CH626917A5

CH626917A5 -

Info

Publication number: CH626917A5
Application number: CH1049376A
Authority: CH
Inventors: Kurt F Stocker
Original assignee: Pentapharm Ag
Priority date: 1976-08-17
Filing date: 1976-08-17
Publication date: 1981-12-15
Also published as: DK147408B; SU946389A3; SE433619B; DE2734427A1; FR2362155A1; LU77957A1; DE2734427C3; IL52607A; ATA590477A; BE857876A; SE7709241L; NL186018C; DK364077A; AU2763377A; DK147408C; DE2734427B2; NO772862L; GB1591333A; NL186018B; AU507161B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen proteolytischen Enzymen aus den Giften von Schlangen der Familie der Crotalidae, insbesondere der Gattungen Agkistrodon, Bothrops, Crotalus und Trimere-surus. 65

Unter thrombinartigen proteolytischen Enzymen sind diejenigen Enzyme zu verstehen, die die hydrolytische Abspaltung von Fibrinopeptiden aus Fibrinogen katalysieren.

Trimeresurus Defibrino-gramineus genierung

Literatur

Herzig, R.H., Ratnoff, O.D., & Shainoff, Y.R.: Stu-dies on a procoagulant fraction of southern copperhe-ad snake venom: The pre-ferential release of fibrin-opeptide B.

J. Lab. and Clin. Med. 76, 451-465 (1970)

Sharp, A.A., Warren, B.A., Paxton, A.M. & Allington, M.J.: Anticoagulant thera-py with a purified fraction from Malayan pit viper venom.

Lancet 1,493-499 (1968) Egberg, N.: Expérimental and clinical studies on the thrombin-like enzyme from the venom of Bothrops atrox. On the primary structure of fragment E. Acta phys. scand. Suppl. 400(1973)

Berger, E., Laurent, A.J. & Stocker, K.F.: The prophy-lactic and therapeutic use of Reptilase.

Praxis 57, No. 17,611-616 (1968)

Funk, C., Gmür, J., Herold, R. & Straub, P. W.: Repti-lase-R. A new reagent in blood coagulation Brit. J. Haematol. 21,43-52 (1971)

Mauro, C.: Sulla azione emocoagulante del veleno di Bothrops jararaca.

Giorn. Ital. di Chirurgia 8, 448 (1949)

Markland, F.S. & Damus, P.S Purification and pro-perties of a thrombin-like enzyme from the venom of Crotalus adamanteus. J. Biol. Chem. 246, 6460-6473 (1971)

Ouyang, C. & Yang, F.Y.: Purification and properties of the thrombin-like enzyme from Trimeresurus gra-mineus venom.

Biochim. et Biophys. Acta 351,345-363 (1974).

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Die genannten proteolytischen Enzyme sind Glykopeptide lonne von 1,8 X 92 cm (233 ml) Sephadex G-100 reinigt, mit Molekulargewichten von 18'000 bis 55'000; aufgrund ihrer Durch die in diesem Verfahren angewandte Fällung des throm-Hemmbarkeit durch Diisopropylfluorophosphat sind sie der binartigen Enzyms als Phenolderivat-Komplex werden zwar die

Gruppe der Serinproteasen zuzuordnen. Wie Thrombin bewir- chromatographischen Reinigungsstufen bedeutend leistungsfä-ken thrombinartige Schlangengiftenzyme durch Fibrinopeptid- 5 higer als bei der direkten Chromatographie von Rohgift, den-abspaltung die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin, sie unter- noch erfordern die zahlreichen Stufen dieses Verfahrens einen scheiden sich aber von Thrombin in ihrem Verhalten gegenüber beträchtlichen Arbeitsaufwand und liefern ein Produkt von unanderen Blutgerinnungsfaktoren, gegenüber Thrombozyten und genügender Reinheit, welches mit prothrombinfreiem Plasma in insbesondere dadurch, dass ihre koagulierende Aktivität gegen- Anwesenheit von Calcium ein in Monochloressigsäure unlösli-über Plasma, durch Thrombininhibitoren wie Heparin, Hirudin, io ches Gerinnsel bildet und daher Faktor XIII aktiviert. HOLLE-Antithrombin III und durch Heparinoide nicht signifikant ge- MANN und WEISS [J.Biol. Chem. 251,1663-1669 (1976)] hemmt wird. erzielten die Isolierung und Reinigung des thrombinartigen En zyms von Bothropsatrox-Gift durch Affinitätschromatographie

