CH645544A5

CH645544A5 - Therapeutisches, adenosin-derivate mit entzuendungshemmender, analgetischer und antipyretischer wirksamkeit enthaltendes mittel.

Info

Publication number: CH645544A5
Application number: CH263281A
Authority: CH
Inventors: Giorgio Stramentinoli; Federico Gennari
Original assignee: Bioresearch Spa
Priority date: 1980-04-22
Filing date: 1981-04-22
Publication date: 1984-10-15
Also published as: FI811249L; MX9203630A; NO811346L; DE3116067C2; DK159453C; GB2144409B; ES511039A0; NL8101984A; SE8102489L; JPH01301692A; SE8700913L; BE888472A; IT8021550A0; SE460198B; SE8700914D0; DK159453B; GB2144038A; LU83307A1; GB8413454D0; JPH0249288B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf therapeutische Mittel mit entzündungshemmender, analgetischer und antipyretischer Wirksamkeit, die als Wirkstoffkomponente mindestens ein Adenosin-Derivat enthalten.

Gegenstand der Erfindung sind die im Patentanspruch 1 definierten therapeutischen Mittel.

Wenn in der Formel IR, Wasserstoff bedeutet, umfasst die Definition nach Patentanspruch I auch die Säureadditionssalze von Verbindungen der Formel I.

25

30

CH2-S-R

Ia

OH OH

wurde die von M. Legraverand, S. Ibanez et al in «Eur. J. Med. Chem.», 12, (1977) S. 105-108 beschriebene Legrave-35 rand-Methode eingesetzt, nach welcher Adenosin durch Reaktion mit Thionylchlorid in Hexamethylphosphoramid zu 5'-Chlor-5'-desoxyadenosin umgesetzt wird.

Das 5'-Chior-5'-desoxyadenosin kann dann durch Reaktion mit dem entsprechenden Mercaptan in einer 2N Na-40 triumhydroxidlösungbei 8Ö°C in den gewünschten Thio-äther überführt werden.

Die erhaltenen Thioäther können durch Umkristallisa-tion aus Wasser oder niederen aliphatischen Alkoholen ge-• reinigt werden.

45 Die erhaltenen Verbindungen der Formel Ia können dann mit einem stöchiometrischen Mengenanteil der entsprechenden Säure versalzt werden.

Die Gruppe der Verbindungen der Formel

50

55

6Q

NH-R.

ch2-s-r

Ib worin Ri und R2 nicht Wasserstoff bedeuten und die beiden R2 keine Isopropylidenkette bilden, wurden nach der von K. Satom und K. Makino in «Nature», 167, (1951) S. 238 be-

3

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schriebenen Satom und Makino Methode hergestellt durch Reaktion der entsprechenden Verbindungen der Formel Ia mit dem benötigten Acylchlorid in wasserfreiem Pyridin. Die erhaltenen Produkte werden zweckmässig aus einem Vol. 1:1 Chloroform/Petroläther-Gemisch umkristallisiert.

Die Gruppe von Verbindungen der Formel nh - r.

ch -s-r

IC

ch3 ch3

sind erhältlich durch Reaktion der entsprechenden Verbindungen der Formel I, worin R2 Wasserstoff bedeutet, mit Aceton in Gegenwart von ZnCl2 nach der vorstehend beschriebenen Satom und Makino Methode. Die erhaltenen Produkte werden zweckmässig durch Umkristallisation aus einem Vol. 1:1 Chloroform/Petroläther-Gemisch gereinigt. Die Gruppe von Verbindungen der Formel nh-r

Id sind durch Oxidation der entsprechenden, nach den vorstehend beschriebenen Methoden hergestellten Thioäther mittels Brom oder Wasserstoffperoxid in wässriger Lösung, wie von J.P. Green Stein und M. Winitz in «Chemistry of the s Amino Acids by John Wiley & Sons Inc.», 2146, (1961) beschrieben, erhältlich. Die erhaltenen Produkte können durch Umkristallisation aus Wasser gereinigt werden.

Von allen wie vorstehend beschrieben erhältlichen Produkten hat sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung 10 5'-Desoxy-5'-methylthioadenosin, nachstehend mit «MTA» der Formel

20

25

ch2-s-ch3

ii

OI^ 01^

oh oh bezeichnet, die eine physiologische, im lebenden Organismus bereits vorhandene Verbindung darstellt, als besonders inter-35 essant erwiesen.

Es wurde nun ein besonders einfaches und vom industriellen Standpunkt aus ökonomisches Verfahren zur Herstellung von MTA gefunden.

