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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von y-Globulin für die intravenöse Injektion, dadurch gekennzeichnet, dass man y-Globulin mit einem Enzym aus der Gruppe von Pepsin und Uropepsin bei einem pH-Wert von 6,0 bis 7,5 behandelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man y-Globulin humanen Ursprungs verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einem pH-'U'ert von 6,5 bis 7,0 arbeitet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Enzym humanen Ursprungs verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Enzym nicht humanen Ursprungs verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzym in einer löslichen Form verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzym in einer immobilisierten Form verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man y-GIobulin in einem Temperaturbereich von 25 bis 37"C während 12 bis 96 Stunden mit dem Enzym behandelt.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man y-Globulin mit dem Enzym behandelt, indem eine oy-Globulinlösung durch eine mit dem Enzym gefüllte Säule geleitet wird, wobei das immobilisierte Enzym verwendet wird.
10. Therapeutisches Mittel für die intravenöse Injektion, dadurch gekennzeichnet, dass es y-GIobulin, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, und einen Stabilisator aus der Gruppe von Human-Uropepsin und Human-Uropepsinogen enthält.
11. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es Human-y-Globulin enthält.
12. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es 0,01 bis 5 Gew.-% Human-Uropepsin oder Human-Uropepsinogen enthält.
13. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es 0,1 bis 1 Gew.-% Human-Uropepsin oder Uropepsinogen enthält.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von y-Globulin für die intravenöse Injektion und dieses y-Glo- bulin enthaltende therapeutische Mittel. -Globulin wurde allgemein für die Prophylaxe und Therapie von durch verschiedene Arten von Viren und Bakterien verursachten Krankheiten verwendet. Es wurde jedoch nur intramuskulär verabreicht, da die intravenöse Verabreichung ernsthafte nachteilige Reaktionen, wie plötzliche Abnahme des Blutdruckes, Schüttelfrost, Erbrechen, Pyrexie, Cyanosis oder Schock, verursachen kann.
Um jedoch den Antikörpertiter im Blut rasch zu erhöhen, ist es klinisch vorteilhaft, y-Globulin intravenös und nicht intramuskulär zu injizieren, da die wirksame Dosis von y-Globulin bei intravenöser Verabreichung kleiner ist als bei der intramuskulären Verabreichung und intravenös injiziertes y-Globulin wirksamer verwendet werden kann. Die intramuskuläre Injektion ist auch aus anderen Gründen unerwünscht, beispielsweise kann sie eine lokale Zersetzung vom y-Globulin an der die intramuskuläre Injektion von grossen Mengen von y-Globulin kann zu lokalen Schmerzen oder zur Verhärtung der Muskeln führen.
Der Vorgang bei den nachteiligen, durch die intravenöse Verabreichung von r-Globulin verursachten Reaktionen wird im allgemeinen wie folgt erklärt: Ein Teil der r-Globu- linmoleküle aggregiert während der Reinigung, und diese Aggregate verursachen eine nicht spezifische Komplementaktivierung, die sich von der Antigen-Antikörper-Reaktion unterscheidet. Es wurden bereits verschiedene Versuche zur Entwicklung eines Verfahrens für die Herstellung von 7-Glo- bulin unternommen, das ohne Verursachen von Komplementaktivierung verabreicht werden kann, d.h. von einem y-Globulin mit einer verminderten anti komplementären Aktivität, das keine nachteiligen Reaktionen verursacht.
Es wurden verschiedene Verfahren für die Herstellung eines solchen y-Globulins vorgeschlagen, beispielsweise (1) teilweiser Abbau von y-Globulin mit einem proteolytischen Enzym (H. Koblet et al., Vox Sang., 13, 92 [1967] und L.A.
Hanson et al., Int. Arch. Allergy, 31, 380 [1967]; (2) chemische Modifizierung von > r-Globulin (Vox Sang., 422 [1975]; (3) Entfernung der Aggregate aus dem y-Globulin (US-PS 4093606 und JP-OSen 81 519/74 und 101 516/74); (4) Zugabe einer oder mehrerer Substanzen zur Verhinderung der erneuten Aggregatbildung in y-Globulin, das von Aggregaten befreit war (JP-OSen 91 321/76 und 47 5156/78) oder (5) Zugabe einer oder mehrerer Substanzen, die die Aggregate im y-Globulin dissoziieren und gleichzeitig die Regeneration von Aggregaten darin verhindern können (JP-OS 20 124/79).
