CH617964A5

CH617964A5 - Process for the preparation of new aminocyclitol antibiotics

Info

Publication number: CH617964A5
Application number: CH193476A
Authority: CH
Inventors: Sol Jacob Daum; Robert Lagrone Clarke
Original assignee: Sterling Drug Inc
Priority date: 1975-02-18
Filing date: 1976-02-17
Publication date: 1980-06-30
Also published as: PT64816B; FR2301265A1; DK143111B; NO146811B; NO803185L; NO148298B; NO760472L; IE42807B1; JPS51108041A; IN147046B; NO146811C; AR221027A1; PT64816A; GB1529376A; NO820574L; EG12994A; IE42807L; NO147308B; NL7601655A; NZ180036A

Description

Cette invention concerne un procédé de préparation d'anti-20 biotiques du type amino-cyclitol de formule I

_ch20-c-nhch2 (ch2)nch0hc0-0-n if dans laquelle Ri, R3 et Rs représentent chacun un atome d'hydrogène, ou bien l'un de Ri, R3 et Rs représente un grou- 60 pement œ-amino-a-hydroxy-alcanoyle inférieur de formule N2NCH2(CH2)„ CHOHCO— dans laquelle n est égal à 0 ou à 1, les autres groupements Ri, R3 et Rs étant des atomes d'hydrogène; R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy; Rs représente un atome d'hydrogène, un grou- 65 pement hydroxy ou un atome d'halogène (comprenant le fluor, le chlore, le brome et l'iode), sauf que lorsque R2 est un atome d'hydrogène, Rs n'est pas un groupement hydroxy eis par rapport aux groupements amino en position 1 et 3; et Rr> et R7 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle.

On prépare des composés de formule I où Ri, R3 et Rs sont des atomes d'hydrogène, le procédé de l'invention qui se fonde sur la méthode décrite dans le brevet des E.U.A.

no. 3 669 838 de Shier et al. Le procédé de l'invention consiste à cultiver un milieu nutritif contenant des glucides, une source d'azote assimilable, des sels essentiels et un dérivé d'aminocy-clitol ajouté de formule:

617 964

4

dans laquelle Ri, R2, R3 et Rs ont les significations données ci-dessus, et où Ri et R3 peuvent en plus représenter une liaison simple réunissant les deux atomes d'azote des groupements amine, en présence d'un micro-organisme mutant approprié, ledit micro-organisme mutant étant incapable de synthétiser ledit aminocyclitol lui-même mais pouvant incorporer ledit aminocyclitol dans le composé de formule I, particulièrement un mutant de Micromonospora purpurea désigné par Micro-

où n a la signification donnée précédemment. Puis on soumet le mélange résultant des composés de formule I où l'un des groupements Ri, R3 et Rs est le groupement co-(N-benzyloxy-carbonyl)amino-a-hydroxy-alcanoyle inférieur:

ch20-c-nhch2(ch2)nchohco-

les deux autres étant des atomes d'hydrogène, à l'hydrogèno-lyse du groupement benzyloxycarbonyle par l'hydrogène sur un catalyseur.

Comme indiqué précédemment, quand on utilise comme substance de départ dans la réaction d'acylation un composé de formule I où chacun des groupements Ri, R3 et Rs est un atome d'hydrogène, on obtient un mélange des trois mono-amides isomères possibles dans lesquels l'un des atomes d'hydrogène des groupements amine, Ri, R3 ou Rs, est remplacé par le groupement a)-(N-benzyloxycarbonyl)amino-a-hydroxy-alcanoyle inférieur. Quand on désire une caractérisa-tion et une étude séparées de ces produits, ils doivent évidemment être séparés l'un de l'autre. On peut effectuer la réaction d'acylation en faisant réagir des quantités équivalents, en moles, du composé de formule I et de l'ester de N-hydroxysuc-cinimide, de préférence à une température de -10°C à 4- 10°C, et dans une solution aqueuse d'un solvant organique inerte, par exemple le tétrahydrofuranne, le dioxanne, l'éther dimé-thylique de l'éthylèneglycol, le diméthylacétamide, le dimé-thylformamide, l'éther diméthylique du propylèneglycol, etc..

On peut effectuer l'hydrogénolyse du groupement benzyloxycarbonyle sur un catalyseur de palladium sur charbon dans un solvant organique miscible à l'eau inerte, par exemple le méthanol, l'éthanol, le dioxanne, le tétrahydrofuranne, l'éther diméthylique de l'éthylèneglycol, l'éther diméthylique du propylèneglycol, etc..

Les aminocyclitols de formule II dans laquelle Ri, R2 et R3

monospora purpurea ATCC 31 119 et à séparer le produit du milieu de culture. On produit les composés de formule I dans laquelle Ri et R3 sont tous deux un atome d'hydrogène quand on utilise l'aminocyclitol de formule II où Ri et R3 représen-s tent une liaison simple. Selon le mode opératoire décrit par Shier et al., la nature du mutant est telle qu'il est incapable de synthétiser la sous-unité aminocyclitol à partir d'un milieu nutritif pour ainsi produire l'antibiotique, mais qu'il peut incorporer cette dernière dans un antibiotique quand on ajoute de l'aminocyclitol au milieu nutritif.

Les composés de formule I, où l'un des groupements Ri, R3 et Rs représente un groupement (o-amino-a-hydroxy-alca-noyle inférieur, sont préparés par un procédé en principe décrit par Konishi et al. dans le brevet des E.U.A.

no. 3 780 018 qui consiste à faire réagir le composé de formule I où chacun des groupements Ri, R3 et Rs est un atome d'hydrogène, avec un ester de N-hydroxy-succinimide de formule:

iv sont des atomes d'hydrogène et Rs est un atome de fluor ou d'iode, sont des nouveaux composés et peuvent être préparés comme décrit ci-dessous. D'autres aminocyclitols de formule II, qui sont également utiles dans la mise en œuvre de la présente invention, sont des composés connus. Ce sont:

Le sulfate de streptamine [Peck et al., J. Am. Chem. Soc. 68, 776 (1946)];

Le dichlorhydrate de 2-épistreptamine [Suami et al.,

J. Org. Chem. 3,2831 (1968)];

Le dichlorhydrate de 2,5-didésoxystreptamine, p.f. >300°C;

et le 6,7-diazabicyclo[3.2.1]octane-2,4-diol (exo, exo), p.f. 185-193°C. [Ces deux derniers composés sont décrits par Testa et al., J. Antibiotics 27, 917-921 (1974)].