40 Dieses neue Verfahren besteht im wesentlichen in der Hydrolyse von S-Adenosylmethionin, nachstehend mit «SAME» bezeichnet, unter genau kontrollierten kritischen Bedingungen, die zu praktisch totaler Hydrolyse und vollständiger Kristallisation des MTA führt und durch das 45 nachstehende Reaktionsschema ausgedrückt werden kann:

nh2

+ ho-ch2-ch2-ch-cooh + h+

oh oh

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4

Dieses genau kontrollierte Hydrolyseverfahren kann auf nach beliebiger Art hergestelltes SAME angewendet werden. Die Herstellung der SAME-Lösung ist jedoch auch ein Faktor, der die Ausführung des Verfahrens auf ökonomisch annehmbare Art beeinflusst.

Die nachstehenden Verfahrensstufen führen zu der wirtschaftlichsten Ausführungsform des Verfahrens:

a) SAME wird in normaler Brothefe angereichert durch Behandlung mit Methionin nach der von F. Schlenk in «En-zymologie», 29, (1965) S. 283 beschriebenen Schlenk-Metho-de.

b) Die in Wasser suspendierten Hefezellen werden durch Behandlung mit Äthyl- oder Methylacetat bei Zimmertemperatur lysisiert nach dem in der DE-OS P 2 336 401.4 beschriebenen Verfahren. Durch Einstellen eines pH-Wertes von 4-6 und Filtration wird eine Lösung erhalten, die praktisch das gesamte in der ursprünglichen Hefe vorhandene SAME enthält.

c) Die Lösung wird unter Vakuum bei 35-40 °C auf etwa 1/10 des ursprünglichen Volumens konzentriert.

d) Das Konzentrat wird während etwa 30 min auf Rückflusstemperatur erwärmt und der pH-Wert mit Soda auf 7 gestellt.

e) Die Lösung wird bei 0-5 °C stehengelassen und das ausgefällte MTA praktisch vollständig und mit guter Reinheit abgetrennt.

Die vorstehend beschriebenen Verfahrensstufen c, d und e, die wie angegeben kritisch und notwendig für vollständige selektive Hydrolyse von SAME zu MTA ohne Bildung von Nebenprodukten sind, sind neu.

In den nachstehenden Beispielen ist die Herstellung von einigen der nach der Erfindung verwendeten Verbindungen der Formel I beschrieben. Prozentuale Konzentrationsangaben sind gewichtsmässig, wenn nichts Anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Für die Herstellung von 5'-Desoxy-5'-methylthioadeno-sin (MTA) werden bei Zimmertemperatur 90 kg Brothefe, deren Gehalt an SAME durch Zusatz von Methionin auf 6,88 g/kg angereichert wurde, mit 11 Liter Äthylacetat und 11 Liter Wasser vermischt.

Nach heftigem Rühren während 30 min wird der pH-Wert mit verdünnter Schwefelsäure auf 4,5 gestellt, das Gemisch filtriert und der Rückstand mit Wasser gewaschen, wobei 1401 einer Lösung mit einem Gehalt an SAME von 4,40 g/1 anfallen, was 99,5% des im Ausgangsmaterial vorhandenen SAME entspricht.

Das so erhaltene Lysat wird bei 40 mbar Vakuum und 35-40 C auf ein Volumen von etwa 141 konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird bei normalem Atmosphärendruck während 30 min unter Rückfluss beim Sieden gehalten, dann auf 20 C gekühlt, der pH-Wert mit 40%iger Sodalösung auf 7 gestellt und die Lösung dann in einem Kühlschrank bei +3 'C über Nacht stehen gelassen.

Die gebildete weisse Ausfallung wird abfiltriert, in 101 siedendem dest. Wasser gelöst und durch Kühlung der Lösung kristallisiert.

Es werden 410 g kristallines MTA hoher Reinheit erhalten, was, bezogen auf das der Hydrolyse unterzogene SAME, 90%iger Ausbeute entspricht. Die Kennzeichen des erhaltenen Produktes entsprechen denjenigen von auf andere Art hergestelltem, reinem MTA.

Beispiel 2

Für die Herstellung von 5'-Desoxy-5'-äthylthioadenosin wird 1 kg Adenosin unter Stickstoffatmosphäre in 101 Hexa-

methylphosphoramid gelöst und die Lösung unter Kühlung mit 7,5 1 Thionylchlorid versetzt.

Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur während 20 h reagieren gelassen, dann mit 101 Wasser versetzt und mit 2N Natronlauge neutralisiert.

Das sich bildende 5'-Desoxy-5'-chloradenosin wird über Nacht bei 3 °C kristallisieren gelassen und dann abfiltriert, wobei mit einer Ausbeute von 89% 0,950 kg 5'-Desoxy-5'-chloradenosin erhalten wird, das in 1012N Natronlauge gelöst und mit 200 ml Äthanthiol versetzt wird. Das Gemisch wird auf 80 °C erwärmt, während 1 h reagieren gelassen und dann mit Eisessig neutralisiert. Das sich bildende 5'-Desoxy-5'-äthylthioadenosin wird bei 3 °C über Nacht ausfällen gelassen, abfiltriert und aus Wasser umkristallisiert, wobei, bezogen auf die vorangehende Stufe, mit einer Ausbeute von 80% 0,830 kg des Endproduktes erhalten wird.

