CH649561A5 - Agmatine derivatives with anticoagulant effect and process for their preparation - Google Patents

Agmatine derivatives with anticoagulant effect and process for their preparation Download PDF

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CH649561A5
CH649561A5 CH1293/81A CH129381A CH649561A5 CH 649561 A5 CH649561 A5 CH 649561A5 CH 1293/81 A CH1293/81 A CH 1293/81A CH 129381 A CH129381 A CH 129381A CH 649561 A5 CH649561 A5 CH 649561A5
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agmatine
derivatives
pro
general formula
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CH1293/81A
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Sandor Dr Bajusz
Erzsebet-Hasenoehrl Szell
Eva Dr Barabas
Daniel Dr Bagdy
Zsuzsanna-Nagy Mohai
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Richter Gedeon Vegyeszet
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Description


  
 

**WARNUNG** Anfang DESC Feld konnte Ende CLMS uberlappen **.

 



   PATENTANSPRÜCHE
1. Agmatin-Derivate der allgemeinen Formel I   X-Pro-Agm (HB)n    worin
X für eine a-Aminosäuregruppe in D-Konfiguration steht, deren Seitenkette eine Phenyl- oder Phenylniederalkylgruppe ist, wobei die Phenylniederalkylgruppe im Alkylteil gegebenenfalls auch Heteroatome enthalten kann,
Pro für L-Prolingruppe und
Agm für Agmatingruppe steht,
B einen Säurerest und n 0, 1 oder 2 bedeutet.



   2. Verfahren zur Herstellung der Agmatin-Derivate der allgemeinen Formel I, worin die Bedeutung von X, Pro, Agm, B und n die gleiche wie im Anspruch   list,    dadurch gekennzeichnet, dass man   1 ,4-Diaminobutan-Derivate    der allgemeinen Formel II   A-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2-(HB)n    II worin A für eine Gruppe   H2N-CNHy    oder   Y-NH(NHy    oder Q steht, und Y und Q in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen bedeuten, während die Bedeutung von B und n die gleiche wie im Anspruch 1 ist, mit an der Aminogruppe geschütztem L-Prolin und der darauffolgenden Aminosäure oder aber einem L-Prolinpeptid kondensiert, von der erhaltenen Verbindung die gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppe Q am 1,4-Diaminobutanteil abspaltet und die freigewordene Aminogruppe zur Guanidinogruppe umsetzt,

   von dem entstandenen geschützten Dipeptidylagmatin die Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe und die gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppe Y der Guanidinogruppe entfernt und das freie Dipeptidylagmatin in Form eines Salzes isoliert.



   3. Die Blutgerinnung hemmende Arzneimittelpräparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Agmatin-Derivaten gemäss Anspruch 1.



   4. Die Blutgerinnung hemmende Arzneimittelpräparate nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Agmatin-Derivaten gemäss Anspruch 1 und Heparin.



   Die Erfindung betrifft hemmend auf die Blutgerinnung wirkende Agmatin-Derivate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittelpräparate enthaltend diese Verbindungen. Die neuen Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel I   X-Pro-Agrn (HB)n    worin
X für eine a-Aminosäuregruppe in D-Konfiguration steht, deren Seitenkette eine Phenyl- oder Phenylniederalkylgruppe ist, wobei die Phenylniederalkylgruppe im Alkylteil gegebenenfalls auch Heteroatome enthalten kann,
Pro für L-Prolingruppe und
Agm   für Agmatingruppe    steht,
B einen Säurerest und n 0, 1 oder 2 bedeutet.



   Die in der vorliegenden Beschreibung gebrauchten Bezeichnungen der Aminosäuren sind die in der Fachliteratur üblichen (Biochem. J. 126, 773 [1972]).



   Es ist bekannt, dass die einfachen Acylderivate des Agmatins (l-Amino-4-guanidino-butans), zum Beispiel das Tosylagmatin (l-[p-Toluolsulfonylamido]-4- guanidino-butan), fähig sind, die proteolytische Reaktion des Trypsins und des Thrombins zu hemmen (Lorand und Rule: Nature   190,722    [1961]; Rule und Lorand: Biochem. Biophys. Acta   81, i30    [1964]). Nach Beobachtungen der genannten Autoren verzögert das Tosylagmatin die Gerinnung des Blutplasmas, d.h.



  kann auch die Fibrinogen-Thrombin-Reaktion bremsen. Eigene Untersuchungen ergaben jedoch, dass die auf die Fibrinogen-Thrombin-Reaktion ausgeübte Wirkung des   Tosylag-    matins ausserordentlich gering ist: 0,7 mg Tosylagmatin sind erforderlich, um die Gerinnungszeit von 1 ml Lösung, die 1,25 mg Fibrinogen und 1,25 NIH-Einheiten Thrombin ( Minimum Requirements   ofDried      Thrombin , 2nd    rev.



  Div. Biol. Conf. Natl. Inst. Health, Bethesda, Md, USA, 1946) enthält, auf das Zweifache (von 15 s auf 30 s) zu erhöhen.



   Ziel der Erfindung war die Herstellung neuer Agmatin Derivate mit grösserer blutgerinnungshemmender Wirkung.