Um aus den Schlangengiften, welche jeweils Gemische von von 2 g Rohgift an einer Kolonne von 2,5 X 56 cm (274 ml) bis über 20 verschiedenen pharmakologisch aktiven Polypepti- 15 p-Aminobenzamidinsuccinyl-diaminodipropylamino-agarose, den darstellen, die thrombinartigen Enzyme anzureichern, wur- bei 4 °C, unter Verwendung von 0,15 M Benzamidin in Na-den nach DEUTSCH (Deutsch, E.: Blutgerinnungsfaktoren, triumcitrat/NaCl-Puffer mit pH 9,0 und nachfolgende Entfer-Verlag Deuticke, Wien 1955) Ballaststoffe durch Säure- und nung des Benzamidins aus dem Eluat durch Dialyse. Sie erhiel-Hitzefällungen aus gelöstem Rohgift ausgefällt und aus der ver- ten so ein Produkt, welches Faktor XIII nicht aktivierte. Dieses bleibenden flüssigen Phase die thrombinartigen Enzyme durch 20 Verfahren liefert zwar ein Produkt von genügender Reinheit in Lösungsmittel- oder Salzfällungen als angereicherte Fraktion nur wenigen Stufen, erfordert aber eine verhältnismässig grosse gewonnen. BANERJEE et al. beschreiben die dreissigfache Kolonne eines kompliziert herzustellenden Adsorbens und be

Anreicherung des thrombinartigen Enzyms von Bothropsjara- nötigt ausserdem zur Eluierung Benzamidin, welches wegen sei-raca-Gift durch Ammoniumsulfatfällung aus einer 0,5 %igen ner Eigenschaft, UV-Licht zu absorbieren, die UV-photometri-Rohgift-Lösung, Wärmebehandlung des gelösten Präzipitates 25 sehe Überwachung des Chromatographieverlaufs verunmöglicht bei 65 °C, Abtrennung von gefällten Ballaststoffen durch Zen- und welches, da es eine beträchtliche Toxizität aufweist, restlos trifugation, Adsorption des thrombinartigen Enzyms an Cal- aus den Eluaten entfernt werden muss, was wiederum eine zeit-ciumphosphatgel, Eluierung mit Natriumphosphatpuffer bei pH raubende Dialyse erfordert.

7,2, erneqte fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und schliess- Es wurde nun gefunden, dass thrombinartige Schlangengiftlich Dialyse gegen Veronalpuffer (siehe Banerjee, E., Devi, A., 30 enzyme, obwohl ihre Gerinnungsaktivität unter den für Blutge-Sarkar, N.: Isolation and purification of a coagulant from snake rinnungstest üblichen pH-, Ionenstärke- und Temperaturbedin-venom of the species Bothrops jararaca and the study of its gungen durch Heparin nicht gehemmt wird, erstaunlicherweise properties. Thromb. Diath. Haem. 5, 296—303 (1960). Die bri- ein ausgeprägtes Bindungsvermögen gegenüber an einem Trätischen Patentschriften 1 094 301 und 1 177 506 beschreiben ger gebundenem insolubilisiertem Heparin aufweisen und daher die Gewinnung des thrombinartigen Enzyms aus dem Gift von 35 durch Umsetzung mit insolubilisertem Heparin aus Rohgift von Agkistrodon rhodostoma durch Chromatographie an Triami- Schlangen isoliert und gereinigt werden können.

noäthylcellulose und nachfolgende Reinigung durch Gelchro- Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur matographie ; so werden 2 g rohes Agkistrodon-rhodostoma- Gewinnung von thrombinartigen proteolytischen Enzymen aus Gift an einer Säule von 35 X 3,9 cm TEAE-Cellulose (= 417 Schlangengiften bzw. Schlangengiftfraktionen, welches dadurch ml) und hierauf an einer Säule von 97 X 6 cm Sephadex G-100 40 gekennzeichnet ist, dass man das Schlangengift bzw. die Schlan-(= 2826 ml) chromatographiert. BONILLA [Thromb. Res. 6, gengiftfraktion in einem wässrigen Medium mit an einem in 151-169 (1975) ] beschreibt die Gewinnung des thrombinarti- Wasser unlöslichen Träger gebundenem insolubilisiertem Hepa-gen Enzyms aus dem Gift von Crotalus horridus durch Chroma- rin in Berührung bringt, um das thrombinartige Enzym an das tographie von 20 g Rohgift an einer Kolonne von 1766 ml Se- insolubilisierte Heparin zu binden, die unerwünschten Begleit-phadex G-100, nachfolgende Chromatographie der aktiven 45 stoffe des Schlangengiftes entfernt und das thrombinartige En-Fraktion an einer Kolonne von 883 ml Diaminoäthylcellulose, zym mit einem wässrigen Medium vom Heparin abspaltet, nachfolgende Chromatographie an 883 ml Carboxymethylcellu- Als Ausgangsmaterialien für die Durchführung des erfin-lose und eine letzte Reinigung durch Chromatographie an einer dungsgemässen Verfahrens eignen sich einerseits klar filtrierte Kolonne von 2,5 X 36 cm (176 ml) DEAE-Cellulose unter oder zentrifugierte wässrige Lösungen des rohen Giftes von

Verwendung eines linear zunehmenden Pufferkonzentrations- so Schlangen der Familie der Crotalidae, insbesondere der Gattungradienten und nachfolgende Chromatographie an einer Kolon- gen Agkistrodon, Bothrops, Crotalus und Trimeresurus. Als ne von 2,5 X 33 cm Sephadex G-200. Die genannten unter Ausgangsmaterialien eignen sich andererseits auch klar filtrierte

