JPH01296162A - レセプタープレインキューベーションエンザイムアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はエンザイムイムノアッセイに関し、特にβ−ガ
ラクトシダーゼ補完アッセイに関する。

〔従来技術〕

種々様々なイムノアッセイは、活性酵素を補完および形
成するβ−ガラクトシダーゼの断片の能力を基にしてい
る。特に、β−ガラクトシダーゼ酵素供与体（ＥＤ）は
β−ガラクトシダーゼ酵素受容体と結合して活性なβ−
ガラクトシダーゼ酵素を形成する。小さい分析体（ａｎ
ａｌｙｔｅ）または該ＥＤに類似した分析体の成る部位
への接合は、補完反応によるβガラクトシダーゼを形成
する能力に影響せず−そのためβ−ガラクトシダーゼ触
媒活性の速度にも影響しない。しかしながら、該ＥＤ−
分析体接合体が抗−分析体抗体と結合している時、その
補完速度は妨害され、それにより反応の初期段附の間の
酵素触媒反応速度が減少する。

酵素触媒反応速度におけるこの減少は、多数の分析体を
定量するのに用いられており、そこでは反応混合物中に
存在するＥＤ−分析体接合体および試料中に存在する分
析体がＥＡの添加の前に抗−分析体抗体を目当てに競争
する。β−ガラクトシダーゼ形成の重合速度および酵素
触媒反応速度は、試料中に存在する分析体の量が増加す
るにつれて増加する。

〔関連文献〕

修飾されたβ−ガラクトシダーゼ酵素供与体および酵素
受容体は、化学合成および組換え技術により調製されて
いる。修飾された断片は、補完に関するβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を保持しており、そして分析体の生産および
該断片への付着を容易にする。例えば米国特許第４，７
０８，９２９号およびその中に引用された文献を参照さ
れない。

〔発明の要約〕

試料中の分析体の濃度を測定するためのβ−ガラクトシ
ダーゼ補完イムノアッセイ法が提供される。この方法は
、予め形成された酵素供与体−（ＥＤ−）分析体接合体
／抗−分析体抗体複合体と試料中に存在する分析体との
結合に基づいている。

この方法は、β−ガラクトシダーゼＥＤ−分析体接合体
／抗−分析体抗体複合体、β−ガラクトシダーゼ酵素受
容体（ＥＡ）、酵素基質および試料を反応せしめ、そし
て該試料中に存在する分析体の量の指標として酵素触媒
反応の速度を測定することを含んで成る。通常、該ＥＡ
は、前記複合体の抗−分析体抗体が試料中に存在する分
析体と反応するための時間の後に反応混合物に添加され
る。

〔好ましい実施態様〕

分析体の濃度を決定するためのβ−ガラクトシダーゼ補
完アッセイ法が提供される。この方法は、予め形成され
たＥＤ−分析体接合体／抗−分析体抗体複合体を利用す
る。該複合体中に存在する抗−分析体抗体が試料中に存
在する分析体と反応するのに十分な時間の間、該複合体
を試料中に存在する分析体と一緒にする。ＥＡおよび酵
素基質を添加して、β−ガラクトシダーゼ活性を有する
反応混合物を形成せしめる。便利には、ＥＡをＥＤ−分
析体接合体／抗−分析体抗体複合体および試料の混合物
に、分析体と該複合体との反応のための時間の後で添加
する。ブレークダウンされたβ−ガラクトシダーゼ触媒
反応の速度を、試料中に存在する分析体の量の指標とし
て、ある選択された時間に測定する。

このアッセイ法は、従来技術のイムノアッセイまたは補
完法により測定されるいずれの分析体を定量するのにも
使用され得る。このアッセイ法は、該分析体を含有する
いかなる水性試料に関しても利用され得る。該分析体は
、免疫原、例えば高分子量（ＭＷ＞　１０００）を有す
るペプチド、タンパク質または炭水化物であってもよい
が、普通には体液中、最も普通には血清または血しょう
中に存在するハブテン（ＭＷ＜　１０００）であろう。

粒状物の除去の他には、通常、即時のアッセイ法のため
に試料の前処理を全く行わないであろう。

酵素供与体および酵素受容体は、β−ガラクトシダーゼ
の部分配列であり、酵素供与体の方がより小さい。どち
らかの単量体が変異されてもよい。

β−ガラクトシダーゼ酵素供与体断片は本来のβ−ガラ
クトシダーゼ単量体のＮ端部分と本質的に同じアミノ酸
配列を有する。該酵素受容体は、β−ガラクトシダーゼ
単量体分子の５０％よりも多い　Ｃ端部分と本質的に同
じかまたは同一の配列を有する。β−ガラクトシダーゼ
活性は、β−ガラクトシダーゼ酵素受容体断片と該酵素
供与体接合体の補完に起因する。

