SE430185B - Med karboanhydras merkt trijodtyronin som medel for bestemning av trijodtyronin - Google Patents

Description

7802948--É _ för T 2 och att provningen kräver en dyrbar apparatur. Dessutom är använd- ningen av rmfißisotoper underkastad en sträng lagstiftning av hälso- vårdsmyndigheterna. 2)_ Mätning av samverkan mellan hormon och TBP (tyroxinbindande protein): a) Bestämning av den fria hormonfraktionen genom dialys vid jämvikt, ultrafiltrering. b) Bestämning av den relativa mättningen av de tyroxinbindande lägena: upptagning medelst ett harts av det märkta T3 (RT3U dvs. I harts T3 upptagning). c) Kvantitativ bestämning av de tyroxinbindande proteínerna: koncentration av TBG (tyroxinbindande globulin) och av TBPA (tyroxin- bindande prealbumin). ' Alla dessa metoder är arbetsamma, baserade på bindningsförmågan av TBP till hormonet och ger ett indirekt mått på det cirkulerande T3. Den metod som mäter upptagningen av det märkta T3 på ett harts _ är, totalt sett, den lätthanterligaste av de tre metoderna, även om den uppvisar de brister som redan har nämnts under 1 b ovan.

Genom mätning av totalt T3 och av samverkan mellan hormonet och TBP är det möjligt att beräkna koncentrationen fritt T3.

Det har nu upptäckts,och detta utgör grunden för föreliggande uppfinning, att det är möjligt att bestämma trijodtyronin ävenši extremt små mängder, i storleksordningen nanogram och mindre, utan några av de svårigheter som nämnts ovan, medelst en metod som inne- fattar användning av en insolubiliserad antikropp, som är specifik 7 3, och av ett medel innehållande ett lösligt T3-enzym- komplex, varvid medlet enligt uppfinningen utmärks av att komplexet består av vid T3 kovalentbundetkolsyraarmydras, vars aktivitet bestämmas.

Insolubilisering gör det, såsom känt, möjligt att erhålla immunoabsorberande antikroppar som uppvisar hög immunologisk speci- ficitet och affinitet. Vid användandet av ovannämnda medel för- bättras dessa egenskaper och framför allt erhåller systemet i synner- het en stabilitet, vilken är sådan, att man kan erhålla resultat som var helt oväntade mot bakgrund av känd teknik. Trijodtyronin kan således mätas även om det förekommer i ytterst små mängder, och metodens reproducerbarhet är mycket god. Detta faktum är så mycket mera anmärkningsvärt, eftersom det är väl känt, att trijodtyronin är en inhibitor för den enzymatiska aktiviteten hos några enzymer, l0 l5 40 vsozsuà-s 3 såsom lysozym, med vilkadet också bildar ett olösligt komplex.

Urvalet av enzym för den immunoenzymatiska bestämningen måste ske enligt följande kriteria: a) Enzymet måste uppvisa en hög specifik aktivitet vid ett sådant pH, att antigen-antikroppbindningen inte försvagas. b) Enzymet måste vara sådant, att det går lätt att mäta (analytiskt). c) Enzymet måste vara lätt tillgängligt i en mycket ren löslig och stabil form. d) Enzymet måste uppvisa reaktiva grupper, till vilka andra molekyler kan bindas utan förlust av biologisk aktivitet. _ e) Enzymet får inte inhiberas av substanser, som finns när- varande i blodserumet.

Vid användning av medlet enligt uppfinningen utföres bestämningen i pm$timH1så,att T3 extraheras ur det prov som skall undersökas medelst affinitetskrornatografi utförd på en insolubiliserad anti-T3 antikropp, varvid kromatografin antingen utföres i en kolonn eller i ett provrör.

Genom detta steg koncentreras den substans som undersöks, varjämte komponenter, som skulle kunna störa analysen, avlägsnas. Därpå behandlas kolonnen med lösningen av T3-enzym-koxnplex och den återstående enzyma- tiska aktiviteten bestämmes i effluenten. Om provet inte innehåller substans som skall mätas (T3), blockerar antikroppen det sensibili- serade enzymet och inhíberar aktiviteten hos detsamma. Om å andra sidan substansen finns närvarande, tävlar den med enzymet om antikroppen, så att åtminstone en del av enzymets molekyler förblir aktiva.

Av det föregående framgår det,att den angivna immunænzyïffitiska metoden under användning av nedlet enligt uppfinningen för bestämning av tri- jodtyronin är fördelaktig, eftersm den ger ett direkt mått på det cirkulerande hornxonet, även om detta förekommer i extremt låga koncentrationer.. Metoden på- verkas dessutom ej av andra substanser som finns närvarande i blod- serumet, och är lätt att genomföra.