Der Abbau von y-Globulin mit einem proteolytischen Enzym, wie Pepsin oder Plasmin, zur Verminderung seiner antikomplementären Aktivität wurde von diesen Methoden als erstes empfohlen und lange Zeit als ein wirksames Verfahren für praktische Zwecke verwendet.
Dieses Verfahren vermindert jedoch die Opsoninaktivität von y-Globulinen, da die Enzyme eine teilweise Zersetzung ihrer molekularen Struktur bewirken. Ausserdem, wenn Pepsin als proteolytisches Enzym verwendet wird, besitzt das erhaltene y-Globulin eine ausserordentlich kurze Halbwertszeit.
Die Erfinder haben ausgedehnte Forschungsarbeiten für die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung von y-Globulin, das infolge seiner genügenden Opsoninaktivität und langer Halbwertszeit für die intravenöse Verabreichung geeignet ist, ausgeführt, indem sie r-Globulin mit einem proteolytischen Enzym behandelten. Sie haben nun überraschenderweise gefunden, dass, wenn y-Globulin in einem neutralen pH-Bereich von 6,0 bis 7,5 mit Pepsin behandelt wird, y-Globulin-Aggregate selektiv zersetzt oder dissoziiert werden können, währenddem monomere y-Globulin-Mole- küle selten beeinflusst werden.
Ziel der Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren für die Herstellung von für die intravenöse Injektion geeignetem y-Globulin durch eine Enzymbehandlung zu schaffen.
Aufgabe der Erfindung ist demnach, ein Verfahren zu schaffen, das die antikomplementäre Aktivität von y-Globulin durch selektiven Abbau der Aggregate vermindert, ohne dabei die monomeren -Globulin-Moleküle abzubauen, d.h. ohne Verlust der Opsoninaktivität, und dadurch die Herstellung von infolge vernachlässigbaren nachteiligen Reaktionen durch intravenöse Injektion verabreichbarem -Globulin mit hohem Antikörpertiter und langer Halbwertszeit zu ermöglichen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein therapeutisches Mittel zur intravenösen Injektion bereitzustellen, das in seiner antikomplementären Aktivität reduziert und durch einen Gehalt an Human-Uropepsin stabilisiert ist, wobei letzteres gleichzeitig als proteolytisches Enzym und Stabilisator für y-Globulin wirkt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein therapeutisches Mittel für die intravenöse Injektion bereitzustellen,
dessen antikomplementäre Aktivität reduziert und durch einen Gehalt an Human-Uropepsinogen als Stabilisator für y-Globulin, dessen anti komplementäre Aktivität reduziert ist, stabilisiert ist.
Figur 1 A und 1 B sind graphische Darstellungen, die die Gelfiltrationsprofile von unbehandeltem und mit immobilisiertem Uropepsin bei einem pH-Wert von 7,0 in Versuch 1 behandeltem y-Globulin vergleichen, und Figur 2A und 2B sind graphische Darstellungen, die die Gelfiltrationsprofile von unbehandeltem und mit immobilisiertem Uropepsin bei einem pH-Wert von 4,5 behandeltem y-Globulin vergleichen.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird im allgemeinen wie nachfolgend beschrieben ausgeführt. Eine Lösung von y-Globulin, das nach bekannten Verfahren erhalten wurde, wird auf einen neutralen pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 7,5, vorzugsweise von 6,5 bis 7,0, eingestellt und wird dann mit einer geeigneten Menge Pepsin oder Uropepsin in einem Temperaturbereich von 25 bis 37"C während 12 bis 96 Stunden behandelt.