Les esters de N-hydroxysuccinimide de formule IV forment une catégorie de composés qui est connue de manière générale.

On a essayé les composés de formule I dans un essai classique antibactérien avec dilution en série, et on a trouvé qu'ils possèdent une activité antibactérienne, en particulier vis-à-vis des organismes résistant à la gentamicine. Les composés sont ainsi utiles comme agents antibactériens.

Les composés de formule I sont essentiellement destinés à une administration orale, locale ou parentérale et peuvent être ss préparés, pour leur utilisation, à l'aide d'un support pharmaceutique par mise en suspension, soit sous forme d'une base libre soit sous forme des sels d'addition d'acide non toxiques, pharmaceutiquement acceptables, dans un support inerte comme le polyéthylèneglycol, soit par mise sous forme de 60 comprimés ou encapsulage pour l'administration orale, seuls ou avec des adjuvants appropriés, ou bien ils peuvent être introduits dans des crèmes ou des gelées classiques pour une application locale.

Les structures moléculaires des nouveaux composés ont été 6s attribuées sur la base de l'étude de leurs caractéristiques chro-matographiques déterminées par Chromatographie sur couche mince (CCM), leur spectre de résonance magnétique nucléaire (RMN) et leur spectre de masse; par dégradation en composés

10

15

\ Il

V-CH2°"C- , , n v

^ 1

-ch20-c-nhch2(ch2)nch0hc0-0-n

35

40

50

5

617964

connus; et par la correspondance entre les valeurs calculées et trouvées pour leurs analyses élémentaires.

Les exemples spécifiques suivants sont représentatifs de la façon de préparer les composés et de la façon de mettre en œuvre le procédé de l'invention, sans que l'invention soit limitée à ces exemples.

Préparation des nouveaux intermédiaires Préparation 1

On met la 2-désoxy-l,6:3,4-dicarbonylstreptamine [Umezawa et al., Bull. Chem. Soc. (Jap.) 44,1411-1415 (1971)] (47 g, 0,21 mole) en suspension dans 500 ml de Pyridine et on traite la suspension agitée par 45 ml de chlorure de méthanesulfonyle. Après refroidissement, on dilue le mélange avec environ 3 litres de méthanol et on filtre le produit que l'on sèche, ce qui donne 39 g de 2-désoxy-5-méthanesulfonyl-l,6:3,4-dicarbonylstreptamine, p.f. 264-266°C.

On chauffe à 125°C pendant 24 heures, un mélange de 2 g (0,0069 mole) de 2-désoxy-5-méthanesulfonyl-l,6:3,4-dicarbo-nylstreptamine, décrite ci-dessus, et de 4,8 g (0,032 mole) d'iodure de sodium dans 70 ml de diméthylformamide, puis on l'amène à siccité. On mélange la 2,5-didésoxy-5-iodo-l,6:3,4-dicarbonylstreptamine brute avec 30 ml d'acide chlorhydrique 6N, on chauffe le mélange à reflux pendant 2,5 heures et on le refroidit et on l'évaporé à siccité sous vide. On dissout le dichlorhydrate de 2,5-didésoxy-5-iodostreptamine brut dans 30 ml d'anhydride acétique, on traite la solution par 5,25 g d'acétate de sodium et on chauffe le mélange à reflux pendant 2,5 heures. Puis on refroidit le mélange, on le verse dans 200 ml d'eau et on l'extrait avec du chloroforme. Les extraits chloroformiques, après lavage une fois avec une solution de thiosulfate de sodium, une fois avec une saumure, une fois avec de l'eau et par évaporation à siccité, fournissent une huile que l'on cristallise dans l'éthanol, ce qui donne deux récoltes totalisant 1,1 g de N,N/-diacétyl-2,5-didésoxy-5-iodostrepta-mine, p.f. 256-258°C. L'hydrolyse de cette dernière par chauffage à reflux avec de l'acide chlorhydrique aqueux et séparation dans un milieu basique fournit la 2,5-didésoxy-5-iodo-streptamine.

Préparation 2

On met 39 g (0,12 mole) de 2-désoxy-5-méthanesulfonyl-l,6:3,4-dicarbonylstreptamine, décrite dans la préparation 1 ci-dessus, dans environ 200 ml d'acide chlorhydrique 6N, on chauffe le mélange sur un bain de vapeur pendant 2 heures, on l'évaporé à siccité sous vide, on le mélange avec 200 ml d'alcool isopropylique et on l'évaporé à siccité une fois encore. On triture l'huile résiduelle avec du méthanol, on la refroidit, et on recueille le solide que l'on recristallise dans le méthanol, ce qui donne le dichlorhydrate de 2-désoxy-5-méthanesulfonylstrep-tamine, p.f. 208-210°C.

Analyse pour C7H16N2O5S • 2HC1:

C H N

Calculée 26,84 5,79 8,94 Trouvée 26,77 5,76 9,17

On refroidit dans un bain de glace une solution de 28,7 g (0,09 mole) de 2-désoxy-5-méthanesulfonylstreptamine dans 45 ml d'eau et 90 ml d'hydroxyde de sodium 2N et on la traite goutte à goutte, en agitant, par ime solution de 45 ml de chlo-roformiate de benzyle dans 80 ml de toluène, ajoutée par une ampoule à brome, et par 160 ml d'hydroxyde de sodium 2N ajoutés par une autre ampoule à brome. Une fois l'addition terminée, on agite le mélange pendant 15 minutes supplémentaires, on le dilue avec environ 50 ml de toluène, on l'agite pendant 3 heures et on le filtre. La recristallisation du solide dans l'éthanol fournit 4,0 g de N,N'-dicarbobenzoxy-2-désoxy-5-méthanesulfonylstreptamine, p.f. 198-201°C.

