CH529104A

CH529104A - Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate

Info

Publication number: CH529104A
Application number: CH1653068A
Authority: CH
Inventors: Stephan Dr Guttmann; Janos Dr Pless; Sandrin Edmond; Pierre-Alin Dr Jaquenoud; Bossert Heinz; Willems Hans
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1968-11-06
Filing date: 1968-11-06
Publication date: 1972-10-15

Description

Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bisher unbekannter Polypeptidderivate der allgemeinen Formel
EMI1.1
10 11 i2 13 1 15 16 17 18 zu 19 20 21 22 23 24 Ser-A1a-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-A sn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-
25 26 27 28 29 70 3). 32 Nle - Gly- Phe -Gly - Pro-Glu-Thr -Pro-Tu?l , worin R für eine Alkyl-, Alkenyl-, gegebenenfalls substituierte Aralkyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe steht, ihrer therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe. Als R kommen beispielsweise der Äthyl-, Allyl-, Phenyl-, p-Nitrophenyl-, p-Chlorphenyl-, p-Bromphenyl-, p-Methoxyphenyl-, Azobenzol- oder der p-Methoxy-Azobenzolrest in Frage.

Die erfindungsgemässen Polypeptidderivate zeichnen sich durch Beständigkeit gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen aus. Ein weiterer Vorteil ist der bekanntlich oxydationsbeständige Norlencin-Rest in Stellung 25.

Die bisher unbekannten Polypeptidderivate können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden, indem man entsprechende zu ihrem Aufbau nötige Verbindungen unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese unter Beibehaltung der
EMI1.2
in Stellung 1, worin R obige Bedeutung hat, die Schutzgruppen abspaltet,

die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 7 zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt. Die Einführung der im Endprodukt am endständigen L-Hemicystin-Molekül gewünschten Gruppe der allgemeinen Formel
EMI1.3
worin R obige Bedeutung hat, kann in einer beliebigen Stufe vor der letzten Stufe erfolgen. In der letzten Stufe sind jedoch Methoden zu verwenden, bei denen Racemisierung nicht auftritt oder gering gehalten werden kann, vorzugsweise die Azid- oder die aktivierte Ester-Methode, wobei zur Aktivierung vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid Verwendung findet. Üblicherweise werden die beim Aufbau von cysteinhaltigen Peptiden zum Schutz der SH-Gruppen verwendeten Benzylreste am Ende der Synthese durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten.

Es wurde nun gefunden, dass die Abspaltung der Benzylschutzgruppen und die Herstellung der (Cys)S-S(Cys)-Bindung vor der letzten Stufe zu besonders guten Ausbeuten an Endprodukt führt.

Beim Aufbau der neuen Polypeptidderivate hat sich für die Blockierung der y-Carboxygruppe, beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A, die tert.-Butyloxygruppe bewährt, doch können auch andere Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Äthoxy-, die tert.-Amyloxy-, die Amidoder die Benzylgruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert.-butoxy-, die Carbo-tert.-amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrobenzoxycarbonylgruppe oder die 2-(Isopropyloxycarbonyl)-3,4,5,6- tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.

Die neuen Polypeptidderivate lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxyoder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzoloder Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polychloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, in Frage. Als Schwermetallkomplex kommen z.

B. diejenigen vom ZinkO+O+ in Frage.

Die Ausgangsprodukte zur Herstellung der neuen Polypeptidderivate können, sofern sie bisher nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.

Die neuen Verbindungen stellen ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel, senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.

Es ist somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels erwünscht ist, z. B.

Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des endogenen Thyreocalcitonins infolge Ausfalls von Schilddrüsengewebe, Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen.

Die neuen Verbindungen sind indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B.

postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.

Die biologische Prüfung der neuen Verbindungen ergab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450 MRC-Einheiten/mg Peptid. Die erforderliche Tagesdosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20 mE bis 10 E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht. Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m. verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E.

Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.

Die neuen Verbindungen können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.

Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.

Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutische wertvolle Stoffe enthalten. Die neuen Verbindungen können auch in Form von Depotpräparaten verabreicht werden.

