JPS5932480B2 - 新規な糖蛋白複合体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗腫瘍活性及びレクチン様活性を示す新規な糖
蛋白複合体に関する。

本発明者はさきにサルノコシカケ科に属するカワラタケ
属の担子菌から抽出法により抗腫瘍活性を示す物質を製
造することに成功し、その活性成分として若干量の蛋白
質を含む蛋白多糖体を分離、確認した（米国特許第４０
５１３１４号公報及び第４２０２９６９号公報参照）。

本発明者はその後更に研究を重ねた結果、カワラタケ属
の担子菌の抽出物中に糖質部分に対する蛋白質部分の含
有割合が高く、且つ蛋白質部分のアミノ酸の結合が特異
的であつて、抗腫瘍活性に加えてレクチン様活性を示す
、従来公知の蛋白多糖体と異質な新規の糖蛋白複合体の
存在を見出し、該糖蛋白複合体の分離に成功して本発明
をなすに至つた。

以下本発明を詳しく説明する。

本発明に係る新規な糖蛋白複合体は超遠心法による測定
で５０００乃至３０００００の範囲の分子量を示し、ロ
ーリイフオリン法で定量して得られる蛋白質量とフエノ
ール硫酸法で定量して得られる糖質量との重量比率が５
０／５０〜８０／２０の範囲にあり、蛋白質部分はその
Ｎ末端アミノ酸がチロシン、ロイシン又はアラニンであ
り及びＣ末端からのアミノ酸の結合順位がロイシンフエ
ニルアラニンーバリンである構造を有し、且つ核酸を含
有することによつて特定し得且つ特徴付けできる。

本発明に係る糖蛋白複合体（以下本物質と略称する）を
特定する上記各パラメータを下記の手法により確認し得
る。

（１）分子量 本発明では高分子物質の分子量の測定に通常用いられる
超遠心法により測定して得られる値を本物質の分子量と
して示した。

（２）蛋白質量と糖質量の重量比率 本物質はローリイフオリン法（青色に呈色）及び塩酸に
よる加水分解物についてのニンヒドリン反応（紫青色に
呈色）に基き蛋白質を含有することが確認し得、又α−
ナフトール硫酸反応（紫色に呈色）、インドール硫酸反
応（褐色に呈色）、アンスロン硫酸反応（緑色に呈色）
、フエノール硫酸反応（褐色に呈色）、トリプトフアン
硫酸反応（紫褐色に呈色）、チオグリコール酸硫酸反応
（緑褐色に呈色）及びオルシン塩酸反応（緑褐色に呈色
）に基き糖質を含有することが確認し得る。

また、本物質中の蛋白質と糖質の各含有量はローリイフ
オリン法並びにフエノール硫酸法によりそれぞれ定量し
得るので、両者の含有量の重量比率が算出し得る。

なお、本物質中に含有されている蛋白質部分についてセ
バーグ法並びにトリフルオロトリクロロエタン法を適用
して沈殿生成を試１験したが両方の場合にも沈殿物の生
成がみられないことに鑑み、本物質中の蛋白質部分と糖
質部分は結合していることが確認し得る。

本物質における糖質部と蛋白質部との結合様式について
考察すると、一般に、糖と蛋白の結合様式としてはＮ−
アシルグリコシルアミン型、０−グリコシド型結合、グ
リコシドエステル型結合などが知られているが、本物質
の場合には上記結合が弱アルカリで容易に切断され難い
こと、および本物質の加水分解後のアミノ酸分析による
グリコサミンの確認などからみて、Ｎアシルグリコシル
アミン型が主体をなしているものと推定される。

３）蛋白質部分におけるアミノ酸の構成 本物質の蛋白質部分のアミノ酸組成を常法により分析し
た結果下記表１のとおりである。

表１にみられるごとく、これらのアミノ酸のうち、アス
パラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、フエ
ニルアラニン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バ
リン及びロイシンの合計量が全アミノ酸量の７５重量％
を占めている。また、蛋白質部におけるＮ末端アミノ酸
の種類は常法によりアミノ基をジニトロフエニル化し、
酸で加水分解した後、生成するジニトロフエニルアミノ
酸を薄層クロマトグラフイ一（ＴＬＣ）及び高速液体ク
ロマトグラフイ一分析をすることにより同定し得、Ｃ末
端アミノ酸とその近接アミノ酸の結合順位は，カルボキ
シペプチダーゼ法を適用し、分解により得られるアミノ
酸を薄層クロマトーグラフイ一分析をすることにより同
定し得る。

なお、本物質の蛋白質部分の物理的特徴を調べる目的で
本物質をカラムアンホライン等電点電気泳動させた結果
によるとＰＨ２．５〜５，５の範囲の等電点を示すこと
に鑑み、本物質は酸性を示す糖蛋白複合体であることが
確認し得る。