Analyse pour C23H28N2O9S:

C

H

N

Calculée

54,32

5,55

5,51

Trouvée

54,75

5,61

5,60

La réaction de cette dernière avec le fluorure de potassium dans le benzène ou l'acétonitrile contenant un éther en couronne, par exemple le 1,4,7,10,13,16-hexa-oxacyclo-octadé-cane, en utilisant le mode opératoire décrit par Liotta et al., J. Am. Chem. Soc. 96, 2250-2252 (1974) fournit la N,N'-dicarbobenzoxy-2,5-didésoxy-5-fluorostreptamine qui, par hydrolyse par un acide minéral aqueux, fournit la 2,5-didéso-xy-5-fluorostreptamine.

Processus de mutation Dans les modes opératoires suivants, on utilise divers milieux constitués comme suit:

Milieu 1

N-Z Amine g/1

Glucose 10

Amidon soluble 20

Extrait de levure 5

N-Z-Amine-Type A (Difco) 5

CaCOa 1

Gélose 15

Milieu 2

Milieu de germination (dans l'eau distillée)

Extrait de bœuf 0,3 %

Tryptone 0,5 %

Dextrose 0,1%

Amidon soluble 2,4 %

Extrait de levure 0,5 %

CaCOa 0,4%

Milieu 3

Soja-glucose g/1

Farine de soja 30

Dextrose (Cerelose) 40

CaC03 1

Milieu 4 TGE (extrait trypticase-glucose)

g/1

Extrait trypticase-glucose 5,0

Trypticase-peptone 3,0

Glucose 1,0

Gélose 15,0

Milieu 5

Milieu de production

Extrait de bœuf 0,3 %

Extrait de levure 0,5 %

Farine de soja 0,5 %

Maltose 0,1%

Amidon 2,4r

Casamino-acide 0,1'

CaCÛ2 0,4% C0CI2 • 6H2O 1 mg/litre s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

617 964

Milieu 6 Gélose d'essai de streptomycine g/1

Extrait de bœuf 1,5

Extrait de levure 3,0

Peptone 6,0

Gélose 15,0

On obtient l'organisme Micromonospora purpurea du Department of Agriculture des Etats-Unis sous le no.

NRRL 2953 et on le maintient sur des cultures de gélose inclinées N-Z amine (Milieu 1). On effectue des fermentations en immersion dans des ballons contenant le milieu de germination 2 pendant 4 jours à 37 °C sur un agitateur rotatif. A partir des semences de cette première étape, on transfère un inoculum à 10% dans le milieu de germination (milieu 2) et l'on continue la fermentation comme ci-dessus à 28°C pendant 7 jours.

Pour établir l'aptitude de l'organisme à biosynthétiser la gentamicine en l'absence de désoxystreptamine ajoutée, on effectue une fermentation de troisième étape en utilisant un inoculum à 5% dans un fermenteur de 10 litres dans un milieu de soja et de glucose (milieu 3) à 28°C, en agitant à 200 tours par minute et en insufflant 2 litres d'air filtré par minute.

Après 6 jours, on acidifie le contenu du réservoir à pH 2,2 avec de l'acide sulfurique 6N, on filtre et on neutralise une portion de 500 ml avec de l'hydroxyde d'ammonium et on la fait passer sur une résine échangeuse d'ions IRC 50 (forme Na+). Puis on rince la colonne avec de l'eau et on l'élue avec de l'acide sulfurique 2N. En suivant le mode opératoire décrit dans le brevet des E.U.A. no. 3 091 772, on isole un échantillon de 300 mg de gentamicine brute, que l'on trouve être biologiquement active et qui contient trois composants similaires à la gentamicine Ci, C2 et Cu par examen en CCM.

Dans le but d'obtenir un mutant de l'organisme, on cultive les cultures de bouillon dans le milieu 2 (37°C pendant 3 jours) et l'on récolte les cellules résultantes par centrifugation, on les lave et on les remet en suspension dans la solution saline tamponnée. On traite cette suspension par l'agent mutagène, la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine. On cultive sur plaque de milieu 4 des échantillons de la culture mutagénisée à 37°C jusqu'à ce que l'on voit des colonies (généralement environ une semaine). Les colonies sont transplantées sur deux séries de plaques (milieu 4) dont une série est recouverte d'une suspension de spores de B. subtilis. Après incubation à 37°C pendant 18 à 20 heures, les «transplantations» qui ne présentent aucune zone d'inhibition sur la plaque à B. subtilis sont transférées de la plaque originale (pas de B. subtilis) à des cultures sur gélose inclinées de milieu 1 et on les fait incuber jusqu'à ce que l'on voit une croissance totale.

Ces mutants non producteurs potentiels sont ensuite mis en présence de désoxystreptamine dans un essai de stimulation de la biosynthèse antibiotique, comme suit. Des cultures mères des mutants potentiels sont déposées sous forme de stries à la surface de plaques de milieu 4 et on les fait incuber à 37°C jusqu'à ce qu'on voit la croissance (environ 3 à 4 jours). Puis on plonge des disques de papier filtre dans une solution de désoxystreptamine (500 jig/ml) et on les place au-dessus des stries de culture. Après incubation pendant 24 heures, on inocule la surface de la plaque avec B. subtilis en utilisant la technique de couverture par une couche, et on continue l'incubation pendant 18 à 20 heures supplémentaires. Les isolats présentant des zones d'inhibition autour du disque sont désignés comme étant des mutants de désoxystreptamine. Un de ces mutants, appelé mutant VIB et déposé le 13 janvier 1975 à American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, sous le nom de Micromonospora purpurea ATCC 31 119, est utilisé dans la production des antibiotiques du type gentamicine comme décrit ci-dessous.