Die neuen Verbindungen und ihre Salze können auch als Zwischenprodukt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.

Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Benzyloxycarbonyl
Bzl = Benzyl
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe = Methoxy
OEt = Äthoxy
NO2 = Nitro Ser = L-Seryl
Asn = L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala = L-Alanyl
Tyr = L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophanyl
Arg = L-Arginyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu = L-Glutamyl
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly = Glycyl
Nle = L-Norleucyl
Cys = L-Cysteinyl
OSu = Oxysuccinimid
EOC = Äthoxycarbonyl
In den nachfolgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Teilsequenz A L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-y-tert.-butyloxy-L-glutamyl-
L-threonyl-L-prolinamid (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)
Thr-Pro-NH2)
Man löst bei -5" 134 g Z-Thr-NH-NH2 in 21 1n Salzsäure und versetzt mit 0,55 1 in Natriumnitrat. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g H-Pro-NH2 Hydrochlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Äthylacetat bei 20 im Vakuum und lässt über Nacht bei 25 stehen.

Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat gelöst, die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Calciumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Man verdampft im Vakuum, löst in warmem Äthylacetat und kühlt ab. Man erhält Z-Thr-Pro-NH2; Smp. 148", [a]D20 = -72" in 95% Essigsäure. Man löst hierauf 90 g Z-Thr-Pro-NH2 in 2 1 Dioxan und 260 ml In Salzsäure und hydriert bei 20 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Man filtriert, verdampft die Lösung im Vakuum, wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält H-Thr-Pro-NH2 HCl; Smp. 216 , [a]D20 = 640 in 95% Essigsäure.

Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml Wasser und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu (OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Man lässt über Nacht bei 20 stehen, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther. Man erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 65" (Zers.), [a] = - 18 in Dimethylformamid.

Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 1 Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 20 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB )-Thr-Pro-NH2 erhalten wird; Smp. 65" (Zers.), [a]D20 = - 280 in Dimethyl- formamid.

Dieses wird in 700 ml Dimethylformamid bei 0 gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH, 18 g N-Hydroxysuccinimid und 32 g Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt, über Nacht bei 20 stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Äthylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lösung mit Wasser, verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/Äthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro-Glu (OTB)-Thr-Pro-NH2; Smp. 1200 (Zers.), [a]D20 = -66" in Dimethylformamid, das man in 1500 ml Dioxan und 300 ml Wasser löst. Man gibt 30 g Palladiumkohle (10%) zu und hydriert bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme.

Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den Rückstand aus Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro- NH2; Smp. 153 , [a]D2 =-79 in Dimethylformamid.

Teilsequenz B
Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin (Z-Nle-Gly-OH)
Man löst 31,6 g H-Gly-Oh in 420 ml in NaOH, gibt 840 ml Tetrahydrofuran zu, versetzt anschliessend mit 130 g Z-Nle-ONP, schüttelt, bis die Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 25 stehen. Dann wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhaltene wässrige Lösung mit in NaOH auf pH 9 gestellt, zweimal mit Äther extrahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert, mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wäscht man mit Wasser und 30%iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein.

Den Rückstand verreibt man mit Äther, lässt 2 Stunden bei -20" kristallisieren. Man erhältZ-Nle-Gly-OH; Smp. 138 , ]D20 = 40 in Dimethylformamid.

b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-Oh in 1000 ml 4n HBr/Eisessig, lässt 50 Minuten bei 25 , verreibt mit Äther, filtriert Kristalle ab und wäscht gut mit Äther. Man erhält HBr-H-Nle-Gly-OH, [a]D20 = + 24,7 in Essigsäure (95 %).

