(OTB)    Thr-Pro-NEa,    Smp. 650 (Zers.),   [a]      2D= 18     in Di methylformamid.



   Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 Li ter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkata lysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird, Smp.



   650 (Zers.),   [a]    D20 =   -280    in Dimethylformamid.



   Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei   0     gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH,
18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbo diimid hinzugefügt, über Nacht bei 200 stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Äthylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonat lösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im
Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Athyl acetat/Äthyläther. Man erhält   Z-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-      Thr-Pro-NHe    vom Smp. 1200 (Zers.) [a]   20    =   -660    in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst. Man gibt 30 g Palladium kohle   (10 9S)    zu und hydriert bis zum Ende der Wasser stoffaufnahme.

  Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp.   1530,     [a]   r:=      -790    in Dimethylformamid.



   Teilsequenz B
Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin  (ZSer-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin  (Z-Nle-Gly-OH)
Man löst 31,6 g H-Gly-OH in 420 ml in Natron lauge, gibt 840 ml Tetrahydrofuran zu, versetzt anschliessend mit 130 g Z-Nle-ONP, schüttelt, bis   di    Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 250 stehen. Dam wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhal tene wässrige Lösung mit In NaOH auf pH 9 gestellt zweimal mit   Ather    extrahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert und mit Essigester extrahiert.

  Die Essig esterlösung wäscht man mit Wasser und mit NaCl   309Ot    trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein Den Rückstand verreibt man mit   Ather,    lässt zwei Stun den bei   -200    kristallisieren und erhält so Z-Nle-Gly-OH Smp.   1380,      [a] D0    =   -4     in Dimethylformamid.



  b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin  (Z-Gly-Me-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-OH in 1000   mi    4n   HBrj    Eisessig, lässt 50 Minuten bei 250, verreibt mit Äther filtriert die Kristalle ab und wäscht gut mit   Ather.    Mar erhält HBr   H-Nle-Gly-OH,    [a] 2D0 = + 24,70 in Essig.



  säure, 95 %.



   Man löst 84 g   HBr- H-Nle-Gly-OH    in 240   ml    H20 versetzt mit 152   ml    4n NaOH, 800   ml      Tetrahydroturar    und 91 g Z-Gly-ONP. Man schüttelt 1 Stunde bei 250 lässt dann 2 Tage bei 250 stehen. Man konzentriert in Vakuum auf 500   ml    ein, stellt mit in Natronlauge   an    pH 9 ein und extrahiert mit   Ather.    Die H2O-Phase   wirc    mit in Salzsäure angesäuert, dann zweimal mit Essig.



  ester extrahiert. Man wäscht mit H2O, NaCl   30 %.   



  trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein.



  verreibt den Rückstand mit   Äther.    Man erhält   Z-Gly    Nle-Gly-OH, Smp.   1550,      [a] 2D    =   -5,60    in Dimethyl formamid.



  c)   Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-    glycin  (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml   4n      HBr/Eisessig,    lässt 50 Minuten bei 250 stehen, dampf im Vakuum ein, verreibt mit Äther, filtriert, wäsch gut mit Äther, trocknet im Vakuum, löst in 280   ni    Wasser etwa 650 ml Dimethylformamid, gibt 66,5   m@    Triäthylamin zu und versetzt mit dem Azid, das wie folgt erhalten wird:

  :
Man kühlt 940   ml    in Salzsäure auf   -5 ,    gibt 96 g Z-Ser-NH-NH2 zu und tropft dann bei   -5     360   m;    in Natriumnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei   -5     überschichtet mit etwa 600   ml    Essigester von 00, steill unter Zugabe von festem Na2CO3 auf pH 8,5,   trenn@    die Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknel die Lösung über Natriumsulfat und filtriert. Die   Reak-    tionslösung dampft man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit 600   ml    Wasser, säuert an, extrahiert mit Äthylacetat, wäscht mit Wasser, mit NaC1   30 %,    kühlt auf   0     und filtriert die Kristalle ab. 

  Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH vom Smp. 2100 mit Zers..



  [a]D20=   -80    in Dimethylformamid.