因みに、本物質の滴定曲線は第１図に示すとおりである
。第１図の滴定曲線は本物質の１％濃度水溶液を調製し
Ｎ／５０ＨＣ１並びにＮ／５０Ｎａ０１Ｖ）各水溶液を
滴定液として用いて測定した結果を示したものである。

（４）糖質部分の構成 本物質の糖質部分の構成糖は、本物質の加水分解生成物
について常法により還元、アセチル化した後、ガスクロ
マトグラフイ一分析を行うことにより確認し得る。

なお、糖質部分の構成糖は下記表２に示すとおりである
。

上表にみられるごとく本物質の糖質部分は８種の単糖を
含有し、量的にはグルコースが主であるがキシロース、
マンノースも相当量存在しグルコース、マンノース、キ
シロースで８５％以上を占めることを特徴とするヘテロ
グリカンである。

］）核酸の存在 本物質中の有機リン酸を湿式灰化法により無機正リン酸
にした後Ｆｉｓｋｅ−ＳｕｂｂａｒＯｗ法により定量し
、核酸塩基としてのウラシルを高速液体クロマトグラフ
イ一（島津高速液体クロマトグラフイ一ＣＡｌ９３−０
７３）を用いＵＶ２５４ｎｍで定量することにより核酸
の存在を確認し得る。

又上記紫外線吸収の測定により２６０ｎｍ及び２８０ｎ
ｍに吸収を示すこと（吸光度比０．７５〜０．９５）か
らも核酸の存在が確認し得る。

なお、通常核酸の分画に用いられているＳｃｈｍｉｄｔ
−Ｔｈａｎｎｈａｕｓｅｒ−Ｓｅｈｎｅｉｄｅｒ法（Ｓ
ＴＳ法）に準拠して本物質の核酸画分の分画を試みたが
分画されなかつたことに鑑み、本物質中の核酸は結合し
た状態で存在しているものと推定される。参考として本
物質の赤外線スベクトルをＫＢｒ錠制法により測定した
結果を例示すると第２図に示すとおりである。第２図に
おいて３６００〜３２００ＣＴＩＬ〜１のプロードな吸
収は種々の度合に水素結合した０Ｈに由来するものと考
えられる。この吸収は試料の糖質部の水酸基をＯ−メチ
ル化すると減少或いは消失することなどから推定できる
。１５３０ｃｍ−１の吸収は−ＮＨの変角振動と考えら
れ、いずれも試料中の蛋白質部分に起因するものと思わ
れる。

また、１２００〜１００００ｍ−１の、プロードな吸収
は糖質部のピラノース環Ｃ−０−Ｃ結合の非対象伸縮振
動によると考えられる。本物質の調製；本物質は下記方
法により製造し得る。

カワラタケ属に属する坦子菌、例えばカワラタケ（ＣＯ
ｒｌＯｌｕｓｖｅｒｓｉｃＯｌＯｒ（Ｆｒ．）Ｑｕｂｌ
．）、アラゲカワラタケ（ＣＯｒｉＯｌｕｓｈｉｒｓｕ
ｔｕｓ（Ｆｒ．月＊Ｑｕ６ｌ．）、ハカワラタケ（Ｃｎ
ｒｉＯｌｕｓｐａｒｇａｍｅｒｕｓ（Ｆｒ．）Ｐａｔ．
）、ニクウスバタケ（ＣＯｒｉＯｌｕｓｃＯｎｓＯｒｓ
（Ｂｅｒｋ）Ｉｍａｚ）、ヤキフタケ（ＣＯｒｉＯｌｕ
ｓｐｕｂｅｓｃｅｎｓ（Ｆｒ．）Ｑｕ６ｌ．）、ミノタ
ケ（ＣＯｒｌＯｌｕｓｂｉｆＯｒｍｉｓ（ＫｌＯｔｚ．
）Ｐａｔ．）又はサカズキカワラタケ（ＣＯｒｉＯｌｕ
ｓｃＯｎｃｈｉｆｅｒ（Ｓｃｈｗ．）Ｐａｔ．）の子実
体又は菌糸体もしくは培養菌糸体を出発原料として用い
る。

なお、培養菌糸体は上掲の各坦子菌を培養して培Ｏ地表
面に発育した菌苔を生理食塩水の存在下でホモジナイズ
したものを種菌とし、これを静置又は深部培養すること
により得られる。生産効率の観点からこの培養菌糸体の
使用が好ましい。本発明の方法で使用する上掲の坦子菌
のうち寄５託されている菌株は下記表３のとおりである
。

上掲の菌株のうち、本物質の生産収率の観点からすれば
カワラタケＣＭ−１０１（ＦＥＲＭ−Ｐ２４ｌ２）を用
いることが有利である。出発原料としての上記担子菌を
熱水又は０．０１〜２．０Ｎの濃度のアルカリ水溶液の
ごとき水性溶媒で抽出を行う。

