CH631485A5

CH631485A5 - Verfahren zur herstellung eines stickstoffhaltigen polysaccharids.

Info

Publication number: CH631485A5
Application number: CH823777A
Authority: CH
Inventors: Chikao Yoshikumi; Toshihiko Wada; Masahiko Fujii; Hiromitsu Makita; Kinzaburo Suzuki; Akio Shinmyo; Haruhisa Hayashi
Original assignee: Kureha Chemical Ind Co Ltd
Priority date: 1976-07-22
Filing date: 1977-07-05
Publication date: 1982-08-13
Also published as: DK334077A; NL174568B; JPS5315495A; AU2700677A; AU514350B2; SE432614B; ATA531277A; ES460885A1; DK144890C; HU175948B; DD133444A5; PL199764A1; AT360941B; RO72636B; DK144890B; DE2731570C3; CS222237B2; BG40486A3; JPS5614276B2; SU740156A3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids, das sich zur Herstellung von Medikamenten, insbesondere solchen zur Krebsbekämpfung, eignet.

Es ist bekannt, dass ein Polysaccharid mit Antitumoraktivi-tät aus der Brühe erhalten werden kann, in welcher Pilz aus der Basidiomyzetenklasse mit wässrigem flüssigem Medium kultiviert worden ist. Es ist auch eine anerkannte Tatsache, dass bei der Submerskultur von Pilzen aus der Basidiomyzetenklasse in einem flüssigen Medium das gewünschte Polysaccharid nicht nur im Myzel, sondern auch im Medium erzeugt wird.

Die Herstellung von Polysaccharid aus solchen Submers-kulturen von Pilzen aus der Basidiomyzetenklasse erfolgte daher allgemein nach einem Verfahren, bei welchem das Myzel zerkleinert wird, während das verwendete Medium (die Kulturbrühe) in der Form, in welcher sie anfällt, oder nach Zugabe von Wasser zu dieser verwendet wird, worauf die Kulturbrühe der Filtration oder Zentrifugentrennung zur Entfernung des Myzelrückstandes aus der Brühe unterzogen und das gewünschte Polysaccharid aus dem so erhaltenen flüssigen Anteil gewonnen wird.

Obwohl dieses Verfahren als zweckmässig und praktisch anwendbar gilt, bietet es doch einige ernsthafte Schwierigkeiten. Wenn beispielsweise das Produkt der Submerskultur direkt in Myzel und flüssigen Anteil getrennt wird, kann diese Trennung nicht wirksam erzielt werden. Dies ist nicht nur durch die erhöhte Viskosität des Systems, sondern auch durch den hohen Wassergehalt des Myzels bedingt. Durch Zusatz von Wasser kann die Viskosität der Kulturbrühe vermindert und die Extraktionsgeschwindigkeit mit Wasser erhöht werden, aber die Verwendung von überschüssigem Wasser führt zu einer längeren Dauer der Trennung und vermindert den Wassergehalt des Myzels nicht.

Aus diesen Gründen sind Verbesserungen bei der Gewinnung der gewünschten Polysaccharide aus Submerskulturen gemäss obigen Angaben insbesondere in bezug auf höhere Effizienz und höhere Ausbeute wünschbar.

Hauptziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Polysaccharid mit Antikrebswirkung und weiteren vorteilhaften pharmakodynamischen Aktivitäten aus Submerskulturen von Pilzen aus der Basidiomyzetenklasse in technischem Massstab und in hoher Ausbeute.

Das Verfahren der Erfindung ist durch die in Patentanspruch 1 genannten Merkmale gekennzeichnet. Wesentlich für das erfindungsgemässe Verfahren ist, dass man die Zielsubstanz nicht direkt aus der Kulturbrühe gewinnt, sondern erst nach einmaligem Trocknen der Kulturbrühe und folgendem Extrahieren derselben mit einem wässrigen Lösungsmittel.

Die Pilze der Basidiomyzetenklasse, die für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden, sind diejenigen, welche der Gattung Coriolus angehören und zu welchen beispielsweise die folgenden gehören: Coriolus versicolor (Fr.) Quél, Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus hirsutus (Fr.) Quél, Coriolus pargamenus (Fr.) Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quél, und Coriolus conchifer (Schw.) Pat. Die morphologischen Merkmale und mykologischen Eigenschaften dieser Basidiomyzeten sind in der Publikation «Coloured Illustration of Fungi of Japan» von Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo, Bände 1,1974, und II, 1975, erläutert. Von diesen Basidiomyzeten sind die im folgenden angegebenen Pilze bei dem Fermentationsforschungsinstitut des Departements für industrielle Wissenschaft und Technologie, dem vom Generaldirektor des japanischen Patentamtes bestimmten Institut, hinterlegt:

Nr. Hinterlegungsdatum

Coriolus FERM-P-2414 25. Dezember 1973

versicolor (Fr.)