Beispiel 3

Für die Herstellung von anderen Verbindungen aus der Gruppe der Formel Ia wird das im Beispiel 2 beschriebene Vorgehen mit der Ausnahme wiederholt, dass anstelle von Äthanthiol Propan-, Butan-, Isobutan-, Pentan-, Hexanbzw. Benzylthiol verwendet wird.

Beispiel 4

Für die Herstellung von N6,2',3/-Triacetyl-5'-desoxy-5/-thioadenosin wird 1 kg MTA in 101 wasserfreiem Pyridin suspendiert und mit 31 Essigsäureanhydrid versetzt. Das Gemisch wird während 4 h reagieren gelassen, dann mit 201 Wasser versetzt und unter Vakuum konzentriert, wobei eine von Pyridin freie ölige Masse erhalten wird, die in 101 eines heissen Vol. 1:1 Chloroform/Petroläther-Gemischs gelöst und kristallisieren gelassen wird. Das erhaltene Produkt wird aus einem Vol. 1:1 Chloroform/Petroläther-Gemisch umkristallisiert, wobei mit einer Ausbeute von 80% 1,140 kg des Endproduktes erhalten werden.

Beispiel 5

Für die Herstellung von anderen Verbindungen aus der Gruppe der Formel Ib wird das im Beispiel 4 beschriebene Vorgehen mit der Ausnahme wiederholt, dass anstelle von MTA andere Thioäther oder Propion- oder Buttersäureanhydrid, Benzoyl-oderTosylchlorid verwendet werden.

Beispiel 6

Für die Herstellung von 5'-Desoxy-2',3'-isopropyliden-5'-methylthioadenosin wird 1 kg MTA in 251 wasserfreiem Aceton suspendiert und mit 2,5 kg geschmolzenem ZnCl2 versetzt. Die Reaktion wird unter Erwärmen auf Rückflusstemperatur während 5 h ausgeführt. Dann wird das Gemisch unter Vakuum auf 1/3 des ursprünglichen Volumens konzentriert und mit 7,5 kg Bariumhydroxid-octahydrat in wässriger Suspension versetzt. Danach wird bis zur Neutralität Kohlendioxid durchgeperlt. Das Gemisch wird filtriert und der Rückstand mit Aceton gewaschen. Das Filtrat wird unter Vakuum konzentriert, wobei ein sirupähnlicher Rückstand erhalten wird. Der Rückstand wird in 101 eines heissen Vol. 1:1 Chloroform/Petroläther-Gemischs aufgenommen, filtriert, kristallisieren gelassen und aus einem Vol. 1:1 Chloroform/Petroläther-Gemisch umkristallisiert, wobei mit einer Ausbeute von 70% 0,795 kg des Endproduktes erhalten wird.

Beispiel 7

Für die Herstellung von anderen Verbindungen der Gruppe der Formel Ic wird das in Beispiel 6 beschriebene Vorgehen mit der Ausnahme wiederholt, dass anstelle von

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

MTA die entsprechenden Adenosin-Derivate als Ausgangsprodukt verwendet werden.

Beispiel 8

Für die Herstellung von MTA-Sulfoxid wird 1 kg MTA in 101 Wasser suspendiert und unter Kühlen mit Brom versetzt. Die Brom enthaltende wässrige Lösung wird unmittelbar entfärbt durch die Oxidation des MTA zu Sulfoxid. Der Zusatz von Brom wird so lange weitergeführt, bis sich die Lösung nicht mehr entfärbt. Dann wird die Lösung durch weitere Zugabe von kleinen Mengenanteilen MTA entfärbt.

Die wässrige Lösung wird mit «Amberlite» IRA 93, einem schwach basischen Ionenaustauscherharz von Rohm und Haas mit einer Polystyrolmatrix so lange behandelt, bis die Reaktion der Bromidionen verschwindet. Dann wird das Gemisch filtriert und der Rückstand mit Wasser gewaschen. Die wässrige Lösung wird auf 101 konzentriert, mit 100 g Aktivkohle behandelt und gefriergetrocknet, wobei mit einer Ausbeute von 90% 0,950 kg des Endproduktes erhalten wird.

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Beispiel 9

Für die Herstellung von anderen Verbindungen der Gruppe der Formel Id wird das im Beispiel 8 beschriebene Vorgehen mit der Ausnahme wiederholt, dass anstelle von s MTA die entsprechenden Adenosin-Derivate verwendet werden.