Es ist allgemein bekannt, dass der optimale pH-Wert für Pepsin üblicherweise im Bereich von 2,0 bis 3,0 liegt und dass, wenn y-Globulin mit Pepsin in diesem Bereich umgesetzt wird, sein Fc-Teil entfernt wird und nur sein F (ab')2- Teil erhalten bleibt, wobei die Opsoninaktivität des y-Globulins verlorengeht. Erfindungsgemäss wird jedoch Pepsin mit y-Globulin im neutralen pH-Bereich von 6,0 bis 7,5 umgesetzt, so dass es selektiv nur auf die y-Globulin-Aggregate einwirken kann und deshalb monomere y-Globulin-Moleküle kaum beeinflusst. Dadurch kann y-Globulin mit niedriger antikomplementärer Aktivität ohne Erniedrigung der Opsoninaktivität des monomeren y-Globulins erhalten werden. pH-Werte von über 7,5 sollten nicht angewendet werden, da sie die Enzymaktivität von Pepsin inaktivieren.
Unter Pepsin wird in dieser Beschreibung sowohl Pepsin wie auch Uropepsin verstanden.
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Versuchsbeispiele veranschaulicht.
Versuch I y-Globulin wurde durch Cohn-Fraktionierung mit Äthanol erhalten und der Gelfiltration auf Sephadex G-200 unterworfen. Wie in Fig. 1 dargestellt, zeigte das Produkt zusätzlich zu einem y-Globulin entsprechenden Hauptmaximum zwei Maxima, die höheren Molekularwerten entsprechen. Das durch die Gelfiltration erhaltene y-Globulin wurde, wie weiter unten in Beispiel 1 beschrieben, mit Uropepsin behandelt. Nach Ausführung der gleichen Gelfiltration wurde beim resultierenden Produkt keine Änderung des Hauptmaximums festgestellt, währenddem die zwei anderen Maxima, die als Indikationen für die Gegenwart von Aggregaten gedeutet werden, wesentlich erniedrigt wurden.
Das y-Globulin zeigte eine 10 CHso/50 mg r-Globulin nicht übersteigende antikomplementäre Aktivität nach der Behandlung mit dem Enzym. Dieser Wert genügt vollkommen den an y-Globulin für die intravenöse Injektion gestellten Anforderungen.
Ein ähnlicher Versuch wurde mit einer bekannten Methode bei einem pH-Wert von 4,5 ausgeführt. Obwohl das Produkt eine genügend niedrige antikomplementäre Aktivität hatte, zeigte das Gelfiltrationsprofil eine allgemein zu niederigen Molekulargewichten verschobene molekulare Verteilung (Fig. 2) infolge des Abbaus von monomeren y-Globulin-Molekülen, wie auch von y-Globulin-Aggregaten. Versuch 2
I/ersuck 2
Opsoninaktivität
Die Opsoninaktivität von mit Pepsin gemäss den Beispielen 1 und 3 (weiter unten) behandeltem y-Globulin wurde nach der Methode von Young et al. (L.S. Young et al., The Journal of Infectious Diseases, 126,257 [1972] geprüft.
Dabei wurden 0,6 ml Serum, das durch Mischen mit E.
Coli (NIHJC-2) bei 4"C absorbiert wurde und 0,1 ml der zu prüfenden y-Globulinlösung mit 0,2 ml einer Suspension von Humanneutrophilen (107 Zellen pro Milliliter) und 0,1 ml der Suspension von E. coli (2 x 106 Zellen pro Milliliter) gemischt. Das Gemisch wurde bei 37 C während zwei Stunden bebrütet und danach auf einem üblichen Nährboden kultiviert. Die Anzahl der überlebenden Bakterien wurde festgestellt. Die Resultate sind in Tabelle 1 gezeigt.
Mit Humanuropepsin oder Schweinepepsin bei einem pH-Wert von 7,0 behandeltes y-Globulin zeigte ein mit monomerem Human-y-Globulin, das von Humanserum nach der Methode von Sober et al. (Sober et al., J. Am. Chem.
Soc., 78, 756 [1956]) gereinigt wurde, vergleichbare Opsoninaktivität. Demgegenüber zeigte mit Human-Uropepsin bei einem pH-Wert von 4,5 behandeltes z-GIobulin nur eine geringe Opsoninaktivität.