Anwendung der lonenaustausch- und Gelchromatographie oder zentrifugierte Schlangengiftfraktionen, welche das throm-

durchgeführten Verfahren ermöglichen zwar die Erzielung einer binartige Enzym angereichert enthalten und aus welchen Baiweit höheren Reinheit als das eingangs beschriebene Adsorp- 55 laststoffe durch Säure- oder Hitzefällungen entfernt worden tionsverfahren, sie sind jedoch zeitraubend und unwirtschaft- sind. Als Ausgangsmaterialien eignen sich ferner rohe Präparate lieh, da nur geringe Rohgiftmengen auf relativ grossen Kolon- der thrombinartigen Schlangengiftenzyme, welche z.B. nach nen chromatographiert werden können. Das aktive Eluat ent- dem im USA-Patent Nr. 3 849 252 beschriebenen Verfahren hält ferner eine relativ geringe Menge Enzym in einem grossen durch Fällung mit einem Phenolderivat aus Rohgift gewonnen Flüssigkeitsvolumen und muss daher entweder durch Ultrafil- 60 wurden.

tration oder Vakuumdestillation eingeengt werden. Nach dem Insolubilisiertes Heparin kann dadurch gewonnen werden,

USA-Patent Nr. 3 849 252 wird das thrombinartige Enzym von dass man Heparin nach einer an sich bekannten Methode über-Bothrops-atrox-Gift dadurch gewonnen, dass man aus 20 g seine Aminogruppen mit den reaktiven Gruppen einer polyme-

Rohgift Ballaststoffe durch Ansäuern ausfällt, hierauf das En- ren wasserunlöslichen Trägersubstanz zur Reaktion bringt und zym durch Bildung eines schwerlöslichen Komplexes mit einem 65 dadurch kovalent an den Träger bindet. Das insolubilisierte He-Phenolderivat zur Fällung bringt, diesen Komplex zerlegt, das parin kann z.B. nach einem der von SCHMER beschriebenen derart angereicherte Enzym an einer Kolonne von 200 ml Verfahren durch Bindung von Heparin an Agarose nach der

DEAE-Sephadex chromatographiert und hierauf an einer Ko- Cyanogenbromidmethode, durch Bindung an Putrescinagarose

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nach der Thiophosgenmethode oder durch Bindung an Epsilon-aminocarproylagarose nach der Carbodiimidmethoder gewonnen werden [s. G. Schmer: The biological activity of covalently immobilized heparin, Trans. Am. Soc. Artificial Int. Org. 18, 321-323 (1972)]. Man kann als Trägersubstanz auch Cellulose und die entsprechenden Derivate, d.h. Putrescincellulose und Epsilonaminocaproylcellulose, verwenden. Insolubilisiertes Heparin kann zweckmässigerweise auch durch Umsetzung von Heparin mit in Form von Perlen genormter Grösse käuflich erhältlicher Cyanogenbromidagarose (z.B. CNBr-Sepharose 4B von der Firma AB Pharmacia, Uppsala, Schweden) hergestellt werden.

Die Behandlung des Ausgangsmaterials mit dem insolubilisierten Heparin (d.h. die Bindung des thrombinartigen Schlangengiftenzyms an das Heparin) und die Abspaltung des Enzyms von dem Heparin kann chargenmässig durch Ausrühren des in Wasser, einer wässrigen Pufferlösung, einer wässrigen Neutralsalzlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltenden wässrigen Lösung gelösten Ausgangsmaterials mit dem insolubilisierten Heparin und nachfolgende Filtration oder aber vorzugsweise unter Verwendung einer Kolonne von insolubilisiertem Heparin durchgeführt werden. Dabei wird das insolubilisierte Heparin in eine Säule, deren Durchmesser etwa einem Zehntel ihrer Höhe entspricht, eingefüllt und mit demselben wässrigen Medium, in welchem auch das Ausgangsmaterial gelöst ist, äquilibriert. Der Säulenauslauf ist zweckmässigerweise mit einem Durchflussphotometer verbunden, welches die optische Dichte der ausfliessenden Eluate bei einer geeigneten Wellenlänge (üblicherweise 280 nm oder 254 nm) misst und automatisch registriert. Die Eluate werden vorzugsweise mittels eines automatischen Fraktionensammlers in Fraktionen unterteilt und gesammelt.