この抽出は通常８０〜１００℃の温度で１〜８時間行う
。抽出物は抽出残渣を除去した後、酸で中和して濃縮し
、得られる濃縮抽出物を（必要に応じ脱塩してから）透
析及び／又は限外沢過処理して分子量５０００以下の部
分を除去する。このようにして得られる生成物は、必要
に応じて濃縮し、乾燥して粉末にする。本発明の方法に
おける上記工程は本発明者らにより既に発表されていて
公知であり、その詳細は米国特許第４０５１３１４号公
報及び第４２０２９６９号公報に開示されている。

次に、本発明の方法では上述のごとくして分子量５００
０以下の部分を除去して得られる生成物もしくはその粉
末化物を等電点沈殿分画法を適用して分画する。

この分画によりＰＨ２．５〜５．０の範囲の画分を分取
する。分画の具体的手順は後記実施例に示すごとく、上
記範囲内におけるＰＨ値を調整することにより行い得る
。本発明の方法では上記分画により沈殿物として得られ
る画分を中和した後、透析或は限外沢過処理して脱塩す
ることにより糖製し、ついで乾燥粉末して製品を得る。

このようにして得られる本物質は淡褐色乃至褐色を呈し
、無昧、無臭の粉末であり、水に溶解するが、メタノー
ル、ピリジン、クロロホルム、ベンゼン及びヘキサンに
はほとんど溶けない。

次に、本物質の生理活性について説明する。（１）急性
毒性マウスおよびラットにおける急性毒性 マウスはＩＣＲ−ＪＣＬ系、４〜５週令、体重２１〜２
４７のものを、ラツトは呑龍系、４〜５週令、体重１０
０〜１５０ｙのものを用いた。

本物質の投与径路は静脈内、皮下、腹腔内および経口の
四経路の投与を実施した。本物質投与後は７日間にわた
り、一般症状、死亡ならびに体重について観察し、観察
期間終了後に層殺剖検した。その結果、下記表４に示す
ごとくラツト、マウスとも投与可能な最大投与量におい
ても−仝く死亡佑１け？めらｈイ Ｄ−の助２）レクチ
ン様活性一般にレクチン活性を示す物質は植物種子中に
多数見出されており、担子菌由来の物質のレクチン活性
については東ドイツ国特許第１２６８１８号がみられる
。

しかしながら、この特許はカワラタケ属に属する担子菌
由来の物質のレクチン活性については全く言及していな
い。又、従来植物種子中にみられるレクチン活性物質、
例えばタチナタマメ（Ｊａｃｋｂｅａｎ）から得られる
コンカナバリンＡ又はピーナツレクチンは本物質とは蛋
白質部分におけるアミノ酸構造及び蛋白質部分に対する
糖質部分の重量比において本質的に区別される。近年、
レクチン活性の生理活性剤特に抗腫瘍剤（制癌剤）にお
ける重要性が認識されてきていることに鑑み、本物質が
以下に示すレクチン様活性を示すことは有意義であると
言い得る。

以下に本物質のレクチン様活性のうち生理活性剤として
の利用上重要と考えられるものの特性を調べた結果を以
下に示す。（１）サルコーマ一１８０細胞凝集活性試験
下記に示す、手順による試験結果から本物質は、サルコ
ーマ一１８０細胞を凝集させることが確認された。

試験方法：ＩＣＲマウスに移植７日目のサル１−っ−１
Ｑｎ的ｈνＡ杓Ｂ５冶ＨＵ６６ｌァ，拡で２〜５倍に稀
釈１０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、これを２回繰返
し細胞を洗滌、赤血球を除去後細胞数が１×１０６個／
ｍｌとなるようＨａ］１ｋｓ液で調整した。

細胞浮遊液０．５ｍ１と本物質６ｍｙを生理食塩水１ｍ
１に溶解した溶液０．５ｍ１をラップテツクチヤンバ一
に分注し、混和した。この混和物を３７℃で１時間静置
後その 上清培地をすてた後、Ｈａｎｋｓ液で１回洗滌後検鏡し
、凝集細胞塊の数を測定した。

対照として０．５ｍ１生理食塩水を用いた。

結果：対照と、本物質の凝集塊数に有意の差を認めた。
（４）サルコーマ一１８０細胞凝集活性の単糖による阻
止試験試験方法：ＩＣＲマウスに移植７日目のサルコー
マ一１８０腹水細胞を取り、Ｈａｎｌｃｓ液で２〜５倍
に稀釈１０００１１）ｍで２分間遠心分離し、これを２
回繰返し細胞を洗滌、赤血球を除去後細胞数が１Ｘ１０
６個／ｍｌとなるようＨａｎｌｃｓ液で調整した。

細胞浮遊液０．５ｍ１と予め種々の単糖と本物質を３７
℃で、３０分インキユベートした溶液０．５ｍ１をラプ
テツクチヤンバ一に分注し、混和した。この混合物を３
７℃で１時間静置後その上清培地をすてた後、Ｈａｎｌ
ｃｓ液で１回洗滌後検鏡し、凝集細胞塊の数を測定した
。

