CH650022A5 - Verfahren zur verringerung der thermischen stabilitaet von mikrobiologischem rennin. - Google Patents

Verfahren zur verringerung der thermischen stabilitaet von mikrobiologischem rennin. Download PDF

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CH650022A5
CH650022A5 CH2724/80A CH272480A CH650022A5 CH 650022 A5 CH650022 A5 CH 650022A5 CH 2724/80 A CH2724/80 A CH 2724/80A CH 272480 A CH272480 A CH 272480A CH 650022 A5 CH650022 A5 CH 650022A5
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rennin
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microbiological
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CH2724/80A
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Sven-Jorgensen Branner
Palle Schneider
Peter Eigtved
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verringerung der thermischen Stabilität von mikrobiologischem Rennin. Rennin ist die Bezeichnung für ein milchkoagulierendes Enzymprodukt.
Bei der Herstellung von Käse wird die Milch koaguliert, um den Quark von der Molke zu trennen. Produkte, die Rennin bzw. Labferment enthalten, das ein aus Kälbermägen isoliertes milchkoagulierendes Enzym ist, wurden lange Zeit für diesen Zweck angewandt. In der Vergangenheit konnte der Bedarf an Rennin durch Labferment (aus Kälbermägen) gedeckt werden, aber in den letzten Jahren wurden verschiedene Austauschstoffe für Labferment entwickelt, wie insbesondere mikrobiologisches Rennin von Mucor miehei und Mucor pusillus. Rennin von Mucor miehei wird zur Käseherstellung bevorzugt aufgrund seiner geringen Kosten, seiner geringen unspezifischen proteolytischen Aktivität und seiner grossen Ähnlichkeit mit Labferment bezüglich der Empfindlichkeit gegen Calciumionen.
Eine andere vorteilhafte Eigenschaft von Rennin von Mucor miehei, die zumindest teilweise seiner hohen thermischen Stabilität zugeschrieben wurde, ist seine ausgezeichnete Lagerbeständigkeit.
Ein Teil der pasteurisierten Molke wird als Zusatz zu Vollmilch angewandt, z. B. in Form von Molkenpulver, um eine angereicherte Milch herzustellen, z. B. als Babynahrung. Die pasteurisierte Molke, die bei der Herstellung von Käse mit
Rennin von Mucor miehei anfällt, kann noch kleinere Mengen Renninaktivität enthalten aufgrund der hohen Stabilität von Rennin von Mucor miehei. Eine etwaige Restrenninaktivität im Molkenpulver ist unerwünscht, da eine Proteinkoagulation nicht mehr auftreten soll. Eine solche könnte jedoch auftreten, wenn das Molkenpulver angwandt wird zur Herstellung von angereicherter Milch als Babynahrung. Die angereicherte Milch kann koagulieren, bevor sie in den Magen des Säuglings kommt, z. B. in der Flasche, wodurch der Milchfluss verstopft wird.
In Biochim. Biophys. Acta 271 (1972) 93-101 (W. S. Rickert, Structural and functional déterminants of Mucor miehei Protease, I. Modification of the NH2 terminus and lysine residues by carbamylation) ist angegeben, dass Protease von Mucor miehei (die wirksame Komponente von Rennin von Mucor miehei) mit Kaliumcyanat carbamyliert werden kann und dass das carbamy-lierte Produkt eine geringere thermische Stabilität zeigt. Praktische Versuche haben gezeigt, dass die Verringerung der thermischen Stabilität des carbamylierten Enzyms zu gering ist, um das oben erwähnte Problem der Renninaktivität in pasteurisierter Molke zu lösen. In der BE-Anmeldung 6/47048 (DE-OS 29 51793) wird vorgeschlagen, das Enzym zur Destabilisierungzu acylieren.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein wirtschaftlich durchführbares Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe mikrobiologisches Rennin in einem solchen Ausmass destabilisiert werden kann, dass die von der restlichen mikrobiologischen Renninaktivität stammenden Nachteile in pasteurisierter Molke wirtschaftlich überwunden werden können.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Verringerung der thermischen Stabilität von mikrobiologischem Rennin durch Behandlung in einem wässrigem Medium mit einem Oxidationsmittel aus der Gruppe der halogenhaltigen Verbindungen, wobei das Halogen eine Oxidationszahl von 0 bis 3 besitzt.
Es hat sich gezeigt, dass mikrobiologisches Rennin, das erfin-dungsgemäss modifiziert worden ist, deutlich destabilisiert ist, und dass die Destabilisierung ausreicht, um den Erfordernissen zu entsprechen, wie sie bei der Verwendung von Molke auftreten, ohne dass nachteilige Wirkungen auf die Lagerstabilität der Renninzubereitung auftreten. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass es erfindungsgemäss möglich ist, einen Destabilisierungsgrad (wie später näher erläutert) von mindestens 5° C, vorzugsweise 7 bis 11° C, zu erreichen, der in dem bevorzugten Bereich dazu führt, dass die thermische Stabilität des modifizierten Enzyms derjenigen von Kälberrennin (Labferment) entspricht, wobei die günstigen Eigenschaften des Kälberrennins kombiniert sind mit den günstigen Eigenschaften des mikrobiologischen Rennins.
Die Renninaktivität wird nach dem British Standard 3624, 1963 gemessen (Verfahren zur Bestimmung der Koagulationskraft von Rennin für Milch).
Da die Erfindung sich auf ein Verfahren zur Verringerung der thermischen Stabilität von mikrobiologischem Rennin bezieht, sind im folgenden die Verfahren zur Messung der thermischen Stabilität und zur Quantifizierung der Verringerung der thermischen Stabilität im folgenden auch Destabilisierung genannt, näher ausgeführt, wobei die Destabilisierung in ° C angegeben ist.