該酵素受容体は、酵素供与体接合体と結合して、アッセ
イの条件下で反応混合物中に存在する分析体の量に関連
して酵素活性が変化するような複合体を提供することに
より特徴づけられる。即ち、該酵素供与体−分析体接合
体／抗−分析体抗体複合体が試料中に存在する分析体と
反応すると、分析体を該反応混合物に全く添加しない時
の酵素活性と比較して、測定時間の間の酵素活性が実質
的に増加する。

β−ガラクトシダーゼ酵素供与体および受容体は米国特
許第４，７０８，９２９号（この開示は引用により本明
細書中に組み込まれる）において、分析体および酵素供
与体−分析体接合体であるとして記載されている。その
出願において記載されているアッセイの条件は主題の発
明に適用できる。

抗−分析体抗体は、ポリクローナルでもモノクローナル
でもよい。抗−分析体抗体の調製法は公知であり、そし
て本発明の部分を構成しない。多数のポリクローナルお
よびモノクローナル抗体が商業的に入手可能である。ま
た、分析体と特異的に結合するレセプターを該抗体の代
わりに利用することもでき、例えばビタミンＢ１２−内
因子および葉酸−葉酸塩結合タンパク質を利用できる。

使用するアッセイ条件および反応緩衝液は、酵素供与体
と酵素受容体との間の補完のために用意される。一般に
、生理的緩衝液、例えばリン酸塩緩衝化塩溶液、トリス
緩衝液および同様な緩衝液が有用である。好ましい緩衝
液は、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ　　ＮａＰＯ４、約
５１１ＩＭ〜約１０ｍＭ　　ＥＧＴ＾、および約１０ｍ
Ｍ〜約２０ｍＭ　　ＮａＮ、を含んで成り、６〜８のｐ
Ｈを有するものである。温度は通常少なくとも２５℃１
好ましくは高められるが６０℃以下であろう。

エンザイムアッセイは一般に室温（２５℃）から約４０
℃よりも低い温度の間、最も普通には約３７℃において
行われる。最適な結果は約３７℃にて達せられた。該ア
ッセイは大気圧にて実施される。

アッセイ媒質中の酵素供与体接合体の濃度は、普通約１
ｎＭ〜約６０ｎＭ、より普通には約５ｎＭ〜約２５ｎＭ
の範囲内であろう。酵素受容体は、普通、実質上過剰で
あろう。酵素供与体接合体対酵素受容体のモル比は、通
常１：３０〜１　：　　２００、普通には１：５０〜１
：１５０であろう。酵素供与体−分析体接合体の濃度は
、試料中に見出されると予想される分析体の最高濃度を
超えるであろう。

試料中に存在する分析体の量を決定する最初の段階とし
て、β−ガラクトシダーゼＥＤ−分析体接合体／抗−分
析体抗体複合体および試料を、該複合体が該試料中に存
在する分析体と反応して第一反応混合物を形成するのに
十分な時間の間インキュベートする。該ＥＤ−分析法接
合体／抗折分析体抗体複合体便利には、実質的に反応が
完了するのに十分な時間の間、水性媒質中鎖ＥＤ−分析
体接合体を抗−分析体抗体と一緒にすることによる、ブ
レインキュベーション段階において形成される。ＥＤ−
分析体と抗−分析体抗体との完全な反応は、３７℃にお
いて通常少なくとも３０分はかかる。その後で、該複合
体をアッセイにおいて使用するかまたは、後の使用のな
めに液体もしくは便利には乾燥した形態において保存し
てもよい。

該ＥＤ−分析体および抗−分析体抗体は、反応混合物中
に存在する実質上全てのＥＤが抗−分析体抗体と結合し
、且つ反応混合物中に存在する全ての抗−分析体抗体が
ＥＤ−分析体接合体と結合するような量において存在す
る。従って、抗体の濃度は所望のアッセイレンジおよび
抗体のクラス並びにアッセイ条件下での該分析体に対す
る結合親和力に依存して変化するだろう。例えば、Ｉｇ
Ｍ対ＥＤ−分析体の正常比が結合部位において１：１０
である一方、　ＩｇＧ対ＥＤ−分析体の比は結合部位に
おいて１：２であろう。該抗体およびＥＤ−分析体接合
体が適当な比において存在する時を決定するために、抗
体濃度の滴定を行って、酵素シャットダウンを達成する
のに必要な抗体の最小濃度を決定する。

°゛酵素シャットダウン″は、ＥＤ−分析体接合体、抗
−分析体抗体、ＥＡおよび基質の存在下で達成される酵
素活性の最低量を意味する。抗体結合部位濃度がＥＤ−
分析体濃度よりも有意に低い時に、酵素で触媒されるバ
ックグラウンド活性の増加された量が観察される。十分
な抗体が存在し、そしてＥＤ−分析体接合体が適切に滴
定される時、酵素速度は最低の活性に達する（シャット
ダウン）。