Tabelle I
Anzahl überlebender
Bakterien in 1 ml umgesetzter Lösung Kontrolle 1,8 x 105 Mit Human-Uropepsin bei pH 7,0 behandeltes y-Globulin 3mg/ml 1,1x104 1 mg/ml 4,0 x 104
0,3 mg/ml 8,0 x 104 Mit Schweine-Pepsin bei pH 7,0 behandeltes y-Globulin 3 mg/ml 1,3 x 104 Monomeres Human-y-Globulin 3 mg/ml 1,2 x 104 Mit Human-Uropepsin bei pH 4,5 behandeltes y-Globulin 3 mg/ml 1,7 x 105
Versuch 3
Vergleich der Halbwertszeiten in vivo
Ein Vergleichstest wurde unter Verwendung von mit Human-Uropepsin bei einem pH-Wert von 7,0 behandeltem y-Globulin und monomerem y-Globulin von Gruppen von jeweils sechs männlichen New-Zealand-Weiss-Zucht-(white- strain-) Kaninchen mit einem Gewicht von 2
bis 2,5 kg.
Jedem Kaninchen wurden durch intravenöse Injektion 50 mg mit radioaktivem Jod (125 J) markiertes y-Globulin verabreicht; Blut wurde nach 3, 6, 12, 24, 36,48, 60, 72 und 96 Stunden nach der Injektion entnommen. Die Radioaktivität der Proben wurde bestimmt und die Halbwertszeit berechnet. Die Resultate werden in Tabelle 2 gezeigt.
Das mit Human-Uropepsin bei einem pH-Wert von 7,0 behandelte y-Globulin zeigte eine mit jener vom monomeren Human-y-Globulin vergleichbare Halbwertszeit.
Tabelle 2 7-Globulin Halbwertszeit 'Stunden
Mit Human-Uropepsin bei pH 7,0 37,2+3,2 behandeltes y-Globulin Monomeres Human-y-Globulin 36,5 -
Versuch 4
Wirkung gegen Pseudomonas-aeruginosa-lnfektion bei Mäusen
Die prophylaktische Wirkung gegen Pseudomonas-aeruginosa-Infektion von mit Human-Urepepsin bei einem pH-Wert von 7,0 behandeltem y-Globulin und monomeres Human-y-Globulin wurde bei Gruppen von je 10 männlichen ddY-Mäusen von 18 bis 20 g Gewicht nach der Methode von Haranaka et al. verglichen (Haranaka et al., The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, 52,490 [1978]). Eine Suspension von 5 x 106 Bakterien in 4%igem Mucin wurde intraperitoneal jeder Maus inokuliert.
Die Mäuse wurden vorgängig durch subcutane Verabreichung von mit Human-Uropepsin bei einem pH-Wert von 7,0 behandeltem y-Globulin und monomerem Human-y-Globulin in Mengen von 30 mg/kg behandelt.
Nach 4 Tagen wurde die Anzahl der überlebenden Mäuse festgestellt. Die Resultate werden in Tabelle 3 gezeigt.
Die Anzahl der überlebenden Tiere, denen mit Human Uropepsin bei einem pH-Wert von 7,0 behandeltes y-Globulin verabreicht wurde, war gleich bei jenen Tieren, denen monomeres Human-y-Globulin verabreicht wurde, wobei die Anzahl signifikant höher lag als jene der Kontrollgruppe, denen kein y-Globulin verabreicht wurde.
Tabelle 3 Überlebende ( Mu) Kontrollgruppe 0 Mäuse, denen das mit Human-Uropepsin 70** bei pH 7,0 behandelte y-Globulin verabreicht wurde Mäuse, denen monomeres 708* Human-y-Globulin verabreicht wurde ** p < 0.01
Obwohl erfindungsgemäss bevorzugt Human-Pepsin verwendet wird, können aus anderen Quellen erhaltene Pepsine auch verwendet werden. Es können gastrisches und urinäres Pepsin, d.h. Uropepsin, verwendet werden.