本物質とインキユベートする際の単糖の濃度は３０００
μｙ／ｍｌであつた。

結果：Ｌ−フコース、α−メチルマンノシドで本物質の
凝集活性は抑制された。

（１１１）赤血球凝集阻止反応 下記に示す手順による試験結果から、本物質は非特異的
赤血球凝集阻止反応を示すことが確認される。

リンパ球幼若化反応 イ）ヒトリンパ球の幼若化反応 正常成人の末梢血を用い、リンパ球培養 法（微量培養法）による５日間の培養で、３Ｈ−Ｔｈｙ
ｍｉｄｉｎｅ（３Ｈ−ＴｄＲ）の取り込みからリンパ球
の幼若化率を下記手順により調べた。

その結果本物質は対照に比し有意（Ｐ〈０．０１）な３
Ｈ−ＴｄＲの取り込み増加がみられた。

健常成人静脈から採血した静脈血を、比 重分離液（ＦｉｃＯｌｌ−ＣＯｎｒａｙ）上に重層し、
４００７、３０分間遠心分離を行い、リンパ球を得た。

２０％新鮮ヒトＡＢ型血清添加ＲＰＭＩ ｌ６４Ｏ培地にリンパ球が７．５×１０′２／ｍｌにな
るように調整した。

上記リンパ球懸濁液０．２ｍ１をマイクロプレート（Ｍ
ｉｃｒＯｔｅｓｔ、フアルコン社）の各ウエル（Ｗｅｌ
ｌ）に分注した。

次に、本物質の生理食塩水溶解液を最終濃度０．１Ｔｆ
１ｆ／ｍｌになるように各ウエルに添加した。

この各ウエルを３７℃において５％（７）ＣＯ２条件下
で炭酸ガス培養器中で４日間培養後、０．０５μＣｉの
３Ｈチミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）を各ウエルに分注し、更
に２４時間培養した。

次いでセルハーベスタ一（ＭＡＳＨ、ラボサイエン ス社）を用い、リンパ球をガラスフアイバ一上にハーベ
ストした。

このガラスフアイバ一を充分に乾燥させた後、カウンテ
イングバイアルに入れ、次いで液体シンチレータ一を３
ｍ１分注し、液体シンチレーシヨンカウンタ一でリンパ
球にとり込まれた放射活性を測定した。

単位は１分間当りのＥＯｌ］Ｎｔ（Ｃ．Ｐ．ｍ．）にて
表示した。

その結果、本物質のリンパ球幼若化能は０．１Ｔｆ！９
／ｍｌの添加濃度で３Ｈ−ＴｄＲの取り込みは８０００
〜１００００ｃ．ｐ．ｍ．を示し顕著であつた。

（ロ）モルモヅトリンピ球に対する幼若化反応Ｈａｒｔ
ｌｅｙ系モルモツトの牌リンパ球１×１０６個／ｍｌと
本物質５０μ７／ｍｌを３７゜Ｃ、５％ＣＯ２で９６時
間培養し、３Ｈ−チミジン０．５μＣｉを添加し更に２
４時間培養、その取り込み量からにより調べたところ、
本物質は幼若化反応を有することがみとめられた。

本物質が示す上記リンパ球幼若化の現象 は、リンパ球が抗原刺激を受けて、抗体産生細胞等の機
能細胞に分化する際に必須の現象である。

また、リンパ球幼若化、即ち細胞分裂の活発化の結果と
して、その抗原に対して反応性を有する細胞群の細胞数
の増加がもたらされ（ＣｌＯｎａｌｅｘｐａｎｓｉＯｎ
）その一部は元の休止状態の細胞にもどつて、再び同じ
抗原の刺激があつた場合に、初回に比べ゛免疫効果゛の
本態であつて、このようにリンパ球幼若化現象は免疫応
答の上で非常に重要な意味をもつ現象である。

本物質は非特異的なリンパ球幼若化活性をもつており、
単一の抗原のように、特定の細胞群のみを幼若化させる
のではなく、より広い範囲の細胞群を幼若化させる活性
を有している。

このような活性が非特異的な免疫賦活効果をもたらし、
微生物感染や癌に対する宿主の抵抗註増強に寄与してい
ると考えられる。

実際、ＢＣＧや０Ｋ−４３２等既に一般に応用されてい
る非特異的免疫賦活作用を介する癌の免疫療法剤にはリ
ンパ球幼若化活性がみられることが知られている。

代表的なレクチンとして知られているＰＨＡ．．ＣＯｎ
Ａを用い経口投与によるＳａｒｃＯｍａ−１８０に対す
る抗腫瘍活性を調べた結果３５〜５０％程度の抗腫瘍活
性がみられた。