Wie bereits erwähnt wurde gefunden, dass die Verbindungen der Formel I starke entzündungshemmende Wirksamkeit, mit welcher analgetische und antipyretische Wir-lo kung einhergehen, aufweisen.

Als erstes wurde die entzündungshemmende Wirksamkeit einiger der Verbindungen der Formel I durch den Test mit experimentell durch Carrageen in Ratten induziertem Ödem abgeklärt, indem die prozentuale Schutzwirkung nach ls der in «J. Pharm. Exper. Therap.», 141, (1963) S. 369 beschriebenen Winter-Methode bestimmt wurde. Die jeweils geprüften Verbindungen, die jeweilige Verabreichungsdosierung und die dabei erhaltenen prozentualen Schutzwirkungen sind in Tabelle 1 im Vergleich zum bekannten therapeu-20 tischen Mittel Indomethacin zusammengefasst.

Tabelle I

Verbindung der Formel I

n = O, R = -CH2, Rj = R2 = H n = O, R = -CH3, Rj = R2 = H n = O, R = -CH2,-C6HS, Rj = R2 = H /CH3

n = O, R = -CH2-CH , Rx = R2 = H ^ch3

n = O, R = -(CH2)e-CH3, Rj = R2 = H n = O, R = -(CH2)ll-CH3, Rx = R2 = H n = O, R = -(CH2)4-CH3, Rj = R2 = H n = O, R = -CH2-CH2-Ch3, Rt = R2 = H n = O, R = -(CH2)2-CH3, Rj = R2 = H

^ch3

n = O, R = -CH , Rj = R2 = H ^ch3

n = O, R = -(CH2)3-CH3, Rj = R2 = H n = O, R = CH-CH2-CH3, Rj = R2 = H

I

ch3

n = O, R =-(CH2)7-CH3, Rt = R2 = H n = O, R = -(CH2)9-CH3, Rj = R2 = H n = 1, R = -CH3, R, = R2 = H n = 1, R = -CH3, Rj = R2 = H n = O, R = -CH3, Rj = R2 = -CO-CH3 n = O, R = -CH3, Rj = R2 = Tosyl n = O, R = -CH3, R, = R2 -CO-C6H5 n = O, R = -CH3, Rj = H, R2-R2 = Isopropyl Indomethacin

Dosierung, oral ED50 Schutzwirkung auf mg/Kg Oedementwicklung %

37 50

23(a) 50

47 10

85 62

95 20

112 10

90 25 80 14 80 53

80 45

85 39

85 35

100 47

106 33

156 50

8,6(a) 50

114 47

204 15

164 10

91 20 9 50

(a) Die Verabreichung der zu prüfenden Verbindung erfolgte durch intramuskuläre Injektion.

Aus Tabelle 1 geht hervor, dass die ED50 von MTA 37 mg/kg beträgt und somit die geringste Dosierung der geprüften Verbindungen der Formel I bei oraler Verabreichung darstellt. Im Vergleichsversuch betrug die EDS0 der bekannten Verbindung Indomethacin 9 mg/kg, wobei bei dieser Dosierung ernsthafte Magengeschwüre auftreten, während das MTA bei einer Dosierung mit EDS0 keinen Sekundäreffekt auf das gastro-intestinale System ausübt. Es ist auch zu beachten, dass die LD von Indomethacin bei Ratten 12 mg/kg beträgt, wie von A. Martelli in «Aspetti di Farmacologia dell'Infiammazione», S. 73, Verl. Tamburini, Mai-60 land (1973) beschrieben, während die LD50 von MTA bei oraler Verabreichung an Ratten mehr als 200 mg/kg beträgt.

Es werden somit vergleichsweise die nachstehenden-therapeutischen Indices (TI) erhalten:

Indomethacin TI = 1,3 es MTA TI = >54,05

Die beschriebenen Verbindungen der Formel I wurden auch einer Reihe von pharmakologischen Tests unterzogen, um deren entzündungshemmende Wirksamkeit zu bestätigen

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6

und deren analgetische und antipyretische Wirksamkeit zu erläutern.

Die in einigen dieser Tests mit MTA erzielten Versuchsresultate sind im nachstehenden angeführt, wobei dieses Produkt in allen Fällen bei oraler Verabreichung die höchste Wirksamkeit zeigte und mit Gewissheit die sicherste Verbindung darstellt, da sie, wie bereits erwähnt, physiologisch im Organismus vorkommt.

Wiederum vom Gesichtspunkt der industriellen Herstellung ist die vorstehend beschriebene Methode zur Herstellung von MTA aus SAME bei weitem die einfachste und wirtschaftlichste Methode und ermöglicht den Verkauf des Produktes zu einem besonders niedrigen Preis.

Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, ist Methylthioadenosin-sulfoxid besonders wirksam bei intramuskulärer Verabreichung. Die grössere Wirksamkeit dieser Verbindung bei intramuskulärer Verabreichung wurde in allen ausgeführten Tests bestätigt. Einige bedeutende Daten hinsichtlich MTA-Sulfoxid sind ebenfalls angeführt, wobei jedoch zu beachten ist, dass alle geprüften Verbindungen in allen Versuchen Aktivität, jedoch in unterschiedlichem Ausmass, aufwiesen.

A) Hinsichtlich entzündungshemmender Wirksamkeit wurden die Produkte auf in Ratten durch Carrageen nach der von G.P. Velo, C. J. Dunn et al in «J. Path.», 111 (1973), S. 149 beschriebenen Velo-Methode induzierter Pleuritis getestet.

Bei oraler Verabreichung einer Dosierung von 75 mg/kg ergab MTA, errechnet aus dem Volumen des Exsudats, eine Schutzwirkung von 42,4% und, errechnet aus der Gesamtzahl Zellen im Exsudat, von 48,8%.

Eine vergleichbare Schutzwirkung wurde mit Indomethacin in einer Dosierung von 10 mg/kg, d.h. bei einer viel näher bei der LD50 liegenden Dosierung, erzielt. Im gleichen Test, ergibt MTA-Sulfoxid bei intramuskulärer Verabreichung in einer Dosierung von 80 mg/kg, errechnet aus dem Volumen des Exsudats, eine Schutzwirkung von 75,8% und bei Errechnung aus der Gesamtzahl Zellen im Exsudat eine solche von 76,4%.

B) Bei Prüfung der entzündungshemmenden Wirkung in dem von C. A. Winter, E. A. Riseley et al in «J. Pharm. Ex-per. Ther.», 141, (1963), S. 369 beschriebenen Test auf in Ratten durch Baumwollkügelchen erzeugtes Granulom, der für chronische Entzündung bedeutsam ist, ergab MTA bei oraler Verabreichung in einer Dosierung von 9 mg/kg bei einem TI von 222 eine Schutzwirkung von 30%.

C) Die analgetische Wirksamkeit der Produkte wurde nach zwei als sehr bedeutsam erachteten Testmethoden geprüft.

In dem von E. Roberts und D. G. Simonsen in «Bio-chem. Pharmac.», 15, (1966), S. 1875 beschriebenen Heiss-plattentest an Mäusen ergibt MTA bei oraler Verabreichung in einer Dosierung von 37 mg/kg eine Schutzwirkung von 50%. Eine etwa äquivalente Schutzwirkung von 58% wird vergleichsweise bei oraler Verabreichung von Amidopyrin in einer Dosierung von 100 mg/kg erzielt.

Im gleichen Test ergibt MTA-Sulfoxid bei intramuskulärer Verabreichung in einer Dosierung von 20 mg/kg eine Schutzwirkung von 50% und bei oraler Verabreichung in einer Dosierung von 100 mg/kg.

In dem von E. Siègmund, R. Cadmus, GO-LU in «Proc. Soc. Exp. Biol. Med.», 95, (1957), S. 729 beschriebenen Strecktest mittels Phenylchinon ergibt MTA bei oraler Verabreichung in einer Dosierung von 37 mg/kg eine Schutzwirkung von 51%.

Im gleichen Test zeigt MTA-Sulfoxid bei intramuskulärer Verabreichung eine EDS0 von 10 mg/kg.

D) Die antipyretische Wirksamkeit wurde nach der von C.V. Winder et al in «J. Pharmacol. Exp. Ther.», 133,

(1961), S. 117 beschriebenen Methode auf in Ratten durch Bierhefe erzeugtes Fieber getestet.

Die antipyretische, I h nach oraler Verabreichung von MTA in einer Dosierung von 300 mg/kg ermittelte Wirkung 5 ergab eine Temperatursenkung um 4,59%, bezogen auf Blindversuche an nur mit Bierhefe behandelten Ratten. Der angegebene prozentuale Wert entspricht einer Temperatursenkung von 38,8 °C auf 37,4 °C.

Zum Vergleich ergab Amidopyrin bei oraler Verabrei-lo chung in einer Dosierung von 200 mg/kg eine Temperatursenkung um 4,69%, und bei intramuskulärer Verabreichung ergab MTA bei einer Dosierung von 80 mg/kg eine Temperatursenkung von 2,35%.

E) Die beschriebenen Verbindungen der Formel I wur-15 den auch auf ihre Fähigkeit zur Verhinderung der Agglome-. ration von Thrombozyten getestet.