   Teilsequenz C    N,,Ni,id-Ditrityl-L-histidyl-tert. -butyloxy-    carbonyl-L-lysyl-L-phenylalaninhydrazid    (Trt)-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2    a) Z-Lys(BOC)-Phe-OMe
94,8 g H-Phe-OMe.HCl werden in 1 Liter   äther    und etwa 50   ml    Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das   Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.



   144 g Z-Lys(BOC)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit dem oben erhaltencn H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf   200      abgekühlt    und eine Lösung von 90,8 g Dicyclo   hexylcarbodümid    in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit   1n    Sodalösung, Wasser, ln Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft.

  Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Lys(BOC)-Phe-OMe; Smp. 102   bis 1050, [ct]2E) = -70 in Methanol, -120 in Dimethyl-    formamid.



  b) H-Lys(BOC)-Phe-OMe   HCl   
29 g Z-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 500 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 53 ml in   HCl/    Methanol in Anwesenheit von Palladiumkohle hydriert.



  Nach Filtrieren und Eindampfen wird der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.



  c) Z-His-Lys(BOC)-Phe-OMe
45 g H-Lys(BOC)-Phe-OMe   HCl    werden in einem Gemisch von 300 ml Acetonitril und 50   ml    Dimethylformamid gelöst, danach eine Lösung von 40 g Z-His   Ns    in 150 ml Essigester und 20 ml Triäthylamin zugegeben und das Ganze 4 Stunden bei   0     stehengelassen.



  Nach Abfiltrieren wird das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend dreimal mit   Wasserígesättigte    Kochsalzlösung (1:1) gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei Z-His-Lys(BOC)-Phe-OMe (hellbeiger, amorpher Schaum) erhalten wird;   [a]?    =   11    in Dimethylformamid.



  d) H-His-Lys(BOC)-Phe-OMe    HC1   
96 g Z-His-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 2000 ml Methanol gelöst. Danach werden 10 g   10S    Palladium auf Aktivkohle in 120 ml in Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g   103S    Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach   5¸    Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa   80 C    der theoretischen Menge   Wasserstoff    verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His   Lys(BOC)-Phe-OMe.    HC1 in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.



  e) Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe
144 g   H-His-Lys(BOC)-Phe-OMe HCI    werden in 3000 ml Pyridin gelöst. Bei etwa   +    50 werden 122 ml Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 207 g Tritylchlorid in 1000 ml Pyridin während 15 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 24 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig In Salzsäure auf pH 4 gestellt.



  Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein. Der Rückstand wird in wenig Äther gelöst, mit Petroläther gefällt und anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe erhalten   wird. [u]D20 = 260 in Dimethylformamid.   



  f)   Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NH-NH-,   
134 g Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 1000 ml Methanol gelöst und mit 60 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/n-Butanol (9:1) und wäscht zweimal mit Wasser. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit   Ather    gewaschen und abfiltriert. Er besteht aus   Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe      NH-NHe    vom Smp. 1250 mit Zers., [a]   2DD    = +   103    in Dimethylformamid.



   Teilsequenz D
1 -(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl    L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy-    carbonyl-hydrazid   Trifluoracetat       (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z. Trifluor-    acetat) a)   l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)-   
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid  (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-NIethylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft   bei 5    26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g   Z-NHNH.,    in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.



  Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC Phe-NH-NH-Z vom Smp.   117,      [a]D    =   5    in Dimethylformamid.



  b)   1 -(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl   
L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid  (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Tri    fluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 20 ' stehen.   



  Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom   Smp. 1910, [a] 2rzD = t 26,43 in Dimethylformamid.   



  Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei   2CL    wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält   BOC-Asn-Phe-NH-    NH-Z vom Smp.   2100,      [a] 2r > D      = 180    in Dimethylformamid.

 

  c)   1 -(N-tert.-B utyloxycarbonyl-L-asparaginyl-       L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy-    carbonyl-hydrazid  (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g   BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z    in 200 m Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei   20'    steher Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man 100   ml    Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ON  und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phos   phorigersäure    gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn Phe-NH-NH-Z, Smp.   2400,      [a]D    =   -280    in Dimethylformamid.



  d)   l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-   
L-asparaginyl-L-as paraginyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid  (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in
150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp.   2100,      {a 2D    =   -340    in Dimethylformamid.



  e)   1 -(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-       L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl-    alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid    (B OC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)   
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in   Ather    kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen.