その後、過剰の抗体が酵素触媒反応の速度に何らの変化
をもたらさないばかりでなく、反応混合物に添加された
少量の分析体が補完の抑制をモジュレートすることもな
く、このなめ酵素触媒反応速度をモジュレートすること
もない。もちろん、抗体の濃度は分析体に対するそれの
親和力および所望のアッセイのレンジに依存して大きく
変化する。

普通、抗体および接合体の濃度はシャットダウンを達成
するのに必要な濃度の８５％以内、より普通には９５％
以内である。加えて、ＥＡの添加の前に反応混合物へ抗
−分析体抗体のＦｃ部分に特異的な第二抗体を添加する
ことは、ポリクローナル抗血清を使った時のシャットダ
ウンにおけるβ−ガラクトシダーゼ触媒反応速度を低下
せしめる。

しかしながら、第二抗体の使用はモノクローナル抗血清
を使った時には有意な違いを生じないことがわかった。

第一反応混合物を形成させるための該ＥＤ−分析法接合
体／抗折分析体抗体複合体料とのインキュベーションは
、該複合体が分析体と反応するのに十分な時間の間であ
る。普通このインキュベーションは約３７℃にて少なく
とも約５分間、より普通には約２０〜５０分間またはそ
れより長い。

通常ＥＡは、試料中に存在する分析体によりＥＤ−分析
体の消失が起こるのに必要とされる反応時間はど長くは
反応混合物中に存在しない。消失段階の間のＥＡの存在
は、過大なバックグラウンドシグナルの蓄積を生み、そ
のなめ分析体−含有および分析一体一非含有の反応混合
物における酵素触媒反応速度の差異を検出することを困
難にする。

ＥＡを試料と同時に添加した時（即ち、０分間のインキ
ュベーション）、０％分析体と高キャリブレータ−分析
体対照〈実施例の部分で“１００％分析体対照パと称す
るもの）との間の速度の差異は、７分と５分での光学濃
度の差異を測定した時全く観察されなかった。（本明細
書中で使用される”１００％分析像分析”または゛′高
キャリブレーター゛は、分析体の無限濃度、即ち分析体
のさらなる添加が反応速度に影響しないような分析体濃
度を有する対照の試料である。）従って、ＥＡを試料と
同時に反応混合物に添加すると、該速度への分析体の影
響を観察するのにかなり長い時間を要する。

便利には、ＥＡの添加の前に該複合体を試料とインキュ
ベートする。ＥＡの添加の後での反応速度の差異は、ポ
リクローナル抗−ジゴキシン抗体を使った模範的なジゴ
キシンアッセイにおいて複合体と試料とのインキュベー
ションのわずか２〜６分後に観察される。しかしながら
、高キャリブレータ−と０％分析体対照との間の反応速
度の差異は、ＥＡの添加に続いて数分以内（通常、１０
分より短い）にそれらの速度を測定すると便利にも少な
くとも約２５％であろう。特定のアッセイ条件下でのそ
の段階にとって最適なインキュベーション時間を決定す
るために、この差異を多数のインキュベーション時間に
おいて測定することができる。ＥＤ−分析体接合体／抗
−分析体抗体複合体の形成のためのより短いインキュベ
ーション時間がモノクローナル抗体を使用する場合には
必要かもしれない。

様々な量の試料を使用することができる。試料が血清で
ある場合、試料は普通ＥＤ−分析法／チー分析体抗体／
試料応混合物の体積の少なくとも１．０−５０％を含ん
で成る。しかしながら、第一反応混合物の体積の２〜４
倍を含んで成り２７／３〜４１５の第二反応混合物を形
成することもできる。

該媒質中の酵素活性の量は、β−ガラクトシダーゼ活性
を測定するための標準的な技術に従って、試料中に存在
する分析体の量の指標として測定される。酵素基質は酵
素により分解された時に分析媒質の光の吸収（光学濃度
）または発光の量の変化をもたらすものを使用する。即
ち、基質の分解が着色または蛍光生成物の出現または消
失をもたらす。好ましい酵素基質はクロロフェノールレ
ッドガラクトシド（ｃＰＲＧ）である。ＣＰＲ（クロロ
フェノールレッド、生成物）の吸光度は５７４ｎｍで測
定される。ＣＰＲＧおよび他の適合性酵素基質、例えば
木星上Ｉニトロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮ
ＰＣ）が商業的に入手可能である。ＣＰＲＧを使った場
合、便利には第一の光学濃度の測定の前にＥＡの添加に
続いて反応混合物を１〜１０分間インキュベートする。