Quél

Coriolus consors FERM-P-988 24. Juni 1971 (Berk.) Imaz.

Coriolus hirsutus FERM-P-2711 6. September 1974 (Fr.) Quél

Coriolus FERM-P-2712 6. September 1974

pergamenus (Fr.)

Pat.

Gemäss der Erfindung werden Pilze, wie die oben erwähnten, nach einem Submerskulturverfahren kultiviert. Die hier verwendete Bezeichnung «Submerskulturverfahren» bezieht sich auf Methoden, bei welchen die Kultur in flüssigem Medium unter Belüftung und Rühren erfolgt und das Wachstum des Myzels nicht an der Oberfläche des flüssigen Mediums, sondern vorwiegend in den tieferliegenden Teilen der flüssigen Schicht erzielt wird. Bei solchen Kulturen wird meist mit einer Belüftungsrate von etwa 0,1 bis 2,0 Liter/Liter/min (Medium) und mit Rührgeschwindigkeiten von etwa 30 bis 800 U/min gearbeitet.

Als Medium für die Submerskultur können alle bekannten natürlichen oder synthetischen Medien verwendet werden, wie sie allgemein für die Kultur von Mikroorganismen verwendet werden, oder geeignete Modifikationen solcher bekannten Medien. Eine Kulturdauer von etwa 3 bis 10 Tagen mit einem solchen Medium ist ausreichend, um das gewünschte Polysaccharid in ausreichend hoher Ausbeute zu erzeugen.

Bei Submerskulturen in wässrigem Medium pflanzt sich das Myzel nicht an der Flüssigkeitsoberfläche unter Bildung grosser Massen fort, wie dies bei stationären Kulturen der Fall ist, sondern die Myzelen entstehen in Form von relativ kleinen plätzchenartigen Gebilden oder als faserige Stücke, was durch die beim Rühren ausgeübten Scherkräfte bedingt ist. Bei diesem Verfahren wird das Polysaccharid nicht nur im Inneren der Myzelen, sondern auch an deren Aussenseite gebildet, d. h.

auch im Medium.

Beim erfindungsgemässen Verfahren wird die aus der oben erwähnten Submerskultur von Pilz aus der Basidiomyzetenklasse erhaltene Kulturbrühe einer Trocknung unterworfen. Diese Trocknung wird meist bei einer Temperatur im Bereich von 60 bis 150 °C erzielt. Die für diese Trocknungsbehandlung angewendeten Trocknungsvorrichtungen bzw. Methoden unterliegen keiner Beschränkung und man kann alle üblichen Vorrichtungen, wie Trockentrommeln, Schnelltrockner oder

5

10

15

20

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30

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40

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60

65

3

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Dünnschichtverdampfungsanlagen, verwenden.

Diese Kulturtrocknungsbehandlung hat die Wirkung, dass die folgende Extraktion mit wässrigem Medium sehr erleichtert wird, ebenso das Gewinnen des Polysaccharides durch Raffinieren der Extraktlösung. Wenn die Temperatur dieser Trocknungsbehandlung niedriger als 60 °C liegt, führt dies nicht nur zu einer verringerten Trocknungsgeschwindigkeit, sondern auch dazu, dass die oben angegebenen Effekte nur in unzureichendem Mass erzielt werden. Es ist auch zu bemerken, dass das gewünschte Polysaccharid bei höheren Trocknungsempe-raturen zum Zersetzen neigt, so dass es sich empfiehlt, die Trocknungsbehandlung bei einer Temperatur von nicht über 150 °C durchzuführen.

Die Kulturbrühe, die der oben erwähnten Trocknungsbehandlung unterzogen worden ist, wird dann mit einem wässrigen Lösungsmittel extrahiert, und zwar nach Methoden, wie sie üblicherweise für die Extraktion der Fruchtkörper oder Myzelen angewendet werden. Die Bezeichnung «wässriges Lösungsmittel» bedeutet hierbei Wasser oder eine wässrige Lösung, die ein Alkali, Salz (z. B. Natriumchlorid, Natriumacetat), polares organisches Lösungsmittel (z. B. Methanol, Äthanol) oder dergleichen enthält, doch ist die Extraktion unter Erhitzen mit Wasser oder einer verdünnten alkalischen Lösung beim Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders wirksam und der Einsatz von Mehrstufen-Extraktionsmethoden mit solchen Extrakt- bzw. Extraktionslösungen ist für die technische Anwendung besonders vorteilhaft.