Biosynthèses avec M. purpurea ATCC 31119

Exemple 1

On maintient des cultures de l'organisme mutant sur des cultures inclinées de gélose N-Z amine (milieu 1) à partir desquelles on effectue des transferts dans des ballons contenant 500 ml de milieu de germination 2. On fait incuber les ballons à 28°C pendant 4 jours sur un agitateur rotatif (course de 5 cm) à 225 tours par minute.

On transfère de manière aseptique un inoculum à 10% (volume/volume) provenant de l'étape de germination, dans des fermenteurs de 14 litres contenant 9 litres de milieu de germination 2 stérile. On les agite à 450 tours par minute à 28-29°C et on y insuffle de l'air filtré à 5 litres par minute. Au moment de l'inoculation, on ajoute 200 mg par litre de sulfate de streptamine sous forme d'une suspension dans de l'eau distillée stérile. On continue la fermentation pendant 8 jours.

On transfère de manière aseptique un inoculum de 10 litres de 24 heures préparé comme précédemment, dans des fermenteurs de 130 litres contenant 70 litres de milieu de germination 2 sterile, et on ajoute 0,31g par litre de sulfate de streptamine en suspension dans de l'eau distillée stérile. On effectue une fermentation aérobie à 29°C pendant 7 jours.

On arrête les fermentations par addition d'acide sulfurique 10N jusqu'à pH 2,0 et par filtration en utilisant un adjuvant de filtration pour recueillir les mycéliums. On ajuste le pH du bouillon filtré à 7,0 et l'on ajoute 1,56 g d'acide oxalique par gramme de carbonate de calcium présent dans le milieu, pour éliminer le calcium. Puis on laisse reposer pendant une nuit, et l'on décante le bouillon clarifié et on le fait passer sur une résine Bio-Rex 70 (échangeur de cations faible) sous forme Na+, en utilisant environ 14 g de résine par litre de bouillon. Puis on lave la colonne avec de l'eau distillée et on l'élue avec de l'acide sulfurique 2N. On réunit toutes les fractions présentant une activité antibiotique, on les neutralise et on les concentre sous vide en dessous de 50°C, jusqu'au moment où la cristallisation du sel devient évidente (à un volume d'environ V3). Puis on ajuste le pH à 10,5, et l'on ajoute quatre volumes d'acétone pour faire précipiter les matières minérales que l'on élimine par filtration. On ajuste le pH du filtrat à 5,0 avec de l'acide sulfurique 6N, on le concentre sous vide à environ 1/20 du volume initial et on le refroidit. On recueille par filtration une récolte cristalline blanche fondant au-dessus de 300°C qui se révèle, par ses propriétés en Chromatographie sur couche mince et son spectre infrarouge, être identique au sulfate de streptamine. De deux fermentations de 10 litres traitées comme précédemment, on obtient un total de 0,7 de sulfate de streptamine, et de deux fermentations de 80 litres, on recueille à cette étape un total de 21 g de sulfate de streptamine.

On concentre encore le filtrat et on ajoute 10 volumes de méthanol ce qui fournit le premier solide antibiotique brut. De deux fermentations de 10 litres on obtient 7 g, et de deux fermentations de 80 litres, on obtient 24 g.

Pour identifier les composants antibiotiques pendant les modes opératoires de purification, on détermine les valeurs de la mobilité chromatographique obtenues par Chromatographie sur papier et Chromatographie sur couche mince pour les gen-tamicines Ci, C2 et Cia et pour chacun des homologues correspondants d'aminocyclitol préparés comme indiqué précédemment, où la mobilité chromatographique (désignée ci-après par MC) est exprimée comme étant:

distance du composant par rapport à l'origine

MC =

distance de la gentamicine Ci par rapport à l'origine

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

617 964

Les systèmes chromatographiques utilisés sont les suivants:

Système 1

Papier Whatman no. 1 saturé avec du sulfate-bisulfate 0,95 M et développé de manière descendante dans de l'éthanol aqueux à 80% plus 1,5% de NaCl, et bioautographe ultérieur en utilisant B. subtilis comme organisme d'essai.

Système 2

Plaque de gel de silice F 254 développée dans la phase inférieure du mélange chloroforme (1): méthanol (1): Hydro-xyde d'ammonium concentré (28%) (1). Les composants sont localisés avec une pulvérisation de ninhydrine et chauffage.

Les valeurs MC des composants antibiotiques principaux de la présente invention par rapport à un complexe de gentamicine de référence, valeurs qui sont toutes données par rapport à la gentamicine Ci, sont données dans le tableau I, où les composés désignés par composant 1, composant 2 et composant 3 sont respectivement:

0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabino-pyranosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-D-streptamine;

0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabino-pyranosyl-(l-»6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-ot-D-érythroglucopyranosyl-(l—>4)]-D-streptamine; et

0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyrano-syl-(l-»6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-D-streptamine.

Tableau I

MC

Système I

MC

Sysrème II

Gentamicine Ci

1

Gentamicine C2

0,89

0,83

Gentamicine Cia

0,50

0,67

Composant 1 (Principal)

0,96

0,92

Composant 2 (Faible)

0,76

0,75

Composant 3 (Faible)

0,50

0,61

Le solide brut (7 g) des fermenteurs de 10 litres, qui présente une activité antibactérienne, est mis en suspension dans 200 ml de méthanol et 10 ml d'hydroxyde d'ammonium concentré (28%), et on agite le mélange pendant 30 minutes et on le filtre. On répète ceci deux fois supplémentaires, et on réunit les filtrats et on les concentre sous vide, ce qui donne une huile jaune pâle pesant 0,9 g. Les «sels épuisés» sont essentiellement dépourvus d'activité antibiotique.