Im einzelnen kann man wie folgt verfahren:

Das Ausgangsmaterial (Schlangenrohgift oder Schlangengiftfraktion) wird in Wasser, einer wässrigen Puffer- oder Neutralsalzlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltenden wässrigen Lösung gelöst. Die Lösung wird klar filtriert oder zentrifugiert und dann auf die Chromatographiesäule gegeben. Die Säule wird mit dem gleichen wässrigen Medium wie dasjenige, in welchem das Ausgangsmaterial gelöst worden ist, so lange gewaschen, bis im auslaufenden Eluat keine U V-absorbierenden Substanzen mehr nachweisbar sind. Nun wird die Säule mit einem wässrigen Eluierungsmittel, z.B. einer Puffer- oder Neutralsalzlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltenden Lösung, deren Konzentration grösser ist als diejenige der wässrigen Lösung, in welcher das Ausgangsmaterial gelöst wurde, gewaschen, um das thrombinartige Schlangengiftenzym von dem Heparin abzuspalten. Es wird so lange gewaschen, bis kein UV-absorbierendes Material mehr eluiert wird. Schliesslich wird die Säule mit einer Pufferoder Neutralsalzlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltenden Lösung von so hoher Konzentration nachgewaschen, dass auch Substanzen, die stärker an das insolubilisierte Heparin gebunden sind als die thrombinartigen Enzyme, restlos aus der Kolonne entfernt werden, so dass das Affinitätsadsorbens nach Äquilibrierung mit dem gleichen Äquilibrierungsmittel wieder regeneriert wird und somit für einen neuen Arbeitsgang bereit ist.

Als Pufferlösungen eignen sich wässrige Lösungen von Salzen anorganischer oder organischer Basen mit anorganischen oder organischen Säuren oder Salze von amphoteren Substanzen mit anorganischen oder organischen Säuren oder Basen, welche eine Pufferwirkung innerhalb des pH-Bereichs von 4 bis 10 entfalten. Besonders geeignet sind untoxische Substanzen oder Substanzgemische, die keine aromatischen Gruppen aufweisen, daher Licht von einer Wellenlänge von 28Ó bzw. 254 nm nicht absorbieren und somit die UV-photometrische Überwachung des Chromatographieverlaufs nicht stören, insbesondere Glycin/NaOH-, Essigsäure/NaOH-, Zitronensäure/ NaOH-, Triäthanolamin/HCl-, Glycylglycin/HCI-, Natriumphosphatpuffer sowie auch vakuumflüchtige Puffersysteme wie Ammoniumformiat-, Ammoniumacetat- und Äthylendiaminte-traacetatpuffer. Für das chargenmässige Arbeiten eignen sich ferner Natriumhydrogencarbonat- und Ammoniumhydrogen-carbonatpuffer, die jedoch wegen C02-Entwicklung für das chromatographische Verfahren unbrauchbar sind. Die thrombinartigen Enzyme verschiedener Schlangengifte besitzen ein unterschiedliches Bindungsvermögen gegenüber dem an einen Träger gebundenen insolubilisierten Heparin; dementsprechend muss auch die Zusammensetzung der Puffer der biologischen Herkunft der zu isolierenden Enzyme angepasst werden. Je geringer die Konzentration der Puffer- oder Neutralsalzlösung oder der Puffer-Neutralsalz-Lösung ist, umso besser wird das Enzym an insolubilisiertes Heparin gebunden. Da aber bei geringer Konzentration auch das unspezifische Bindungsvermö-gen des Heparins für Proteine am grössten ist, müssen Konzentrationen gewählt werden, bei welchen das thrombinartige Enzym gebunden wird, andere Proteine jedoch die Kolonne ungehindert durchlaufen. Für jedes Gift können die optimalen Konzentrationsbedingungen durch einfache Vorversuche ermittelt werden. Die Bindung aller untersuchten thrombinartigen Schlangengiftenzyme erfolgt bei Konzentrationen der Pufferoder Neutralsalzlösungen oder Puffer-Neutralsalz-Lösungen, die je nach Giftart in einem Molaritätsbereich von 0,01 bis 0,5 liegen, und bei einem von 4 bis 10. Zur Abspaltung der an insolubilisiertes Heparin gebundenen thrombinartigen Schlangengiftenzyme werden Puffer- oder Neutralsalzlösungen oder Puffer-Neutralsalz-Lösungen verwendet, die eine höhere Konzentration aufweisen als die zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete Lösung. Vorzugsweise verwendet man die gleiche Pufferlösung wie diejenige, welche zur Bindung des Enzyms an das Heparin verwendet wurde, erhöht jedoch deren Konzentration durch Zusatz eines stark dissoziierenden Neutralsalzes, vorzugsweise Natriumchlorid, derart, dass das gebundene Enzym von dem Heparin abgespalten wird. Da in einigen Schlangengiften auch andere Substanzen mit einer Affinität gegenüber insolubilisiertem Heparin vorhanden sind, wird die Konzentration der zur Eluierung verwendeten Lösung vorzugsweise so eingestellt, dass das thrombinartige Enzym abgespalten wird, andere Substanzen mit höherer Affinität jedoch an Heparin gebunden bleiben. Die Abspaltung aller an insolubilisiertes Heparin gebundenen thrombinartigen Schlangengiftenzyme wird vorzugsweise bei Konzentrationen, die zwischen 0,1 und 1 Mol liegen, und in einem pH-Bereich von 4 bis 10 durchgeführt. Die restlose Entfernung aller am insolubilisierten Heparin gebundenen Giftbestandteile mit einer Heparinaffinität, die stärker als diejenige der thrombinartigen Enzyme ist, wird zweckmässigerweise mit Puffer- oder Neutralsalzlösungen oder Puffer-Neutralsalz-Lösungen, die ein pH von 4 bis 10 und eine Molarität von 0,5 bis 2 aufweisen, durchgeführt. Vorzugsweise wird wiederum die erste Pufferlösung, welche zur Bindung des Enzyms an das Heparin verwendet wurde, durch Zusatz eines Neutralsalzes, vorzugsweise Natriumchlorid, auf die gewünschte Konzentration gebracht. Das Affinitätsadsorbens kann nun durch Waschung mit der ersten Pufferlösung, welche zur Bindung des Enzyms an das Heparin diente, wieder in den gebrauchsfertigen Zustand versetzt werden.