Unter idealen Bedingungen kann ein Enzym bei einer entsprechenden (hohen) Temperatur so inaktiviert werden, dass die Restaktivität des Enzyms abnimmt als Funktion der Zeit entsprechend einer exponentiell abfallenden Kurve, d.h. mit einer gut definierten Halbwertszeit, die eine Funktion der Temperatur (°C) ist.
Die Halbwertszeit Tlß kann nach der folgenden Formel berechnet werden:
(tr-t1)ln2
Ti/2 = J
lnA: - lnA2
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35
40
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65
in der Ai die Enzymaktivität nach dem Erhitzen auf eine bestimmte Temperatur für die Zeit ti bedeutet, während A2 die Enzymaktivität nach dem Erhitzen auf die gleiche Temperatur für die Zeit t2 angibt. Die Halbwertszeit ist kürzer je höher die Temperatur ist bei sonst gleicher Arbeitsweise. Bei vielen Enzymen wird die Halbwertszeit wesentlich verändert durch eine Veränderung des pH-Werts der Enzymlösung und der Ionenstärke sowie das Vorhandensein bestimmter Salze. Ausserdem kann die Halbwertszeit wesentlich verändert werden durch chemische Modifizierung des Enzyms. Wenn eine chemische Modifizierung eines bestimmten Enzyms zu einer Verringerung der thermischen Stabilität des Enzyms führt, ist der Grad der Destabilisierung n° C wenn das ursprüngliche (nicht modifizierte) und das modifizierte Enzym die gleiche Halbwertszeit bei N° C und (N-n)°C besitzen.
Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die Destabilisierungs-werte bis zu einem gewissen Grad nur Näherungswerte darstellen, da die Halbwertszeit immer nur ein Näherungswert ist. Alle Destabilisierungswerte dieser Beschreibung sind bei einem pH-Wert von 6,0 gemessen, da die Ergebnisse der Destabilisierungs-messungen pH-abhängig sind.
Normalerweise wird die erfindungsgemässe Behandlung von einem Aktivitätsverlust begleitet und es hat sich gezeigt, dass aus wirtschaftlichen Gründen die Destabilisierung nicht weiter als bis zu einem Aktivitätsverlust von ungefähr 50 %, vorzugsweise ungefähr 30 %, und insbesondere weniger als 10 %, durchgeführt werden sollte.
In einem typischen Fall scheint die Destabilisierung von 10° C mit einem Aktivitätsverlust, der auf weniger als 10 % begrenzt ist, ein annehmbarer Kompromiss zwischen den oben angegebenen sich widersprechenden Faktoren zu sein.
Beispiele für geeignete Oxidationsmittel, die erfindungsge-mäss angewandt werden können, sind ein Hypochlorit, z.B. Natriumhypochlorit, ein Hypobromit, z.B. Natriumhypobromit, freies Chlor, N-Chlorsuccinimid, Chloramin-T und Trichloriso-cyanursäure.
Das Oxidationsmittel sollte in einer solchen Konzentration angewandt werden, dass die gewünschte Destabilisierung in einer annehmbaren Zeit erreicht wird, die irgendwo zwischen einigen Minuten bis zu 48 Stunden oder sogar darüber liegen kann, wenn die Reaktion nicht abgebrochen wird. Wenn die Konzentration an Oxidationsmittel zu gering ist, ist die Destabilisierung zu gering, und wenn die Konzentration an Oxidationsmittel zu hoch ist, wird der Aktivitätsverlust zu hoch. Die optimalen Konzentrationen entsprechen üblicherweise einem Gewichtsverhältnis zwischen Oxidationsmittel und Gesamtmenge an Protein in der Enzymzubereitung von ungefähr 3 bis 30 Teilen Oxidationsmittel auf 100 Teile Gesamtprotein. Wenn das mikrobiologische Rennin auf eine hohe Einheitsaktivität gereinigt worden ist, kann die Menge an Oxidationsmittel auf so geringe Mengen wie 1 g pro 100 g Gesamtprotein verringert werden.
Der pH-Wert, bei dem die Reaktion stattfindet, kann innerhalb weiter Grenzen variieren, d.h. zwischen einem pH-Wert von ungefähr 3 bis 10, wobei der bevorzugte Bereich hauptsächlich von dem angewandten Oxidationsmittel abhängt. So liegt der bevorzugte Bereich bei Verwendung von Hypochlorit als Oxidationsmittel bei 5 bis 9 und insbesondere bei 6 bis 8.
Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch, so lange sie auf Werten z.B. unterhalb ungefähr 30° C gehalten wird, bei denen die Stabilität des Enzyms ausreichend ist. Die Stabilität des Enzyms kann jedoch verbessert werden durch Zugabe bekannter proteinstabilisierender Mittel z.B. von NaCl in einer Menge von 5 bis 20 %, bezogen auf die Enzymzubereitung, oder Sorbit in den üblichen enzymstabilisierenden Mengen.
Der Reaktionsmechanismus (durch den die Destabilisierung eintritt) ist noch nicht vollständig aufgeklärt und es ist auch noch nicht geklärt, ob das erhaltene destabilisierte Enzymmolekül
650 022
Halogensubstituenten enthält oder nicht. Offensichtlich kann das Enzym wie alle Proteinmoleküle zahlreiche und unterschiedliche Reaktionen eingehen, z. B. Oxidations- und Chlorierungsreaktionen. Da im vorligenden Falle die Destabilisierung von Interesse ist, sind Reaktionen, die zu einer Desaktivierung des Enzyms führen, unerwünscht, während solche Reaktionen, die zu einer thermischen Destabilisierung des Enzyms ohne Verringerung der Enzymaktivität führen, erwünscht sind.