このことはレクチンとしてのリンパ球幼若化活性が抗腫
瘍作用に結びつくことを示しているといえる。

（Ｖ） リンバ球膜表面における糖鎖との親和性本物質
がリンパ球に結合する特性を有することは下記に示すＦ
ＡＣＳ （ＦｌｕＯｒｅｓｃｅｎｃｅＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌ
ｌＳＯｒｔｅｒ、ＢｅｃｔＯｎ−ＤｉｃｋｉｎｓＯｎ社
、Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて行つた結果により確認し得た。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胸腺を滴出し、 ＰＢＳ中でよくほぐし、２００メツシユのフイルタ一を
通して単細胞懸濁液を得た。

０．８３％塩化アンモン含有トリス塩酸バツフア一処理
により赤血球を除去して胸腺リンパ球を得た。

一方本物質の５％濃度の溶液（ＰＨ７．Ｏ）０．４ｍ１
にＦＩＴＣ （ＦｌｕＯｒｅｓｃｅｎｃｅｉｓＯ−ＴｈｉＯｃｙａｎ
ａｔｅ）０．６〜を添加し、４℃で一夜攪拌し、セフア
デツクスＧ−２５により未結合ＦＩＴＣ除去し、ＦＩＴ
Ｃ標識物を得た。

１×１０７個の胸腺リンパ球と０．２％ ＦＩＴＣ標識物０．１ｍ１を４℃で２０分間反応させＦ
ＩＴＣ標識物の結合リンパ球をＦＡＣＳにより解析した
。

その結果本物質がリンパ球に結合することが確認し得た
。

又、本物質がリンパ球に結合する特性は下記の手順に従
つて電子顕微鏡下での検鏡によつても確認し得た。本物
質２５ワとフェリチッ２５ワを反応せしめたのち、胸腺
細胞とＩｎｖｉｔｒＯで反応させた。

めの結果フェリチッのみではリンパ球表面に全く結合し
ないが本物質とフェリチッの結合物の場合はリンパ球表
面に結合しているのが走査電顕により観察される。これ
は本物質がリンパ球表面に結合していることの直接的証
明である。上述した本物質のリンパ球への結合特性は下
記に述べるごとくその抗腫瘍効果及び免疫応答に関与す
る。

リンパ球幼若化反応の場合、その第一段階の反応として
リンパ球への結合があることが考えられる。

しかし、リンパ球への結合により、リンパ球活性化を介
して抗腫瘍効果を発現する機作のみならず、リンパ球活
性化を阻害する因子のリンパ球への結合を抑制すること
により結果的に免疫応答を増強する作用機作も考えられ
る。即ち、例えば担癌状態の個体の血清中には、免疫応
答を抑制する作用をもつ物質が存在していることが知ら
れているが、本物質は、担癌マウス血清中より得られた
免疫抑制性物質のリンパ球への結合を抑制し、その結果
免疫抑制性物質とのリンパ球機能抑制を解除することが
分つた。従つて、本物質はリンバ球への結合性により、
一方では直接リンパ球を活性化し、一方では免疫抑制性
物質のリンバ球への結合を抑制することにより、非特異
的免疫賦活効果を発現し、抗腫瘍効果や抗感染効果を示
すものと考えられる。（｝ マクロフアージの走行性体
重１８〜２０ｙの８週令Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、本
物質の生理食塩水溶解液 （０．０３、０．１、１．０又は１０−絋ｍｌ濃度）１
ｍ１を腹腔内に注射した。

各投与群８〜１０匹／群で実験を行い、対照として生理
食塩水１ｍ１腹腔内投与群を設けた。注射後４８時間目
に、上記マウスをエーテル麻酔下で瀉血、注射後ヘパリ
ンを添加したパンクズ化液４ｍ１を腹腔内に注射し、腹
腔を充分にマツサージした。次いで、腹腔を開き、駒込
ピペツトにて上記注入液をとり出し、血球計算盤にて腹
腔滲出細胞数を測定した。その結果、第３図に示す如く
、本物質はマクロフアージに対し著明な活性を示すこと
が確認された。マクロフアージはそれ自身のもつ貧食作
用や抗体依存性の細胞障害作用により、宿主の癌や感染
に対する抵抗性に寄与している。

また、マクロフアージはいわゆる免疫系にも深く関与し
ており、リンパ球への抗原ＰｒｅｓｅｎｔａｔｉＯｎや
免疫反応の調節に役割を果していることが知られている
。

しかもレクチンにより刺激されたマクロフアージでは、
上述の様にマクロフアージの機能が高められている。マ
クロフアージ走化性はマクロフアージ活性化の指標であ
り、したがつて本物質はマクロフアージの活性化を介し
てマクロヲアージ宿主抵抗性をも増強するものと推定さ
れる。（３）抗腫厚活性 （１） ＳａｒｃＯｍａ〜１８０（結節型）に対する抗
腫瘍活性ＩＣＲ−ＪＣＬ系の２群のマウスに常法により
増殖したＳａｒｃＯｍａ−１８０の細胞１０６個を腹腔
内へ移植し、移植から２４時間経過後１群のマウスのみ
に本物質を１ＴＩ７９／Ｋｇ、１０ｍ９／Ｋ９並びに１
００ヮ／Ｋｇの投与量で１日おきに１回の割合で２０日
間腹腔内へ投与した。