Beispielsweise kann Uropepsin aus Human-Urin nach der Methode von Seijffers gereinigt werden (Seijffers, Amer. J.
Physiol:, 206, 1106 [1964]).
Beispielsweise kann Human-Urin durch eine mit 0,1 M Acetatpufferlösung (pH 5,3) eingestellte DEAE-Cellulosesäule geleitet werden, so dass Uropepsinogen an der Säule absorbiert wird. Dann wird das Uropepsinogen mit der gleichen Pufferlösung, die 03M Natriumchlorid enthält, eluiert. Das Eluat wird konzentriert und durch Gelchromatographie an Sephadex G-100 weiter gereinigt und einer Säurebehandlung unterworfen.
Gastrisches Pepsin kann beispielsweise nach der Methode von Tang et al. gewonnen werden (Tang et al., Method in Enzymology, 19,406 [1970]). Dabei wird Human-Magensaft durch eine mit 0,2M Natriumcitratpuffer (pH 3,0) eingestellte Amberlite-IRC-50 Säule geleitet. Nach Waschen der Säule mit 0,2M Citratpuffer (pH 3,8) wird das absorbierte Pepsin mit 0,2M Citratpuffer (pH 4,2) eluiert. Gastrisches Pepsin wird aus dem Eluat nach weiterer Chromatographie unter den gleichen Bedingungen erhalten. Man kann auch Pepsin aus anderen Quellen, z.B. vom Schwein, verwenden.
Pepsin kann auch aus gezüchteten Tumorzellen, die mit Pepsin produzierenden Zellen vereinigt wurden, oder durch genetische Technologie hergestellt werden. Beispielsweise kann es in grossem Massstab von Bakterienkulturen, wie E.
coli. das einer Rekombination einer komplementären DNA unterworfen wurde, die von einer Messenger RNA-Matrize für Pepsin mit einer Umkehrtranscriptase transcribiert wurde, produziert werden.
Pepsin kann entweder in einer löslichen oder in einer immobilisierten Form verwendet werden. Beispielsweise kann Pepsin auf einem geeigneten Träger, wie einem unlöslichen Träger, bestehend aus Sepharose , Sephadex , Cellulose oder dergleichen, immobilisiert werden. Die Verwendung von immobilisiertem Pepsin erleichtert die Entfernung von y-Globulin nach der Enzymbehandlung. Die immobilisierte Form ist besonders dann erwünscht, wenn kein Human-Pepsin verwendet wird, da dadurch die Pepsinverunreinigung der y-Globulin-Zubereitung wirksam vermieden werden kann.
y-Globulin wird mit Pepsin im allgemeinen bei einerTemperatur im Bereich von 25 bis 37"C, bei der übliche Enzymreaktionen stattfinden. behandelt.
Die Reaktionszeit kann 12 bis 96 Stunden betragen, wobei sie von der antikomplementären Aktivität des y-Globulin- Rohmaterials, der Aktivität des verwendeten Pepsins und der Menge des y-Globulins und des Pepsins abhängig ist.
Obwohl -Globulin mit immobilisiertem Pepsin chargenweise behandelt werden kann, ist ein Verfahren, bei dem eine y-Globulinlösung durch eine immobilisiertes Pepsin enthaltende Säule geleitet wird, leistungsfähiger und wird deshalb bevorzugt. Wenn Pepsin in einer löslichen Form eingesetzt wird, muss der pH-Wert der Lösung nach der Reaktion zur Inaktivierung des Pepsins z.B. auf 8,0 bis 8,5 erhöht werden.
