CH661744A5

CH661744A5 - Vermiculit als traegerunterlage fuer immobilisierte biologische materialien.

Info

Publication number: CH661744A5
Application number: CH3969/83A
Authority: CH
Inventors: Wayne Elliott Swann
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-07-20
Publication date: 1987-08-14
Also published as: SE8304027L; DK323583A; GB2125407B; DE3323078A1; IT8322155A1; CA1195630A; AU1590283A; GB2125407A; FI832633A0; IL68941A0; GB8319625D0; IT1163824B; DK323583D0; SE8304027D0; US4504582A; IT8322155A0; NL8302587A; FR2530657A1; FI832633A7; LU84920A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Immobilisieren von biologischen Materialien, wie in Patentanspruch 1 definiert.

Biologische Materialien, wie Enzyme oder enzymerzeugende Mikroorganismen oder Zellen werden oft als Katalysatoren für synthetische Reaktionen und für analytische Verfahren verwendet. Derartige Katalysatoren sind erwünscht, weil sie mit hoher Spezifität und Wirksamkeit unter im allgemeinen milden Reaktionsbedingungen arbeiten.

Weil Enzyme und andere Biokatalysatoren im allgemeinen wasserlöslich sind, eignen sie sich für die Verwendung in ansatzweisen Reaktionssystemen. Die Wiederverwendung derartiger Enzyme und anderer Biokatalysatoren ist beschränkt infolge der Schwierigkeiten, solche Materialien aus dem verbrauchten Reaktionsmedium in aktiver oder verwendbarer Form wiederzugewinnen. Ferner neigen diese Materialien dazu, als Verunreinigungen in den hergestellten Produkten zu verbleiben. Um diese Schwierigkeiten zu vermeiden, wurden Methoden entwickelt, um biologische Materialien, welche katalytische Aktivität aufweisen, auf unlöslichen festen Unterlagen zu immobilisieren. Die Immobilisierung soll zu einem stabilisierten biologischen Material führen, welches den Anforderungen von wiederholter oder kontinuierlicher Verwendung widersteht.

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Es wurden verschiedene Immobilisierungssysteme für biologische Materialien beschrieben. Enzyme wurden durch Absorption an unlösliche Materialien, wie Holzkohle, Glas, Zellulose, Calciumphosphatgel, Montmorillonit und organische Ionenaustauscherharze und andere immobilisiert. Die 5 Immobilisierung wurde auch durch Einschluss in Stärke und Acrylamidgele, covalente Bindungen zwischen Enzymen und unlöslichen organischen Polymeren sowie covalente Bindungen zwischen den Enzymmolekülen selbst erzielt.

Die bisher bekannten Verfahren führen zu Produkten mit m herabgesetzter biologischer Aktivität, verglichen mit derjenigen entsprechender ungebundener biologischer Materialien. Diese biologischen Materialien sind als empfindlich auf thermale und chemische Denatuierung oder Inaktivierung bekannt. Der Verlust an biologischer Aktivität erfolgt oft, i r> wenn Immobilisierungsoperationen unter harten Bedingungen ausgeführt werden, was besonders problematisch sein kann, wenn polymere Kondensationsreaktionen durchgeführt werden. Ferner sind die aus dem bisherigen Verfahren hervorgehenden Produkte oft nachteilig in bezug auf ihre Hydro- :o philizität, ihre Festigkeit, ihre Haltbarkeit und ihre Porosität.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Immobilisierung biologischer Materialien zu entwickeln, welches die biologische Aktivität der Produkte nicht herabsetzt. 25

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Immobilisierung biologischer Materialien, in welchem die erhaltenen Produkte ausgezeichnete Festigkeit, Haltbarkeit, Porosität und biologische Stabilität aufweisen. Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfin- w dung ist die Beschaffung eines Verfahrens zur Immobilisierung einer hohen Menge an biologischem Material pro Volumeneinheit der fertigen Unterlage (hohe Dichte).