Die Agglomeration von Thrombozyten ist als komplexe Erscheinung bekannt, die in ein primäres Stadium aufgrund der direkten Wirkung eines Stimulans, beispielsweise Adeno-20 sin-diphosphat, d.h. ADP, oder Epinephrin, und ein sekundäres Stadium aufgrund der durch das aus den Thrombozyten freigesetzte ADP induzierten Agglomeration aufgeteilt werden kann. Wenn in dieser Hinsicht die Thrombozyten mit dem subendothelialen Collagen in Berührung gelangen, 25 regt das Collagen eine ganze Reihe von Reaktionen an, die zur Freisetzung von ADP aus den Thrombozyten führt. Durch dieses ADP wird die zweite Welle der Agglomeration von Thrombozyten erzeugt. Die nachstehenden Tests wurden ausgeführt, um die agglomerationsverhindernde Wir-30 kung der beschriebenen Verbindungen der Formel I zu bestimmen:

1) in vitro Tests auf die durch ADP und Collagen in Gegenwart von Verbindungen der Formel I induzierte Throm-bozyten-Agglomeration;

35 2) in vitro Tests auf die durch Arachidonsäure (AA) induzierte Thrombozyten-Agglomeration;

3) in vivo Tests auf durch ADP und Collagen in mit den Verbindungen der Formel I behandelten Personen induzierte Thrombozyten-Agglomeration.

40 Auch in diesem Fall wurden die bedeutendsten Resultate mit MTA erzielt, so dass diese Resultate als Hinweis für das Verhalten der gesamten Klasse Verbindungen der Formel I angeführt sind.

Die Testresultate der nachstehend beschriebenen Versu-45 che sind in Fig. 1-4 der Zeichnungen diagrammatisch dargestellt.

1) in vitro Tests:

Blut wurde ohne Stauung entnommen und mit so viel 3,8%iger Natriumzitrat-Lösung versetzt, um ein Gewichtsso Verhältnis BIut:Natriumzitrat von 9:1 zu erhalten. Durch Zentrifugieren bei Zimmertemperatur wurde Plasma mit einem hohen und solches mit einem niedrigen Gehalt an Thrombozyten hergestellt. Die Thrombozyten-Agglomeration wurde nach der von G. V. R. Born und M.J. Cross in «J. ss Physiol.», London, 168, (1963), S. 178 beschriebenen Born & Cross Methode an der Plasmafraktion mit hohem Gehalt an Thrombozyten bestimmt. Die Agglomerationsmittel wurden in den nachstehenden Konzentrationen eingesetzt: ADP (Sigma) 1 (iM; Collagen (Horn) 5 ng/ml; Arachidonsäure 60 4 x 1Ö-4M.

Als Vergleichssubstanz eines die Agglomeration verhindernden Mittels wurde Adenosin in einer Konzentration von 1 x 10"5 M eingesetzt.

Im Diagramm von Fig. I sind die mit ADP als Agglome-65 rationsmittel erhaltenen Testresultate aufgezeichnet, wobei auf der Abszisse die Zeitdauer in min und auf der Ordinate die prozentuale Agglomeration eingetragen sind. Die Kurve 1 bezieht sieh auf Blindversuche, die Kurve 2 auf die mit

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1 x IO-5 M Adenosin behandelten Muster und Kurve 3 auf die mit 5 x IO-4 M MTA behandelten Muster.

Aus den Kurven des Diagramms geht hervor, dass MTA die durch ADP induzierte primäre Thrombozyten-Agglomeration stark vermindert und demzufolge die zweite Agglomerationswelle unterdrückt.

Die gleichen, jedoch mit Collagen als Agglomerationsmittel ausgeführten Tests ergaben negative Resultate, d.h. MTA zeigte höchstens eine vernachlässigbare Wirksamkeit in bezug auf die Verhinderung der durch Collagen induzierten Thrombozyten-Agglomeration.

2) Das Diagramm von Fig. 2 zeigt die Auswirkung von verschiedenen MTA-Konzentrationen auf durch AA in einer Konzentration von 4 x 10~4 M induzierter Thrombozyten-Agglomeration. Die Kurve 1 bezieht sich auf Blindversuche, die Kurve 2 auf eine Anwendungskonzentration des MTA von 2,5 x IO"4 M, die Kurve 3 auf eine Anwendungskonzentration des MTA von 5 x IO"4 M und die Kurve 4 auf eine Anwendungskonzentration des MTA von 10~3 M. Es ist offensichtlich, dass die Wirksamkeit in bezug auf die Verhinderung der Thrombozyten-Agglomeration durch MTA proportional zu dessen Anwendungskonzentration verläuft.