Die so erhaltene Extraktlösung wird dann zur Raffination der Lösung behandelt, um aus dieser die Stoffe mit Molekulargewichten von weniger als 5000 zu entfernen und dadurch das gewünschte Polysaccharid zu erhalten, und zwar durch Ultrafiltration und/oder Umkehrosmose.

Nach dem Entfernen der Anteile mit niedrigem Molekulargewicht (Molekulargewicht von weniger als 5000) aus der Extraktlösung durch die oben beschriebene Raffinationsbehandlung kann die Extraktlösung der Sprühtrocknung oder der Gefriertrocknung unterworfen und dann zu kommerziellen Produkten verarbeitet werden.

Das nach dem Verfahren der Erfindung in der oben beschriebenen Weise erhältliche Polysaccharid ist meist ein leberbrauner Stoff mit einem Stickstoffgehalt von 2 bis 8%, meist 3 bis 6%, das keinen klaren Schmelzpunkt zeigt und sich bei Temperaturen von über etwa 120 °C langsam schwarz färbt und zersetzt, in Wasser löslich aber nahezu unlöslich in Alkohol, Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan und ferner nahezu geschmacklos und geruchlos ist.

Die nachfolgende Tabelle I zeigt die Ergebnisse verschiedener, an erfindungsgemäss erhältlichen Produkten durchgeführten Farbreaktionstests.

Tabelle I

Farbreaktion

Farbe

Resultate a-N aphthol/Schwefelsäure-

purpurn

Saccharide

Reaktion (Molish-Reaktion)

bestätigt

Indol/Schwefelsäure-Reaktion braun

Saccharide

(Disch-Reaktion)

bestätigt

Anthron/Schwefelsäure-Reak- grünlich-

Saccaride tion blau bestätigt

Phenol/Schwefelsäure-Reak braun

Saccharide tion

bestätigt

Triptophan/Schwefelsäure-

purpur

Saccharide

Reaktion braun bestätigt

Lowry-Folin-Prozess blau

Peptidbindungen

bestätigt

Ninhydrin-Reaktion nach purpur-blau a-Aminosäuren

Hydrolyse mit Salzsäure

bestätigt

Die in der obigen Tabelle angegebenen Testergebnisse deuten darauf hin, dass das vorliegende Polysaccharid ein stickstoffhaltiges Polysaccharid ist. Das Molekulargewicht des Polysaccharides, gemessen in der Ultrazentrifuge, liegt meist im Bereich von 5000 bis 300 000 und das Gewichtsmittel-Molekulargewicht beträgt meist 10 000 bis 100 000. Die nach anderen Messmethoden erhaltenen Werte, wie etwa durch Fraktionieren mit einer Ultrafiltrationsmembran, liegen meist im Bereich von 10 000 bis 100 000. Daraus ergibt sich eine zuverlässige io Schätzung dahingehend, dass das mittlere Molekulargewicht des erfindungsgemäss erhältlichen Polysaccharides typisch im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt.

Das nach dem Verfahren der Erfindung erhältliche stickstoffhaltige Polysaccharid zeigt eine hervorragende Anti-15 tumoraktivität an Mäusen, und zwar nicht nur bei intraperitonealer, sondern auch bei oraler Verabreichung. Dies deutet darauf hin, dass das vorliegende Polysaccharid eine ausgezeichnete Brauchbarkeit als oral verabreichbares Antikrebsmittel aufweist. Tatsächlich ist dieser Effekt durch viele unterschied-20 liehe Experimente bestätigt worden. Ferner zeigt das vorliegende Polysaccharid zusätzlich zu dem oral erzielbaren Antitu-moreffekt auch eine hohe Aktivität in bezug auf die Wiederherstellung einer unterdrückten Immunität des Patienten. Das vorliegende Polysaccharid ist nicht nur zur Vorbeugung ungünsti-25 ger Nebeneffekte der Chemotherapie des Krebses und zur Erhöhung der Sensitivität bei der Radiotherapie, sondern auch zur Vorbeugung gegen die Ummunitätsschwächung oder Abnahme der physischen Kraft des Patienten geeignet, wie sie als Folge operativer Eingriffe oder Bluttransfusionen auftritt, 3o und ferner zur Behandlung bzw. Vorbeugung von Viren- oder Bakterieninfektionen, die besonders dann eine Gefahr darstellen, wenn die physische Kraft bzw. Immunität des Patienten abnimmt. Die orale Verabreichbarkeit der vorliegenden Polysaccharide bietet auch eine ausgezeichnete Wirkung in bezug 35 auf die Verbesserung der Leberfunktion, der Appetitanregung, der Beseitigung von Darmstörungen und der Förderung des Harnabganges. Ferner hat sich das erfindungsgemäss erhältliche Polysaccharid auch für die Behandlung der Lepra als nützlich erwiesen.