Det inses, att maflet enligt uppfinningen kan användas även för bestämning av anti-T3 antikroppar, eftersom det är tillräckligt att insolubilisera T3, varefter först provet bringas i kontakt med det insolubiliserade T3 och sedan det enzym som är kovalent bundet till anti-T3. Till sist mäts den återstående enzymatiska aktiviteten.

Om provet inte innehåller antikroppar, kommer resultatet att bli ett enqmrantfluxmp Tydmmplex, och den enzymatiska aktiviteten kan ej be- stämmas. Om å andra sidan antikroppar förekommer i provet, bildar 7802948-5 4 dessa ett T3-antikroppskomplex och det blir möjligt att bestämma aktiviteten hos det sammansatta enzym-antikropp.

Material för proven Kolsïmäflfiäßkas och nötserumalbumin var av Böhringer-Mannheim Co.:s tillverkning. l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimiden kom.från Sigma. 3,5,3'-trijodtyronin och glutaraldehyd levererades av Fluka.

Reagensen för elektroforesen levererades av Canal00- Bio-Gel edüflls från Bio-Rad och alla övriga produkter från Carlo Erba efler Merck.

Provningsresultat A) Preparering av anti-T3 antikroppar: 50 mg BSA (nötserum-albumin) löstes i 25 ml vatten och 150 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid tillsattes. Därefter till- sattes droppvis 100 mg T3, löst i 5 ml N,N-dimetylformamid. Efter omkring 5 min. tillsattes 50 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminoprOpyl)- karboaiimia . F Reaktionen tilläts fortgå i 18 timmar vid rumstemperatur i mörker med omröring, Sedan reaktionen fullbordats centrifugerades provet och dialyserades mot åtskilliga ombyten destillerat vatten i 72 timmar. Antalet T3-återstoder ingående i varje molekyl albumin bestämdes spektrofotometriskt med hjälp av koefficienten 6 100 M_l cm-1 vid 320 nm (nanometer). Resultatet visade, att omkring 5 T3- âterstoder var sammanfogade med varje molekyl BSA. UV-spektra för BSA och T3-BSA-konjugat är visade i fig. l på den bifogade ritningen, som kurvorna l och 2. Antikroppen erhölls genom sekventiell immunise- ring av kaniner med T3-BSA-konjugatet. För titrering av anti- kroppar användes den passiva agglutiniseringsmetoden. Detta är en klassisk metod inom serologin och består i att röda blodceller, som tidigare behandlats med garvsyra, belägges med det antigen som skall bestämmas, varpå ett agglutiniseringsprov utföres. >Den erhållna antikroppen hade en spädning av l:8000. Reningen av antikroppen utfördes genom centrifugering av serumet och utspäd- ning av den överstående vätskan med en volym vatten och en volym av en mättad lösning av ammoniumsulfat, så att en slutlig koncentration av 33 % erhölls. Efter 15 min. centrifugerades blandningen vid 4000 rpm i 20 minuter och fällningen rördes ut i'en saltlösning och fälldes igen med ammoniumsulfat, tills lösningen hade avfärgats full- ständigt. Fällningen, upptagen i en saltlösning, dialyserades mot två byten (eller skildes från saltlösningen vid 4°C tills ammonium- sulfatet helt avlägsnats). l0 7802948-s B) Preparering av immunoabsorberande antikroppar på polyakrylamid Bio-Gel P-300 tilläts bli hydratiserat i 24 timmar i vatten och tvättades många gånger i samma medium. Till 100 ml hydratiserad gel sattes 500 ml 6 % lösning av glutaraldehyd i en 0,1 M fosfat- buffert vid pH 7,0. Lösningen inkuberades över natten vid 370. Gelet tvättades sedan 10-20 gånger med vatten, med 500 ml volym vid varje tvättoperation. l0 ml aktiverat gel blandades med 12 ml blodserum.

Lösningen rördes långsamt vid rumstemperatur i 14 timmar, centrifu- gerades vid 3000 rpm i 10 min. vid 4°C och den överstående vätskan avlägsnades för bestämning av kvantiteten antikropp som inte hade absorberats. Gelpartiklarna tvättades därefter med en isotonisk buffert, tills den optiska tätheten i den överstående vätskan var mindre än 0,02 vid 280 mm. Kvantiteten antikropp som hade bundits var 23 mg per ml gel.