Der Destabilisierungsgrad von mindestens 5° C, vorzugsweise 7 bis 10° C und der damit verbundene Aktivitätsverlust von nicht mehr als 30 %, vorzugsweise weniger als 10 %, werden für die praktische Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens als Grenzen angesehen. Die aktives Halogen enthaltenden Oxidationsmittel erfüllen diese Voraussetzung.
Freies Chlor disproportioniert, wenn es in ein wässriges Medium eingeleitet wird, in Chlorid- und Hypochloritionen. Die oben angegebenen N-Chlorverbindungen wandeln sich entsprechend in Hypochloritionen um. Das bevorzugte Reagens ist Natriumhypochlorit, das bei einem pH-Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, angewandt wird.
Die in der BE-Anm. 6/47048 angegebene Acylierung führt zu einer Destabilisierung von ungefähr 3° C. Die Oxidation mit Wasserstoffperoxid führt ebenfalls zu einer Destabilisierung.
Die direkte Behandlung des Enzyms mit einem aktives Halogen enthaltenden Reagens, z. B. Natriumhypochlorit, besitzt verschiedene Verfahrensvorteile gegenüber der Umsetzung mit Peroxid. Der Hauptvorteil liegt vermutlich darin, dass das Reagens mit aktivem Halogen vollständig in dem Reaktionsgemisch aufgebraucht werden kann, während die Reaktion mit Peroxid abgebrochen werden muss z.B. durch Zugabe von Katalase.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Rennin mit einem Oxidationsmittel behandelt, das Chlor enthält. Ausserdem ist es bevorzugt, die erfindungsgemässe Behandlung bis zu einem Destabilisierungsgrad von mindestens 5° C, vorzugsweise 7 bis 11°C, und einem Renninaktivitätsverlust von nicht mehr als 50 %, vorzugsweise nicht mehr als 30 %, durchzuführen. Günstig ist die Verwendung eines Oxidationsmittels, das ein Halogen mit einer Oxidationszahl von 0 bis 1 enthält, insbesondere von Hypochlorit. Ferner ist es besonders günstig, das erfindungsgemässe Verfahren auf Rennin anzuwenden, das von Mucor miehei gebildet worden ist. Das Gewichtsverhältnis von Oxidationsmittel zu Gesamtprotein in der Enzymzubereitung liegt günstigerweise zwischen 0,01 und 1, vorzugsweise zwischen 0,03 und 0,3. Der pH-Wert des wässrigen Mediums beträgt günstigerweise 5 bis 9, und die Temperatur liegt vorteilhafterweise bei 0 bis 30° C.
Die Erfindung bezieht sich auch auf das erfindungsgemäss hergestellte bzw. modifizierte mikrobiologische Rennin sowie auf die Anwendung dieses Rennins zur Koagulation von Milch bei der Käseherstellung. Die bei diesem Käseherstellungsverfahren anfallende Molke kann nach Pasteurisierung als proteinhalti-ger Zusatz zu Nahrungsmitteln, insbesondere Babynahrung, angewandt werden.
In der Praxis hat es sich gezeigt, dass die Anwendung von destabilisiertem Rennin zur Herstellung von haltbaren Käsesorten besonders günstig ist.
In zwei parallelen Behältern zur Käseherstellung mit einem Fassungsvermögen von 150 ml wurde jeweils ein Käse mit Hilfe von Rennin von Mucor miehei entsprechend Beispiel 16 und mit Hilfe von nicht modifiziertem Rennin von Mucor miehei hergestellt. Es wurden 2 mal 6 Versuche durchgeführt. Aus diesen Versuchen wurde geschlossen, dass das erfindungsgemässe Rennin im Stande war, übliche dänische Käsearten, wie Sams0 und Danbo mit mindestens ebenso guten Eigenschaften zu erzeugen wie das nicht modifizierte Rennin.
Das erfindungsgemässe Destabilisierungsverfahren kann und wird vorzugsweise durchgeführt als letzte Stufe bei der Herstellung von mikrobiologischem Rennin. Tatsächlich kann (handels3
5
10
15
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55
60
65
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4
üblich) reines mikrobiologisches Rennin oder Renninkonzentrat für das erfindungsgemässe Verfahren angewandt werden. So wird z.B. der pH-Wert einer mikrobiologischen Renninlösung, die sonst für die üblichen Aufbereitungsstufen vor der Abgabe fertig ist, auf einen vorbestimmten Bereich für die Behandlung (z.B. pH 7) eingestellt und die Lösung dann unter Rühren bei Raumtemperatur mit einer Lösung des Oxidationsmittels vermischt, wobei die Menge an Oxidationsmittel in dem oben erwähnten Bereich von 3 bis 30 Teilen (beispielsweise 20 Teile Natriumhypochlorit) auf 100 Teile Gesamtprotein in der mikrobiologischen Renninlösung liegt. Das Gemisch wird dann einige Stunden stehen gelassen, bis der erwünschte Destabilisierungs-grad erreicht ist, z. B. 2 bis 3 Stunden. Die Reaktion kann abgebrochen werden durch Zugabe von Aktivkohle oder einem Reduktionsmittel wie Natriumsulfit, nach einer entsprechenden Zeit. Das destabilisierte Enzymprodukt kann dann den üblichen Aufarbeitungsschritten, z.B. Filtration, Einstellung von pH-Wert und Enzymaktivität auf Standardstärken usw. unterworfen werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Als Ausgangsmaterial wurde ein Rennin-Konzentrat angewandt, das hergestellt worden war entsprechend «2. Pilot plant experiment»in der GB-PS 1108287, wobei nur die Kulturflüssigkeit auf eine Aktivität entsprechend einer 1 %igen Lösung des reinen Enzyms konzentriert worden war (Comptes Rendus des Traveaux du Laboratoire Carlsberg, Bd. 37, Nr. 14,301-325) und 18 % NaCl zu dem rohen Konzentrat zugegeben worden waren (der Einfachheit halber im folgenden als «Rennilase 46» bezeichnet).