上記移植から２５日経過後に両者の群に発生した腫瘍を
滴出して本物質の投与群から滴出した腫瘍の平均重量（
Ｔ）と本物質を投与しない対照群からの腫瘍の平均重量
（Ｃ）とから本物質の腫瘍抑制率を下記式により算出し
た。又、本物質を上記腹腔内注射に代えて経口で１００
ｍ９／Ｋｇ並びに２５０ワ／Ｋ９の投与量で同様に投与
して、上記手順に従つて本物質の抗腫瘍率を算出した。

（４）Ｅｈｒｌｉｃｈ腹水癌細胞（以下ＥＣ細胞と略記
する）に対する抗腫瘍活性ＥＣ細胞（５×１０６個／Ｍ
Ｏを本物質 ５０００μｙ／′！ｎｌを含むＨａｎｋｓ液中で３７℃
、３時間培養し（Ｉｎｃｕｂａｔｅ）、このようにして
培養したＥＣ細胞の１０６／匹をＩＣＲＪＣＬ系マウス
（１群１０匹）の腹腔内に移植し（本物質の投与量５０
ワ／Ｋｇ）移植から２０日経過後におけるマウスの生存
率によつて本物質の抗腫瘍活性を調べた。

なお、本物質で処理しないＥＣ細胞を移植した対照群（
１群１０匹）では移植後２０日迄に全動物が腫瘍死した
。

上記（１）及び（４）につ３・ての試験結果は後記実施
例に示すとおりであり、本物質の抗腫瘍活性が優れてい
ることが確認される。

本物質は上述したごとく、優れた抗腫瘍活性を示すので
抗腫瘍剤、特に経口抗腫瘍剤として有用である。

又、本物質はレクチン様活性を有するので宿主を介して
の免疫賦与活性があり、担癌患者のみならず、あらゆる
患者における免疫力の賦活及びこれら患者におけるウイ
ルス、細菌感染による種々の感染症の予防に卓効を奏す
る。本物質は通常粉末形態で患者に経口投与されるが患
者の状態によつては注射形態で投与することもできる。

本物質の投与量は経口投与では通常１〜１００ｍ９／Ｋ
９／日であつて、本物質は従来報告されている担子菌由
来の糖蛋白体もしくは多糖体から成る抗腫瘍活性物質に
比し極めて少量の投与量で優れた腫瘍抑制効果を奏する
。以下実施例を例示する。

実施例 １ 本物質の調製 カワラタケＣＭ−１０１（ＦＥＲＭ−Ｐ２４ｌ２、ＡＴ
ＣＣ２Ｏ５４７）菌株を、グルコース５％（重量、以下
同様）、ペプトン０．２％、酵母工キズ０．３％、ＫＨ
２ＰＯ４Ｏ．ｌ％及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２００．１％か
ら成る培地で１０日間培養し、培地表面に発育した菌苔
を生理的食塩水と共にホモジナイズしたものを種菌とし
た。

この種菌を上記同様な組成の培地２００ｍ１を収容した
１１容の培養器１００本にそれぞれ接種し、２５〜２７
℃で２５日間培養して各菌糸体を得た。菌糸体収量は培
養器１本当りそれぞれ２．０〜４．５ｙであつた。

この菌糸体１００７を０．１Ｎの苛性ソーダの水溶液３
１を用いて９７℃の温度で１時間抽出した。抽出残渣を
除去した後、得られた抽出物を酸で中和し、濃縮した。
次いで、得られた濃縮抽出物を透析及び限外沢過処理し
て該抽出物中の分子量５０００以下の低分子量物質を除
去した。

上記透析及び限外沢過処理に際しては必要に応じて濃縮
抽出物の脱塩処理を行う。上記低分子量物質を除去して
得られる生成物（この生成物は濃縮し、乾燥して粉末に
したものでもよい）を等電点沈殿分画法を適用してＰＨ
３．Ｏ及び３．５で分画してＰＨ３．Ｏ〜３．５の範囲
の画分を分取した。

上記分画操作は上記生成物をＰＨ３．５の緩衝液と混合
し、遠心分離して得られる上澄液を中和した後、アミコ
ン社製の卓上ハイフロー２０００型限外沢過装置（膜Ｄ
Ｍ−５）を用いて撹拌、冷却しながら、操作圧１．５ｋ
ｇ／Ｃｄｌ温度１０℃にて脱塩処理し、濃縮したものを
ＰＨ３．Ｏの緩衝液と混合し、遠心分離して得られる沈
殿物を分取することにより行つた。