Gewünschtenfalls, insbesondere wenn nicht Human-Pepsin verwendet wird, kann es vom y-Globulin durch eine geeig nete Methode, wie Gelfiltration, getrennt werden. Vorzugsweise wird immobilisiertes Pepsin verwendet, da es leicht vollständig abgetrennt werden kann.
y-Globulin, das, wie oben beschrieben, mit Pepsin behandelt wurde, hat eine antikomplementäre Aktivität, die einen Standardwert von 20 CHso/50 mg y-Globulin nicht übersteigt. Eine Injektion kann aus dem erfindungsgemäss erhaltenen y-Globulin nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Obwohl die Injektion in Form einer Flüssigkeit vorliegen kann, wird aus Gründen der Stabilität eine gefriergetrocknete Zubereitung, die für die Verwendung gelöst werden kann, bevorzugt. Vorzugsweise werden ein oder mehrere Stabilisatoren, wie Human-Serum-Albumin, Glycin, Sorbitol oder Gelatine, zugegeben. y-Globulin-Zubereitungen von höherer Stabilität sind solche mit einem Gehalt an Human-Uropepsin oder Human-Uropepsinogen als Stabilisatoren insbesondere in einer Menge von 0,01 bis 5 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 1 Gew.%.
Die Behandlung von y-Globulin mit Uropepsin wird im allgemeinen wie oben angegeben durchgeführt, sie kann jedoch auch nach der nachfolgenden Methode erfolgen.
1"Globulin mit hoher antikomplementärer Aktivität wird in einer bestimmten Menge in ein Gefäss, z.B. Phiolen, gegeben, Uropepsin wird zugefügt und zu einer niedrigeren antikomplementären Aktivität inkubiert. Das Gemisch wird als solches ohne Entfernung des Uropepsins lyophilisiert. In dieser Behandlung wirkt Uropepsin auch als Stabilisator.
Obwohl das erfindungsgemässe Verfahren besonders für die Herstellung von intravenös injizierbarem Human-y-Globulin geeignet ist, kann es auch für y-Globulin tierischen Ursprungs eingesetzt werden.
Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen veranschaulicht. Da die Reaktionstemperatur, Durchflussgeschwindigkeit, Dauer der Enzymbehandlung, Konzentration von y-Globulin und andere Faktoren miteinander im Zusammenhang stehen, sind auch andere als in den Beispielen ange gebene Verfahrensbedingungen für die Verminderung der antikomplementären Aktivität von y-Globulin geeignet.
Beispiels
Herstellung von Uropepsinogen
1001 von menschlichem Urin wurden auf etwa /logo ihres ursprünglichen Volumens unter Verwendung eines Druckultrafiltrationsinstrumentes ( Pellicon , Millipore Co., und Diaflo , Amicon Co.) mit einem Trennfaktor von 10 000 Dalton konzentriert. 100 ml des konzentrierten Urins wurden auf eine DEAE-Cellulose (Whatman Co.) Säule (2,5 x 20 cm) gegeben, die mit 0,1 M Acetatpuffer (pH 6,0) eingestellt war und mit dem gleichen Puffer, der 0,3M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Das Eluat wurde auf etwa 100 ml durch Utrafiltration konzentriert und der Dialyse unterworfen. Die dialysierte Lösung wurde dann auf eine DEAE Sepharose-Säule (Pharmacia Co.) (2,5 x 20 cm) unter den gleichen Bedingungen wie oben gegeben.
Die eluierte Fraktion wurde auf etwa 10 ml konzentriert und auf eine Sephadex G-100 Gelfiltrationssäule (2,5 x 90 cm) zur weiteren Reinigung gegeben. Etwa 80 ml der erhaltenen Lösung wurden lyophilisiert und ergaben 20 mg des Uropepsinogens.
Beispiel 2
Herstellung von Schweinepepsin
5 kg Magenschleim des Schweines wurden in einem Mischer homogenisiert und das Homogenat wurde mit 10 1 0,02 M Phosphatpuffer (pH 6,9) während 1 Stunde unter vorsichtigem Rühren extrahiert. Das Extrakt wurde durch eine DEAE-Cellulose-Säule (10 x 60 cm), die mit dem gleichen Puffer eingestellt wurde, geleitet, worauf das adsorbierte
Pepsinogen mit dem gleichen Puffer, enthaltend 0,3M NaCI, eluiert wurde. Das Eluat wurde mittels Ultrafiltration durch eine Diaflomembran (Amicon) auf 80 ml konzentriert.