Es wurde nun gefunden, dass biologische Materialien in einfacher und sehr wirtschaftlicher Weise immobilisiert wer-den können, während gleichzeitig ein hoher Grad an deren katalytischer Wirksamkeit aufrechterhalten werden kann. Das erfindungsgemässe Verfahren erzeugt ein insolubilisiertes biologisches Materialpräparat, welches biologisches Material eingefangen in Vermiculit-Partikel, die mit einem Polymer überzogen sind, enthält. Je nach dem gewählten Polymer und der Natur des innerhalb des Vermiculites eingeschlossenen biologischen Materials kann es vorteilhaft sein, das Polymer zu vernetzen oder zu kondensieren. Es tritt ein sehr kleiner Aktivitätsverlust auf, wenn das Präparat hergestellt wird, und 4"' solche Präparate weisen ausgezeichnete Festigkeit und Haltbarkeit auf. Wenn das Polymer vernetzt oder kondensiert wird, kann ferner die Hydrophilizität dieser Matrialien durch Variieren des Masses an Vernetzung oder Kondensation eingestellt werden. Das erfindungsgemässe Verfahren erzeugt ein ><> Präparat, welches durch einfache Filtration von den Reaktionsgemischen getrennt werden kann oder in kontinuierlichen Reaktionsverfahren verwendet werden kann, wie jene, in weichen ein reagierendes Substrat durch einen Reaktor mit gepackter Kolonne fliesst. r>

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden Vermiculit-Partikel mit dem biologischen Material, wie z.B. ganzen nassen Zellen, die aus einer Fermentationsbrühe erhalten werden, in Berührung gebracht. Ein polymeres Überzugsmaterial wird zu dem Vermiculit zugesetzt, um die Partikel zu überziehen. Verschiedene Vernetzungs-, Kondensierungsund Gelierungsmittel können sodann zugesetzt werden, um das Polymer und/oder das biologische Material zu vernetzen und zu stärken, um einen harten, permeablen Überzug zu bilden. Das Polymer kann gegebenenfalls mit einer Polycarbon- fi säure kombiniert werden, um ein wasserlösliches Vorpolymer zu bilden, bevor es mit dem Vermiculit vermischt wird. Dieses Verfahren führt zur Bildung eines biologischen Materialpräparates, in welchem das biologische Material innerhalb des mit Polymer überzogenen Vermiculites immobilisiert ist.

Die Immobilisierung von biologischem Material innerhalb des Vermiculites kann durch physikalischen Einschluss, durch covalente Bindung des Polymers über das Vernetzungsoder Kondensierungsmittel mit reaktionsfähigen Gruppen des biologischen Materials oder durch Vernetzung innerhalb der Vermiculit-Partikel über ein geeignetes Vernetzungsmaterial erfolgen. Beispielsweise, wenn das Polymer ein Polyalky-lenimin ist, kann das biologische Material durch covalente Bindung immobilisiert werden, da Amin- und Carboxylgrup-pen des biologischen Materials anstelle einer Aminogruppe des Polyalkylenimins oder einer Carboxylgruppe einer Polycarbonsäure, welche dem überzogenen Vermiculit zugesetzt werden kann, treten können. Covalente Bindung zum Polymer können schliesslich über ein Kondensierungsmittel erfolgen.

Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht die Herstellung einer breiten Vielfalt an biologischen Materialpräparaten. Das biologische Material kann Enzyme, mikrobielle Zellen, Antigene, Antikörper, Antibiotika, Coenzyme, Pflanzenzellen, tierische Zellen, Bakterien, Hefen, Pilze. Gewebekulturen oder Gemische davon umfassen. Biologische Materialien werden vorzugsweise dem Vermiculit in wässeriger Form zugesetzt.