   Es wurde gefunden, dass die neuen Dipeptidyl-Derivate des   Agmatins,    die der allgemeinen Formel I entsprechen, worin die Bedeutung von X, Pro, Agm, B und n die gleiche wie oben ist, eine bedeutende Hemmung auf die Blutgerinnung ausüben. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Seitenkette des N-terminalen D-a-Aminosäureteils des Dipeptidyl   agmatins    eine Phenylniederalkylgruppe ist; das D-Phenylalanyl-L-prolylagmatin erwies sich zum Beispiel als ausserordentlich aktiv.



  In der Tabelle I ist die auf die Fibrinogen-Thrombin-Reaktion ausgeübte Wirkung einiger Verbindungen der allgemeinen Formel I und des bekannten Tosylagmatins angegeben. Die Wirksamkeit der Verbindungen wird durch diejenige Substanzmenge gekennzeichnet, die erforderlich ist, die Ge   rinnungszeit    des Fibrinogens auf das Zweifache zu verlängern. Auch die relative Wirksamkeit der neuen Agmatinderivate ist in der Tabelle zusammengestellt. Das als Bezugsbasis dienende   Tosylagmatin    wird als 1 betrachtet.

  Die Wirksamkeitsuntersuchungen wurden in einem System folgender Zu   sammensetzung    vorgenommen: 0,2   ml      0,5%ges    Rinderfibrinogen in 0,9%iger Kochsalz lösung, 0,1 ml tris(Hydroxymethyl)methylamin-hydrochlorid    Salzsäure-Puffer (pH =7,4), der das Agmatinderi-    vat enthält und 0,1 ml US Standard Human Thrombin 5   NIH-Einhei       ten/mi.   



   Ohne das   Agmatinderivat    gerinnt das System in 15 Sekunden.



   Tabelle I Verbindung   llg/Ansatz    relative Aktivität   H-D-Phg-Pro-Agm    1,4 200 H-D-Ser(Bzl) Pro-Agm 0,7 400 H-D-Phe-Pro-Agma 0,12 2333   Tosylagmatin    280 1
Entsprechend den in der Fachliteratur üblichen Abkürzungen (s. z.B. Biochem.   J. 126, 773/1972)    bedeuten: Phg = Phenylglycin, Agm =   Aginafin;    Bzl, Z bzw. Boc = Benzyl-, Benzyloxycarbonyl- beziehungsweise tert.-Butyloxycarbonylgruppe. -D-Ser(Bzl) steht für O-Benzyl-D-seringruppe.



   Es wurde ferner gefunden, dass die blutgerinnungshemmende Wirkung der neuen Dipeptidyl-agmatin-Derivate der allgemeinen Formel I durch das handelsübliche und in der Heilkunde angewendete Heparin noch verstärkt wird. Dieser Effekt kann in vitro und in vivo gleichermassen nachgewiesen werden.  



   Bei den Versuchen in vitro wurde die Wirkung von D



     Phe-Pro-Agm'2HCl    (Verbindung der allgemeinen Formel I mit X = D-Phenylalanin, B = Chlor, n = 2) und Heparin in isolierten Systemen der unten angegebenen Zusammensetzungen A und B untersucht.



   A: Fibrinogen-Thrombin-Reaktionsgemisch 0,2 ml 0,5%iges Rinderfibrinogen in 0,9%iger Kochsalz lösung, 0,1 ml tris(Hydroxymethyl)methylamin-hydrochlorid
Salzsäurepuffer (pH = 7,4), der das Agmatinderi vat und/oder das Heparin (132,2 E/mg U.S.Ph.



   XVII) enthält, und 0,1 ml US Standard Human Thrombin 10 NIH-Einhei ten/ml.



   Ohne Hemmsubstanz gerinnt das System in 15 Sekunden.



   B: Menschliches Citratplasma 0,2 ml menschliches Citratplasma 0,1 tris(Hydroxymethyl)methylamin-hydroclorid
Salzsäurepuffer (pH = 7,4), der das Agmatinderi vat und/oder das Heparin (132,2 E/mg,   U.S.Ph..   



   XVII) enthält, und 0,1 ml   US Standard Human Thrombin 10 NIH-Einhei-    ten/ml.



   Ohne Hemmsubstanz gerinnt das System in 15 Sekunden.



   In der Tabelle II ist gezeigt, welche Wirkung die gerinnungshemmenden Substanzen, an sich oder zusammen angewendet, auf die Gerinnungszeit der Systeme A und B aus üben. Die Bezugsgrundlage der Realtivangaben ist die ohne Hemmsubstanz gemessene Gerinnungszeit. Für die Gerinnungszeit bei kombinierter Anwendung sind sowohl die auf Grund der Einzelwerte zu erwartende Wirkungssumme wie auch der tatsächlich gemessene Wert angegeben.