Ebenfalls geprüft wurde die Fähigkeit von MTA, die Wirksamkeit von Prostacyclin (PGI2) zur Verhinderung von durch AA induzierter Thrombozyten-Agglomeration zu erhöhen. Im Diagramm der Fig. 3 sind die erhaltenen Testresultate dargestellt. Die Kurve 1 bezieht sich auf Blindversuche, die Kurve 2 auf eine Anwendungskonzentration des MTA von 5 x IO"4 M, die Kurve 3 auf eine Anwendungskonzentration von PGI2 von 5 x 10-9, M und die Kurve 4 auf ein Gemisch von MTA in einer Anwendungskonzentration von 5 x 10"5 M und PGI2 in einer Anwendungskonzentration von 5 x 10"9 M. Aus Fig. 3 ist ersichtlich, dass durch Anwendung des Gemisches eine starke Erhöhung der Wirksamkeit zur Verhinderung der Thrombozyten-Agglomeration bei Anwendungskonzentrationen der beiden Wirkstoffkomponenten erzielt wird, die bei einzelner Anwendung unwirksam sind.

3) Für die Ausführung der in vivo Tests wurden drei offensichtlich gesunde freiwillige Prüfpersonen im Alter von 35,42 bzw. 48 Jahren, die zuvor während mindestens 15 d keinerlei Arzneimittel eingenommen hatten, vor und nach der Einnahme von zu prüfenden Verbindungen der Formel I in einer Dosierung von je 100 mg alle 8 h während 3 d Agglomerationstests unterworfen und die erhaltenen Testresultate ausgewertet. Die Blutprobe für die Bestimmung der Thrombozyten-Agglomeration wurde 2 h vor Einnahme der letzten Dosis der zu prüfenden Verbindung entnommen.

Im Diagramm von Fig. 4 sind die mit MTA erzielten Testresultate dargestellt. Die ausgezogenen Kurven beziehen sich auf die Testresultate von Blindproben mit den unbehandelten Prüfpersonen, und die gestrichelten Kurven beziehen sich auf die Testresultate der gleichen Prüfpersonen nach der Behandlung mit MTA. Es ist offensichtlich, dass in vivo durch ADP in einer Anwendungskonzentration von 1 nM induzierte Thrombozyten-Agglomeration durch die Behandlung mit MTA stark unterdrückt wird.

Wiederholung der gleichen Testreihe unter Zusatz von Collagen in einer Anwendungskonzentration von 5 ng/ml zum Blut ergab, dass MTA keine Wirksamkeit zur Verhinderung von durch Collagen induzierter Thrombotyzen Agglomeration aufweist, sondern nur die Latenzzeit der Erscheinung verlängert.

Die Tatsache, dass MTA und in mehr oder weniger vergleichbarem Ausmass die übrigen Verbindungen der gleichen Klasse durch ADP induzierte Thrombozyten-Agglomeration stark unterdrückt, dagegen praktisch keine Wirkung auf durch Collagen induzierte Thrombozyten-Agglomeration zeigt, deutet daraufhin, dass durch MTA das erste Agglomerationsstadium verhindert wird, während eine direkte Auswirkung auf das zweite Agglomerationsstadium von vernachlässigbarem Ausmass ist.

Die Verwendung in Kombination mit anderen bekannten Arzneimitteln gegen Thrombozyten-Agglomeration, die im allgemeinen gegen das zweite Agglomerationsstadium wirksam, gegen das erste Agglomerationsstadium jedoch kaum wirksam sind, ist daher von besonderem Interesse.

Durch die erwiesene Wirksamkeit wird angeregt, MTA und die anderen Verbindungen der Formel I, selbst wenn sie weniger wirksam sein sollten, nicht nur als therapeutisches Mittel gegen die Thrombozyten-Agglomeration einzusetzen, sondern auch als antithrombotisches und antiatheroskleroti-sches Arzneimittel, da das veränderte Verhältnis zwischen Thrombozyten und Aderwandungen, neben der Tatsache, die Basis für thrombogenetische Mechanismen darzustellen, auch eine primäre Rolle in atherosklerotischen Erkrankungen spielt.

F) Die einschläfernde Wirkung wurde nach dem von R.W. Morris in «Arch. int. Pharmacodyn», 161, Nr. 2, (1966) S. 380 beschriebenen Morris-Test geprüft. In diesem Test wurde die Dauer des in Mäusen durch intramuskuläre Verabreichung von Pentobarbital in einer Dosierung von 20 mg/kg erzeugten Schlafs durch MTA um 87% verlängert.

G) Hinsichtlich akuter Toxizität sind die beschriebenen Verbindungen der Formel I bei oraler Verabreichung praktisch ohne akute Toxizität. In therapeutischer Dosierung sind sie bei jeder beliebigen Verabreichungsform praktisch ohne Toxizität.

DL50, mg/kg

MTA oral >2000

intravenös 360

MTA-Sulfoxid oral >2000

intravenös 400

Die beschriebenen Adenosin-Derivate der Formel I können, verdünnt mit entsprechenden pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmitteln, in jeder beliebigen, therapeutisch wirksamen Form verabreicht werden, oral, parenteral, in die Venen oder rektal, wie auch in Produkten für äusserliche örtliche Anwendung.