  Man erhält BOC-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 2500 (Zers.),   [a]    =   340    in Dimethylformamid.



  f) 1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy-    carbonyl-hydrazid.    Trifluoracetat  (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluor acetat)
Man löst 43.5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z   Trifluoracetat,    Smp.   2420,      [a]D20 = -22  in Dimethylformamid.   



     Teitsequenz    E
Trityl-L.seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-
L-arginin-hydrazid    (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH.))    a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl    (guanido)N-nitro-L-argininmethylester  (BOC-Trp-Arg(N02)-OMe)   
Man löst 35   g H-Arg(NO.2)-OMe HCl,    63 g BOC Trp-OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 200 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure gewaschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp   Agr(NO2)-OMe    vom Smp.   1300,      [aib1 =      -22     in Dimethylformamid.



  b) N-tert.-B u tyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-trypto phanyl-(guanido)N-nitro-argininmethylester    (BOC-Tyr-Trp-Arg(NO.2)-OMe)   
Man löst 15 g   BOC-Trp-Arg(NO9)-OMe    in 80 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g   H-Trp-Arg(NO.,)-OMe    als Hydrochlorid zurück; Smp.   1200,      [ai    =   -90    in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 200 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen.

  Nach Waschen mit verdünnter   Phosphorigersäure    und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von Äther   BOC-Tyr-Trp-Arg(NOe)-    OMe isolieren; Smp.   1300,      [a]2E0=      -11     in Dimethylformamid.



  c)   tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-lrtyrosyl-   
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester    (B OC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NOO)-OMe)   
Man löst 13,5 g   BOC-Tyr-TpArg(NO9)-OMe    in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 250 gibt man 500   ml    Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man   BOC-Ala-Tyr-Trp -Arg(NO-)-OMe    vom Smp. 1200 (Zers.),   [n]?,O    =   120    in Dimethylformamid.



  d)   tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-E-alanyl-L-tyrosyl-   
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester  (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g   BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO)-OMe    in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g   BOC-Ser-N:z,    lässt 16 Stunden bei   0     stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. 

  Man erhält 13,5 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp   Arg(NO*,)-OMe;    Smp. 1350 (Zers.),   [ofl 2rn =      -150    in Dimethylformamid.



  e) Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto    phanil > L-arginin Hydrazid  (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH-,)   
Man löst 13,2 g von dem obigen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10%ig) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in Dimethylformamid auf,  dampft wiederum ab, um die Spuren von Essigsäure zu   baseitigen.    Anschliessend löst man den Rückstand in 250   ml    5n methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 20 stehen, dampft ab. löst in Methanol, dampft ab und löst in 250 ml Pyridin auf Danach gibt man 10 ml Triäthylamin zu, kühlt auf 00, gibt 9,5 g Triphenyl   chiormethan    zu und lässt 16 Stunden bei   0     stehen.



  Man dampft zur Trockne ein, löst in Essigester und wäscht mit einer   5 ,;igen    NaCl-Lösung. Man trocknet, dampft ab, wäscht den Rückstand mit einem Gemisch von Diäthyläther-Petroläther   (2:1)    und löst in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei   40     stehen. Man dampft ab, wäscht den Rückstand bis zur Neutralität mit Wasser und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man erhält   Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Ärg-NHNH,    Smp.   1530,      [&alpha;]D20 = -6  in Dimethylformamid.   



   Teilseqenz   Fl   
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl    L-leucinmethylester.    Hydrobromid    (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr)    a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe   HBr   
Man löst 21,0 gZ-Cys(Bzl)-OCP und 12,3 g H-Val   Leu-OMe-HCl    in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und kristallisiert den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp.   1600,    [al    r     =   -280    in Dimethylformamid. das man in 210 ml einer 40%igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.

  Man lässt 1 Stunde bei   25    stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyl äther um. Man erhält H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr,   Smp. 1680, [&alpha;]D20 = + 14  in Dimethylformamid.   



  b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe HBr
Man löst 20 g   Z-Thr-NHNHe    in 350 ml Dimethylformamid, kühlt auf   -20S,    gibt 100 ml einer Lösung von   2n    Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei   -200    werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val Leu-OMe HBr hinzugefügt und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei   0     geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von   EssigsäureÅathylester/NVasser,    wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um.

  Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OMe, Smp.   208 ,      [l] D    =   -27     in Dimethylformamid.



   Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in   200    ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei   0     einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus   MethanollDläthyläther    um. Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)   Val-Leu-OMe    1,3 HBr, Smp.   2020,      C1;D    =   -10     in Dimethylformamid.



   Teilsequenz F2
S-Benzyl-ss-mercaptopropionyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid  (MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe   HCl   
Man löst 43 g   H-Leu-Ser-OMe HCl    und 53 g BOC-Asn-ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus   Methanol    um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn   Leu-S r-OMe, Smp. 1900, [r]4D= -243 in Dimethyl-    formamid. das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei   25S    stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther. Man erhält   H-Asn-Leu-Ser-OMe HCI, Smp. 1800, [n] D20 = -230    in Dimethylformamid.



  b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe    HCI   
Man löst 39,5 g   BOC-Ser-NHNH.    in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf   -200,    gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei   200    werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu   Ser-OMe-HCl    hinzugefügt, danach 16 Stunden bei   0     gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert. Man erhält   BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 1350, [aj 20 -220    in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um.

  Man erhält   H-Ser-Asn-Leu -Ser-OMe       HCI,    Smp. 1550 (Zers.),   [rrlD      =      -150    in Dimethylformamid.



  c)   MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH.2   
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe   HCl    und 13,5 g MCP(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3.5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Äthanol um. Man erhält 21,3 g MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser OMe, Smp.   193 ,    [&alpha;]D20 = -18  in Dimethylformamid.



  das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit   Diäthyläther/Methanol    (1:1) und trocknet das so erhaltene MCP(Bzl) - Ser - Asn-Leu-Ser-NH-NH2, Smp.



  2510, [al D20= -16  in Dimethylformamid.



   Teilsequenz F
EMI6.1     


<tb> ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl <SEP> 
<tb> L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl
<tb> L-valyl-L-leucin-hydrazid <SEP> 
<tb> (MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-NHNH2) <SEP> 
<tb> 
Man löst 16,2 g MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH   NH.    (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid.

 

  kühlt auf   -20 , gibt    40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 14 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten   bei-20     gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24.8 g   H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe.    1,3 HBr zu und rührt 16 Stunden   bsi    250. Danach wird filtriert.



  die Lösung abgedampft und der Rückstand mit heissem Methanol durchgewaschen. Man erhält 24,1 g    MCP(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-   
Val-Leu-OMe, Smp.   2440,      [a] D0      3    -22  in Dimethylformamid, das man bei 600 in 100 ml Dimethylformamid löst, gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei   60      stehen. Das entstandene Octapeptidhydrazid   kristalls    siert aus. Man wäscht mit Diäthyläther, Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid.

  Man erhält 15,1 g Octapeptidhydrazid, Smp.   265 ,      [a]      =      -35     in   Dimethylformamid/Wasscr      (3 :1).    Man suspendiert das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter   Rührcn    und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiatreaktion durch die Lösung geleitet. Man dampft zur Trockne ab und wäscht den Rückstand mit Wasser und Aceton durch.

  Nach Trocknen erhält man
EMI7.1     


<tb> MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val  Leu-NHNH3, Smp.   2780      [rt} 20      = -19     in Dimethylformamid!Wasser (3   1).   



   Teilsequenz ABC    L-Histidyl-e-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-   
L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl    glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl    tert. -butoxy-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamib 3 Acetat  (H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Phe-Gly-Phe-    Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2.    3 CH3COOH) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl-    alanyl-glycyl-L-prolyl-tert.-butyloxy-   
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid  (H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)    Thr-Pro-NH2)   
Man löst 12 g   H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-      NH2    in 100   ml    Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril bei   0-,    gibt 2,1 g N-Hydroxysuccinimid, 8,0 g Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH, 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid zu,

   lässt über Nacht bei   0     stehen, filtriert, verdampft im Vakuum und kristallisiert aus Chloroform. Man erhält Z - Ser - Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr   Pro-NH9-,    Smp.   125-1380,    [&alpha;]D20 =   440    in Dimethylformamid.