Beispiel 1
Zwei Versuchsreihen von je 3mal 25 ml eines Gemisches aus 12,5 ml Rennilase 46 und 12,5 ml Wasser wurden durch Zugabe von 1 n NaOH auf einen pH-Wert von 7,0,8,0 bzw. 9,0 eingestellt und zu jedem Gemische 0,4 ml einer 2,25-m-Lösung von NaCIO zugegeben, wobei der pH-Wert auf den oben angegebenen Werten konstant gehalten wurde.
Die erste Reihe aus drei Proben wurde über Nacht (ungefähr 18 Stunden) in den Kühlschrank gestellt. Die zweite Reihe aus drei Proben wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Abfallen des pH-Wertes wurde nach dieser Zeit gemessen und notiert. Dann wurden die Proben durch Vermischen von 0,2-ml-Probe mit 50 ml Wasser verdünnt und gleichzeitig der pH-Wert mit Natriumacetat/Essigsäure auf 6,0 eingestellt.
Das Absinken des pH-Wertes und die Restaktivitäten nach Beendigung der Reaktion zwischen dem Rennin und dem Natriumhypochlorit sind in der folgenden Tabelle angegeben.
pH nach
Restaktivität % nach
Anfangs-pH
2-h-Probe
18-h-Probe
2-h-Probe 18-h-Probe
7,0
6,9
6,9
86,3 83,1
8,0
7,6
7,6
86,1 81,7
9,0
8,2
8,2
78,4 75,4
Jetzt wurden die verdünnten Proben 30 Minuten bei einem pH
von 6,0 auf 55° C erwärmt und anschliessend die Restaktivität gemessen. Man erhielt die folgenden Werte:
Restaktivität (%) nach 30 min bei 55°C
Anfangs-pH
2-h-Probe
18-h-Probe
7,0
16,3
4,9
8,0
16,3
4,3
9,0
32,3
14,6
Vergleich
98,7
Die oben angegebenen Restaktivitäten entsprechen den folgenden Werten für die Halbwertszeit und die Destabilisierung.
T1<2 (min);
Destabilisierung, °C
30 min bei 55° C, pH 6,0
Anfangs-pH
2-h-Probe
18-h-Probe
2-h-Probe
18-h-Probe
7,0
11,5
6,5
11
12
8,0
11,5
6,6
11
12
9,0
18,4
10,8
10
11
Vergleich - -
Beispiel 2
Der pH-Wert von drei 150-mI-Proben Rennilase 46 wurde auf 5,0,6,0 bzw. 7,0 eingestellt. Jede dieser drei Proben wurde in drei Teile aufgeteilt, zu denen jeweils 0,8,1,2 bzw. 1,6 ml einer handelsüblichen 2,25-m-Lösung von NaOCl gegeben wurden, und der pH-Wert wurde konstant auf den angegebenen Werten gehalten.
Diese neun Proben wurden dann 18 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur (22° C) stehen gelassen und anschliessend von jeder der neun Proben 10 ml entnommen. Zu diesen 10-ml-Proben wurden jeweils 0,4,0,6 bzw. 0,8 ml l-m-Na2S03-Lösung gegeben, je nachdem, wieviel NaOCl zu der jeweiligen Probe zugesetzt worden war, um überschüssiges Hypochlorit, soweit vorhanden, zu zerstören.
0,2 ml der so behandelten Proben wurden mit 50 ml Wasser verdünnt und der pH-Wert mit Essigsäure/Natriumacetat auf 6,0 eingestellt. Diese verdünnten Proben wurden 30 Minuten auf 55° C erwärmt. Die Aktivitätsausbeute, die Restaktivität nach der Wärmebehandlung und die berechnete Halbwertszeit sowie die Destabilisierung gehen aus der folgenden Tabelle hervor.
pH
zugesetztes NaOCl (ml)
Aktivitätsausbeute (96)
Restaktivität (%); 30 min bei 55° C, pH 6,0
TV2 (min); 30 min bei 55°C, pH 6,0
Destabilisierung fC)
'
0,8
99,4
59,4
39,9
8
5,0
1,2
95,3
57,6
47,7
9
1,6
84,8
56,1
36,0
9
0,8
100
53,9
33,6
9
6,0
1,2
91,6
50,5
30,4
9
1,6
81,4
47,9
28,3
9
0,8
98,1
49,1
29,2
9
7,0
1,2
87,7
42,7
24,4
10
1,6
78,3
35,7
20,2
10
Beispiel 3
600 ml Rennilase 46 wurden bei einer Temperatur von ungefähr 10° C mit Hilfe von 4 n NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Diese Probe wurde in sechs Teile von jeweils 100 ml aufgeteilt. Zu diesen sechs Proben wurden jeweils 0,0,8,1,2,1,6, 2,0 bzw. 2,4ml einer handelsüblichen 2,25-m-NaOCl-Lösung gegeben und der pH-Wert jeweils auf 7 eingesteht.