Es wurde gefunden, dass Vermiculit einen ausgezeichneten Träger für die Immobilisierung von biologischem Material ergibt. Vermiculit-Partikel sind fähig, sehr grosse Mengen an biologischen Materialien zu absorbieren, wodurch eine dichte Ladung entsteht. Vermiculit ist ferner sehr billig und leicht erhältlich, wodurch es besonders günstig ist zur Verwendung als Träger in der grosstechnischen Erzeugung von Produkten. Schliesslich ist die resultierende Immobilisierungsunterlage, welche aus dieser Methode zur Immobilisierung biologischen Materials hervorgeht, steif und hochaktiv.

Es wurde festgestellt, dass die Partikelgrösse des im erfindungsgemässen Immobilisierungsverfahren verwendeten Vermiculites in grossen Grenzen variieren kann. Beispielsweise kann die Partikelgrösse des Vermiculites von einem feinen Pulver bis etwa 1 cm variieren, vorzugsweise beträgt sie etwa 0,5 bis 1 mm. Die Menge an biologischem Material, welche dem Vermiculit zugesetzt wird, kann je nach dem spezifischen Endverbrauch des biologischen Materialpräparates variieren. Im allgemeinen beträgt sie etwa 0,001 bis 2 g (Trockengewichtsbasis) pro Gramm verwendetem Vermiculit, vorzugsweise etwa 0,01 bis etwa 1 g pro Gramm Vermiculit.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte biologische Matrialpräparat kann in seiner Hydrophilität, Festigkeit, Haltbarkeit und Posität stark differieren. Die Herabsetzung des Masses, in welchem das zum Überziehen des Vermiculites verwendete Polymer vernetzt oder kondensiert wird, kann zu einem Präparat mit grösserer Hydrophilität führen. Der Zusatz von monofunktionellen Vernetzungsmitteln kann die Festigkeit und Haltbarkeit des Polymer-Vermi-culit- biologischen Materialpräparates erhöhen, indem die zusätzlichen funktionellen Gruppen das Polymer weiter kondensieren und ein hydrophoberes Präparat ergeben.

Die allgemeine Porosität der Matrix kann erhöht werden durch Zusatz eines wasserlöslichen zerkleinerten Materials zum Polymer, bevor dieses vollständig kondensiert ist. Das trockene Material wird anschliessend durch Zusatz von Wasser nach der Kondenstion entfernt, welches den Feststoff auflöst. Der Teil an Präparat, welcher zuvor von den Feststoffen eingenommen wurde, wird leergelassen, wodurch eine erhöhte Porosität der Matrix erzielt wird. Jedes wasserlösliche zerkleinerte Material, welches das Polymer, das Vermiculit oder das biologische Material nicht wesentlich beeinflusst, kann zur Erhöhung der Porosität des Gemisches verwendet

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werden. Wasserlösliche Polycarbonsäuren, wie jene, welche mit den unkondensierten Polymeren umgesetzt werden, sind besonders geeignet zur Erhöhung der Matrix-Porosität, da überschüssige Mengen, welche zur Erhöhung der Porosität verwendet werden, die Kondensationsreaktionen nicht wesentlich stören.

Die im erfindungsgemässen Verfahren und den erfindungsgemässen Präparaten verwendeten Polymere variieren allgemein im Molekulargewicht je nach den Reaktionsbedingungen, und weisen vorzugsweise eine vernetzte Kettenstruktur auf. Eine Vielzahl polymerer Materialien kann im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, einschliesslich Polyalkylenimine, Polysaccharide, Polyacrylamide, Polyurethane, Alginate und Carageenen. Bevorzugte Polymere sind Polyalkylenimine.

Polyalkylenimine können durch mit Säure katalysierte Additionspolymerisation von Alkyleniminmonomeren hergestellt werden. Ein bevorzugtes Polylakylenimin ist Polyäthy-lenimin (PEI), weil es leicht erhältlich ist zu verhältnismässig niederen Preisen und in den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Kondensationsreaktionen gut funktioniert. Poly-äthylenimin wird im allgemeinen durch Ringöffnungspolymerisation von Äthylenimin in Gegenwart von Katalysatoren, wie Mineralsäuren, erzeugt. Das Polymer ist stark vernetzt und enthält primäre, sekundäre und tertiäre Aminogruppen. PEI ist wasserlöslich, und nach Vernetzung oder Kondensation der Polymerketten entsteht ein wasserunlösliches Produkt.