光学濃度の第一の読み取りと第二の読み取りとの間は普
通１〜５分、より普通には２〜４分である。酵素基質は
予め形成されたＥＤ−分析体接合体／抗−分析体抗体複
合体、試料またはＥＡのいずれかと共に反応液に添加さ
れ得る。

血清試料中に存在するジゴキシンの量を測定するための
模範的な方法は、ポリクローナル抗−ジゴキシン抗体お
よび該抗−分析体抗体のＦｃ部分に特異的な第二抗体を
使う。その方法は次の段階を次のような順序で含んで成
る：（ａ）約３０ｍＭ〜４０ｍＭのβ−ガラクトシダー
ゼＥＤ−ジゴキシン接合体をポリクローナル抗−ジゴキ
シン抗体および第二抗体と反応緩衝液中約３７℃にて約
３０分間インキュベートして第一反応混合物を形成せし
める。

前記抗−ジゴキシン抗体はＥＤ−分析体と比較して実質
的にシャットダウンを達成するのに十分な量で存在する
。（ｂ）同体積の前記試料と前記第一反応混合物とを一
緒にして第二反応混合物を形成せしめる。（ｃ）前記第
二反応混合物を約３７℃にて約５０分間インキュベート
する。（ｄ）約０．５μＨ〜２．０μ阿のβ−ガラクト
シダーゼＥＡおよび過剰の基質、通常約２１１ＩＭ〜約
１０ｍＭのＣＰＲＧを前記第二反応混合物と一緒にして
着色反応混合物を形成せしめる。（ｅ）前記着色反応混
合物を約３７℃にて少なくとも約１分間インキュベート
する。（ｆ）前記着色反応混合物の光学濃度を測定する
。（８）前記着色反応混合物を約３７℃にて少なくとも
約１分間さらにインキュベートする。（ｈ）前記着色反
応混合物の光学濃度を測定する。（ｉ）段階（ｆ）と（
ｈ）との光学濃度測定値の差異を測定し、そしてこれを
既知の濃度の試料についての光学濃度の差異と比較する
。対照試料を使った時の濃度に対する光学濃度のグラフ
は、前記試料の濃度を決定するのに使用され得る。

血清試料中に存在するＴ３の量を測定するための方法は
モノクローナル抗体を使用する。その方法は次の段階を
次のような順序で含んで成る＝（ａ）約５　ｎＭ〜５０
　ｎＭのβ−ガラクトシダーゼＥＤ−７３接合体を反応
Ｍ街液中モノクローナルマウス抗−Ｔ３３体と約３７℃
にて約１０〜３０分間インキュベートして第一反応混合
物を形成せしめる。

前記抗−Ｔ３抗体はＥＤ−分析体接合体と比較して実質
的にシャットダウンを達成するのに十分な量で存在する
９（ｂ）前記第一反応混合物約１体積と前記試料的４体
積とを一緒にして第二反応混合物を形成せしめる。（ｃ
）前記第二反応混合物を約３７℃にて少なくとも約１５
分間インキュベートする。（ｄ）約１．５Ｘ１０−７Ｍ
〜７．５Ｘ１０−７Ｍのβ−ガラクトシダーゼＥＡおよ
び過剰の基質、通常約２ｆｆ１Ｍ〜約６ｍＭのＣＰＲＧ
を前記第二反応混合物と一緒にして着色反応混合物を形
成せしめる。（ｅ）前記着色反応混合物を約３７℃にて
少なくとも約１分間インキュベーＩ・する。（ｆ）前記
着色反応混合物の光学濃度を測定する。（ｇ）前記着色
反応混合物を約３７℃にて少なくとも約１分間インキュ
ベートする。（ｈ）前記着色反応混合物の光学濃度を測
定する９（１）段ＩＰ７（ｆ）と（ｈ）との光学濃度測
定値の差異を測定し、そしてこれを既知のＴ３濃度の試
料についての光学濃度の差異と比較する。

本発明を容易にする試薬を含有するキットもまた期待さ
れる。そのキットは、第一容器中にＥＤ−分析体接合体
／抗−分析体複合体をそして第二容器中に酵素受容体を
含んで成る。酵素基質は、ＥＤ−分析体接合体／抗−分
析体抗体複合体またはＥＡのどちらかと共に、便利には
前記複合体と共にインキュベー）〜され得る。該ＥＤ−
分析法接合体／抗折分析体抗体複合体］試料のアッセイ
に適する量の試薬を含有する単位用量のタブレットとし
て乾燥形で配合することができる。該ＥＡは錠剤形で用
意してもよい。各タブレットは分析体を倉まないだろう
が酵素基質を含んでいてもよい、前記複合体を含有する
タブしットは通常ＥＡを含まず、そしてＥＡを含有する
タブレ・ｌトはＥＤ−分析体接合体および抗−分析体抗
体を含まない。各タブレットは緩衝液をさらに含んでい
てもよい。該タブレットは常用の添加剤、例えば安定剤
、乾燥剤、賦形剤等と配合されてもよい。