Nach ungefähr 15 Stunden bei ungefähr 5° C wurden 2 ml 1 m Na2S03 zugegeben, um überschüssiges Hypochlorit, soweit vorhanden, zu zerstören. Durch die Sulfitzugabe wurde die Stabilität des Rennins nicht verändert. Die Aktivitätsänderung wurde gemessen. Es wurden auch 5 ml der Proben lOfach in 0,1-m-Acetatpuffer, pH 6,0, verdünnt und anschliessend 5 ml der verdünnten Proben 15 Minuten auf 60° C erwärmt. Die Restaktivität nach der Wärmebehandlung wurde bestimmt und die Halbwertzeit und die Destabilisierung berechnet. Man erhielt die folgenden Ergebnisse.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
5
650 022
zugesetztes Änderung der Restaktivität TI/2 (min); Destabili-2,25-m- Gesamtaktivi- nach Wärme- 15 min bei sierung NaOCl (ml) tät (%) behandlung (%) 60°C, pH 6,0 (°C)
0
_
99
0,8
+ 0,6
35
9,9
9
1,2
0
19
6,3
10
1,6
- 4,4
14
5,3
10
2,0
- 8,5
10
4,5
10
2,4
-14,9
7
3,9
11
Beispiel 4
In diesem Beispiel wurde nicht Rennilase 46 verwendet, sondern ein entsprechendes Produkt, zu dem kein NaCl zugege-, ben worden war.
Aus dem oben angegeben Ausgangsmaterial wurden 5 Proben von 200 g mit 0,5,10,15 bzw. 20 % NaCl hergestellt. Der pH-Wert wurde mit Hilfe von 4 n NaOH auf 6,0 eingestellt.
Von jeder der oben angegebenen fünf200-g-Proben wurden 100 ml entnommen. Zu jeder dieser fünf Proben wurde 1 ml einer handelsüblichen 2,25-n-NaOCl-Lösung gegeben, wobei die Temperatur zwischen 5 und 10° C gehalten wurde. Der pH-Wert aller fünf Proben wurde dann mit 4 n NaOH auf 7,0 eingestellt und die Proben bei ungefähr 5°C stehengelassen.
Nach ungefähr 20 Stunden langem Stehen wurde die Aktivitätsänderung bestimmt. Ferner wurden 5 ml dieser Proben auf das lOfache mit 0,1-m-Acetatpuffer, pH 6,0, verdünnt und anschliessend 5 ml der verdünnten Proben 15 Minuten auf 60° C erwärmt. Die Restaktivität wurde bestimmt. Eine nicht behandelte Probe wurde als Blindprobe durchgeführt.
Die Versuchsparameter und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.
zuge
Änderung
Restaktivität
zuge gebenes der nach der
Ti,2 (min);
De gebenes
2,25-m-
Gesamt
Wärmebe
15 min bei stabili
NaCl
NaOCl aktivität handlung
60° C,
sierung
(%)
(ml)
(%)
(%)
pH 6,0
(°C)
0
0
_
98
_
_
0
1
-4,2
31
8,9
9
5
1
+7,8
32
9,1
8
10
1
+4,0
40
11,3
8
15
1
+6,8
46
13,4
8
20
1
+2,4
51
15,4
8
Beispiel 5
Es wurden 10 Versuchsreihen durchgeführt bei unterschiedlichen pH-Werten, nämlich 2,5,3,0,4,0,5,0,6,0,7,0,8,0,9,0, 10,0 und 11,0. Jede Reihe bestand aus drei Proben, die hergestellt worden waren durch Verdünnen von jeweils 12,5 ml Rennilase 46 mit einem gleichen Volumen Wasser. Zu der ersten Probe jeder Reihe wurden 75 jxl, zu der zweiten 150 |il und zu der dritten 300 [il handelsübliche 2,25-m-Natriumhypochloritlösung gegeben, entsprechend (ungefähr) 4,8, bzw. 16 g Natriumhypochlorit auf 100 g Gesamtprotein in der Probe. Der pH-Wert der 10 Reihen wurde konstant auf den angegebenen Werten gehalten. Die Reaktionstemperatur war für alle Proben gleich (ungefähr 5°C).
Nach einer Reaktionszeit von ungefähr 114,66 bzw. 90 Stunden für die erste, zweite bzw. dritte Probe jeder Reihe wurden alle Proben auf 50 ml ergänzt. Proben zur Analyse wurden hergestellt durch entsprechende Verdünnung (ungefähr 1:125), wobei der pH-Wert gleichzeitig mit Hilfe von Essigsäure/-Natriumacetatlösung auf 6,0 eingestellt wurde.
Diese Proben wurden dann 30 Minuten auf 55° C erwärmt. Die Aktivitätsausbeute, Restaktivität nach der Wärmebehandlung, berechnete Halbwertszeit und Destabilisierung sind in der folgenden Tabelle angegeben.
An-fangs-pH-Wert zugesetztes NaCIO (|il-/25-ml-Probe)
End-
pH-
Wert
Aktivitätsausbeute (%)
Restaktivität (%)
T„2
(min)
Destabilisierung (°C)
75
2,52
93,0
77,3
80,8
6
2,5
150
2,75
80,5
71,6
62,2
7
300
2,50
16,2
40,7
23,1
9
75
3,00
101,3
76,9
79,2
6
3,0
150
3,15
97,6
60,5
41,4
8
300
3,00
32,4
70,0
22,7
9
75
3,96
106,1
71,8
62,8
7
4,0
150
4,05
102,4
64,2
46,9
8
300
3,94
69,8
41,3
23,5
9
75
4,95
104,4
74,5
70,6
7
5,0
150
4,99
99,4
62,2
43,8
8
300
4,80
71,1
45,1
26,1
10
75
5,86
101,7
59,4
39,9
8
6,0
150
5,98
94,8
40,8
23,2
9
300
5,66
61,5
8,6
8,48
11
75
6,61
96,3
39,5
22,4
9
7,0
150
6,64
90,2
7,1
7,86
11
300
6,51
49,2
4,0
6,46
11
75
7,40
94,3
48,3
28,6
8
8,0
150
7,26
87,1
6,4
7,57
11
300
-
-
-
-
75
8,02
90,4
68,2
54,3
7
9,0
150
7,79
77,7
17,5
11,9
10
300
7,34
47,3
9,3*
2,92*
13
75
8,34
81,2
78,6
86,4
6
10,0
150
8,23
68,5
34,0
19,3
9
300
7,83
44,4
9,3*
2,92*
13
75
10,34
57,2
93,5
30,9
4
11,0
150
10,02
42,2
74,4
70,3
7
300
9,80
9,9
-
-
* 10 min. Wärmebehandlung
Diese Werte zeigen, dass die folgenden Bedingungen für die Destabilisierung mit Natriumhypochlorit optimal sind:
pH-Bereich 6 bis 8
Menge an Natriumhypochlorit: 150 [ü einer 2,5-m-Lösung pro Probe, entsprechend (ungefähr) 8 g Natriumhypochlorit pro 100 g Gesamtprotein.