Im nachstehenden sind beispielsweise einige typische, MTA enthaltende pharmazeutische Zubereitungen angeführt:

100 mg Kapseln

MTA 100,2

Mannit 195,0

Magnesiumstearat 5,0

300,2

50 mg Kapseln mg

MTA 50,1

Mannit 100,0

Magnesiumstearat 3,0

153,1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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100 mg Tabletten

MTA Stärke

Magnesiumstearat Lactose

50 mg Tabletten

MTA Stärke

Magnesiumstearat Lactose

100 mg Suppositorien

MTA

Suppositorienmasse

50 mg Suppositorien

MTA

Suppositorienmasse

100,2 100,0 15,0 85,0 300,2

mg

50,1 120,0 15,0

115.0

300.1

50 mg Injektionsampulle

MTA-HCl (56,15 mg basisch äquivalent)

50 mg

5 Lidocain-HCl

25 mg

Wasser auf

3 ml

25 mg Injektionsampulle

10 MTA-HCl (28,07 mg basisch äquivalent)

25 mg

Lidocain-HCl

20 mg

Wasser auf

2 ml

100 mg orale Dosierung

MTA-HCl (112,3 mg basisch äquivalent) 100 mg

Zitronenaroma 0,025 mg

Zucker 1 g

Antifermentierungsmittel 50 mg

1 Wasser auf 5 ml mS 50 mg orale Dosierung

17 a 25 MTA-HCl (56,15 mg basisch äquivalent) 1700,0 Zitronenaroma 1800,2 Zucker

Antifermentierungsmittel Wasser auf

50

0,015 0,5 30 5

mg mg g mg ml

30 .

mg 100 g Salbe

50,1 MTA

1450.0 Basis für wasserlösliche Salbe, auf

1500.1 35 Antioxidant

5 g

100 g 0,1g

4 Blatt Zeichnungen

Claims

645 544

PATENTANSPRÜCHE 1. Therapeutisches Mittel mit entzündungshemmender, analgetischer und antipyretischer Wirksamkeit, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoffkomponente mindestens eine Verbindung der Formel

NH-R

(O)

n ch -s-r

(I)

In der Formel I haben die angegebenen Substituenten vorzugsweise die nachstehend angeführte Bedeutung:

R = Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Decyl, Dodecyl, He-s xadecyl Octadecyl, Benzyl;

Rj = Wasserstoff, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Benzoyl, Tosyr;

R2 = Wasserstoff, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Benzoyl, TosyL

10 Bevorzugte Säureadditionssalze von Verbindungen der Formel I sind das Chlorid, Sulfat, Phosphat, Formiat, Ace-tat, Zitrat, Tartrat, Methansulfonat, p-Toluolsulfonat.

Die Verbindungen der Formel I sind zum Teil neu.

Die Verbindungen der Formel I können in Abhängigkeit 15 von den jeweiligen Substituenten nach verschiedenen Methoden hergestellt werden.

Für die Herstellung der Gruppe von Verbindungen: der Formel

QR^

worin R lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1—18 C-Atomen oder Phenylalkyî mit 1-6 C-Atomen in der Alkylenkette, Rj Wasserstoff, aliphatisches Acyl mit 1-6 C-Atomen oder aromatisches Acyl, R2 Wasserstoff, aliphatisches Acyl mit 1-6 C-Atomen oder aromatisches Acyl bedeuten oder die beiden Substituenten R2 zusammen eine Isopropylidenkette bilden, und n für Null oder 1 steht, oder ein Säureadditionssalz davon, enthält.
2. Mittel nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass in der Verbindung der Formel I Rt und R2 gleich sind und Wasserstoff bedeuten, R = CH3 ist, und n für Null steht.
3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Verbindung der Formel I Rx und R2 gleich sind und Wasserstoff bedeuten, R = CH3 ist, und n für 1 steht.
4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Verbindung der Formel I Rx und R2 gleich sind und Wasserstoff bedeuten, R lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1-12 C-Atomen darstellt, und n für Null steht.
5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Verbindung der Formel I Rt und R2 gleich sind und Wasserstoff bedeuten, R Benzyl darstellt, und n für Null steht.
6. Mittel nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, dass in der Verbindung der Formel I Rj und R2 gleich sind und Benzoyl bedeuten, R Methyl darstellt» und n für Null steht.
7. Mittel nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass in der Verbindung der Formel I Rj und R2 gleich sind und Tosyl bedeuten, R Methyl darstellt, und n für Null steht.
8. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Verbindung der Formel I die beiden Substituenten R2 zusammen eine Isopropylidenkette bilden, R Methyl darstellt, und n für Null steht.