該キットは、高および中間の分析体キャリブレータ一対
照標準をさらに含んでいてもよい。Ｍ街液および酵素基
質は、前記複合体を含有する試薬およびＥＡを含有する
試薬中に用意されない場合に該キットの中に含まれてい
てもよい。

〔実施例〕

鮭−り 例１はシャットダウンを達成するのに必要なＥＤ−分析
体および抗−分析体抗体の相対濃度の模範的な測定であ
る。いくつかの酵素供与体−分析体接合体は、全てが反
応混合物中に存在する時、抗−分析体抗体と反応するよ
りも速く酵素受容体と反応することが決定されている。

従・って、酵素受容体の添加の前に酵素供与体−分析体
接合体を抗−分析体抗体の種々の希釈液とインキュベー
トした。

模範的アッセイにおいて、ＥＤ−ジゴキシンおよび抗−
ジゴキシン抗体の相対濃度を測定した。

使用した緩衝液：　１００ｍＭ　　ＮａＰＯ４および１
５０ｍＭ　ＫＰＯ，；１０ｍＭ　ＥＧＴ＾（エチレン−
ビスーオキシエチレンニトリロ四酢酸）　；　２０ｍＭ
　ＮａＮ１　；　０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　；０．
０５＋ａＭジチオトレイトール；　２ｍＭ　Ｍｇ（Ｏ＾
Ｃ）２　’４Ｈ２０；　６．２５ｍｇ／　ｍｆ　０ＮＰ
Ｇ　；　ｐＨ７、ｏ。溶液は使用まで氷上に保存した。

ＥＤ−分析体濃度は３．８ｎＭであった。ポリクローナ
ルウサギ抗−ジゴキシン抗体を１　：　１０００の希釈
度で始まる逐次的二倍希釈法にて使用した。該酵素供与
体および抗体をＥＡの添加前に３７℃で３０分間インキ
ュベートした。インキュベーションは、ヤギの抗−ウサ
ギ血清（ＧＡＲＳ）をさらに含む希釈液シリーズのうち
の１つとの二重反復試験において行った。酵素基質とし
て０ＮＰＣを使って、該溶液の光学濃度を３００秒目３
よび４００秒目３測定して酵素触媒反応速度を決定した
。

第−Ｕ 抗体　　　　　…＾／１２０秒　　ｍ＾／１２０秒１　
：　１０００　　　　　　　１８０　　　　　　　　３
５１　：　２０００　　　　　　　１９０　　　　　　
　　４０１　：　４０００　　　　　　　２１２　　　
　　　　　６０１　：　８０００　　　　　　　２４２
　　　　　　　１３８１　：　１６０００　　　　　　
　２８０　　　　　　　２２２１　：　３２０００　　
　　　　　２９５　　　　　　　２６５１　：　６４０
００　　　　　　　３０２　　　　　　　２８０シャッ
トダウン反応は抗体の１　：　４０００と１：１６．０
００との間の希釈度で起こった。各抗体の希釈度におい
てＧＡＲＳの存在が低い酵素活性レベルをもたらした。

阿−ｊユ 例２においてＯｎｇおよび１１００ｎのジゴキシン試料
の間に酵素活性において差異が見られるかどうか測定し
た。ＥＤ−ジゴキシンおよび抗−ジゴキシン抗体を３７
℃にて３０分間インキュベートした。１　：　２０００
　、１　：　４０００　、１　：　８０００　、１　：
　１６，０００および１　：　３２，０００の抗体希釈
液を３．８ｎＭのＥＤ−ジゴキシンと供に使用しな。二
重の試料を次のようにしてアッセ・イした。Ｏｎｇおよ
び１１００ｎを含有するジゴキシン標準液を各複合体に
添加した。第一グループはＥＡおよび基質の添加の前に
３７℃で５０分間インキュベートした。第二セットの試
料においては、該標準液をＥＡおよび基質と共に添加し
、第二のインキュベーションはしなかった。

匿−じし−六一 検体　　　Ａｂ　　　　５０分間の　０分間の０　　　
１：２０００　　　２７　　　　　２９０　　　１：４
０００　　　４１　　　　　４６０　　　１：８０００
　　　９１　　　　１２００　　　１　：　１６０００
　　１３１　　　　１１．６０　　　１　：　３２００
０　　１５１　　　　２１８第二のインキュベーション
なしのものにおいては、光学濃度をＥＡの添加５分後と
７分後に測定した時、Ｏｎｇと１００１のジゴキシン試
料の間の酵素活性速度に有意な差異はないことがわかっ
た。