40 Das erfindungsgemässe Verfahren wird nun am Beispiel einer Ausführungsform erläutert. Dabei beziehen sich alle Angaben in Prozent auf das Gewicht, wenn nicht anders vermerkt.

45 Beispiel

1600 Liter Medium mit 10% Glucose, 1,5% Hefeextrakt, 0,1% KH2PO4 und 0,1% MgS04- 7H2O wurden in ein 2 m3 fassenden vertikalen Fermentator eingespeist und das Medium mit 20 Liter einer Pilzaufschlämmung von Coriolus versicolor 50 (Fr.) Quél FERM-P-2414 versetzt, die aus einer Schüttelkultur erhalten worden war, und sieben Tage bei 26 °C mit einer Belüftungsrate von 0,5 Liter/min/Liter Medium und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min kultiviert.

Die so erhaltene Kulturbrühe (Aufschlämmung) wurde in 55 Teilmengen von je etwa 500 Liter getrennt und jede dieser Portionen wurde in einem Doppeltrommeltrockner getrocknet. Die Oberflächentemperatur des Trommeltrockners wurde so eingestellt, dass die Temperatur an der Oberfläche der Kulturbrühe (die Brühenoberfläche haftet in Form einer dünnen 60 Schicht an der Trommeloberfläche) Werte von 65 °C, 80 °C, 90 °C, 110 °C bzw. 145 °C erreicht und der Wassergehalt der getrockneten Produkte jeweils geringer als 20 Gew.-% war (siehe folgende Tabelle II).

Dann wurde jedes dieser getrockneten Produkte mit 250 65 Liter heissem Wasser versetzt und 3 Std. bei 95 ± 1 °C extrahiert. Nach dem Abkühlen wurden die Proben unter Verwendung eines Schraubendekanters und einer Trennzentrifuge mit Trennplatten in Myzelrückstand und Extraktlösung getrennt.

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Die scheinbare Viskosität des Mischsystems und die für die bestimmten Wert steigt, kann die raffinierte Lösung gelieren, Zentrifugentrennung bei diesem Extraktionsverfahren erfor- was die Behandlung erschwert. Der Konzentrations-Grenz-derliche Zeit sind in Tabelle II angegeben. wert, unter welchem keine Gelierung erfolgt, ist in Tabelle II

Die aus der oben beschriebenen Behandlung erhaltene als kritische Konzentration angegeben.

Extraktlösung wurde durch eine PM-5 Membran eines HF- 5 Die Dauer der Sprühtrocknung der konzentrierten Lösung Ultrafilters der Firma Amicon Co. geführt, um die Extraktkom- und die Ausbeute an Polysaccharid sind ebenfalls in Tabelle II ponenten mit Molekulargewichten von weniger als 5000 aus angegeben. Zu Vergleichszwecken (Vergleichsbeispiele) wurde der Extraktlösung abzutrennen, was etwa 100 Liter gereinigte die gemäss obigen Angaben erhaltene Kulturbrühe ähnlich wie Lösung ergab. Da die Konzentration dieser raffinierten Lösung in den Beispielen behandelt, aber bei Temperaturen von 45 °C etwa 1% betrug, wurde sie in einer Konzentrieranlage auf einen,0 bzw. 160 °C getrocknet bzw. nicht getrocknet. Die an den so für die folgende Sprühtrocknung geeigneten Konzentrations- erhaltenen Proben ermittelten Ergebnisse sind ebenfalls in der wert eingeengt. Wenn die Lösungskonzentration über einen folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Beispiele Vergleichsbeispiele

Probe Nr.