Man löst 84 g HBr R-Nle-Gly-OR in 240 ml Wasser, versetzt mit 152 ml 4n NaOH, 800 ml Tetrahydrofuran und 91 g Z-Gly-ONP. Man schüttelt 1 Stunde bei 25 und lässt dann 2 Tage bei 25 stehen. Man konzentriert im Vakuum auf 500 ml, stellt mit in NaOH auf pH 9 und extrahiert mit Äther. Die wässrige Phase wird mit in Salzsäure angesäuert, dann zweimal mit Essigester extrahiert. Man wäscht mit Wasser, 30 %iger Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Man erhält Z-Gly-Nle-Gly-OH; Smp. 155", [a]D20 = 5,60 in Dimethylformamid.

c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycin (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml 4n HBr/ Eisessig, lässt 50 Minuten bei 25 stehen, dampft im Vakuum ein, verreibt mit Äther, filtriert, wäscht gut mit Äther, trocknet im Vakuum, löst in 280 ml Wasser, etwa 650 ml Dimethylformamid, gibt 66,5 ml Triäthylamin zu und versetzt mit der Lösung des Azids, die wie folgt erhalten wird:

Man kühlt 940 ml 1n Salzsäure auf -5 , gibt 96 g Z-Ser- NH-NH2 zu und tropft dann bei 5 360 ml in Natriumnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei -5", überschichtet mit etwa 600 ml Essigester von 0 , stellt unter Zugabe von festem Natriumcarbonat auf pH 8,5, trennt die Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknet die Lösung über Natriumsulfat und filtriert. Die Reaktionslösung dampft man im Vakuum ein, versetzt den Rückstand mit 600 ml Wasser, säuert an, extrahiert mit Äthylacetat, wäscht mit Wasser und 30 %iger Kochsalzlösung, kühlt auf 0 , filtriert Kristalle ab.

Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH; Smp. 210 (mit Zers.), [a]D20 = 80 in Dimethylformamid.

Teilsequenz C Na ,amid Ditrityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanin hydrazid RCl [(Trt)-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 - HCI] a) Z-Arg(NO2)-Phe-OMe
51,8 g H-Phe-OMe RCl werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses Öl erhalten wird.

67,6 g Z-Arg(NO2)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit 41,2 g H-Phe OMe versetzt. Danach wird auf -20" abgekühlt und eine Lösung von 43,4 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Eisester gelöst und hierauf in der Kälte mit ln Natronlauge, Wasser, in Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäure äthylester-Phase wird vollständig eingedampft.

Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man ZArg(NO2)-Phe-OMe; Smp. 131-133", [a120 = 70 in Methanol, -4" in Dimethylformamid.

b) H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 H2O 1,2 HBr
20 g Z-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 50 ml Eisessig gelöst und unter leichtem Kühlen 50 ml 40 %ige Bromwasserstoffsäure in Eisessig zugesetzt. Danach lässt man das Ganze unter zeitweiligem Umschütteln während 1 Stunde bei 20 stehen. Nach vollständigem Eindampfen wird der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und zweimal mit Äther gewaschen.

Die wässrige Phase wird vollständig eingedampft und der Rückstand aus Methanol/Äther umkristallisiert. Smp. 165 bis 167 mit Zers., [a]D20 = + 180 in Methanol, + 14" in Dimethylformamid.

c) Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe
46,1 g H-Arg(NO2)-Phe-OMe 0,5 H2O 1,2 HBr werden in 100 ml Wasser gelöst, hierauf erwärmt und anschliessend abgekühlt. Nach Zugabe von Chloroform und Eisessig wird mit Ammoniak auf pH 9 gestellt. Die Chloroformphase wird noch einmal mit Wasser gewaschen, anschliessend über Natriumcarbonat getrocknet und filtriert. Dem Filtrat wird eine Lösung von 44,5 g Z-His(Z)-OH, 12,1 g Hydroxysuccinimid in 200 ml Acetonitril und 100 ml Pyridin zugesetzt, danach das Ganze auf -20" abgekühlt und mit einer Lösung von 21,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 70 ml Acetonitril versetzt. Anschliessend wird unter zeitweiligem Rühren 4 Stunden im Eiskasten stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft.

Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend folgendermassen gewaschen: 10 %ige Kaliumcarbonatlösung (pR X 10), Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Wasser, gesättigte Kochsalzlösung, Schwefelsäure (pH 3), Wasser, Kochsalzlösung. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft, wobei ein hellbeiger Schaum erhalten wird. Dieser Schaum wird je zweimal in wenig Methanol gelöst und mit Äther gefällt. Die Ätherphasen werden abdekantiert und der Niederschlag getrocknet. Man erhält Z-His(Z)-Arg(NO2) Phe-OMe (amorpher Schaum), [a]D20 = -8 in Methanol, 0 in Dimethylformamid.

d) H-His-Arg-Phe-OMe-4 HCI
25 g Z-His(Z)-Arg(NO2)-Phe-OMe werden in 800 ml Eisessig gelöst. Danach werden 10 g 10% Palladium auf Aktiv kohle in 200 ml ln Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach 51/2 Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80% der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei H-His-Arg-Phe-OMe-4 HCI in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.

e) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe RCl
21,5 g H-His-Arg-Phe-OMe-4 HCI werden in 100 ml Pyridin und etwa 100 ml Dimethylformamid gelöst. Bei etwa + 5 wird bis pH 9 Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 29 g Tritylchlorid in 300 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls wieder mit Tri äthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig ln Salzsäure auf pH 4 gestellt. Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein.

Der Rückstand wird mit Äther versetzt und vom Äther anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl erhalten wird.

f) Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 HCl
17 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-OMe HCl werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 40 ml Hydrazinhydrat versetzt.

Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen.

Man dampft ein, löst-den Rückstand in Chloroform und wäscht zweimal mit Wasser. Die Chloroformphase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert; er besteht aus Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 HCI; Smp. 158 , [a]D18 = in Dimethylformamid.

Teilsequenz D l-(H-Asparaginyl-L4eucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl- L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid Trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CR1COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl)-2-benzyl- oxycarbonyl-hydrazid (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei -5" 26 ml
Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NH-NH2 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter Phosphorigersäure wird getrocknet und eingedampft.

Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 117 [a]D20 = -5" in Dimethylformamid.

b) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (B OC-Asn-Phe-NH NH
Man löst 41 g BOC-Phe-NH-NH-Z in 400 ml Trifluor essigsäure und lässt 1 Stunde bei 20 stehen. Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NH-NH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp. 191?, [a]D20 = + 26,40 in Dimethylformamid. Diese Substanz wird zusammen mit
35 g BOC-Asn-ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei 20 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nach einander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [aj020 = 180 in Dimethylformamid.

c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 26 g BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Tri fluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 20 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in 100 ml Dimethylformamid mit 17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 20 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essig ester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z; Smp. 240 , [a]D20 = -28" in Dimethylformamid.

d) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-asparaginyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml
Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 20 stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12 g BOC-Leu-ONP und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml
Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 20 wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn Phe-NH-NH-Z vom Smp. 210 , [a]D22 = 34" in Dimethylformamid.

e) 1 -(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-leucyl- L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy- carbonyl-hydrazid (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 20 stehen.

Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Äther kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und 25 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 20 wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter Phosphorigersäure gewaschen. Man erhält BOC Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp. 250 (Zers.), [a]DZO = -340 in Dimethylformamid.

f) 1-(1-Asparaginyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl- alamin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid trifluoracetat (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat)
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 200 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei 20 stehen. Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Äther kristallisiert. Man erhält H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe NH-NH-Z-Trifluoracetat; Smp. 242", [a]D20 = -22" in Dimethylformamid.

Teilsequenz E tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-L-arginin-hydrazid (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NH-NH2 - CH3COOH) a) N-tert. -Butyloxycarbonyl-L-tryptophanyl-(guanido)-N- nitro-L-argininmethylester (BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 35 g H-Arg(NO2)-OMe RCl, 63 g BOC Trp
OCP und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylform amid auf und lässt 16 Stunden bei 20 stehen. Nach Ver dampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essig ester aufgenommen und mit verdünnter Schwefelsäure ge waschen. Man engt etwas ein und fällt mit Äther aus. Dabei kristallisiert BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe vom Smp. 1300, [a]D20 = -22" in Dimethylformamid.

b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl (guanido)-N-nitro-argininmethylester (BOC-Tyr-Trp
Arg(NO2)-OMe)
Man löst 15 g BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe in 80 ml Sn methanolischer Salzsäurelösung auf und lässt 1 Stunde bei
Zimmertemperatur stehen. Nach Verdampfen des Lösungs mittels und Behandeln mit Äther verbleiben 13 g H-Trp
Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp. 1200, [a]D20 = -90 in Dimethylformamid. Dieses Dipeptid wird zusammen mit 14 g BOC-Tyr-OCP und 8 g N-Methylmor pholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden
Stehen bei 20 wird das Lösungsmittel verdampft und der
Rückstand in Essigester aufgenommen.