上記沈殿物はＰＨを中性に調整しながら水に再溶解し上
記と同様な手法により脱塩処理して精製し、次いで乾燥
して粉末形態の本物質を得た。上述のようにして得られ
た本物質について分子量、糖の呈色反応、蛋白の呈色反
応、比旋光度、赤外スペクトル、アミノ酸分析、Ｎ末端
アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、糖質部分の構成糖、蛋白質
含量と糖質含量、紫外線吸収及び核酸の存在を示すウラ
シルと有機リンとの含量、及び生理活性上の特性を測定
した結果を表５に総括して示す。

なお、本物質についての上記各性質は下記手順によりそ
れぞれ測定した。ただし、本文中に測定手順を具体的に
示したものについてはその手順に従つて測定した。分子
量： Ｍ／１０ＫＣ１水溶液を用いて調製した本物質の０．３
％濃度の溶液を試料とし、２５℃の温度で、遠心カラム
の液柱を１．７ｍｍとして２２０００ｒ．ｐ．ｍで５時
間測定した。

比旋光度 本物質の０．１％濃度の水溶液を試料として、５？のセ
ルを用いて、ナトリウムのＤ線（５８９ｍμ）で旋光度
を測定し、比旋光度を算出した。

アミノ酸分析：本物質の１０即を試料として用い、これ
に６Ｎ塩酸４ｍ１を加え、ドライアイス・アセトンで凍
結後、減圧封管し、１１０℃で２４時間加水分解し、次
で乾燥後３０〜４０ｍ１のＰＨ２．２のクエン酸緩衝液
に溶解し、アミノ酸分析装置により測定した。

Ｎ末端アミノ酸分析：本物質の７ｍ９を試料として用い
、下記手順によりトリメチルアミンを用いるＤＮＰ（ジ
ニトロフルオロベンゼン）法で測定した。

試料を水０．７ｍ１ＶＣ溶解したのち、この溶液に５％
トリメチルアミン水溶液０．１４ｍ１１５％ジニトロフ
ルオロベンゼン／エチルアルコール０．７ｍ１を加え、
遮光下２８℃で３時間撹拌した。

得られた反応液に数滴の水ど少量のトリメチルアミン水
溶液を加えエチルエーテルにて４回洗つたのち、次に濃
塩酸数滴を加え酸性とし、更にエチルエーテルにて３回
洗滌したのち、水層を６ＮＨＣ１に相当する酸性度に調
整し、１１０℃に２０時間加熱して加水分解を行つた。
得られる加水分解液に水を加えて、約１ＮＨＣ１に相当
する酸性度としたのち、エチルエーテルにて３回抽出し
、エーテル層を乾個し、分析用試料とした。分析は高速
液体クロマトグラフイ一を用い（カラムＺＯｒｂａｘＯ
．Ｄ．Ｓ４．６φ×２５０ｍｍ）、移動層はアセトニト
リル−リン酸１ナトリウム系のグラージエント溶出法を
適用し、検出は２５４ｎｍにより測定した。Ｃ末端アミ
ノ酸分析：本物質の試料２５０Ｔｆ１９を秤量し、Ｍ／
４００ＴｒｉｓｐＨ８．６の緩衝液９．４６ｍ１に溶解
した。

別に、カルボキシペプチダーゼＡ−ＤＦＰ（ＳＩＧＭＡ
社製）を０．３０Ｕ／０．５４ｍ１の濃度に調製し、こ
れを上記試料液に加え、１０ｍ１としたのち、３０′Ｃ
にて、経時的に１ｍ１を分取し、これに氷冷しながら、
５０％酢酸１．５ｍ１を加え、ＰＨ２として、酵素反応
を停止し、沈殿物は遠心分離で除去した。

得られる上澄液を分取し、乾固後、ＰＨ２．２の緩衝液
に溶解し、アミノ酸自動分析計により、遊離アミノ酸を
分析した。

糖質部分の構成糖の分析： 本物質の試料１０即をガラスアンプルにとり、１．０ｍ
１１Ｎ硫酸を加えて、１００℃で１６時間加水分解を行
い、得られた加水分解液を室温で炭酸バリウムで中和し
た後、▲過し、得られた沢液に水素化ホウ素ナトリウム
を加えて還元し、次いでイオン交換樹脂を用いて脱塩し
た。

脱塩して得られた液を濃縮乾固し、残存するホウ素化合
物をメチルアルコールと共に減圧で共沸下に除去した後
、乾燥乾固した。残渣をビリジンにとかし、同量の無水
酢酸で１００℃でアセチル化し、得られたアセチル化混
合物を減圧下に保持して該混合物中の試薬を除去後、四
塩化炭素にとかしガスクロマトグラフで測定した。核酸
塩基としてのウラシルの測定： 本物質の試料を加水分解後、ゾルバヅクスＣＮカラムを
用いた高速液体クロマトグラフイ一により６％酢酸水溶
液を移動相としＵＶ２５４ｎｍで測定を行つた。