Beispiel 6
Es wurden zwei Proben hergestellt durch Vermischen von 25 ml Rennilase 46 mit 20 g Eiswasser und der pH-Wert mit Hilfe von 4 n NaOH auf 7,0 eingestellt. Zu diesen beiden Proben wurden 33 bzw. 66 mg N-Chlorsuccinimid, jeweils in 5 ml Eiswasser, zugegeben, wobei der pH-Wert gleichzeitig auf 7,0 eingestellt wurde.
Zwei Stunden später wurden 0,2 ml der Proben mit 50 ml Wasser verdünnt, wobei gleichzeitig der pH-Wert mit Hilfe von Natriumacetat/Essigsäure auf 6,0 eingestellt wurde.
Die Restaktivität nach der Umsetzung von Rennin mit N-Chlorsuccinimid betrug:
zugesetztes N-Chlorsuccinimid (%)
Restaktivität (%)
33
99,0
66
96,5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
650 022
zugesetztes
Restaktivität (%),
Ti/2 (min);
Destabili
N-Chlor-
30 min bei 55°C,
30 min bei 55° C,
sierung succinimid (mg)
pH 6,0
pH 6,0
(°C)
33
41,5
23,6
10
66
26,4
15,6
10
Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 wurde eine Wärmebe-handlung30 Minuten bei 55°C,pH6,0, durchgeführt. Anschliessend wurde die Restaktivität bestimmt und die Halbwertszeit und Destabilisierung berechnet.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. 5
10
15
20
25
Beispiel 7
Eine ungefähr 2-m-Lösung von NaOBr wurde hergestellt durch Zutropfen von 3 g Br2 zu 10 ml 4 n NaOH unter Rühren und Kühlen im Eis-Wasser-Bad.
25 ml Rennilase 46 wurden mit 25 ml Wasser vermischt und der pH-Wert mit 1 nNaOH auf 7,5 eingestellt. Zu 25 ml dieser Lösung wurden 0,5 ml der wie oben hergestellten Natriumhypo-bromit-Lösung in ungefähr 1 Stunde zugegeben, wobei der pH-Wert zwischen 7,3 und 7,8 gehalten wurde durch Zugabe von In HCl.
Ungefähr 30 Minuten später wurde der Aktivitätsverlust und die Thermostabilität bestimmt. Es zeigte sich, dass der Aktivitätsverlust ungefähr 20 % betrug und die Restaktivität nach 20 Minuten langer Behandlung bei pH 6,0 und 60° C14 % betrug, entsprechend einer Halbwertszeit von ungefähr 7 Minuten oder einer Destabilisierung von ungefähr 8°C.
30
Beispiel 8
50 ml Rennilase 46 wurden mit 50 ml Wasser verdünnt. Das Gemisch wurde im Eisbad gekühlt und der pH-Wert mit 1 n NaOH auf 7,0 eingestellt. Dann wurden ungefähr 0,1g freies Chlor eingeleitet, wodurch der pH-Wert auf ungefähr 3,8 sank 35 und die Flüssigkeit trüb und heller wurde. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 10 Minuten stehen gelassen und dann 4 ml 1-m-Na2S03-Lösung zugegeben, um überschüssiges Chlor zu entfernen.
Vor und nach der Chlorzugabe wurden 0,2 ml Proben mit 50 ml 40 Wasser verdünnt und der pH-Wert mit Natriumacetat/Essigsäure auf 6,0 eingestellt. Der bei der Reaktion zwischen Rennin und Chlor eintretende Aktivitätsverlust betrug 21%.
Nach 30 Minuten langer Behandlung des mit Chlor behandelten Rennins bei 55° C wurde eine Restaktivität von 63 % gefun- 45 den. Das entspricht einer Halbwertszeit von ungefähr 45 Minuten oder einer Destabilisierung von ungefähr 8°C.
Beispiel 9
Es wurden 2 Proben durch Vermischen von 25 ml Rennilase 46 50 und 25 g Eiswasser hergestellt und der pH mit 4 n NaOH auf 7,0 eingestellt. Zu diesen beiden Gemischen wurden 60 bzw. 120 mg Trichlorisocyanursäure gegeben und gleichzeitig der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.
Ungefähr 4 Stunden später wurden 0,2 ml der oben angegebe- 55 nen Gemische mit 50 ml Wasser verdünnt und gleichzeitig der pH-Wert mit Natriumacetat/Essigsäure auf 6,0 eingestellt. Die so verdünnten Proben wurden 30 Minuten bei 55° C behandelt.
Die Aktivitätsausbeuten, die Restaktivitäten nach der Wärmebehandlung und die berechneten Halbwertszeiten und Destabili- 60 sierungen gehen aus der folgenden Tabelle hervor.
65
Beispiel 10
Es wurden zwei Anteile von je 25 ml Rennilase 46 mit je 20 g Eiswasser verdünnt und der pH-Wert mit 4 n NaOH auf 7,0 eingestellt. Dann wurden 70 bzw. 140 mg Chloramin-Tin 5 ml Eiswasser zu den beiden Proben gegeben und gleichzeitig der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.