Die konzentrierte Lösung wurde mit 1N HCI auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert und während 10 Minuten bei 37"C gehalten. Unmittelbar danach wurde der pH-Wert der Lösung durch die Zugabe von 4N Acetatpuffer (pH 5,0) auf 4,40 erhöht. Die Lösung wurde auf eine Säule (5 x 90 cm) von Sephadex G-100 gegeben, die mit einer physiologischen Salzlösung eingestellt worden war, und die Entwicklung wurde mit der gleichen Lösung ausgeführt. Die Fraktionen, welche Schweinepepsin enthielten, wurden gesammelt. Die Ausbeute betrug etwa 500 mg Pepsin.
Beispiel 3 a) Herstellung von immobilisiertem Uropepsin
10 ml Sepharose 4B wurden mit destilliertem Wasser auf 20 ml aufgefüllt. Der pH-Wert wurde mit 6N Natriumhydroxidlösung auf 11,0 eingestellt. Dann wurden 20 ml einer 2,5%igen Cyanbromidlösung zugegeben und der pH-Wert der Suspension wurde durch die Zugabe von 6N Natriumhydroxidlösung während 30 Minuten im Bereich von 11,0 bis 11,5 gehalten, währenddem die Temperatur der Lösung bei 16"C gehalten wurde. Unmittelbar danach wurde Sepharose 4B sorgfältig mit destilliertem Wasser und 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung, die beide auf 5"C gekühlt wurden, zur Entfernung von Cyanogenbromid gewaschen. Das Sepha rose 4B wurde in einer 0, 1M Natriumhydrogencarbonatlö- sung suspendiert, wobei 20 ml einer Suspension erhalten wurden.
Zu dieser Suspension wurden 10 mg Uropepsinogen zugegeben, das nach der Reinigungsmethode von Seijffers aus menschlichem Urin erhalten wurde. Es wurde bei 5"C während 16 Stunden unter vorsichtigem Rühren umgesetzt wodurch immobilisiertes Uropepsinogen erhalten wurde.
Das immobilisierte Uropepsinogen wurde während 10 Minuten bei einem pH-Wert von 2,0 aktiviert, um immobilisiertes Uropepsin zu erhalten. Nachdem das immobilisierte
Uropepsin mit destilliertem Wasser gewaschen wurde, wurde eine 0,01 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend
0,15M Natriumchlorid, zugegeben, bis 20 ml einer Suspen sion erhalten wurden.
b) Herstellung von mit Uropepsin bei einem pH-Wert von 7.0 behandeltem y-Globulin
Eine Säule wurde mit 1,2 ml des immobilisierten, gemäss a) erhaltenen Uropepsins gefüllt, mit 0,01M Phospatpufferlö sung (pH 7,0) eingestellt und bei einer Temperatur von 370C gehalten. 20 ml einer 110 mg/ml y-Globulin enthaltenden
Lösung wurden mit einer Durchflussrate von 6 ml pro
Stunde durch die Säule geleitet und während 96 Stunden mit dem Uropepsin umgesetzt. Die Tabellen 4 und 5 zeigen die Änderung der antikomplementären Aktivität von r-Glo- bulin nach verschiedenen Behandlungsdauern mit
Uropepsin und die Eigenschaften des erhaltenen y-Globu- lins.
Tabelle 4
Reaktionszeit (Stunden)
0 12 24 48 96
Antikomplementäre Aktivität CHso/50 mg y-Globulin 86,7 65,4 22,9 16,7 10,0
Tabelle 5
Unbehandelt Mit Uropepsin behandelt
Reinheit 7S 90% 7S 98% (Elektrophorese) Grösser als 7S-10% Grösser als 7S-2% Antikomplemen- 87 CHso/50 mg 10 CHso/50 mg täre Aktivität y-Globulin y-Globulin
Influenza Virus Influenza Virus 0,11 mg/ml 0,11 mg/ml Antikörpertiter* Coxsackie Virus Coxsackie Virus
0,31 mg/ml 0,31 mg/ml
Klebsiella Klebsiella
0,63 mg/ml 0,63 mg/ml
E. coli E. coli
0,63 mg/ml 0,63 mg/ml
Opsoninaktivität** 100 100 * Minimale Konzentration, bei dery-Globulin bakterielle Agglutination ver ursacht.