  Tabelle II Die Steigerung der blutgerinnungshemmenden Wirkung von   D-Phe-Pro-Agm 2HCI    durch Heparin in einem isolierten System (A) und in menschlichem Citratplasma (B) Relative Gerinnungszeit   D-Phe-Pro-Agm2HCI    Heparin   D-Phe-Pro-Agm2HCI    Heparin   D-Phe-Pro-Agm2HCI    + Heparin    llg/Ansatz    an sich berechnet gefunden A 0,10 0,05 2,5 1,1 2,6 4,0
0,10 0,10 2,5 1,5 3,0 6,0
0,10 0,20 2,5 2,0 3,5 9,0
0,20 0,05 4,0 1,1 4,1 7,5
0,20 0,10 4,0 1,5 4,5 13,0
0,20 0,20 4,0 2,0 5,0 22,0 B 0,05 0,05 2,2 1,0 2,2 4,0
0,05 0,10 2,2 2,0 3,2 6,2
0,05 0,20 2,2 3,8 5,0 9,5
0,10 0,05 3,4 1,0 3,4 7,8
0,10 0,10 3,4 2,0 4,4 13,0
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I werden in der Humanmedizin in folgenden Dosen angewendet:
1.

  Bei intravenöser Infusion 50-100 mg/h, wobei die Infusion täglich 6-12 Stunden dauert.



   2. Die mit Heparin kombinierten Verbindungen der allgemeinen Formel I werden als subcutane Injektion in einer Dosis von 50-60 mg Peptid + 3500-4500 E Heparin drei- bis viermal täglich appliziert.



   Beide Werte gelten für Erwachsene.



   Bei den Versuchen in vivo wurden 2-3 kg schweren grauen Kaninchen subcutan folgende Substanzen appliziert: a) 5 mg/kg Heparin (132,2 E/mg, U.S.Ph. XVII) b) 10 mg/kg   D-Phe-Pro-Agm 2HCI,    beziehungsweise c) 5 mg/kg Heparin + 10 mg/kg   D-Phe-Pro-Agm 2HCI.   



   Nach Applikation der Verbindungen wurde alle 30 Minuten aus der Ohrvene der Kaninchen eine Blurprobe entnommen und im Thrombelastograph die Gerinnungszeit des Vollblutes bestimmt (H. Hartert: Zschr. f. clin. Med.   153,423    [1955]).



   Aus den Versuchen ergab sich eindeutig, dass das Heparin beziehungsweise das Agmatinderivat an sich in den eingesetzten Dosen (a und b) nur eine recht schwache Wirkung aus üben: die Gerinnungszeit des Vollblutes wird auf kaum das Eineinhalbfache verlängert (relative Gerinnungszeit höchstens 1,2-1,5), und auch die Prothrombinaktivität des Blutes ändert sich nicht wesentlich. Werden die beiden Hemmstoffe jedoch in den gleichen Dosen gemeinsam appliziert (c), so tritt eine bedeutende Hemmung der Blutgerinnung ein. Uber 3-4 Stunden beträgt die relative Gerinnungszeit das Vier- bis Fünffache des Wertes der Kontrolle. Die Prothrombin-Aktivität der zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommenen Blutproben wurde nach Quick (J. Biol.   Chem. 109,73    [19351) bestimmt.

  Betrachtet man den Wert vor der Behandlung als 100%, so verringerte sich die Prothrombin-Aktivität auf   20-30%,    was gemäss den Daten der Fachliteratur als eine antikoagulente Wirkung von therapeutischem Wert zu betrachten ist.



   Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der neuen Agmatinderivate der allgemeinen Formel I, worin die Bedeutung von X, Pro, Agm, B und n die gleiche wie oben ist. Die Verbindungen werden erfindungsgemäss hergestellt, indem man 1,4-Diaminobutan-Derivate der allgemeinen Formel II   A-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2-(HB)n    II worin A für eine Gruppe   H2N-C(NHF    oder   Y-NH-C(NHF    oder Q steht, und Y und Q in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen bedeuten, während die Bedeutung von B und n die gleiche wie oben ist, mit an der Aminogruppe geschütztem L-Prolin und der darauffolgenden Aminosäure oder aber einem L-Prolinpeptid auf die in der Peptidchemie übliche Weise kondensiert, 

   von der erhaltenen Verbindung gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppe Q am 1,4-Diaminobutanteil abspaltet und die freigewordene Aminogruppe in an sich bekannter Weise zur Guanidinogruppe umsetzt, von dem entstandenen geschützten Dipeptidylagmatin die Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe entfernt, die gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppe Y der Guanidinogruppe abspaltet und das freie Dipeptidylagmatin in Form eines Salzes isoliert.



     Diejenigen    Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen X die Bedeutung D-Phenylalanin-Gruppe hat, werden  erfindungsgemäss bevorzugt hergestellt, indem man aus Z-D Phe-Pro-OH (Nikolaides u.a.: J. Med. Chem.   11,74    [1968]) mit Chlorkohlensäurealkylester ein gemischtes Anhydrid bereitet und dieses mit Agmatin-hydrochlorid (Verbindung der allgemeinen Formel II mit A =   H2N-C(NHF    Gruppe, B = Chlor und n   = 1)    oder mit an der Guanidinogruppe eine Benzyloxycarbonyl(Z)-Gruppe tragendem Agmatin (Verbindung der allgemeinen Formel II mit A =   Y-NH-C(NHF    Gruppe, Y = Z und   n =0) umsetzt,    von dem gebildeten geschützten Dipeptidylagmatin die Schutzgruppe(n) Z abspaltet und das D-Phe-Pro-Agm in Form eines Salzes abtrennt.