Nach Waschen mit verdünnter Phosphorigersäure und Einengen des Lösungs mittels kann man mit Hilfe von Äther BOC-Tyr-Trp-Arg (NO2)-OMe isolieren; Smp. 1300, [a]D20 = -11" in
Dimethylformamid.

c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto- phanyl-(guanido)-N-nitro-L- argininmethylester (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in
130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 25" stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rück stand mit Dimethyläther, filtriert ab, löst in 100 ml Dimethyl formamid auf und versetzt mit 8,0 g BOC-Ala-OCP und
3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei 25 gibt man
500 ml Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein. Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe; Smp. 1200 (Zers.), [a]D20 = -12" in Dimethylformamid.

d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl L-tryptophanyl-(guanido)-N-nitro-L-argininmethylester (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst 12,3 g BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 100 ml Sn methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und 8,5 g BOC-Ser-N3, lässt 16 Stunden bei 0 stehen, gibt 500 ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefe Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe; Smp. 208 , [a]D20 = -27" in Dimethylformamid.

Man löst 20 g von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigester (1:1) auf, leitet während 1 Stunde bei 0 einen Strom gasförmigen Bromwasserstoffs ein, dampft anschliessend ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol/Diäthyläther um.

Man erhält H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe 1,3 HBr; Smp. 202", [a]n20 = 100 in Dimethylformamid.

c) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH
Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe. 1,3 HBr in 1800 ml Methanol, gibt 900 ml 2n Natronlauge zu, lässt
1 Stunde bei 25 stehen, gibt 240 ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden bei 0stehen. Man filtriert die ausgeschiedene kristalline Masse ab, wäscht diese zuerst mit ln Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 50 im Hochvakuum. Man erhält das H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH; Smp. 219 , [am20 = 530 in ln Ammoniak.

Teilsequenz F2 tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-seryl-
L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-S er-NH-NH2) a) H-Asn-Leu-Ser-OMe RCl
Man löst 43 g H-Leu-Ser-OMe HCI und 53 g BOC-Asn ONP in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol um. Man erhält 51,6 g BOC-Asn-Leu-Ser-OMe; Smp. 1900, [a]D20 = -24" in Dimethylformamid, das man in 500 ml einer 4n Lösung von Salzsäure in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Diäthyläther.

Man erhält H-Asn Leu-Ser-OMe HCI; Smp. 1800, [a]D20 = -23" in Dimethylformamid.

b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe RCl
Man löst 39,5 g BOC-Ser-NH-NH2 in 500 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 , gibt 200 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 werden 40 ml Triäthylamin und 38,0 g H-Asn-Leu-Ser-OMe HCl hinzugefügt, danach 16 Stunden bei 0 gerührt, zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther umkristallisiert.

Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe; Smp. 135 , [a]D20 = 220 in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n Salzsäurelösung in Methanol löst. Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält H-Ser-Asn Leu-Ser-OMeRCl; Smp. 155 (Zers.), [am20 = 150 in Dimethylformamid.

c) B OC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe HC1 und 18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 10 ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25" stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25,1 g BOC-Cys (Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe; Smp. 182", [a]D20 = -17" in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200 ml Dimethylformamid löst.

Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu, lässt 16 Stunden bei 30 stehen, fällt mit Diäthyläther, wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2; Smp. 224", [a]D20 = -13" in Dimethylformamid.

Äthoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucin
EMI6.1

Man löst 18,4 g B OC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH- NH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf 200, gibt 40 ml einer 2n Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei 200 gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl) Val-Leu-OH (Teilsequenz F1) zu und rührt 16 Stunden bei 25". Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit 1n Essigsäure durchgewaschen.

Man erhält B OC-eys(Bzl)-S er-Asn-Leu-S er-Thr-Cys (Bzl)-Val- Leu-OH; Smp. 217 , [a]D20 = -270 in Dimethylformamid.

Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml getrocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit 1n Essigsäure und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man BOC Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH; Smp. 248 (Zers.), [a]D20 = M1 0 in Dimethylformamid/Wasser (3 : 1).

Man löst das so erhaltene Nonapeptid in 5000 ml 0,01n Ammoniak auf, gibt unter Rühren 1n Wasserstoffperoxyd bis zur negativen Nitroprussiatreaktion zu, dann noch 200 ml
EMI6.2

<tb> Eisessig, <SEP> filtriert <SEP> und <SEP> lyophilisiert. <SEP> Man <SEP> erhält <SEP> BOC-Cyrs-Ser
<tb> Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH; <SEP> Smp. <SEP> 238 <SEP> (Zers),
<tb> [a]n20 = 180 in Dimethylformamid/Wasser (3 1), das man in 300 ml Trifluoressigsäure löst, lässt 30 Minuten bei 25" stehen, dampft ab, wäscht den Rückstand mit Essigester und löst ihn in 300 ml Dimethylformamid auf.

Zu dieser Lösung gibt man 30 g Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester - der wie nachstehend beschrieben hergestellt ist - sowie 14 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25 stehen, dampft ab und wäscht den Rückstand mit Chloroform. Man löst in 300 ml Dimethylformamid, gibt 50 ml Wasser und 50 g DOWEX-50 hinzu, rührt 15 Minuten, filtriert, wäscht den Harz mit Dimethylformamid und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand zuerst mit Chloroform und anschliessend mit Essigester und trocknet. Man
EMI6.3

<tb> erhält <SEP> das <SEP> EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH;
<tb> Smp. 263", [a]D20 = 210 in Dimethylformamid/Wasser (3:1).

Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester
Man löst 200 g p-Nitrophenol und 113 ml Pyridin in 1200 ml Essigester, kühlt auf 0 , gibt unter Rühren 156 ml Chlorameisensäureäthylester zu, rührt noch 30 Minuten bei 0 , wäscht mit Wasser, trocknet über Na2SO4 und dampft zur Trockne ein. Man löst den Rückstand in Diäthyläther und kristallisiert den Kohlensäure-p-nitrophenyl-äthylester durch Zugabe von Petroläther; Smp. 65".

Teilsequenz ABC Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin amid Triacetat (H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle- Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 .3 CH3COOH) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl- glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid Tetra- hydrochlorid (H-S er-Gly-Nle-Gly-Ph e-Gly-Pro-Glu- Thr-Pro-NH2 4 HC1)
Man löst 12 g H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 100 ml Dimethylformamid und 20 ml Acetonitril bei 0 und gibt 2,1 g Hydroxysuccinimid, 8,0 g Z-Ser-Gly-Nle Gly-OH, 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt über Nacht bei 0 stehen,

abfiltriert, verdampft im Vakuum und kristallisiert aus Chloroform. Man erhält Z-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2; Smp. 125-138 , [a]D20 = -440 in Dimethylformamid.

Man löst in 400 ml Dioxan und 40Q ml HCl/Dioxan und hydriert bei Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkatalysator und Säure bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Man filtriert, dampft im Vakuum ein, löst in Methanol, versetzt mit Äther und erhält H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu- Thr-Pro-NH2 4 HCI; Smp. 1300 (Zers.), [a]D20 = -520 in Dimethylformamid.

b) Nim-Trityl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl- L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl - L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid#triacetat (H-His(Trt) -Arg-Phe-S er-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro Glu-Thr-Pro-NH2 .3 CH3COOH)
Man löst 9,9 g Trt-His(Trt)-Arg-Phe-NH-NH2 RCl (Teilsequenz C) in 100 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 , gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20 , gibt 28 ml Triäthylamin und 10,0 g H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe- Gly- Pro Glu-Thr-Pro-NH2 HCl zu, rührt 4 Stunden bei 0 , filtriert und dampft zur Trockne ein.

Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/Methanol (8 2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Neutralität, trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man löst den Niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf und fällt durch Zugabe von Diäthyläther. Man erhält Trt His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr- Pro-NH2 [Smp. 168 (Zers.), iD20 = 430 in Dimethylformamid], das man in 500 ml Essigsäure/Wasser (8 : 2) löst.

Man lässt 3 Stunden bei 40 stehen, dampft ein, wäscht den Rückstand in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum über KOH-Spänen. Man erhält H-His(Trt)-Arg-Phe-Ser Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2!3 CH3COOH; Smp. 182" (Zers.), [a]D20 = -56" in Essigsäure.

Teilsequenz DE N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-
L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalamin-hydrazid di- acetat (B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn- Phe-NH-NH2 - 2 CH3COOH) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl- L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl- L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-b enzyl oxycarbonyl-hydrazid-diacetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf -20 , gibt
100 ml 2n Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 68 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NH-NH2 acetat (Teilsequenz E).

Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert.-Butylnitrit, lässt
10 Minuten bei 200 rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in
150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei 0 wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester/Butanol und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Ammoniaklösung. Nach Eindampfen des Lösungsmittels verbleibt das B OC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z CH3COOH vom Smp. 175o, [a]D20= - 19,50 in Dimethylformamid.

b) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl- L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L4eucyl L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin hydrazid di- acetat (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn Phe-NH-NH2 2 CH3COOH)
Man löst 90 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NH-NH-Z 2 CH3COOH in 500 ml Dimethylformamid und hydriert mit 10 g Pd/C (10%ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol kristallisiert.

Man erhält BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe- NH-NH2-2 CH3COOH vom Smp. 265 , [or]D20 = -570 in Dimethylformamid.

Teilsequenz ABCDE
L-Seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl
L-phenylalanyl-L-histidyl-L-arginyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl
L-prolinamid hexatrifluoracetat ( H - S er-Ala-Tyr-Trp-Arg
Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 6 CF3C02H)
Man löst 15,2 g BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu- Asn-Asn-Phe-NH-NH2 diacetat (Teilsequenzen D, E) in 200 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 , gibt 15 ml Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butylnitrit zu und rührt 10 Minuten bei -20". Man gibt 14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18,6 g des in Teilsequenz A, B,

C erhaltenen Tridecapeptidacetats zu, rührt das erhaltene Gemisch 16 Stunden bei 0 , filtriert und dampft zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Diäthyläther und mit Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8 : 2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat Form), dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Wasser um. Man erhält das Boc-Ser-Ala-Tyr-Trp Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His(Trt)-Arg-Phe-Ser-Gly Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 - Acetat; Smp. 145" (Zers.), [a]D20 = -67" in Essigsäure, das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml Trifluoressigsäure löst.

Man lässt 1 Stunde bei 25 stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von 1000 ml Diäthyläther. Man filtriert, löst den Rückstand in Dimethylformamid und fällt mit Diäthyl äther. Nach Trocknen über KOH-Spänen erhält man das H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 - 6 CF3CO2H; Smp. 1300 (Zers.), [a]D20 = 42" in Essigsäure.

Beispiel 1 Äthoxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl-L-asparaginyl L-leucyl-L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucyl-
L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl- alanyl-glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl-L-prolin-
EMI7.1

<tb> amid <SEP> Rexaacetat <SEP> Octahydrat <SEP> (EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser Thr-Cys-Val-Leu-S er-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-
Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-
Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 Rexaacetat Octahydrat)
Man löst 1,0 g Nonapeptid (Teilsequenz F) in 10 ml Dimethylformamid, gibt 1,5 g N-Hydroxysuccinimid und 0,52 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 6 Stunden bei 25 ,

filtriert und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und Diäthyläther und trocknet.
EMI7.2

<tb>

Man <SEP> erhält <SEP> EOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu O-Su; Smp. 242", das man in 10 ml Dimethylformamid löst.