餞−」− 例３において酵素触媒反応速度の変化への第二のインキ
ュベーションの効果を測定した。０分〜１．００分のイ
ンキュベーション時間を１０分間隔で測定した。光学濃
度の変化は、ＥＡおよび酵素基質の添加ｆ＆　５〜７分
の期間内に測定された。反応速度の阻害率は次のように
計算した。Ｏｎｇのジゴキシン試料（０％分析体対照）
の光学濃度の変化を１１００ｎのジゴキシン標準試料（
１００％分析像分析）の光学濃度の変化から差し引く。

その数を１００ｎＨの試料についての光学濃度の変化で
割って阻害率を決定した。０．１０，２０，３０，４０
．５０および６０分についての阻害率は、それぞれ０．
２４，３７，４５，５１゜５９および６０であった。従
って、最初の３０分間が最後の３０分間よりも重要であ
るが、ＥＤ−分析体／抗−分析体複合体と分析体との反
応は１時間以内で完全には達していなかった。

隨−先 例４において固定された抗−分析体抗体の希釈度を使っ
て最適なＥＤ−分析体濃度を決定した。

この実験では、１　：　４０００の抗体希釈液を使って
ＥＤ−分析体接合体濃度を２．３ｎＭ〜６．８ｎＭの範
囲で変化させた。第二のインキュベーション（ＥＤ−分
析体接合体／抗−分析体抗体複合体を既知の濃度の分析
体とインキュベートする）は、６０分間であった。ＥＡ
の添加の後、３００秒および４２０秒目に反応混合物の
光学濃度を読みとり、酵素触媒反応速度を決定した。モ
ジュレーションの割合はいずれか２つの検体間の差異で
あった；即ち、高い方の検体の速度で割った正味の差異
。４ｎｇとＯｎｇとの検体間のモジュレーション率（％
）は、２．３゜３．０　、３．８　、４．６　、５．３
　、６．１および６．８ｎＭのＥＤ濃度についてそれぞ
れ２３．５　、２６．０　、３５．０　、３６．２　、
２７．９゜２３．０および１９．１であった。従って使
用した１　：　４０００の抗体の希釈度については、３
．８ｎＭと４．６ｎＭの間のＥＤ濃度においてモジュレ
ーションがピークになる。

匠−１ この例において、より濃縮されたＥＤ−ジゴキシン／抗
体複合体と共に反応混合物の５０％としての血清試料を
使ったアッセイを行うことの可能性を決定づける。Ｃ〕
、４および１１００ｎのジゴキシン対照標準を、３．８
ｎＭおよび４．６ｎＭＥＤ接合体と共に使−）た、この
場合血清の体積はそれぞ、ｆ′Ｎ試料の２０および５０
％を有していた。第二のインキュベーションは３０分間
であった。より濃縮されたＥＤ−ジゴキシン／抗体複合
体を５０％血清と共に操作しそしてこれは５０％より少
ない血清試料を有する反応混合物よりも幾らか優れた結
果を与えた。

鮭−１ この例において、酵素基質としての０ＮＰＧの使用を酵
素基質としてのクロロフェノールレッドガラクトシド（
ｃＰＲＧ）の使用と比較した。系における０ＮＰＧｅｔ
度ハ１．３３ｍｇ／　ｍｌ’７：’あり、そしテＣＰＲ
Ｇ濃度は０．８Ｂ／ｍｊ２であった。　ＣＰＲＧを使う
と光学濃度の各値（シグナル）が増加した。光学濃度の
値は、ＣＰＲＧを使うと約７倍大きくなった。しかしな
がら、阻害およびモジュレーションの比率（％）の差異
は重要ではなかった。即ち、各値は大きくなるけれども
その値の比は同じであった。

鮭−り 上記の例の結果を組み合わせた模範的なジゴキシンアッ
セイを次のように行った。各試薬濃度は下記に挙げられ
ている。反応混合物に添加される試薬類の濃度は、最終
反応混合物中の試薬濃度（系の値）として与えられる。

ＥＤ−分析体＝　３４ｎＭ試薬＝　３．４ｎＭ系抗体＝
１：５００試薬＝　１　：　５０００系Ｇ八ＲＳ＝１：
６．２５試薬＝１　：　６２．５系血清試料＝第二反応
混合物の５０％＝ＩＯ％系酵素受容体＝　１．２ｍＭ試
薬＝０．６９ｍＭ系ＣＰＲＧ　＝　４ｍｇ　／　ｍｊ！
試薬＝　０．８ｍＭ／　＋ｎｌ系該免疫複合体を３７℃
にて３０分間インキュベートした。試料を添加し、そし
てさらに１０分間インキュベートした。ＥＡの添加から
９０秒および２１０秒目に光学濃度を読みその量を測定
した。

１１００ｎおよびＯｎＨのキャリブレータ−を使った阻
害率は４４，３％であり、一方４ＢおよびＯＢのキャリ
ブレータ−を使ったモジュレーション率は３０．２％で
あった。