   Erfindungsgemäss kann man auch 4-(tert.-Butyloxycarbonylamino)-butylamin (Verbindung der allgemeinen Formel II mit A = Q = tert.-Butyloxycarbonyl(BOC)-Gruppe   undn=0)    (Geiger: Liebigs Ann.   Chem 750 165    [1971]) in an sich bekannter Weise (Fuchs u.a.: Liebigs Ann. Chem. 1977, 602) mit Benzyloxycarbonyl-L-prolin kondensieren, von dem Kondensierungsprodukt die BOC-Gruppe abspalten, die freiwerdende Aminogruppe zur Guanidinogruppe umsetzen, die Gruppe Z des Produktes   Z-Pro-Agm    entfernen und Pro-Agm mit der entsprechenden, an der Aminogruppe geschützten a-Aminosäure (zum Beispiel mit BOC-D-Ser(Bzl)-OH oder Z-D-Phg-OH) koppeln, schliesslich die Schutzgruppe der ter   minalen    Aminogruppe des geschützten Dipeptidylagmatins abspalten und das freie Dipeptidylagmatin in Form eines Salzes isolieren.



   Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert. Die RrWerte wurden schichtchromatographisch an Silikagel (Kieselgel G, REANAL, Budapest) mit folgenden Lösungsmittelsystemen ermittelt: 1. Chloroform-Methanol 9:1 2. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 240:20:6:11 3. Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser 60:20:6:11 4.   Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser    30:20:6:11
Beispiell
D-Phenylalanyl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid (Verbindung der allgemeinen Formel I mit X = D-Phenylalan   ylgruppe, B=Chlorund n=2)   
Schritt 1:   N-Benzyloxycarbonyl-S-methyl-isothio-    carbamid
13,9 g (0,1 Mol) S-Methyl-isothiocarbamid-sulfat werden in 50 ml Wasser gelöst.

  Die Lösung wird auf 0-5   C    gekühlt und bei dieser Temperatur unter Rühren innerhalb von etwa 20 Minuten mit 15   ml    (0,1 Mol) Chlorkohlensäurebenzylester und 50   ml    4n Natronlauge versetzt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit 3 x 50 ml kaltem Wasser und dann mit 3 x 50   ml    n-Hexan gewaschen und schliesslich über Phosphorpentoxyd im Vakuumexsikkator getrocknet: 15,7 g (70%) Produkt werden erhalten.    ¯¯¯¯¯   
Schmp.: 74-75   Q    Rf= 0,70-0,75.



  Analyse für   CloHl2o2N2S    (M = 224,27)   berechnet:C=53,55%    H=5,39%   N=12,49%      S=14,3%    gefunden: C=53,59% H=5,69% N=12,23%   S=14,27 /e   
Schritt 2:   N-tert.-Butyloxycarbonyl-NG-benzyloxycarbo-    nyl-agmatin
6,7 g (30 mMol)   1-(tert.-Butyloxycarbonyl)-1,4-diamino-    butan-hydrochlorid (Geiger: Liebigs Ann.   Chem. 750, 165    [1971]) und 6,7 g (30 mMol) des gemäss Schritt 1 erhaltenen Isothiocarbamid-Derivates werden in 15 ml Äthanol gelöst.



  Nach Zusatz von 4,2   ml    (30 mMol) Triäthylamin wird die Lösung auf dem Dampfbad 3 Stunden lang erwärmt. Dann wird das Reaktionsgemisch eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in einem Zweiphasengemisch aus 150 ml Benzol und 50   ml    n Essigsäure gelöst. Die benzolische Phase wird mit 10 ml Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der kristalline Rückstand wird in 30-50 ml auf etwa 10   C    gekühlten Benzols suspendiert, die Suspension filtriert und das Produkt mit n-Hexan gewaschen. 7,9 g (60%) Produkt werden erhalten. Schmp.: 99-101   "C;      Rlf=    0,60-0,64.



   Analyse für   Cl8H2804N4 CH3COOH 2/3    H 0 (M = 436,5) berechnet:   C=55,03%      H=7,69%      N = 12,84%    gefunden:   C=55,l    % H=7,8 %   N=12,65%.   



   Schritt 3:   NG-Benzyloxycarbonyl-agmatin-dihydrochlo-    rid (Verbindung der allgemeinen Formel II mit A = Y-NH   C(NH > Gruppe,    Y = Benzyloxycarbonylgruppe,   B =    Chlor und n = 2)
5,5 g (15 mMol) des gemäss Schritt 2 erhaltenen geschützten Agmatins werden in 10   ml    Äthylacetat suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren und Eiskühlung mit 20   ml    11-15% Salzsäure enthaltendem Äthylacetat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten gerührt und dann mit 10   ml    Äthylacetat verdünnt. Das Produkt wird abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und im Vakuumexsikkator über Kaliumhydroxyd bei Raumtemperatur getrocknet. 4,3 g (83%) Produkt werden erhalten. Schmp. 150-153   C;      R4f=0,49-0,59.   



  Analyse für   C13H2002N4.2      HCl l/3      H2O    (M = 343,3) berechnet: C = 45,48% H= 6,65% N= 16,32%   C1=    20,65% gefunden: C=45,5 %H=6,5   % N=16,3      %cd=20,3    %.