Das Bindungsvermögen von insolubilisiertem Heparin gegenüber den thrombinartigen Schlangengiftenzymen ist bei tiefer Temperatur am grössten und nimmt mit steigender Temperatur ab. Man kann dieses Phänomen dazu nutzen, die Bindung des Enzyms an das Heparin bei tiefer Temperatur, z.B. in einer mit Eiswasser gekühlten Kolonne, und die Abspaltung des Enzyms durch Erhöhung der Temperatur im Kühl- bzw. Heizman-

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tel der Kolonne, z.B. auf 40 °C, unter Verwendung einer einzi- An unlösliche Träger gebundenes, immobilisiertes Heparin gen Pufferlösung von gleichbleibender Konzentration und kann räumlich geeignet angeordnete, mit geeigneten basischen gleichbleibendem pH zu bewirken. Gruppen ausgestattete Proteine über Ionenaustausch an sich

Die Abspaltung des Enzyms vom insolubilisierten Heparin binden. Diese Wechselwirkung zwischen dem Polyanion Hepa-kann ferner bei gleichbleibender Konzentration des wässrigen 5 rin und den amphoteren Proteinen wird sowohl durch stärkere Mediums an Puffer und/oder Neutralsalz durch Erhöhung oder Anionen als Heparin als auch durch stärkere Kationen als das Herabsetzung des pH über bzw. unter den Wert, bei welchem betreffende Protein konkurrenziert. Durch Eluierung mit stark die Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin stattge- dissoziierenden Salzen oder durch Verschiebung der Wasserfunden hat, durchgeführt werden. Der für jedes Enzym geeigne- stoffionenkonzentration können daher über Ionenbindungen an te pH-Bereich lässt sich durch Vorversuche ermitteln. io insolubilisiertes Heparin gebundene Proteine wieder abgelöst

Der Gehalt der erhaltenen Eluate an thrombinartigem werden.

Schlangengiftenzym kann durch einen Gerinnungstest, Vorzugs- Aus dem nachfolgenden Ausführungsbeispiel 1 geht hervor, weise an Fibrinogen, geprüft werden. Als Gerinnungstest eignet dass das thrombinartige Enzym von Bothrops moojeni selbst sich z.B. die Messung der Gerinnungszeit in Sekunden, nach beim unphysiologischen pH von 8,5 eine derart grosse Affinität Zusatz von 0,2 ml verdünntem Eluat zu 0,2 ml 0,4 %igem Rin- 15 gegenüber an CNBr-Sepharose gekoppeltes Heparin besitzt, derfibrinogen, bei pH 7,4 und 37 °C. Die einfache Gerinnungs- dass es bei einer Elektrolytkonzentration von 0,1 Mol pro Liter Zeitbestimmung eignet sich gut zur Erstellung eines Aktivitäts- festgehalten wird. Erst die Erhöhung der Elektrolytkonzentra-profiles in chromatographischen Eluierkurven (siehe Fig. 1 der tion auf die unphysiologische Höhe von 0,25 Mol pro Liter beiliegenden Zeichnung). Aus einer nach derselben Technik un- vermag bei pH 8,5 das Enzym aus seiner Salzbildung an Hepa-ter Verwendung eines Thrombin-Standardpräparates (z.B. US- 20 rin ablösen.

Standard Thrombin, National Institute of Health, Bethesda, Dass zwischen dem Heparin und dem thrombinartigen En-

Md.) oder unter Verwendung eines Standardpräparates für das zym eine spezifische chemische Bindung entsteht, geht daraus betreffende thrombinartige Schlangengiftenzym (z.B. Ancrod- hervor, dass die Hauptmenge der im Bothrops-moojeni-Gift Standard der Weltgesundheitsorganisation oder Batroxobin enthaltenen Proteine die Säule aus immobilisiertem Heparin moojeni Standard, First British Standard) ermittelten Eichgera- 25 ungehindert passiert. Ein weiterer Beweis für diese Tatsache den kann aus der Gerinnungszeit die Aktivität quantitativ in besteht ferner darin, dass immobilisiertes Chondroitinsulfat A,

NIH-Thrombin-Einheiten bzw. in Ancrod-Einheiten oder in ein chemisch nahe mit Heparin verwandtes Mucopolysaccharid, Batroxobin-Einheiten abgelesen werden. Der Gehalt an throm- kein Bindungsvermögen gegenüber der thrombinartigen Pro-binartigem Enzym kann aber auch in einem photometrischen teinase aus Bothrops-moojeni-Gift aufweist.