例８ マウスのモノクローナル抗体（ロット番号＾７６９６）
を使って血清中のＴ３についてのアッセイを次のように
行った。試薬の濃度は以下のようであった。

ＥＤ−分析体＝５．８ｘ　１０−’Ｍ試薬＝２Ｘ１０−
ｇＭ系抗体＝　１　：　８００試薬＝　１　：　２０，
０００系Ｅ＾＝１５ｕ／テスト＝　４５０ｎＭ系該酵素
供与体および抗体を湯浴中３７℃にて４５分間インキュ
ベートした。１０μｒのＥＩ）−分析体／抗体複合体を
４０μ！の試料に添加し、３７℃にて１５分間インキュ
ベートした。２００μｒのＥＡおよび基質を添加し、そ
して３７℃でインキュベートした。ＥＡの添加後６０秒
および１８０秒目に光学濃度を読み取った。０および８
ｎｇ／ｍ１の間のモジュレーションは、１．：　８００
とｉ　：　ｔｏｏｏの抗体希釈度の間の４７〜４８％の
値にピークがあるとわかった。ＥＡの濃度を３９ｕ／テ
スト〜１．５ｕ／テストの間で変えた。阻害およびモジ
ュレーションは、減少されたＥＡを用いて３９〜１２ｕ
／テストの間で向上した。１２ｕ／テスト以下では、Ｅ
Ａ濃度の変化による阻害率およびモジュレーション率の
相違が非常に小さくなった。ヤギの抗−マウス血清の最
初の溶液への添加によって、モジュレーションにおいて
全く有意な差異が生ぜずそして抑制においてもごく小さ
い差異が生じることがわかった。

本発明は、インキュベーション段階を削除し、はとんど
の分析試薬の混合を可能にし、そしてほとんど技術時間
を要求しない、さらに、該試薬は操作の簡易化および便
利な包装のために単位用量として配合することもできる
。該アッセイは、分析体が多い程大きいシグナルを与え
るような陽性の応答を有することを実験的に示した。こ
の方法はより少数の試薬と段階を使って実施されるので
、理想的には実地利用にも適する。