   Schritt 4: Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl NG-benzyloxycarbonyl-agmatin
2 g (6 mMol) des gemäss Schritt 3 erhaltenen geschützten Agmatin-hydrochlorides werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Zu der Lösung werden 1,5   ml    Wasser und so viel Tri äthylamin gegeben, dass ein pH-Wert von 8-9 entsteht (etwa 1,5   ml    Triäthylamin). Dann wird die Lösung auf - 15 C gekühlt und zu einem auf die folgende Weise bereiteten gemischten Anhydrid gegeben.



   2,4 g (6 mMol)   Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-    prolin (Nikolaides u.a.: J. Med. Chem.   11,74    [1968]) werden in 12   ml    Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf   -15      C    gekühlt und bei dieser Temperatur unter Rühren mit 0,66   ml    (6 mMol) N-Methylmorpholin und 0,8 ml (6 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester versetzt. Man rührt das Gemisch 10 Minuten lang und gibt dann die zuerst bereitete Lösung hinzu. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird -falls erforderlich - mit Triäthylamin auf 8-9 eingestellt. Das Reak   tionsgemisch wird      bei -15      C    eine Stunde lang und dann bei   0      C    eine Stunde lang gerührt.

  Nach dem Eindampfen wird der Eindampfrückstand in einem aus 20 ml Wasser und 60 ml eines 4:1-Gemisches von Benzol und Äthylacetat bestehenden Zweiphasengemisch gelöst. Die organische Phase wird zuerst mit 2 x 20 ml   1%    N-Methylmorpholin enthaltenden Wassers, dann mit 2 x 20   ml    0, ln Salzsäure und schliesslich mit 2 x 20 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. 3,1 g (80%) Produkt werden erhalten. R2f= 0,30-0,35.

 

   Schritt 5: D-Phenylalanyl-L-prolyl-agmatin-hydrochlorid
3,1 g (4,8 mMol) des gemäss Schritt 4 erhaltenen geschützten Dipeptidyl-agmatins werden in 40   ml    Methanol gelöst. Die Lösung wird mit 4,8 ml 2n Salzsäure versetzt und in Gegenwart von Palladiumaktivkohle hydriert. Dann wird der Katalysator abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 5   ml    Methanol gelöst und die Lösung mit 30-40 ml Aceton verdünnt. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit Aceton gewaschen und  an der Luft   getrocknet. 2,05g    (95%) Produkt werden erhalten.

  Schmp.:   216-219"C;      R4f= 0,5-0,6;      20 = -      125,5    (c=   1, 0,ln    Essigsäure).



  Analyse für   C19H3002N6.2      HCl.i/3      H2O    M = 453,4) berechnet:   C= 50,32%      H= 7,26%    N= 18,53%   C1=    15,64% gefunden: C=50,8 %H=7,5 %N=18,3   %cd=15,    6%.



   Beispiel 2
D-Phenylalanyl-L-prolylagmatin-dihydrochlorid (Verbindung der allgemeinen Formel I mit X = D-Phenylalanylgruppe,   13    = Chlor und n= 2)
Schritt 1: Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolylagmatin-hydrochlorid
4 g (10 mMol) Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-Lprolin (Nikolaides u.a.: J. Med.   Chem. 11,    74 [1968]) werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf - 15   C    gekühlt und bei dieser Temperatur unter Rühren mit 1,11   ml    (10 mMol) N-Methylmorpholin und 1,32 ml (10 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten lang gerührt und dann mit einer auf folgende Weise bereiteten Lösung versetzt.



   2,05 g (10 mMol)   Agmatin-dihydrochlorid    (Verbindung der allgemeinen Formel II mit A = H2N-C(NH)-Gruppe, B = Chlor und n = 2) werden in 15   ml    Dimethylformamid suspendiert. Nach Zugabe von 2   ml    Wasser und 1,4   ml    (10 mMol) Triäthylamin wird das Gemisch auf - 15   C    gekühlt und mit dem zuerst bereiteten Gemisch vereinigt. Das Reaktionsgemisch wird bei - 15   C    zwei Stunden lang, ohne Kühlung noch eine weitere Stunde lang gerührt und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 100   ml    0,2n Salzsäure gelöst und die Lösung mit 3 x 20   ml    Äthylacetat ausgeschüttelt.

  Der pH-Wert der wässrigen Phase wird mit festem Natriumhydrogencarbonat auf   8,0-8,5    eingestellt. Dann wird die Lösung mit 5 x 20 ml Chloroform ausgeschüttelt. Die Chloroformphasen werden vereinigt, mit 2 x 10 ml Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit Diäthyl äther verrieben, filtriert, mit Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet. 4,1 g (75%) Produkt werden erhalten.



  R3f= 0,5-0,6.



   Schritt 2: D-Phenylalanyl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid
3,8 g (7 mMol) des gemäss Schritt 1 erhaltenen geschützten Dipeptidylagmatins werden in 60   ml    Methanol gelöst.



  Die Lösung wird mit 3,5   ml    2n Salzsäure versetzt und in Gegenwart von Palladiumaktivkohle hydriert. Dann wird der Katalysator abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Methanol gelöst und die Lösung mit 40-60 ml Aceton verdünnt.



  Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet. 2,95 g (95%) Produkt werden erhalten. Schmp.: 216-219   C;      R4f=0,5-0,6; [a]2D0 = - 125,5 (c= 1, ln Essigsäure).   