1

2

3

4

5

1

2

3

Trockentemperatur (°C)

65

80

90

110

145

45

160

keine

Trocknung

Wassergehalt nach dem Trocknen (Gew.-%)

20

17

12

6

50

2

-

Menge der getrockneten Kultur (kg)

31

30

28

27

50

26

-

Heisswassermenge bei der Extraktion (Liter)

250

350

250

0

scheinbare Viskosität (cPs) des für die Extraktion

150

100

200

100

250

verwendeten Mischsystems

Dauer (min) der Trennung

35

30

60

30

90

Dauer (Std.) der Ultrafiltration

5,5

5

10

5

20

Kritische Konzentration (%) der raffinierten Lösung 15

15

8

15

4

Dauer (Std.) der Sprühtrocknung

10

24

10

37

Ausbeute (g)

900

950

800

950

Antitumoraktivitäten (Tumorinhibierung, %)

96

97

95

98

97

93

60

95

Intraperitoneale Verabreichung

orale Verabreichung

65

67

70

60

62

65

10

71

Bemerkungen

enthält

Verunreini

gungen

Aus den in Tabelle II angegebenen Zahlenwerten ist zu von über 150 °C durchgeführt wurde, bedeuten diese Werte ersehen, dass durch die Trocknungsbehandlung der nach dem 40 eine ausgezeichnete Inhibierungswirkung.

erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Kultur unter den Die Tumorinhibierung wurde nach der üblichen Methode angegebenen Temperaturbedingungen, insbesondere bei einer bestimmt, die im folgenden kurz beschrieben ist: Sarcoma-180 Temperatur im Bereich von 60 bis 150 °C, die folgende Extrak- Tumorzellen wurden intraperitoneal auf Mäuse transplantiert. tionsbehandlung, die Extraktreinigungsbehandlung und die Nach sieben Tagen ausreichendem Wachstum wurden 106 die-Konzentration der raffinierten Lösung sowie die Sprühtrock- 45 Ser Zellen nochmals auf die Achselhöhlenhaut der anderen nung in sehr vorteilhafter und rationeller Weise erzielt werden Mäuse zur Bildung fester Tumoren transplantiert. Mit der Ver-können. abreichung der Testsubstanzen wurde 24 Std. nach dem Trans-

Jedes der so erhaltenen Polysaccharidprodukte war ein plantieren begonnen. Bei intraperitonealer Verabreichung leicht in Wasser lösliches braunes Pulver. (Das Produkt von wurde die Substanz mit einer Dosierung von 10 mg in jeweils Vergleichsbeispiel 3 enthielt Spurenmengen unlöslicher 50 einer Tagesdosis an jedem zweiten Tag während einer Zeit-

Anteile.) Die Ergebnisse der Elementaranalyse der Produkte spanne von 20 Tagen verabreicht, so dass eine Gesamtmenge zeigte, dass jedes Produkt aus C, H, N und O bestand, wobei der von 0,2 ml/20 g (Mäusekörpergewicht) erreicht wurde. Bei ora-N-Anteil etwa 3 bis 3,5% betrug. Auch die Ergebnisse verschie- 1er Verabreichung wurde die Substanz in einer Dosierung von dener Farbreaktionstests der in Tabelle I angegebenen Art bes- 1000 mg/kg einmal täglich während einer Zeitspanne von 20 tätigen, dass die Produkte stickstoffhaltige Polysaccharide sind. 55 Tagen verabreicht, um eine Gesamtdosis von 0,2 ml/20 g (Mäu-

Die Inhibierungswirkung des vorliegenden Polysaccharides sekörpergewicht) zu erreichen. Jeder Tumor wurde 25 Tage gegen feste Sarcoma-180 Tumoren von Mäusen bei intraperito- nach dem Transplantieren ausgeschält. Das Tumorinhibie-nealer oder oraler Verabreichung entspricht den in Tabelle II rungsverhältnis wurde aus dem mittleren Gewicht der Tumo-angegebenen Werten. In allen Fällen mit Ausnahme der Probe, ren der Gruppe von Mäusen, welchen die Testsubstanz verab-bei welcher die Trocknungsbehandlung bei einer Temperatur 60 reicht worden war, und dem durchschnittlichen Tumorgewicht der Vergleichsgruppe berechnet.

Claims

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1. Verfahren zur Herstellung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, dass man Pilz der Gattung Coriolus aus der Klasse der Basidiomyzeten einer Sub-merskultur in wässrigem flüssigem Medium unterwirft, die erhaltene Kultur bei einer Tempëratur von 60 bis 150 °C trocknet und mit wässrigem Lösungsmittel extrahiert, und dass man die so erhaltene Extraktlösung-dann raffiniert, indem man aus dieser die Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als 5000 durch Ultrafiltration und/oder Umkehrosmose entfernt.

2. Nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 erhaltenes stickstoffhaltiges Polysaccharid.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion mit einem wässrigen Lösungsmittel in mehreren Stufen durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Lösungsmittel Wasser und/oder eine verdünnte alkalische Lösung ist.