今まで本発明の詳細な説明してきたが、発明の精神およ
び特許請求の範囲から逸脱することなく多くの変更およ
び改良を行うことができることは、当業者にとって明ら
かであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中に存在する分析体の量を測定するための方法
   であって、 （ａ）反応緩衝液中でβ−ガラクトシダーゼＥＤ−分析
   体接合体／抗−分析体抗体複合体、β−ガラクトシダー
   ゼＥＡ、酵素基質および前記試料を、前記複合体が前記
   試料中に存在する分析体と反応するのに十分な時間の間
   一緒にして反応混合物を形成せしめ；そして （ｂ）前記試料中に存在する分析体の量の指標として前
   記反応混合物における酵素触媒反応の速度を測定する、 ことを含んで成る方法。 ２、試料中に存在する分析体の量を測定するための方法
   であって、 （ａ）反応緩衝液中でβ−ガラクトシダーゼＥＤ−分析
   体接合体／抗−分析体抗体複合体および前記試料を、前
   記複合体が前記試料中に存在する分析体と反応するのに
   十分な時間の間一緒にして第一反応混合物を形成せしめ
   ； （ｂ）β−ガラクトシダーゼ酵素受容体（ＥＡ）を、Ｅ
   ＡがＥＤと反応してβ−ガラクトシダーゼを形成するの
   に十分な時間の間、前記第一反応混合物と一緒にして第
   二反応混合物を形成せしめ、ここで酵素基質は前記第一
   反応混合物または第二反応混合物に添加され；そして （ｃ）前記試料中に存在する分析体の量の指標として前
   記第二反応混合物における酵素触媒反応の速度を測定す
   る、 ことを含んで成る方法。 ３、前記ＥＤ−分析体／抗−分析体抗体複合体が、水性
   媒質中ＥＤ−分析体接合体を実質的に酵素シャットダウ
   ンを達成するのに十分な抗−分析体抗体と共に実質的に
   完全な反応のために十分な時間の間インキュベートする
   ことにより形成される、請求項２に記載の方法。 ４、段階（ａ）の前に前記ＥＤ−分析法／抗−分析体抗
   体複合体を前記抗−分析体抗体のＦｃ部分に特異的な第
   二抗体と一緒にしてＥＤ−分析法／抗−分析体抗体／第
   二抗体の複合体を形成せしめる、請求項２に記載の方法
   。 ５、血清試料中に存在する分析体の量を測定するための
   方法であって、 （ａ）反応緩衝液中でβ−ガラクトシダーゼＥＤ−分析
   体接合体／抗−分析体抗体複合体と前記試料とを、前記
   抗−分析体抗体が前記試料中に存在する分析体と反応す
   るのに十分な時間の間一緒にして第一反応混合物を形成
   せしめ； （ｂ）β−ガラクトシダーゼＥＡを、β−ガラクトシダ
   ーゼ酵素を形成せしめるのに十分な時間の間、酵素基質
   の存在下で前記反応混合物と一緒にして第二反応混合物
   を形成せしめ；そして （ｃ）前記試料中に存在する分析体の量の指標として、
   前記第二反応混合物の酵素触媒反応の生成物による光の
   吸収または発光の変化を測定する、ことを含んで成る方
   法。 ６、前記段階（ｃ）の測定が、段階（ｂ）の混合後３７
   ℃で少なくとも１分間のインキュベーション後とそれか
   ら少なくとも約１分後の第二の時刻との前記第二反応混
   合物の光学濃度の差異を測定すること含んで成る、請求
   項５に記載の方法。 ７、血清試料中に存在するジゴキシンの量を測定するた
   めの方法であって、次の段階： （ａ）約３０ｍＭ〜４０ｍＭのβ−ガラクトシダーゼＥ
   Ｄ−ジゴキシン接合体をポリクローナル抗−ジゴキシン
   抗体および前記抗−ジゴキシン抗体に特異的な第二抗体
   と共に反応緩衝液中約３７℃にて約３０分間インキュベ
   ートして第一反応混合物を形成せしめ、ここで前記抗−
   ジゴキシン抗体および前記ＥＤ−ジゴキシン接合体は実
   質的にシャットダウンを達成する量で存在し； （ｂ）同体積の前記試料と前記第一反応混合物とを一緒
   にして第二反応混合物を形成せしめ；（ｃ）前記第二反
   応混合物を約３７℃にて約１０分〜約３０分間インキュ
   ベートし； （ｄ）約０．５ｍＭ〜２．０ｍＭのβ−ガラクトシダー
   ゼＥＡおよび約２ｍＭ〜約１０ｍＭのＣＰＲＧを前記第
   二反応混合物と一緒にして着色反応混合物を形成せしめ
   ； （ｅ）前記着色反応混合物を約３７℃にて少なくとも約
   １分間インキュベートし； （ｆ）前記着色反応混合物の光学濃度を測定し；（ｇ）
   前記着色反応混合物を約３７℃にて少なくとも約１分間
   インキュベートし； （ｈ）前記着色反応混合物の光学濃度を測定し；（ｉ）
   段階（ｆ）と（ｈ）との光学濃度測定値の差異を測定し
   ；そして （ｊ）前記差異を既知の濃度の試料についての光学濃度
   の差異と比較する、 ことを含んで成る方法。 ８、血清試料中に存在するＴ−３の量を測定するための
   方法であって、次の段階： （ａ）約５ｍＭ〜５０ｍＭのβ−ガラクトシダーゼＥＤ
   −Ｔ３接合体を反応緩衝液中約３７℃にて約４５分間モ
   ノクローナル抗−Ｔ３抗体とインキュベートして第一反
   応混合物を形成せしめ、ここで前記抗−Ｔ３抗体および
   前記ＥＤ−分析体接合体はシャットダウンを達成する量
   で存在し； （ｂ）前記第一反応混合物約１体積と前記試料約４体積
   とを一緒にして第二反応混合物を形成せしめ； （ｃ）前記第二反応混合物を約３７℃にて少なくとも約
   １５分間インキュベートし； （ｄ）β−ガラクトシダーゼＥＡおよびＣＰＲＧを前記
   第二反応混合物と一緒にして、約１．５×１０＾−＾７
   Ｍ〜７．５×１０＾−＾７Ｍのβ−ガラクトシダーゼＥ
   Ａおよび約２ｍＭ〜約６ｍＭのＣＰＲＧを有する着色反
   応混合物を形成せしめ； （ｅ）前記着色反応混合物を約３７℃にて少なくとも約
   １分間インキュベートし； （ｆ）前記着色反応混合物の光学濃度を測定し；（ｇ）
   前記着色反応混合物を約３７℃にて少なくとも約１分間
   インキュベートし； （ｈ）前記着色反応混合物の光学濃度を測定し；（ｉ）
   段階（ｆ）と（ｈ）との光学濃度測定値の差異を測定し
   ；そして （ｊ）前記差異を既知の濃度の試料についての光学濃度
   の差異と比較する、 ことを含んで成る方法。 ９、ＥＤ−分析体接合体／抗−分析体抗体複合体を含ん
   で成る試薬タブレット。 １０、第一容器中に実質的に分析体およびＥＡがないＥ
   Ｄ−分析体接合体／抗−分析体抗体の複合体並びに第二
   容器中に実質的にＥＤ−分析体接合体、抗−分析体抗体
   および分析体がないＥＡを含んで成るキット。