   Beispiel 3
O-Benzyl-D-seryl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid (Verbindung der allgemeinen Formel I mit X= O-Benzyl-D-serylgruppe,   B    Chlor und n = 2)
Schritt 1: L-Prolyl-agmatin-dihydrochlorid
3,7 g (10 mMol)   Benzyloxycarionyl-L-prolin-P-nitro-    phenylester (Goodman und Stueben: J.   Am.    Chem. Soc. 81, 3980 [1959]) werden in einem Gemisch aus Dimethylformamid und Pyridin (10   mi      5      ml)    gelöst und zu der Lösung 2,03 g (10 mMol) Agmatin-dihydrochlorid (Verbindung der allgemeinen Formel II mit X=   H2N-C(NH)-Gruppe,      B =    Cl und n= 2) sowie 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin zugegeben.



  Das Reaktionsgemisch wird 16-20 Stunden lang gerührt und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in einem Zweiphasengemisch aus 50 ml   0,ln    Salzsäure und 20   ml    Äthylacetat aufgelöst. Die wässrige Phase wird mit 2 x 20 ml Diäthyläther gewaschen, dann mit festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und schliesslich mit 5 x 20   ml    Chloroform ausgeschüttelt. Die Chloroformphasen werden vereinigt, mit 2 x 10   Wasser    gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Das als Eindampfrückstand erhaltene Benzyloxycarbonyl-L-prolyl- agmatinhydrochlorid (R3f=   0,32-0,42)    wird in 40 mi Methanol gelöst, die Lösung wird mit 10   ml    ln Salzsäure versetzt und in Gegenwart von Palladiumaktivkohle hydriert.

  Dann wird der Katalysator abfiltriert, mit Wasser gewaschen und das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wird mit Di äthyläther verrieben, filtriert, mit Diäthyläther gewaschen und im Vakuumexsikkator über Kaliumhydroxyd getrocknet.



  2,1   g (70%) Produkt werden    erhalten. Schmp.:   186189 C;       R4f= 0,15-0,25; 20 = -33,25 (c = 1, Methanol).



   [α]20D    Analyse für   CloH2loN2 2      HC1    (M = 300,2) berechnet:   C = 40,00%      H = 7,72% N = 23,32%      Cl = 23,62%    gefunden: C=40,0 % H=7,7 %N=23,0 % Cl=23,3 %.



   Schritt 2: O-Benzyl-D-seryl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid
1,5 g (5 mMol) des gemäss Schritt 1 erhaltenen L-Prolylagmatin-dihydrochlorides werden in 5 ml Dimethylformamid suspendiert. Die Suspension wird mit 0,5 ml Wasser und 0,7 ml (5 mMol) Triäthylamin versetzt, auf - 15   C    gekühlt und zu-dem auf die folgende Weise bereiteten gemischten Anhydrid gegeben.



   1,5 g (5 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-D-serin (Otsuka u.a.: Bull. Chem. Soc. Japan 39, 1171 [1966]) werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf  - 15   C    gekühlt und bei dieser Temperatur unter Rühren mit 0,6 ml (5 mMol) N-Methylmorpholin und 0,7 ml (5 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester versetzt. Das Gemisch wird noch 10 Minuten lang gerührt und dann zu der zuerst bereiteten Suspension gegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei - 15   C,    dann eine Stunde lang bei 0   C    gerührt und schliesslich unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in einem Zweiphasengemisch aus 10 ml Wasser und 50 ml Chloroform aufgelöst.

  Die organische Phase wird mit 2 x 10   ml    Wasser und danach mit 2 x 10   ml      5%iger    Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wird mit Diäthyläther verrieben, filtriert, mit Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Das erhaltene tert.-Butyloxycar   bonyl-O-benzyl-D-seryl-L-prolyl-agmatin-hydrochlorid    (R3f = 0,4-0,5) wird in 5 ml Athylacetat suspendiert. Zu der Suspension werden unter Rühren und Eiskühlung 10 ml 11-15% Salzsäure enthaltendes Äthylacetat gegeben. Die Suspension wird 30 Minuten lang gerührt, dann wird das Produkt abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und im Vakuumexsikkator über Kaliumhydroxyd getrocknet. 

  Die Substanz wird in 20 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. 1,62 g (65%) Produkt werden erhalten. Schmp.:   110-115      "C.   



      R4f=0,560,66; 20 = -47 (c= 1, 0,ln Essigsäure).



   [α]D      Analyse für   C20H3203N6 2HCI H2O    (M = 495,45) berechnet:   C = 48,48%    H = 7,32% N = 16,96% C1= 14,31% gefunden: C=48,4 % H= 7,4   %N=16,85% C1= 14,3 %.   



   Beispiel 4    D-Phenylglycyl-L-prolyl-agmatin-dihydrochlorid    (Verbindung der allgemeinen Formel I mit X= Diphenylglcyl Gruppe,   13    = Chlor und n = 2)
Schritt 1: 1-Amidino-3,5-dimethyl-pyrazol-acetat
20,1 g (100 mMol)   l-Amidino-3,5-dimethyl-pyrazolnitrat    (Thiele und Dralle:   Ann. 302, 294    [1898]) werden in 200 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird mit 110 ml n Natronlauge versetzt. Dann wird die wässrige Phase abgetrennt und mit 2 x 50 ml Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die Meth   ylenchloridphasen    werden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet, mit etwa 6 ml Essigsäure angesäuert und unter vermindertem Druck eingedampft.