On mélange la base huileuse avec 4 g de gel de silice (Davi-son, qualité 923, 74-149 microns) et on l'introduit dans une colonne de gel de silice mesurant 1,8x28 cm. On prépare la colonne sous forme d'une suspension en utilisant la phase inférieure du mélange alcool isopropylique (l)xhloroforme (2):hydroxyde d'ammonium aqueux à 17% (1). On développe la colonne avec ce solvant et l'on recueille des fractions de 50 ml.

Les fractions 8 et 9 contiennent un seul composant positif à la ninhydrine qui fournit 20 mg sous forme d'une huile jaune pâle par élimination du solvant. Le spectre de masse de cette substance, appelé composant 1, présente un ion moléculaire et des fragments principaux chacun supérieur de 16 unités de masse (c'est-à-dire d'un atome d'oxygène) à ceux obtenus pour la gentamicine Ci, comme suit:

Référence:

gentamicine Ci : M+ 477,420,360,350, 347, 322,319,304 Composant 1 : M+ 493,436, 376,366, 363,338, 335, 320.

On transforme cette substance en son sulfate en la dissolvant dans l'éthanol et en ajoutant quelques gouttes d'éthanol contenant de l'acide sulfurique. On recueille le solide blanc résultant et on le sèche, ce qui donne 22 mg du composant 1, la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyra-nosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-méthyl-amino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-> 4 )]-D-strepta-mine, sous forme de la di-base heptasulfatée et décahydratée, p.f. >300°C.

Analyse pour (C2iH43Ns08)2 • 7H2SO4 • IOH2O:

îs Calculée Trouvée

27,22 27,15

H

6,53 6,67

N

7,55 7,79

12,09 12,76

Les fractions 10-13 fournissent un composant positif à la ninhydrine, plus polaire, appelée la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-20 méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-D-streptamine, le composant 2 qui présente une activité antibiotique.

Les fractions 15-26 présentent un troisième composant plus 25 polaire présentant une activité antibiotique. Le spectre de masse de ce composant présente des pics caractéristiques des sucres correspondant à la gentamicine Cia, à 129 (purpurosa-mine) et 160 (garosamine) et est appelé le composant 3, la O-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-30 (l-»6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-gluco-pyranosyl- ( 1 ->4)] -D -streptamine.

Ou bien, on isole comme suit le nouveau composant 1: on dissout un mélange de la base antibiotique brute obtenue comme précédemment (0,9 g) dans 7 ml d'eau et on ajuste le 35 pH à 4,5 avec de l'acide sulfurique IN. On fait passer le solvant sur une colonne de résine échangeuse d'anions forte (IRA 401) sous forme OH~ (dimensions du lit = 0,7 X10 cm). On élue la colonne avec de l'eau et on évapore l'éluat sous vide à 35°C. On triture le résidu résultant avec 50 ml de la 40 phase inférieure d'un solvant composé d'hydroxyde d'ammonium aqueux à 17%, d'alcool isopropylique et de chloroforme (1:1:2). On décante le solvant et on le concentre sous vide, ce qui laisse un résidu huileux pesant 140 mg. Le spectre de masse de cette substance correspond à celui des fractions 8 et 9 45 ci-dessus c'est-à-dire M+ 493, 436, 376, 366, 363, 338, 335, 320.

Le spectre de résonance magnétique nucléaire du composant 1 est également compatible avec la structure proposée correspondant à la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino^-50 L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-méthyIamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]-D-streptamine et est résumé dans le tableau II.

Tableau II

55 ô

Intégration

Attribution

5,87,5,60

2

OCHO épimères

5,22

12

H échangeable

3,09,3,15

6

NCH3X2

2,9-4,8

13

-CHO X 6, -CHN X 5, -CH2O

60 1,9-2,6

4

-CH2CH2-

1,72

6

CHsC-, CHBCH

Ou bien, on dissout un échantillon de 4 g du sel antibiotique 65 brut dans 50 ml d'eau et on le fait passer sur une résine échangeuse d'anions AG1X8 (lit de résine 1x27 cm). On élue l'antibiotique avec de l'eau et l'on réunit toutes les fractions actives et on les évapore sous vide. On effectue l'élimination du sel sur

617964

le résidu par extraction avec de l'hydroxyde de sodium métha-nolique. On mélange la base libérée avec 7 g de gel de silice et on l'introduit sur une colonne de 50 g de gel de silice. On développe cette colonne avec le mélange chloroforme: métha-nokhydroxyde d'ammonium concentré (28%) (3:4:2) et l'on recueille des fractions de 25 ml. Les premières fractions fournissent le nouveau composant 1 le moins polaire, mais mélangé avec plusieurs impuretés moins polaires comme le montre la Chromatographie sur couche mince. On réunit ces fractions et on introduit le produit concentré sur une colonne de 50 g de gel de silice comme précédemment. On développe cette colonne avec le mélange chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (5:3:1) et l'on recueille des fractions de 25 ml. Les fractions 6-12 contiennent le composant désiré débarrassé des impuretés évidentes. On transforme l'huile résultant de l'élimination du solvant en sulfate dans l'acide sulfurique éthanolique comme décrit précédemment, ce qui donne 0,124 g du composant 1 sous forme de la di-base heptasulfatée et décahydratée, p.f. >300°C, décrit ci-dessus.

En cultivant un aminocyclitol approprié avec le mutant Micromonospora purpurea ATCC 31119, dans le milieu de germination 2 et en séparant les produits décrits ci-dessu§ dans l'exemple 1, on prépare de la même manière les composés suivants de formule I:

Exemple 2

La 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]épistreptamine (MC par rapport à la gentamicine Ci: Système 1 = 0,59, Système 2 = 0,63); la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino- ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]épistreptamine; et la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-pj-L-arabinopyranosyl-(l-^6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l^>4)]épistreptamine sont obtenues en utilisant l'épistreptamine au lieu de la streptamine dans le mode opératoire de fermentation.