Ungefähr zwei Stunden später wurden 0,2 ml der oben angegebenen Proben mit 50 ml Wasser verdünnt, wobei der pH-Wert gleichzeitig mit Natriumacetat/Essigsäure auf 6,0 eingestellt wurde. Die so erhaltenen Proben wurden 30 Minuten auf 55° C erwärmt. Die Aktivitätsausbeuten und Restaktivitäten nach der Wärmebehandlung, berechneten Halbwertszeiten und Destabili-sierangen gehen aus der folgenden Tabelle hervor.
zugesetztes Tri
Tu, (min);
Destabili chlorisocyanur
Aktivitäts
30 min bei 55° C,
sierung säure (mg)
ausbeute (%)
pH 6,0
(°C)
60
93,0
35
9
120
81,5
16
10
zugesetztes
Tm (min);
Destabili
Chloramin-T
Aktivitäts
30 min bei 55° C,
sierung
(mg)
ausbeute (%)
pH 6,0
(°C)
70
96,5
19,2
10
140
77,9
8,5
12
Beispiel 11
Der pH-Wert von 25 ml Rennilase 46 wurde mit 1 n NaOH auf 10,0 eingestellt.
Das Gemisch wurde in Eiswasser gekühlt und einzelne Anteile von 2 ml einer Lösung enthaltend 0,05 m J2 in 0,25 m KJ wurden zu der oben angegebenen Rennilaselösung gegeben, wobei gleichzeitig der pH-Wert mit 1 n NaOH nach jeder Zugabe von 2 ml des Jodreagenzes auf 10 eingestellt wurde. Es wurde eine Vergleichsprobe entnommen sowie eine Probe von 0,5 ml vor jeder neuen Zugabe von 2 ml Jodreagenz.
Zu Analysezwecken wurden die 0,5-ml-Proben verdünnt und der pH-Wert mit Essigsäure/Natriumacetat auf 6,0 eingestellt. Dann wurden die Proben 30 Minuten auf 60° C erwärmt.
Die Versuchsergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.
zugesetzte
Aktivitäts
Restaktivität
Tin (min);
Destabili
Lösung von ausbeute
60° C,
30 min bei sierung
J2 in KJ (ml)
(%)
30 min (%)
60°C, pH 6,0
(°C)
0
100
88
163
0
2
100
88
163
0
4
96
90
197
0
6
91
88
163
0
8
76
85
128
1
10
63
71
61
3
Beispiel 12
Rennilase 46 mit und ohne zugesetztes NaCl wurde auf das dreifache verdünnt. 20 ml der so verdünnten Rennilase 46 wurden auf einen pH-Wert von 8,5 gebracht und auf 0° C gekühlt, woraufhin 0,7 ml einer Lösung von 0,05 m J2 in 0,25 m KJ zugegeben wurden. Ungefähr 15 Minuten später wurde der pH-Wert durch Zugabe von 0,1 m NaHS03 auf 6 eingestellt.
Für Analysezwecke wurde diese Probe verdünntund gleichzeitig der pH-Wert mit Essigsäure/Natriumacetat auf 6,0 eingestellt. Dann wurde die Probe 30 Minuten auf 60° C erwärmt.
Die Aktivitätsausbeute betrag 42,6%.
Die Restaktivität nach der Wärmebehandlung betrug 35 %.
Die berechnte Halbwertszeit bei 60° C und pH 6 betrug 20 Minuten.
Das entspricht einer Destabilisierung von ungefähr 5° C, da eine Vergleichsprobe die gleiche Halbwertszeit von ungefähr 20 Minuten bei 65° C zeigte.
7
650 022
Beispiel 13
3 g Protease von Mucor pusillus (Noury, 1:220000) wurden in 30 ml 10 %iger NaCl-Lösung gelöst und der pH-Wert bei 5 bis 10° C auf 6,5 eingestellt. 3mal 50 [il 15 %ige NaOCl-Lösung wurden in Intervallen von 30 Minuten zugegeben. Nach drei Stunden langem Rühren wurde das Gemisch 16 Stunden bei 4°C stehen gelassen und der pH-Wert anschliessend auf 5,0 eingestellt. Es wurden Proben zur Bestimmung der Aktivität und Thermostabilität entnommen.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Reaktionszeit der Probe
Aktivitätsausbeute (%)
Halbwertszeit (min) bei pH 6,0, 0 bis 30 min bei
50°C 55°C
Destabilisierung (°C)
Vergleich
100
144 bis 155
18 bis 31
-
24 h
84 bis 91
26 bis 22
5 bis 11
5
Beispiel 14
In diesem Beispiel wurde anstelle von Rennilase 46 ein ähnliches Produkt verwendet, bei dem anstelle von 18 % NaCl nur 6 % NaCl zugesetzt worden waren.
1 Liter dieses Ausgangsmaterials wurde in vier Proben von jeweils 250 ml aufgeteilt. Die Temperatur wurde auf 5 bis 10°C gehalten und der pH-Wert von drei Proben mit 4 n NaOH auf 6,5 eingestellt. Ferner wurden 1,1,2 bzw. 1,4 Vol.-% einer Lösung von 13,5 Gew.-% NaOCl zu den drei Proben gegeben und anschliessend der pH-Wert mit 4 n NaOH auf 7,5 eingestellt und die Proben bei ungefähr 5°C inkubiert.