   Man löst in 400 ml Dioxan und 400 ml   H.20    und hydriert bei Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkatalysator bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme.



  Man filtriert, dampft im Vakuum ein, löst in Methanol, versetzt mit   Ather    und erhält H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 1300 (Zers.),   [aj 2.D0 - 520 in Dimethylformamid.   



  b)   L-Histidyl-#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-       L-phenyl alanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl- glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl- tert.-butyloxy-L-glutamyl-L-threonyl-   
L-prolinamid Triacetat  (H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe    Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2-    3   CHssCO2H)   
Man löst 9,9 g   Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NHNH,    in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf   -200,    gibt 30 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert. Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei   -200,    gibt 28 ml Triäthylamin und 9,7 g   H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-G1y    Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 zu, rührt 4 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein.



   Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/Methanol   (8 : 2)    auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf
100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. M löst den Niederschlag wiederum in   Dimethylformalr    auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. M erhält Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-PE Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 (Smp. 1350 Zers    [a] ?DO    =   -310    in Dimethylformamid, das man in 500 Essigsäure/Wasser   (8 : 2)    löst. Man lässt 3 Stunden   1    400 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KO Späne.

  Man erhält
H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-    Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH.2   3 CHsCOOH (Smp. 1420 Zers.),   [a)D20=    -45 in Dimethylforman    Teilsequenz    DE
Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin-hydrazid.

  Diacetat  (Tr t-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-    Phe-NHNHe-    2 CH3COOH) a) l-(N-Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto    phanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-   
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)-
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid Diacetat  (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH-Z    Diacetat)   
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf   -20     gibt 100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und   1    darin 72 g   Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2    (Te sequenz E). Anschliessend versetzt man mit 12 ml ter Butylnitrit, lässt 10 Minuten bei   -200    rühren und   triol    35 ml Triäthylamin zu.

  Das so erhaltene Gemisch wi mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu-As Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) u; 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformam vereinigt. Nach 16 Stunden bei   0     wird eingedamp Man löst den Rückstand in Essigester und wäscht n verdünnter Essigsäure und Sodalösung. Nach Ei dampfen des Lösungsmittels verbleibt das
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn    Phe-NHNH-Z    2 CH3COOH vom Smp.   1680,      [e]      ?,O    =   -190    in Dimethylformamid.



  b) Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin-hydrazid Diacetat    (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Ar-Asn-Leu-Asn-Asn   
Phe-NHNH2 . 2 CH3COOH)
Man löst 90 g   Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Le      Asn-Asn-Phe-NHNH-Z 2 CHsCOOH    in 500 ml I methylformamid und hydriert mit 10 g Pd!C   (10S    bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Ab trieren des Katalysators wird das Lösungsmittel   vi    dampft und der Rückstand aus einem Gemisch v   Ather    und Äthanol. enthaltend   1.S    Essigsäure, krist lisiert. 

  Man erhält   Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Le      Asn-Asn-Phe-NlllNH2    . 2   CHsCOOH    vom Smp.   n 1 '      [a] b'0 =      -530    in Dimethylformamid.



   Teilsequenz ABCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-    #-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-phenylalanyl-   
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl-  alanyl-glycyl-L-prolyl-tert.-butyloxy-L-glutamyl    L-threonyl-L-prolinamid.    Hexaacetat  (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-    Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH.2    6   CHoCO.,H)   
Man löst 15,8 g   Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-      Asn-Asn-Phe-NHNH.2 Diacetat    (Teilsequenz DE) in 200 ml Dimethylformamid,

   kühlt auf   -200,    gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml   tert.-Butyl-    nitrit zu und rührt 10 Minuten bei   -200.    Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidacetats in Dimethylformamid zu. rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 00, filtriert und dampft zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und Chloroform, löst in Dioxan/Wasser   (8 : 2),    behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um.

  Man erhält das
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-
Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2.   Acetat,      Smp. 1350 (Zers.), [aJ D20 = -45  in Dimethylformamid,    das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml 80 %iger Essigsäure löst. Man lässt 1 Stunde bei 450 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyläther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyläther. Nach Trocknen über KOH-Späne erhält man das
H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-    Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH-    6   CH.CO,H,      Smp. 1300 (Zers.) [a] 20 - 430 in Essigsäure.   