C) Preparering av T3-kolsyraanhydras-konjugat (T3-BCA) 50 mg'kolsynænügflra5 löstes i 25 ml vatten och blandades med mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid, 20 ml T3, löst i ml N,N-dimetylformamid, tillsattes droppvis, varvid pH hölls mellan ,5 och 6,0. Lösningen hölls under konstant omröring vid rumstempera- tur i mörker under ungefär l8 timmar. Då detta steg fullbordats,,' centrifugerades provet och dialyserades mot åtskilliga ombyten vatten vid 4°C under omkring 48 timmar. Den spektrofotometriska analysen visade, att en T3-rest hade sammanfogats ned.en kolsynænüqmüasmolekyl.

Konjugatets återstående enzymatiska aktivitet motsvarade ungefär 50 % och skilde sig från det nativa enzymet då det undersöktes elektro- foretiskt. av det nativa enzymets aktivitet. T3-BCA-konjugatet var homogent D) Bestämning av T3 En kalibreringskurva ritas först enligt följande procedur: l ml antikropp, insolubiliserad på Bio-Gel P-300, placeras i en kolonn (0,5 x 5,0 cm), vilken termostateras vid 25°C. l ml lösning innehållande T3-BCA-konjugat vid en koncentration av 0,5 M får strömma genom kolonnen. Denna får stå i en time och tvättas så med 1 ml isotonisk lösning, varjämte konjugatets återstående biologiska akti- vitet bestämmes i effluenten. Den biologiska aktiviteten hos T3-BCA- konjugatet bestämmes spektrofotometriskt vid 25°C genom mätning av ökningen av absorptionen vid 348 nm på grund av hydrolys förorsakad av p-nitrofenylacetat. l ml effluent blandas med 1 ml av 3 milli- veozàss-s_ l0 I erhölls; 6 . molar (mM) p-nitrofenylacetatlösning, 0,3 ml 20 mM fosfatbuffert (pH 7,4) och 0,7 ml vatten. I standardcellen placeras ett nollprov,_ som innehåller alla reagens utom enzymet. För bestämning av trijod- tyronin placeras gradvis ökade kvantiteter fritt hormon (från 3 till 70 ng per ml) i olika kolonner, vilka vardera innehåller l ml insolu- biliserad antikrópp, varvid provkärlen får stå i l timme. Hartset ' tvättas med 5 ml isotonisk lösning (buffert), elueras igen med l ml av 0,5 uM T3-BCA och får stå i en timme. Hartset tvättas igen med l ml isotonisk buffert, och den specifika aktiviteten av T3-BCA- konjugatet bestämmes i effluenten. Fig. 2 i bifogad ritning återger T3-BCA-konjugatets specifika aktivitet som en funktion av koncentra- tionen fritt T3 (abskissa). Den minsta kvantiteten som kan mätas är l-2 ng.

E) Bestämning av T3 i standardhumanblodsera Med den beskrivna metoden analyserades tre standardsera från hypo-, eu- och hypertyroidala patienter, varvid följande värden ll0 ng per l00 ml - 236 ng per 100 ml - 500 ng per 100 ml.

Dessa värden står i god överensstämmelse med värden, som uppmätts lmed användning av radioimmunologiska metoder. Antikroppens specifi- citet, sådan den erhållits enligt föreliggande uppfinning, har ut- värderats genom mätning av förmågan hos T4 i tävlan med T3 om anti- serum. För att erhålla en variation av den specifika aktiviteten ' hos T3-BCA-konjugat, som var ekvivalent med den aktivitet som åstad- kommes av 2 ng T3, behövs 500 ng T4. Om man betänker, att den normala koncentrationen T4 i humanblodserum är omkring 80 ng per ml, är dess störande inverkan i mätsystemet försumbar.

Förklaring av ritningen 7 Fig. l är ett UV-spektrum av serumalbumin (nöt) och T3-nöt- serumalbumin-konjugat i vattenlösning. Kurvan l avser serumalbumin ensamt. Kurvan 2 avser T3-serumalbumin-konjugat. Kurvan 3 är differentialspektrat för konjugatet minskat med serumalbuminet.

Fig. 2 visar procenten variation i aktivitet hos konjugatet T34xüspæam§@&às som en funktion av koncentrationen fritt T3. Kurvan a) gäller området 0 till 7 ng per ml och kurvan b) gäller området 0 till 70 ng per ml. Aktiviteten bestämdes på det sätt som angivits OVaIl .

Claims (1)

1. 7802948-5 PATENTKRAV Medel för immunologisk bestämning av trijodtyronin (T-3) inne- hållande ett lösligt T-S-enzyrn-komplex, k ä n n e t e c k n a t därav, att komplexet består av vid T-3 kovalent bundet kolsyraanhydras, vars aktivitet bestämmes.