** Relativer Wert, wenn die Opsoninaktivität von unbehandeltem v-Globulin mit 100 angegeben wird.
Beispiel 4
50 mg r-Globulin, das von Humanplacenta (z.B. gemäss JP-OS 48-7762 erhalten wurde) und 1 mg Human-Uropepsin wurden in 5 ml 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 0,15M Natriumchlorid, gelöst. Nachdem sie während 60 Minuten bei 37"C umgesetzt wurden, wurde die Umsetzung durch Zugabe einer 0, 1N Natriumhydroxidlösung gestoppt.
Die Eigenschaften des erhaltenen y-Globulins werden in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
Unbehandelt Mit Uropepsin behandelt
Antikomplemen- 60 CHso/50 mg 11 CHso/50 mg täre Aktivität y-Globulin r-Globulin Antikörpertiter* Influenza Virus Influenza Virus
0,11 mg/ml 0,11 mg/ml
E. coli E. coli
0,63 mg/ml 0,63 mg/ml Opsoninaktivität** 100 109 * Minimale Konzentration, bei dery-Globulin bakterielle Agglutination ver ursacht.
** Relativer Wert, wenn die Opsoninaktivität von unbehandeltem ,v-Globulin mit 100 angegeben wird.
Beispiel 5
2 ml immobilisiertes Schweinepepsin- Sepharose , das gemäss dem Verfahren in Beispiel 1 erhalten wurde, wurden in eine Säule gegeben, mit 0,01M Phosphatpufferlösung (pH 6,5) eingestellt und bei 30"C gehalten. Dann wurden 20 ml einer Lösung, enthaltend 100 mg/ml y-Globulin, während 48 Stunden durch Durchleiten der Lösung durch die Säule mit einer Durchflussrate von 10 ml pro Stunde umgesetzt. Die Eigenschaften des erhaltenen y-Globulins werden in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7
Unbehandelt Mit Pepsin behandelt
Antikomplemen- 65 CHso/50 mg 13 CHso/50 mg täre Aktivität y-Globulin y-Globulin
Influenza Virus Influenza Virus
0,11 mg/ml 0,11 mg/ml Antikörpertiter* Coxsackie Virus Coxsackie Virus
0,31 mg/ml 0,31 mg/ml
Klebsiella Klebsiella
0,63 mg/ml 0,63 mg/ml
E. coli E. coli
0,63 mg/ml 0,63 mg/ml Opsoninaktivität** 100 75 * Minimale Konzentration, bei derfly-Globulin bakterielle Agglutination ver ursacht.
** Relativer Wert, wenn die Opsoninaktivität von unbehandeltem y-GIobulin mit 100 angegeben wird.
Beispiel 6
Je 10 ml einer 1,5 mg Uropepsin pro ml enthaltenden Lösung wurden in 1000 Phiolen, die je 500 mg y-Globulin (31 CHso/50 mg y-Globulin) enthielten, gegeben, und die Mischungen wurden während 96 Stunden bei 37"C und einem pH-Wert von 6,5 bebrütet. Nach Beendigung der Bebrütung wurden die Gemische, wie sie erhalten wurden, ohne Entfernung des Uropepsins lyophilisiert. Die antikomplementäre Aktivität des behandelten y-Globulins betrug 18 CHso/50 mg y-Globulin.
Beispiel 7
1 g Uropepsin wurde als Stabilisator zu 250 g y-Globulin (16 CHso/50 mg y-Globulin) gegeben. Das Gemisch wurde in 5 1 einer 0,9%gen physiologischen Salzlösung gelöst. Nach Sterilisieren der Lösung durch Filtration wurden je 10 ml der Lösung in Phiolen gegeben und lyophilisiert. Die Resultate der Messungen der anti komplementären Aktivität nach der Lagerung bei 4"C während 3 Monaten werden in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8 Stabilisator Antikomplementäre Antikomplementäre
Aktivität vor Lagerung Aktivität nach Lagerung CHsl/50 mg y-Cilobulin CHso/S0 mg y-Globulin Kein 16 48 Uropepsin 16 14