   Beispiel  ss-Mercaptopropionyl-L-seryl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-
L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-    L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl-    alanyl-L-histidyl-L-lysyl-L-phenylalanyl-
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl- alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid   Hexaacetat.    Hydrat
EMI8.1     


<tb>   (MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser    <SEP> 
<tb> 
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His    Lys-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-   
Thr-Pro-NH2 6 Acetat Hydrat)
Man löst 1,05 g Octapeptid-Hydrazid (Teilsequenz F) in einem Gemisch von 50 ml Dimethylformamid und 1,2 ml 2n Dioxan/HCl bei 200.

  Man gibt 0,116 ml   tert.-Butylnitrit    zu, rührt 10 Minuten bei   -200,    gibt 1,4 ml Triäthylamin und 3,1 g Tricosapeptid-Acetat (Teilsequenz ABCDE) und 5 ml Wasser zu und rührt 16 Stunden bei 00. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton, löst in Trifluoressigsäure, lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft ab und wäscht mit Essigester. So erhält man das rohe Peptidderivat, das man in 100 ml 0,3n Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und anschliessend 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzugibt. Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10   w:    100 cm), die mit einer 0,15n   Ammoniumacetatpuffer-LIjsunge      quilibriert    wurde.



  Die Elution wird mit einem   steigenden      Nor3zentrations-    und pH-Gradient   (0,15n    auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen. die das reine Peptid enthalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet.



  Man erhält
EMI8.2     


<tb>   MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-    <SEP> 
<tb>  Val-Leu-Ser
Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-    His-Lys-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-       Glu-Thr-Pro-NHe    6   CH.3C0.2H    .12.   HeO,      Smp. 2200 (Zers.), [aj D 20 = -57  in Essigsäure ln.   

 

   Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.):   Ala11,      Argn".      Asn@@@,      Cys/2n.!s,      Glu1.,    Gly3.0, His1.1,   Leu.,.s,    Lys0.9,   Nlel.0,    Phe8.0,   Proot,      Ser@.@,      Thr1.1,      Tyr1 .,    Val0.9 (Trp 1,0 durch Spektrophotometrie). 

Claims (1)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    I. Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptidderivates der Formel EMI8.3 <tb> <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <tb> MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-- <SEP> <tb> 11 32 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tyr-Trp-Arg-Asn-L eu-Asn-Asn-Phe-His-Lys-Phe- 22 23 24 23 26 27 28 29 30 31 Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren und Mercaptopropionsäure unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert,
    wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 6 zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls anschliessend die Säureadditionssalze herstellt, indem man das Polypeptidderivat der obigen Formel durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
    II. Verwendung des nach Patentanspruch I hergestellten Polypeptidderivates der Formel EMI8.4 <tb> <SEP> L <SEP> <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> <SEP> 61 <SEP> ; <SEP> a <SEP> 9 <SEP> io <SEP> <tb> MCPSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala- <SEP> <tb> 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Lys-Phe- 22 23 24 2S 26 27 21 29 30 31 Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH, zur Herstellung von Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet,
    dass man das Polypeptidderivat obiger Formel durch Umsetzung mit Schwermetallsalzen in die entsprechenden Schwermetallkomplexe überführt.
    UNTERANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptidderivates nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man aus EMI8.5 <tb> <SEP> Bzl <SEP> Bzl <tb> MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-NHNH2 <SEP> <tb> die beiden S-Benzylreste abspaltet die Thiolgruppen zum Disulfid oxydiert,
    das entstandene EMI9.1 <tb> <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <tb> MPC-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-NHNH2 <tb> nach Überführung in das Azid mit 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn -Asn-Phe- EMI9.2 <tb> <SEP> BOC <SEP> OT <tb> <SEP> 19 <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 1 <SEP> 29 <tb> His-Lys- <SEP> Phe <SEP> -S <SEP> er <SEP> -Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu <SEP> <tb> 30 31 Thr-Pro-NH2 kondensiert und die Schutzgruppen des erhaltenen geschützten Polypeptidderivates abspaltet.
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