Test unter Verwendung eines synthetischen chromogenen 30 Das erfindungsgemässe Verfahren besitzt gegenüber den Thrombinsubstrates, wie z. B. Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl, in bekannten Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen Enzym-Einheiten bestimmt werden. Eine Einheit (U) ist dann Schlangengiftenzymen mehrere erhebliche Vorteile. Das Bin- -die Menge Enzym, welche unter den Testbedingungen innert dungsvermögen von insolubilisiertem Heparin für thrombinarti-einer Minute 1 uMol Substrat spaltet. ge Schlangengiftenzyme ist so gross, dass an einer Chromatogra-

35 phiesäule von nur 20 ml Inhalt mehr als 4 g Rohgift oder eine Aus den vereinigten aktiven Fraktionen können uner- äquivalente Menge vorgereinigte Enzymfraktion aufgetrennt wünschte Puffersubstanzen und Salze durch Dialyse ganz oder werden können, wobei thrombinartige Enzyme von einem ho-teilweise entfernt werden. Eine gleichzeitige Entsalzung und hen Reinheitsgrad erhalten werden. Dies entspricht etwa dem Konzentrierung der vereinigten aktiven Fraktionen kann durch 40-fachen der Leistungsfähigkeit einer Ionenaustauschchroma-Ultrafiltration, z.B. durch eine Diaflo-Membran UM-2 (Ami- 40 tographie an Celluloseaustauschern, etwa dem 400-fachen der con, Oosterhout, Holland), vorgenommen werden. Ob die das Leistungsfähigkeit einer Gelchromatographie und etwa dem 25-thrombinartige Schlangengiftenzym enthaltende Fraktion ent- fachen der Leistungsfähigkeit der Affinitätschromatographie an salzt und konzentriert werden soll, hängt von der Art des ver- p-Aminobenzamidin-succinyl-diaminodipropylaminoagarose. wendeten Puffers, von der chromatographierten Substanzmenge Dieses grosse Bindungsvermögen des insolubilisierten Heparins und vom Verwendungszweck des Produktes ab. Bei Verwen- 45 erhöht nicht nur die Trennkapazität einer relativ kleinen Chro-dung untoxischer Puffersysteme, wie z.B. Glycin/NaOH/NaCl, matographieapparatur, sondern bewirkt auch, dass die aktiven zur Gewinnung thrombinartiger Enzympräparate für die experi- Fraktionen des Eluates das Enzym in wesentlich höherer Kon-mentelle und/oder therapeutische Defibrinogenierung muss zentration enthalten, als dies bei Ionenaustausch- und Gelchro man nicht oder nur partiell entsalzen, um aus den vereinigten matographie der Fall ist, wodurch viel weniger Arbeitsaufwand aktiven Fraktionen des Eluates nach herkömmlichen Methoden 50 für Konzentrierung und Entsalzung der Eluate aufgebracht wer-eine isotonische sterile, pyrogenfreie Lösung herstellen zu kön- den muss. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden die nen. Partielle Entsalzung genügt auch dann, wenn das in einem thrombinartigen Schlangengiftenzyme in wenigen, leicht durch-Eluat enthaltene thrombinartige Schlangengiftenzym zwecks zuführenden und weitgehend automatisierbaren, gut registrierweiterer Reinigung rechromatographiert werden soll ; es genügt baren Arbeitsgängen gewonnen. Eine Verwendung von toxi-dann, die Puffer- bzw. Salzkonzentration des Eluates auf den 55 schen Eluiermitteln ist nicht erforderlich.

zur Bindung erforderlichen tieferen Wert zu reduzieren, um das

Enzym erneut an insolubilisiertes Heparin binden zu können. Es war durchaus nicht vorauszusehen, dass man thrombinar-

Die Bindung zwischen dem insolubilisierten Heparin und tige Enzyme durch Bindung an insolubilisiertes Heparin aus den thrombinartigen Enzymen ist sehr wahrscheinlich salzarti- Schlangengiften isolieren könnte. Es war zwar bekannt [siehe I. ger Natur. Heparin ist ein aus Schwefelsäureestern des Glucosa- 60 Danishefsky et al., Thrombosis Research 8,134 (1976) ],

mins und der Glucuronsäure aufgebautes Mucopolysaccharid. Thrombin durch Affinitätschromatographie an durch Bindung Als ein starkes Polyanion kann Heparin mit basischen Amino-, an Sepharose unlöslich gemachtem Heparin zu reinigen. Bei Guanidino- und Imidazolgruppen von Proteinen Salzbindungen dieser Methode wird davon Gebrauch gemacht, dass Heparin (Ionenbindungen) eingehen. Aus diesen Bindungen kann in be- Thrombin hemmt, d.h. gegenüber Thrombin eine hohe Affinität stimmten Fällen die Hemmung der biologischen Aktivität des 65 bzw. Bindungsfähigkeit aufweist. Die Entdeckung der Tatsache, betreffenden Proteins resultieren. So hemmt Heparin durch sei- dass auch thrombinartige proteolytische Schlangengiftenzyme, ne Einwirkung auf Thrombin und auf die Gerinnungsfaktoren welche als solche durch Heparin nicht gehemmt werden, d.h. IXa, Xa, XIa und XIIa die Blutgerinnung. gegenüber gelöstem Heparin keine erkennbare Bindungsfähig-