Exemple 3

La 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-( 1 —>4)]-2,5-didésoxy-streptamine (MC par rapport à la gentamicine Ci: Système 1 = 0,95, Système 2 = 0,98); la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-H>4)]-2,5-didésoxystreptamine (MC par rapport à la gentamicine Ci):

Système 1 = 0,66, Système 2 = 0,73); et la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]-2,5-didésoxystreptamine sont obtenues en utilisant la didésoxystreptamine à la place de la streptamine dans le mode opératoire de fermentation.

Les mêmes 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-cc-D-érythro-glucopyranosyl-(1^4)]-2,5-didésoxystreptamine; et 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l-î>6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]-2,5-didésoxystreptamine décrites ci-dessus et ayant les mêmes valeurs MC que données ci-dessus sont obtenues en utilisant le 6,7-diazobicyclo[3.2.1] octane-2,4-diol] (exo, exo) au lieu de la streptamine dans le mode opératoire de fermentation.

Exemple 4

La 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(1^6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1—>4)]-5-iodo-2,5-didésoxystreptamine; la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyranosyl-(l~>6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-ce-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]-5-iodo-2,5-didésoxy-streptamine; et la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-5-iodo-2,5-didésoxystreptamine sont obtenues en utilisant la 5-iodo-2,5-didésoxystreptamine à la place de la streptamine dans le mode opératoire de fermentation.

Exemple 5

La 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyranosyl-(W6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-5-fluoro-2,5-didésoxystreptamine; la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-

3-m0thylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,5-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-gIucopyranosyl-(l->4)]-5-fluoro-2,5-didésoxystreptamine; et la O-3-désoxy-

4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]-5-fluoro-2,5-didésoxystrep-tamine sont obtenues en utilisant la 5-fluoro-2,5-didésoxy-streptamine à la place de la streptamine dans le mode opératoire de fermentation.

Exemple 6

En suivant un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple 1 et en utilisant 0,10 g par litre de 2-désoxystrepta-mine dans une fermentation de 10 litres dans le milieu de production 5, en présence de M. purpurea ATCC 31 119, et en séparant le produit comme précédemment, on obtient 0,51 g de substance brute qui, par Chromatographie sur gel de silice, fournit comme composant principal une substance dont l'identité des mobilités chromatographiques montre qu'elle est identique à la gentamicine Ci, c'est-à-dire la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-p-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]-D-2-désoxystreptamine.

Synthèse des dérivés à substituant Amino-hydroxy-alcanoyle inférieur

Exemple 7

On refroidit à 5°C dans un bain de glace, une solution de 270 mg (0,54 mmole) de 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthyl-amino-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2-amino-6-m0thyl-amino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro~glucopy-ranosyl-(l-s>4)]-D-streptamine, décrite ci-dessus dans l'exemple 1 (composant 1), dissous dans 5 ml de tétrahydrofuranne aqueux à 50%, et on la traite par 208 mg (0,59 mmole) de l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide S-(— )-Y-(N-benzyl-oxycarbonyl)amino-a-hydroxybutyrique (brevet des E.U.A. no. 3 780 018 de Konishi et al.), et on agite le mélange à 5°C pendant 20 heures. Puis on concentre le mélange à 10 ml sous

8

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

vide. On ajoute 25 ml de n-butanol et 10 ml d'eau, et l'on sépare les couches. On lave de nouveau la couche aqueuse avec 10 ml de n-butanol. On évapore les couches organiques réunies, ce qui laisse un résidu de 513 mg de produit brut que l'on laisse de côté.

On évapore la couche aqueuse à siccité, ce qui donne 304 mg d'un résidu que l'on dissout dans 25 ml de tétrahydrofuranne aqueux à 50% et que l'on traite par 208 mg supplémentaires de l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide S-(—)-Y-(N-benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxybutyrique comme précédemment. Le traitement du mélange réactionnel fournit 435 mg supplémentaires du produit brut que l'on réunit aux 513 mg préalablement obtenus et on les Chromatographie sur 7 plaques de gel de silice 40x20 cm d'une épaisseur de 1 mm. On développe le système avec la phase inférieure du mélange chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré à 28% (3:1:1). Sept passages dans ce système de solvant sont nécessaires, et après avoir élué la bande du produit qui est visible à l'ultra-violet, on obtient 229,5 mg d'un produit brut des trois produits monoacylés.

On dépose le mélange des produits acylés sur trois plaques de gel de silice de 40x20 cm et 1 mm d'épaisseur et on développe les plaques 5 fois avec la phase inférieure du mélange chloroforme:isopropanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (4:1:1), deux fois avec la phase inférieure du mélange chloroforme:isopropanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (3:1:1) et 9 fois avec la phase inférieure du mélange chIoroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (4:1:1). On obtient 3 bandes distinctes visibles sous un rayonnement ultra-violet que l'on découpe séparément et que l'on élue du gel de silice avec la phase inférieure du mélange chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (1:1:1), ce qui fournit trois composants: A, 90,9 mg; B, 59,1 mg; et C, 48,5 mg, qui sont les dérivés amide de l'acide S-(-)-Y-(N-benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxybutyriqueen positions 2', 1 et 3 respectivement de la Ô-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)-]-D-streptamine. Les valeurs Rf pour les composants À, B et C, quand on développe 5 fois sur gel de silice avec la phase inférieure du système chloroforme: méthanokhydroxyde d'ammonium concentré (28%) (4:1:1), sont:

A - 0,48 B - 0,62 C - 0,70

On agite le composant B (1-amide, 56,1 mg) dissous dans 25 ml d'éthanol aqueux à 50% et 20 mg de palladium-sur-charbon à 10%, dans un agitateur de Parr à 3,75 atmosphères pendant 5,5 heures, après quoi on élimine le catalyseur par filtration sur un adjuvant de filtration. L'évaporation du solvant fournit 34,3 mg d'un verre blanc que l'on dissout dans 2,5 ml d'eau et que l'on traite par 11,4 mg d'acide sulfurique dans 0,1 ml d'eau. L'addition de 10 ml d'éthanol fait précipiter la l-[S-(-)-Y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]-D-streptamine sous forme du pentasulfate (32 mg), p.f. 230-235°C avec décomposition; CCM, Rf = 0,18 (gel de silice, chloroforme:méthanol:hydro-xyde d'ammonium concentré (28%): eau, 1:4:2:1; Rf de référence de la gentamicine Ci = 0,73).