Nach einer Reaktionszeit von 3,27 bzw. 53 Stunden wurden 50 ml der mit Hypochlorit behandelten Proben entnommen und zu jeder dieser 50 ml Proben 250 mg (0,5 % Gew./Vol.) Aktivkohle (Carboraffin BGN) gegeben. Am Tag nach der Zugabe der Aktivkohle wurden die Proben filtriert und auf die Stabilität und ■ Renninaktivität untersucht (1. Bestimmung). Die Proben wurden 9 Tage nach Zugabe des Hypochlorits auf 5° C gehalten und anschliessend erneut die Stabilität und Renninaktivität (Aktivitätsausbeute bzw. Endaktivität) bestimmt (2. Bestimmung). Nach weiteren 4 Tagen bei ungefähr 5° C und 2 Tagen bei ungefähr 25°C wurde die Renninaktivität erneut bestimmt und die Aktivitätsausbeute berechnet (3. Bestimmung).
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammenge-fasst, aus denen hervorgeht, dass keine deutliche Änderung der Destabilisierung oder Aktivitätsausbeute auftritt, wenn die Reaktionszeit von 3 auf 53 Stunden verlängert wird.
Tabelle 1
zugesetztes
Bestimmung
Destabilisierung (°C)
Hypochlorit
(Vol.-%)
Reaktionszeit
3h
27 h
53 h
1,0
1.
9,2
9,4
9,1
2.
9,3
9,4
9,3
1,2
1.
10,0
10,1
9,8
2.
10,0
10,1
10,1
1,4
1.
10,6
10,7
10,5
2.
10,6
10,6
10,7
Tabelle 2
zugesetztes Bestimmung Aktivitätsausbeute (%)
Hypochlorit
(Vol.-%) Reaktionszeit
3h
27 h
53 h
1,0
1.
96
99
97
2.
97
99
95
3.
97
97
98
1,2
1.
90
93
92
2.
94
90
92
3.
92
94
94
1,4
1.
89
91
90
2.
92
89
91
3.
91
89
88
Beispiel 15
Fünf 25-ml-Proben von Rennilase 46 wurden auf einen pH-Wert von 2, 2,5, 3, 3,5 bzw. 6,0 eingestellt.
Zu jeder dieser Proben wurden 0,04 gNatriumchlorit gegeben, wobei der pH-Wert jeweils konstant auf dem angegebenen Wert gehalten wurde.
Die Proben wurden 6 Tage bei 5° C stehen gelassen und anschliessend die Restaktivität und die Thermostabilität bei 55° C und pH 6,0 untersucht.
Anfangs pH
Restaktivität (%)
Halbwertszeit (min) (nach 30 min. langer Wärmebehandlung)
Destabilisierung
(°C)
2,0
23
122
5,5
2,5
73
63
6,7
3,0
90
53
7,0
3,5
97
48
7,3
6,0
94
49
7,2
Beispiel 16
In diesem Beispiel wurde anstelle von Rennilase 46 ein ähnliches Enzymprodukt verwendet, das in zwei Punkten modifiziert war: 1. Die Kulturbrühe war auf eine Aktivität entsprechend einer Lösung von ungefähr 1,6% reinem Enzym konzentriert (im Gegensatz zu 1 % reinem Enzym); und 2. waren zu dem Rohkonzentrat 9 % NaCl (anstelle von 18% NaCl) zugesetzt worden.
Auf diese Weise wurden in einer Technikumsanlage 5952 kg modifizierte Rennilase 46 hergestellt.
Der pH-Wert wurde mit 34 % NaOH bei 9° C auf 6,4 eingestellt und 109 kg einer Lösung von 12,5 Gew. -% NaOCl zugegeben. Während dieser Behandlung stieg der pH-Wert auf 8,0 und wurde mit 37 %iger HCl auf 7,4 eingestellt.
Nach 18 Stunden bei 9 bis 5° C war der pH-Wert auf 6,9 gefallen. Dann wurde 1 % Aktivkohle bei 4 bis 5° C zugegeben. 26 Stunden später wurde das Gemisch mit Hilfe einer Filterpresse filtriert und die Destabilisierung erneut gemessen. Schliesslich wurde die überstehende Flüssigkeit unter vermindertem Druck bei 30° C und einem pH-Wert von 6,7 eingeengt und NaCl auf eine Gesamtmenge von 18 % zugesetzt.
Es zeigte sich, dass die Halbwertszeit des Endproduktes 11 Minuten betrug und die Destabilisierung 10°C.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Claims (11)

650 022 PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Verringerung der thermischen Stabilität von mikrobiologischem Rennin, dadurch gekennzeichnet, dass man das Rennin in einem wässrigen Medium mit einem Oxidations-mittel aus der Gruppe der halogenhaltigen Verbindungen behandelt, wobei das Halogenatom eine Oxidationszahl von 0 bis 3 besitzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Halogen Chlor ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung bis zu einem Destabilisierungsgrad von mindestens 5°C, vorzugsweise 7 bis 11°C, bei einem Aktivitätsverlust von nicht mehr als 50 %, vorzugsweie nicht mehr als 30%, durchführt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Oxidationsmittel eine halogenhal-tige Verbindung verwendet, wobei das Halogenatom eine Oxidationszahl von 0 oder 1 besitzt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Oxidaditonsmittel ein Hypochlorit verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als mikrobiologisches Rennin ein solches von Mucor miehei verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gewichtsverhältnis in dem Reaktionsgemisch von Oxidationsmittel zu Gesamtmenge an Protein in der Enzymzubereitung zwischen 0,01 und 1, vorzugsweise zwischen 0,03 und 0,3, anwendet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert zwischen 5 und 9 arbeitet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem wässrigen Medium bei einer Temperatur zwischen 0 und 30° C arbeitet.
10. Destabilisiertes mikrobiologisches Rennin, das hergestellt worden ist mit Hilfe eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
11. Verwendung des Erzeugnisses nach Anspruch 10, zur Käseherstellung, wobei man das Rennin zur Koagulation der Milch verwendet.
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