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keit aufweisen, oder anders ausgedrückt, von gelöstem Heparin nicht gebunden werden, durch insolubilisiertes Heparin gebunden und somit durch Bindung an insolubilisiertes Heparin isoliert und gereinigt werden können, war sehr überraschend und nicht voraussehbar.

Beispiel 1

9 g Heparin-Natrium mit einer spezifischen biologischen Aktivität von 162 internationalen Einheiten per mg wurden in 1 Liter 0,1-molarem Natriumbicarbonatpuffer, der 0,5 Mol/Liter Natriumchlorid enthielt und ein pH von 8,3 aufwies, gelöst. Der Lösung wurden 45 g CNBr-Sepharose 4B (AB Pharmacia, Uppsala), welche zuvor in 0,001 N Salzsäure gequollen und gewaschen worden war, zugesetzt. Die Mischung wurde während 2 Stunden gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde die Mischung durch eine Glasfilternutsche G-3 filtriert und das abfiltrierte Sepharose-Heparin fünfmal mit je 300 ml Natriumbicarbonatpuffer der oben angegebenen Zusammensetzung gewaschen. Zur Absättigung von allfällig noch vorhandenen reaktionsfähigen CNBr-Gruppen wurde das Sepharose-Heparin während 2 Stunden mit 1 Liter 0,5 %igem Äthanolamin im Natriumbicarbonatpuffer der obigen Zusammensetzung gerührt. Das Sepharose-Heparin wurde wiederum auf einer Glasfilternutsche gesammelt und noch dreimal mit je 300 ml Natriumbicarbonatpuffer gewaschen. Nun wurde das Sepharose-Heparin so lange mit 0,1-molarem Natriumacetatpuffer von pH 4,0 nachgewaschen, bis das pH des Filtrâtes 4,0 betrug. Schliesslich wurde das insolubilisierte Heparin mit mehreren Portionen 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 gewaschen, in eine Kolonne von 26 mm Durchmesser eingefüllt und mit demselben Glycin/NaOH-Puffer äquilibriert. Die Kolonne, die eine Höhe von 29 cm aufwies und somit etwa 153 ml insolubilisiertes Heparin enthielt, wurde nun zur absteigenden Chromatographie eingerichtet. Der Säulenauslauf wurde über ein auf die Messung bei 280 nm eingestelltes, mit einem automatischen Schreiber ausgerüstetes Durchflussphotometer an einen Fraktionensammler, der zur Sammlung von Fraktionen von je 350 Tropfen eingestellt war, angeschlossen.

30 g Bothrops-atrox-Gift (Bothrops moojeni nach HÖGE) wurden in 600 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mittels 1N HCl auf 3,0 und nach einer Stunde Inkubationszeit mit 1N NaOH auf 7,3 gestellt. Das dabei entstandene flockige Produkt wurde durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Dem Überstand wurde eine Lösung von 15 g Natriumsalicylat in 300 ml destilliertem Wasser zugesetzt. Das pH der Lösung wurde mit 1 N HCl auf 3,0 gestellt. Nach 60

Minuten wurde der gebildete Niederschlag abzentrifugiert, in 200 ml 0,1-molarem Glycin-NaOH-Puffer von pH 8,5 aufgenommen und auf einem Ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon) so lange mit demselben Puffer gewaschen, bis eine Filtratprobe nach Zusatz von Eisen-III-chlorid keine violette Färbung mehr gab und daher frei von Salicylsäure war. Das auf dem Filter überstehende Konzentrat von etwa 30 ml wurde mit 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 auf ein Volumen von 50 ml eingestellt. Es enthielt dann 2240 Batroxobin-Einhei-ten (BU) per ml und wurde auf die vorbereitete Sepharose-Heparin-Säule gegeben. Durch Spülung mit 750 ml 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer I) wurden Ballaststoffe eluiert. Hierauf wurde die Kolonne mit 0,1-Mol/Liter Natriumchlorid enthaltendem 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer II) eluiert, bis 1120 ml Flüssigkeit durchgeflossen waren, wobei erneut Ballaststoffe eluiert wurden. Nun wurde das thrombinartige Enzym in Form von zwei UV-absor-bierenden und Fibrinogen-koagulierenden Zonen durch Eluierung mit 0,25 Mol/Liter Natriumchlorid enthaltendem 0,1 -molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer III) bis zu einem Durchflussvolumen von 900 ml aufgefangen. Schliesslich wurden noch an dem Sepharose-Heparin gebunden gebliebene Substanzen durch Eluierung mit 600 ml 1 Mol/Liter Natriumchlorid enthaltendem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer IV) entfernt. Der Chromatographieverlauf ist in Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung schematisch dargestellt.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, in welcher einerseits die UV-Absorption (Abs) bei 280 Nanometer und andererseits die mit Eluatproben in Verdünnung 1:10 erzielten Fibrinogen-gerinnungszeiten (Gz) in Sekunden als Funktionen der aufgefangenen Flüssigkeitsvolumina in ml aufgetragen sind. Die Absorption ist durch die ausgezogene Kurve dargestellt, während die Gerinnungsaktivität durch das gestrichelte Profil dargestellt ist. Die geraffte Aufzeichnung der Flüssigkeitsvolumina ist durch die gestrichelten Unterbrüche in der Absorptionskurve angedeutet.