  Der erhaltene kristalline Rückstand wird in Diäthyläther suspendiert,   dann abfiltriert,    mit Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet.



  18,25 g (92%) Produkt werden erhalten. Schmp.: 114-116   C.   



  Analyse für   C6HloN4 CH3COOH    (M = 198,2) berechnet: C=48,47% H=7,12%N=28,27% gefunden: C=48,6 % H=7,1 %N=28,5 %
Schritt 2: L-Prolyl-agmatin-dihydrochlorid
4,2 g (10 mMol) Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-4 (tert.-butyloxycarbonylamido)-butylamin (Fuchs u.a.: Liebigs Ann.   Chem. 1977, 602)    werden in 10 ml Äthylacetat suspendiert. Zu der Suspension werden unter Rühren und Eiskühlung 20 ml 11-15% Salzsäure enthaltendes Äthylacetat gegeben. Die Suspension wird 30 Minuten lang gerührt, dann wird die Festsubstanz abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und im Vakuumexsikkator über Kaliumhydroxyd getrocknet. Das Produkt (R3f=0,24-0,34) wird in 10 ml Äthanol gelöst und die Lösung mit 2 g (10 mMol) des gemäss Schritt 1 erhaltenen   1-Amidino-3,5-dimethyl-pyrazol-acetates    versetzt.



  1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin werden zugegeben, das Reaktionsgemisch wird auf dem Dampfbad 3 Stunden lang gewärmt und dann unter vermindertem Druck eingedampft.



  Der Eindampfrückstand wird mit Äthylacetat verrieben, ab   abfiltriert,    mit Athylacetat und Diäthyläther gewaschen und dann getrocknet. Das erhaltene Benzyloxycarbonyl-L-prolyl   agmatin-hydrochlorid (R3f = 0,3-0,4) wird in 40 ml Methanol    gelöst. Die Lösung wird mit 10   ml    n Salzsäure versetzt und in Gegenwart von Palladiumaktivkohle hydriert. Dann wird der Katalysator abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Eindampfrückstand wird durch Verreiben mit Diäthyläther kristallisiert,   abffltriert,    mit Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet. 1,81 g (60%)   L-Prolyl-agmatin-dihydrochlorid    werden erhalten.



  Schmp.:   186189      "C;      R4f=0,15-0,25.   



   Schritt 3:   D-Phenylglycyl-L-prolyl-agmatin-dihydro-    chlorid
Aus 1,43 g (5 mMol) Benzyloxycarbonyl-D-phenylglycin (Wissmann u.a.: Z. Physiol.   Chem. 355, 1083    [1974]) wird gemischtes Anhydrid bereitet und mit 1,5 g (5 mMol) des gemäss Schritt 2 erhaltenen   L-Prolyl-agmatin-dihydrochlorides    umgesetzt. Das beim Aufarbeiten des Reaktionsgemisches erhaltene   Benzyloxycarbonyl-D-phenylglycyl-L-prolyl-agma-    tin-hydrochlorid (R3f= 0,28-0,34) wird in 30 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird mit 5   ml    n Salzsäure versetzt und in Gegenwart von Palladiumaktivkohle hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. 

  Der Rückstand wird mit Diäthyläther verrieben, abfiltreirt, mit Diäthyläther gewaschen und im Vakuumexsikkator über Kaliumhydroxyd getrocknet. 1,62 g (75%)Produkt werden erhalten. R3f=   0,1-0,2;      R4f=0,43-0,50;      [a]2D0    =   -94'    (c=   1, 0,ln    Essigsäure). 

Claims (4)