核酸存在の確認のための有機リン酸の定量：本物質中の
有機リン酸化合物を湿式灰化法により無機の正リン酸に
分解した後、定量した。

本物質の試料２〜と５ＮＨ２Ｓ０４２ｍ１をキエルダー
ル分解ピン中で加熱濃縮し、茶色になつたら冷却し、そ
の、３０％Ｈ２Ｏ２ｌ〜２滴を加え再び加熱し、無色と
し、冷却した後純水１ｍ１を加え湯浴中で５分間加熱し
、一定量にメスアップしたのち、その一部につきＦｉｓ
ｋｅ−ＳｕｂｂａｒＯｗ法により定量した。試料を使用
せずに同様な手順で定量したものをプランクとした。実
施例 ２〜１８ カワラタケＣＭ−１０１（ＦＥＲＭ−Ｐ２４ｌ２）の代
りに表５に示す各菌株を用い、等電点沈殿分画を表５に
示す各ＰＨ範囲で行うほかは、実施例１に記載と同様な
手顔に従つて本物質を製造し、得られる各物質について
実施例１と同様に理化学性質、構造上の性質及び生理活
性土の特性を測定した。

結果は表５及びその以降に総括して示す。なお、上記実
施例１〜１８により得られた物質は何れも下記に示すご
とき糖並びに蛋白の呈色反応を小した。（１）糖の呈色
反応 又、各実施例により得られた物質の赤外吸収スペクトル
を測定した結果、いずれも３６００〜３２００ＣＴｒＬ
−１１６００（１７７１−１、１５３０ＣＴＩＩ−１及
び１２００〜１０００Ｃ７１１−１ＶＣ吸収を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る糖蛋白複合体の滴定曲線（Ｎ／５
０ＨＣ１並びにＮ／５０Ｎａ０Ｈの各水溶液を使用）を
示したものであり、第２図は本発明に係る糖蛋白複合体
（実施例１）の赤外吸収スペクトルを示したものであり
、第３図は本発明に係る糖蛋白複合体のマクロフアージ
走化性を、血球計算盤にて腹腔滲出細胞数を測定した結
果に基いて示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 超遠心法による測定で５０００乃至 ３０００００の範囲の分子量を示し、ローリイフオリン
   法で定量した蛋白質量に対するフェノール硫酸法で定量
   した糖質量の重量比率が５０／５０〜８０／２０であり
   、蛋白質部分はそのＮ末端アミノ酸がチロシン、ロイシ
   ン又はアラニンであり及びＣ末端からのアミノ酸の結合
   順位がロイシン−フェニルアラニン−バリンである構造
   を有し、且つ核酸を含有することを特徴とする糖蛋白複
   合体。 ２ 蛋白質部分はアスパラギン酸、スレオニン、セリン
   、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、シス
   テイン、バリン、メチオニン、シスタチオニン、イソロ
   イシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリ
   プトファン、オルニチン、リジン、ヒスチジン及びアル
   ギニンから構成されており、アスパラギン酸、スレオニ
   ン、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、フェ
   ニル−アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンの
   合計量が全アミノ酸量の７５重量％以上である特許請求
   の範囲第１項記載の糖蛋白複合体。 ３ 糖質部分はフコース、リボース、アラビノース、キ
   シロース、マンノース、ガラクトース、グルコース及び
   グルコサミンから構成されており、グルコース、マンノ
   ース及びキシロースの合計量が全糖量の８５重量％以上
   である特許請求の範囲第１項記載の糖蛋白複合体。 ４ 核酸塩基としてのウラシル含有量が０．０１〜０．
   ５０重量％である特許請求の範囲第１項記載の糖蛋白複
   合体。 ５ カワラタケ属に属する担子菌を水性溶媒で抽出し、
   得られる抽出物を透析及び／又は限外濾過して該抽出物
   中の分子量５０００以下の部分を除去し、得られる生成
   物を等電点沈殿分画法で分画してｐＨ２．５乃至５．０
   の範囲の画分を分取することを特徴とする糖蛋白複合体
   の製造法。 ６ 超遠心法による測定で５０００乃至 ３０００００の範囲の分子量を示し、ローリイフオリン
   法で定量した蛋白質量に対するフェノール硫酸法で定量
   した糖質量の重量比率が５０／５０〜８０／２０であり
   、蛋白質部分はそのＮ末端アミノ酸がチロシン、ロイシ
   ン又はアラニンであり及びＣ末端からのアミノ酸の結合
   順位がロイシン−フェニルアラニン−バリンである構造
   を有し、且つ核酸を含有する糖蛋白複合体を有効成分と
   する、レクチン様活性を示すことを特徴とする抗腫瘍剤
   。