617964

Analyse pour C25H50O10N6 • 5H2SO4:

C H N

Calculée 27,67 5,57 7,75 Trouvée 27,50 5,58 7,42

On traite de la même manière les composants A et C. A fournit 47 mg de 2'-[S-(—)-y-amino-a-hydroxy-butyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-éry-thro-glucopyranosyl-(l-»4)]-D-streptamine sous forme de la di-base tétrasulfatée et heptahydratée, p.f. 237-241 °C avec décomposition; CCM, Rf = 0,33 [gel de silice, chloroforme: méthanol: hydroxyde d'ammonium concentré (28%): eau, l:4:2:l;Rf de référence de la gentamicine Ci = 0,73],

Analyse pour (C2sH5oN60io)2 • 4H2SO4 • 7H2O:

C

H

N

Calculée

35,16

7,20

9,84

Trouvée

35,38

7,08

9,49

Le composant C fournit 26 mg de 3-[S-(— )-y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-mé-thyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-D-streptamine sous forme de la di-base pentasulfatée et trihy-dratée, p.f. 220-230°C avec décomposition; CCM, Rf = 0,30 [gel de silice, chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%):eàu, 1:4:2:1; Rf de référence de la gentamicine Ci = 0,73].

Analyse pour (C25HsoN60io)2 • 5H2SO4 • 3H2O:

C H N

Calculée 34,64 6,74 9,67 Trouvée 34,35 6,38 8,60

En procédant d'une manière similaire à celle décrite dans l'exemple 7 en utilisant respectivement les antibiotiques décrits dans les exemples 2,3,4 et 5 et l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide S-(-)-Y-(N-benzyloxycarbonyl)amino-a-hydro-xybutyrique ou l'ester pentafluorophénylique de la N-(benzyl-oxycarbonyl)-(S)-isosérine [acide (S)-ß-amino-a-hydroxypro-pionique, décrit par Haskell et al., Carbohydrate Research, 28, 273-280 (1973)], on prépare de la même manière les composés suivants de formule I:

Exemple 8

l-[(S)-P-amino-a-hydroxypropionyl]-0-3-désoxy-4-C-mé-thyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-]2,6-dia-mino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyra-nosyl-(l->4)]épistreptamine et 2'-[(S)-ß-amino-a-hydroxypro-pionyl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabino-pyranosyl-(l-»6)-Ó-]2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétra-désoxy-<x-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4]-épistreptamine.

Exemple 9

l-[S-(—)-Y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-|3-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-]2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)-2,5-didésoxystreptamine et 2'-[S-(-)-Y-amino-a-hydro-xybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-ara-binopyranosyl-(l-i>6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-2,5-didésoxystreptamine.

9

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

617 964

10

Exemple 10

l-[(S)-P-amino-a-hydroxypropionyl]-0-3-désoxy-4-C-mé-thyl-3-méthylammo-p-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2,6-dia-mino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l^>4)]-

5-iodo-2,5-didésoxystreptamine et 2'-[(S)-ß-amino-a-hydroxy- s propionyl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino^-L-ara-binopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4]-5-iodo-2,5-didésoxystrepta-mine.

Exemple 11

l-[S-(-)-Y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-mé-thyl-3-m0thylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2-amino-

6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-érythro-glu-copyranosyl-(l-H.4)]-5-fluoro-2,5-didésoxystreptamine et 2'-[S-(—)-Y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-m6thyl-3-m6thylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1^6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-5-fluoro-2,5-didésoxystrepta-mine.

Résultats des essais antibactériens

On teste la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyranosyl-(l-»6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-mé-thyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a~D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]-D-streptamine décrite ci-dessus dans l'exemple et appelée composant 1 en la comparant à la gentamicine vis-à-vis d'un certain nombre de micro-organismes selon le mode opératoire suivant.

On prépare des solutions mères de chaque composé contenant 200 g/ml de base, dans de l'eau distillée et on les stérilise par filtration. On cultive pendant 24 heures à 37°C des cultures des microorganismes d'essai dans des tubes de 10 ml de phosphate-tryptose ou bouillon de Mueller-Hinton. On ajuste chaque culture avec du bouillon jusqu'à une densité optique de 0,1 sur un spectronic 20 (environ 108 cellules/ml). On dilue les cultures ajustées à raison de 1:500 dans le bouillon pour les utiliser comme inoculum (concentration finale en cellules d'environ 2xl05 cellules/ml). On teste l'activité antibactérienne des composés d'essai par une méthode de dilution en tube en une seule série. On prépare des dilutions originales en double dilution en série dans du bouillon à partir des solutions mères de médicaments, et l'on place 0,2 ml de chaque concentration de médicaments dans 17 tubes de 13x100 ml. On inocule tous les tubes avec 0,2 ml de la culture diluée appropriée (concentration finale de cellules par tube = 105 cellules/ ml). On détermine les concentrations inhibitrices minimales (plus faibles concentrations en médicaments ne présentant pas de croissance visible) après une incubation de 16 heures à 37°C.

Les résultats sont donnés dans le tableau III ci-dessous. On considère les composés inactifs à des concentrations inhibitrices supérieures à 100 jig/ml.