  1. PATENTANSPRÜCHE 1. Agmatin-Derivate der allgemeinen Formel I X-Pro-Agm (HB)n worin X für eine a-Aminosäuregruppe in D-Konfiguration steht, deren Seitenkette eine Phenyl- oder Phenylniederalkylgruppe ist, wobei die Phenylniederalkylgruppe im Alkylteil gegebenenfalls auch Heteroatome enthalten kann, Pro für L-Prolingruppe und Agm für Agmatingruppe steht, B einen Säurerest und n 0, 1 oder 2 bedeutet.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der Agmatin-Derivate der allgemeinen Formel I, worin die Bedeutung von X, Pro, Agm, B und n die gleiche wie im Anspruch list, dadurch gekennzeichnet, dass man 1 ,4-Diaminobutan-Derivate der allgemeinen Formel II A-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2-(HB)n II worin A für eine Gruppe H2N-CNHy oder Y-NH(NHy oder Q steht, und Y und Q in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen bedeuten, während die Bedeutung von B und n die gleiche wie im Anspruch 1 ist, mit an der Aminogruppe geschütztem L-Prolin und der darauffolgenden Aminosäure oder aber einem L-Prolinpeptid kondensiert, von der erhaltenen Verbindung die gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppe Q am 1,4-Diaminobutanteil abspaltet und die freigewordene Aminogruppe zur Guanidinogruppe umsetzt,
    von dem entstandenen geschützten Dipeptidylagmatin die Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe und die gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppe Y der Guanidinogruppe entfernt und das freie Dipeptidylagmatin in Form eines Salzes isoliert.
  3. 3. Die Blutgerinnung hemmende Arzneimittelpräparate, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Agmatin-Derivaten gemäss Anspruch 1.
  4. 4. Die Blutgerinnung hemmende Arzneimittelpräparate nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Agmatin-Derivaten gemäss Anspruch 1 und Heparin.
    Die Erfindung betrifft hemmend auf die Blutgerinnung wirkende Agmatin-Derivate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittelpräparate enthaltend diese Verbindungen. Die neuen Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel I X-Pro-Agrn (HB)n worin X für eine a-Aminosäuregruppe in D-Konfiguration steht, deren Seitenkette eine Phenyl- oder Phenylniederalkylgruppe ist, wobei die Phenylniederalkylgruppe im Alkylteil gegebenenfalls auch Heteroatome enthalten kann, Pro für L-Prolingruppe und Agm für Agmatingruppe steht, B einen Säurerest und n 0, 1 oder 2 bedeutet.
    Die in der vorliegenden Beschreibung gebrauchten Bezeichnungen der Aminosäuren sind die in der Fachliteratur üblichen (Biochem. J. 126, 773 [1972]).
    Es ist bekannt, dass die einfachen Acylderivate des Agmatins (l-Amino-4-guanidino-butans), zum Beispiel das Tosylagmatin (l-[p-Toluolsulfonylamido]-4- guanidino-butan), fähig sind, die proteolytische Reaktion des Trypsins und des Thrombins zu hemmen (Lorand und Rule: Nature 190,722 [1961]; Rule und Lorand: Biochem. Biophys. Acta 81, i30 [1964]). Nach Beobachtungen der genannten Autoren verzögert das Tosylagmatin die Gerinnung des Blutplasmas, d.h.
    kann auch die Fibrinogen-Thrombin-Reaktion bremsen. Eigene Untersuchungen ergaben jedoch, dass die auf die Fibrinogen-Thrombin-Reaktion ausgeübte Wirkung des Tosylag- matins ausserordentlich gering ist: 0,7 mg Tosylagmatin sind erforderlich, um die Gerinnungszeit von 1 ml Lösung, die 1,25 mg Fibrinogen und 1,25 NIH-Einheiten Thrombin ( Minimum Requirements ofDried Thrombin , 2nd rev.
    Div. Biol. Conf. Natl. Inst. Health, Bethesda, Md, USA, 1946) enthält, auf das Zweifache (von 15 s auf 30 s) zu erhöhen.
    Ziel der Erfindung war die Herstellung neuer Agmatin Derivate mit grösserer blutgerinnungshemmender Wirkung.
    Es wurde gefunden, dass die neuen Dipeptidyl-Derivate des Agmatins, die der allgemeinen Formel I entsprechen, worin die Bedeutung von X, Pro, Agm, B und n die gleiche wie oben ist, eine bedeutende Hemmung auf die Blutgerinnung ausüben. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Seitenkette des N-terminalen D-a-Aminosäureteils des Dipeptidyl agmatins eine Phenylniederalkylgruppe ist; das D-Phenylalanyl-L-prolylagmatin erwies sich zum Beispiel als ausserordentlich aktiv.
    In der Tabelle I ist die auf die Fibrinogen-Thrombin-Reaktion ausgeübte Wirkung einiger Verbindungen der allgemeinen Formel I und des bekannten Tosylagmatins angegeben. Die Wirksamkeit der Verbindungen wird durch diejenige Substanzmenge gekennzeichnet, die erforderlich ist, die Ge rinnungszeit des Fibrinogens auf das Zweifache zu verlängern. Auch die relative Wirksamkeit der neuen Agmatinderivate ist in der Tabelle zusammengestellt. Das als Bezugsbasis dienende Tosylagmatin wird als 1 betrachtet.
    Die Wirksamkeitsuntersuchungen wurden in einem System folgender Zu sammensetzung vorgenommen: 0,2 ml 0,5%ges Rinderfibrinogen in 0,9%iger Kochsalz lösung, 0,1 ml tris(Hydroxymethyl)methylamin-hydrochlorid Salzsäure-Puffer (pH =7,4), der das Agmatinderi- vat enthält und 0,1 ml US Standard Human Thrombin 5 NIH-Einhei ten/mi.
    Ohne das Agmatinderivat gerinnt das System in 15 Sekunden.
    Tabelle I Verbindung llg/Ansatz relative Aktivität H-D-Phg-Pro-Agm 1,4 200 H-D-Ser(Bzl) Pro-Agm 0,7 400 H-D-Phe-Pro-Agma 0,12 2333 Tosylagmatin 280 1 Entsprechend den in der Fachliteratur üblichen Abkürzungen (s. z.B. Biochem. J. 126, 773/1972) bedeuten: Phg = Phenylglycin, Agm = Aginafin; Bzl, Z bzw. Boc = Benzyl-, Benzyloxycarbonyl- beziehungsweise tert.-Butyloxycarbonylgruppe. -D-Ser(Bzl) steht für O-Benzyl-D-seringruppe.
    Es wurde ferner gefunden, dass die blutgerinnungshemmende Wirkung der neuen Dipeptidyl-agmatin-Derivate der allgemeinen Formel I durch das handelsübliche und in der Heilkunde angewendete Heparin noch verstärkt wird. Dieser Effekt kann in vitro und in vivo gleichermassen nachgewiesen werden. **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.
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