Zu dieser Lösung gibt man 3,1 g Tricosapeptid-Hexatrifluoracetat (Teilsequenz A, B, C, D, E), 0,4 ml Triäthylamin sowie 1,2 g N-Hydroxysuccinimid und rührt 16 Stunden bei 250. Man dampft zur Trockne ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe, geschützte Dotriacontapeptid, das man in 100 ml 0,3 Essigsäure löst, mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und gibt 50 ml 0,6n Ammoniumhydroxid hinzu.

Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet.die erhaltene Lösung auf eine C'arboxymethylcellulosesäule (10 x 100 cm), die mit einer 0,15n Ammoniumacetatpufferlösung equilibriert wurde. Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrations- und pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6,5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt.

Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid enthalten, werden dreimal gefriergetrocknet, der Rückstand wird mit Äthanol und anschliessend mit Diäthyläther gewaschen und über Kalium
EMI8.1

<tb> hydroxid <SEP> im <SEP> Hochvakuum <SEP> getrocknet. <SEP> Man <SEP> erhält <SEP> EOC-Cyr
<tb> Ser-Asn-Leu-S <SEP> er-Thr-Cy's-Val-Leu-S <SEP> er-Ala-Tyr-Trp <SEP> -Arg Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 6 CH1CO2H 8 H2O; Smp.

240 (Zers.), [a]D20 =-56" in Essigsäure ln. Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.): Ala1,1, Arg2,0, Asp3,9, Cys/21,6, Glu1,2, Gly3,0 Hisl,l, Leu2,9, Nlet,O, Phe3,0, Pro2,1, Ser3,8, Thrs,9, Tyr1,0, ValO,g (Trpl,o durch Spektrophotometrie).

Claims

PATENTANSPRÜCHE

I. Verfahren zur Herstellung von Polypeptidderivaten der allgemeinen Formel EMI8.2 13 1 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly 27 28 29 30 31 32 Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-IYH2, worin R für eine Alkyl-, Alkenyl-, gegebenenfalls substituierte Aralkyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe steht, und ihrer therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende zu ihrem Aufbau nötige Verbindungen unter Bildung von von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden,

zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese unter Beibehaltung der EMI8.3 in Stellung 1, worin R obige Bedeutung hat, die Schutzgruppen abspaltet, die Mercaptogruppen nach Bildung der Teilsequenz 1 bis 7 zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls anschliessend die Säureadditionssalze herstellt, indem man die Polypeptidderivate der obigen Formel durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

II. Verwendung der nach Patentanspruch I hergestellten Polypeptidderivate der Formel EMI8.4 19 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly- 27 28 29 30 31 32 Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-E=H2 zur Herstellung von Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Polypeptidderivate der obigen Formel durch Umsetzung mit Schwermetallsalzen in die entsprechenden Schwermetallkomplexe überführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Polypeptidderivaten nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der allgemeinen Formel EMI8.5 worin R für eine Alkyl-, Alkenyl-, gegebenenfalls substituierte Aralkyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylt gruppe steht, nach vorheriger Aktivierung nach der Azidmethode oder der Methode der aktivierten Ester mit 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg- 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Ele-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 kondensiert. nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man 2.

Verfahren zur Herstellung von Polypeptidderivaten Verbindungen der allgemeinen Formel EMI9.1 worin R für eine Alkyl-, Alkenyl-, gegebenenfalls substituierte Aralkyl- oder eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe steht, nach Umwandlung in das Oxysuccinimid mit 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2° 21 22 23 H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Prc-Glu-Thr-Pro-NH, kondensiert.

3. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidderivates nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man EMI9.2 nach vorheriger Aktivierung nach der Azidmethode oder der Methode der aktivierten Ester mit 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-A sn-Leu-Asn-Asn-Phe- 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 His-Arg-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-G1y-Pro-G1u-Tlir-Pro-NH2 kondensiert.

4. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidderivates nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man EMI9.3 nach Umwandlung in das Oxysuccinimid mit 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe- 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 kondensiert.