Tableau III*

Concentration inhibitrice minimale (ng/ml)

Organisme

Composant I

Gentamicine io Staphylococcus aureus Smith

0,78

0,195

Escherichia coli Vogel

3,13

Escherichia coli W677/HJR66

50

inactive

Escherichia coli JR 35

3,13

6,25

Escherichia coli JR 76.2

6,25

100

is Escherichia coli JR89

50

Escherichia coli K12 ML 1629

3,13

1,56

Enterobacter cloacae A-20960

1,56

25

Klebsiella pneumoniae 39645

1,56

0,78

Klebsiella pneumoniae A-20636

3,13

50

20 Proteus mirabilis MGH-1

6,25

1,56

Providencia 164

100

Inactive

Providencia stuartii A-20894

100

Pseudomonas aeruginosa MGH-2

3,13

0,39

Pseudomonas aeruginosa A-20717

12,5

<12,5

25 Pseudomonas aeruginosa A-20741

Inactif

Inactive

Pseudomonas aeruginosa A-20897

12,5

Inactive

* Cultivé dans le bouillon tiyptose-phosphate.

30 On fait un essai de comparaison de ce même composant 1 décrit ci-dessus dans l'exemple 1, la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-m0thylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-D-streptamine, avec le complexe de 35 gentamicine (Ci, C2 et Cia) et la gentamicine Ci, et l'on fait un essai de comparaison entre les 1-, 3- et 2'-[S-(— )-Y-amino-cc-hy-droxybutyryljamides du composant 1, décrits ci-dessus dans l'exemple 21, et appelés respectivement composé 1 (1-HABA), composant 2 (3-HABA) et composant 1 (2'-HABA), 40 et les 1-, 3-, et 2'-[S-(—)-Y-amino-a-hydroxybutyryl]amides correspondants de la gentamicine Ci (tous décrits par Konishi et al. dans le brevet des E.U.A. no. 3 780 018 délivré le 18 décembre 1973) et appelés respectivement Ci (1-HABA), Ci (3-HABA) et Ci (2/-HABA). Les résultats sont donnés 45 dans le tableau IV ci-dessous où les organismes d'essai 1, 2,3, 4, 4 et 5 désignent respecticement B. subtilis ATCC 6633, S. aureus, Smith, E. coli JR 76.2, Ent. cloacae A-20960, K. pneumoniae A-20636 et Ps. aeruginosa A-20897.

Tableau IV*

Organismes d'essai

Composé

1

2

3

4

5

6

Gentamicine

Ci, C2, Cla

=£0,024

0,39

50

12,5

25

>100

Gentamine Ci

0,049

0,78

50

12,5

25

>100

Composant I

0,098

1,56

6,25

0,78

3,13

25

Ci (1-HABA)

0,39

3,13

12,5

3,13

6,25

>100

Composant I

(1-HABA)

0,78

6,25

12,5

6,25

12,5

>100

Ci (3-HABA)

3,13

25

>100

100

>100

Composant I

(3-HABA)

6,25

50

100

50

>100

Ci (2'-HABA)

6,25

50

100

25

50

>100

Composant I

(2'-HABA)

1,56

25

50

25

50

>100

* Cultivé dans le bouillon Mueller-Hinton.

B

Claims

617964

REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un nouveau composé de formule I

i ch-nh-r dans laquelle

Ri, R3 et R8 représentent chacun un atome d'hydrogène, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy; R5 représente un atome d'hydrogène, un groupement hydroxy ou un atome d'halogène, sauf que lorsque R2 est un atome d'hydrogène, Rs n'est pas un groupement hydroxy en eis par rapport aux groupements amino en positions 1 et 3; et Rô et R7 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle, ou d'un de ses sels d'addition d'acide, caractérisé en ce qu'on cultive un milieu nutritif contenant des glucides, une source d'azote assimilable, des sels essentiels et un aminocyclitol ajouté correspondant en présence d'un microorganisme mutant et on isole le produit du milieu de culture, ledit aminocyclitol ayant la formule II

nh-r'.

ii ho ^ nh-r-,

dans laquelle Ri et R3 représentent des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une simple liaison réunissant les deux atomes d'azote des groupements aminés et R2 et Rs ont les significations précédentes, ledit micro-organisme mutant étant ch3nh

40 incapable de synthétiser ledit aminocyclitol lui-même mais étant capable d'incorporer ledit aminocyclitol dans le composé de formule I, dans les conditions précédentes.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la souche de micro-organisme est Micromonospora purpu-

45 rea ATCC 31 119.
3

617 964

amino-a-hydroxy-alcanoyle inférieur, caractérisé en ce qu'on exécute le procédé de la revendication 1 et l'on fait réagir le o

dans laquelle n est égal à 0 ou à 1 et l'on soumet le groupement benzyloxycarbonyle du produit résultant à l'hydrogéno-lyse par l'hydrogène sur un catalyseur.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, permettant de préparer la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)^-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2-amino-6-(méthyIamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-gIucopyranosyl-

so (l->4)]-D-streptamine et la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthyl-amino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-{2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l^>4)]-D-streptamine, caractérisé en ce que l'aminocyclitol ajouté est la streptamine.

ss
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2 permettant de préparer la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)^-L-arabmopyranosyl-(l->6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l->4)]-D-2,5-didésoxystreptamine; la 0-3-désoxy-4-C-60 méthyl-3-(méthylamino)-p-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-cc-D-érythro-gIuco-pyranosyl-(l-54)]-D-2,5-didésoxy-streptamine et la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-p-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-gluco-65 pyranosyl-(l-*4)]-D-2,5-didésoxystreptamine, caractérisé en ce que l'aminocyclitol ajouté est la 2,5-didésoxy-streptamine.
5. Procédé pour produire un composé de formule i où cependant l'un de Ri, R3 et Rs représente un groupement co-
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on transforme la base libre obtenue en un de ses sels d'addition d'acide.
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on composé de formule I avec un ester de N-hydroxysuccinimide de formule IV

iv transforme la base libre obtenue en un de ses sels d'addition 15 d'acide.