Das thrombinartige Enzym (Batroxobin) war in 800 ml Eluat in einer Konzentration von 100 Batroxobin-Einheiten per ml enthalten. Die Ausbeute, bezogen auf die aufgetragenen 112'000 BU, betrug somit 71,4%. Das Eluat wurde auf einem Ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon) auf 80 ml eingeengt und diente als Batroxobinkonzentrat für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparates mit einem Batroxobingehalt von 22 Batroxobin-Einheiten per ml zur therapeutischen Defi-brinogenierung.

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C

1 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen proteolytischen Enzymen aus Schlangengiften bzw. Schlangengiftfraktionen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Schlangengift bzw. die Schlangengiftfraktion in einem wässrigen Medium mit an einem in Wasser unlöslichen Träger gebundenem insolubili-siertem Heparin in Berührung bringt, um das thrombinartige Enzym an das insolubilisierte Heparin zu binden, die unerwünschten Begleitstoffe des Schlangengiftes entfernt und das thrombinartige Enzym mit einem wässrigen Medium vom Heparin abspaltet.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wässrige Medium Wasser ist.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wässrige Medium eine Q,01- bis 0,5-molare Pufferlösung ist, die ein pH von 4 bis 10 aufweist.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte 20 Heparin verwendete wässrige Medium eine wässrige 0,01- bis 0,5-molare Lösung eines Neutralsalzes, z.B. Natriumchlorid, ist, die ein pH von 4 bis 10 aufweist.
5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte 25 Heparin verwendete wässrige Medium eine sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltende wässrige Lösung ist, die eine Gesamtkonzentration von 0,01 bis 0,5 Mol/Liter und ein pH von 4 bis 10 aufweist.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeich- 30 net, dass man als insolubilisiertes Heparin ein durch Bindung von Heparin über seine Aminogruppen an die reaktiven Gruppen einer polymeren wasserunlöslichen Trägersubstanz, z.B. Agarose, Putrescinagarose, Epsilonaminocaproylagarose oder Cyanogenbromidagarose, erhältliches Produkt verwendet. 35
7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Abspaltung des Enzyms von dem insolubili-sierten Heparin eine wässrige Pufferlösung verwendet, welche eine molare Konzentration, die grösser ist als diejenige der zum Binden des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendeten 40 Lösung ist und zwischen 0,1 und 1 Mol pro Liter liegt, und welche ein pH von 4 bis 10 aufweist.
8. Verfahren nach Patentansprüchen 1 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Pufferlösung 0,1 bis 1 Mol pro Liter eines Neutralsalzes, z.B. Natriumchlorid, enthält. 45
9. Verfahren nach Patentanspruch 1 und 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin bei einer Temperatur durchführt, die über der Temperatur liegt, bei welcher das Enzym an das insolubilisierte Heparin gebunden wird.
10. Verfahren nach Patentanspruch 1 und 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abtrennung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin mittels der gleichen Pufferlösung oder Puffer-Neutralsalz-Lösung, wie sich zum Binden des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendet wird, jedoch bei einem pH durchführt, das unter oder über dem pH liegt, bei welchem das Enzym an das insolubilisierte Heparin gebunden wird.

Thrombinartige Schlangengiftenzyme werden als Reagenzien zur Untersuchung von Blutgerinnungsvorgängen, als anti-haemorrhagische Arzneimittel sowie als Mittel zur experimentellen und therapeutischen Defibrinogenierung und somit zur Antikoagulation verwendet.

In der nachfolgenden Tabelle sind für die thrombinartigen Enzyme aus den Giften einiger Schlangenarten die Verwendung und die diesbezüglichen Literaturhinweise angegeben.

Tabelle 1 Gift der Arten:

Verwendung für

Agkistrodon Blut-contortrix Untersuchung

Agkistrodon Defibrino-rhodostoma genierung

Bothrops atrox

Defibrinogenierung

Blutstillung

50

55

Blutuntersuchung

Bothrops Blutstillung jararaca

Crotalus Defibrino-

adamanteus genierung

60