Das Polyäthylenimin kann mit einem Aminvernetzungs-

mittel vernetzt werden, um ihm zusätzliche Stabilität und Festigkeit zu verleihen. Diese Behandlung führt zu eingeschlossenem biologischem Material mit einiger Vernetzung zwischen dem Polyalkylenimin und freien Aminogruppen des s biologischen Materials. Vernetzungsmittel umfassen Glutar-dialdehyd, Diisocyanate, Polyisocyanate, 2,4,6-Trichlor-s-tria-zin, Bisoxiran, Bisimidat, Divinylsulfon, l,5-Difluor-2,4-dini-trobenzol und dergleichen. Glutardialdehyd wird für diesen Zweck bevorzugt.

io Das gewählte Polymer wird im allgemeinen dem Präparat in genügender Menge zugesetzt, um die Vermiculit-Partikel im wesentlichen zu überziehen, und diese Menge variiert im allgemeinen wesentlich je nach der Grösse der Partikel des Vermiculites, der Natur der biologischen Materialien und den 15 gewünschten physikalischen Eigenschaften. Im allgemeinen kann das Polymer zwischen etwa 0,5 bis etwa 25 Gewichtsprozent des Präparates betragen und vorzugsweise zwischen etwa 2% bis etwa 15 Gewichtsprozent des Präparates. Die Menge an verwendetem Vernetzungs- und/oder Kondensa-20 tionsmittel hängt von der Menge an Polymer ab, wie im folgenden noch näher erläutert wird.

Wenn das Polymer Polyäthylenimin ist, verwendet man eine hochwirksame Methode zur Kondensation eine Polycarbonsäure (PCA), um die Aminogruppen von benachbarten PEI-Ketten zu überbrücken. Kondensationsmittel, vorzugsweise Carbodiimide, bewirken die Kondensation leicht. Die bei der Herstellung des erfindungsgemässen kondensierten Polyäthylenimins auftretenden Reaktionen sind im folgenden illustriert:

(1) H^—CH2-^[CH2CH2N]n[CH7CH2NH]n,CH2CH7NH2 N [CH2CH2NH]n„-CH2CH2NH2

(2)

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(pei)

Reaktion (1) zeigt die Polymerisation von Äthylenimin unter Bildung von PEI mit verzweigtkettiger Struktur, in welcher n und n' ganze Zahlen grösser als 0 sind und n" 0 sein kann (was anzeigt, dass die [CH2CH2NH]-Gruppe nicht vorhanden ist) oder grösser als 0. Reaktion (2) zeigt die Bildung eines Salzes der Aminogruppen von PEI mit einer Polycarbonsäure, in welcher R eine substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffgruppe ist, die Reaktionen (3) und (4) zeigen die Kondensation des PEI mit Polycarbonsäure unter Verwendung eines Carbodiimid-Kondensationsmittels. R und R' sind Kohlenwasserstoffgruppen, welche zusammen mit anderen Reaktionsteilnehmern und Bedingungen der illustrierten Reaktionen eingehender im folgenden beschrieben sind.

Im allgemeinen können Polycarbonsäuren, welche zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, substituierte oder unsubstituierte Carbonsäuen sein, welche mindestens zwei Carboxylgruppen enthalten. Vorzugsweise sind die Polycarbonsäuren wasserlöslich, so dass sie verwendet werden können, um die Porosität des Präparates zu erhöhen, wie auch zur Kondensation des Polyalkylenimins. Beispiele von geeigneten Polycarbonsäuren umfassen Adipin, Azelain, 1,11-Undecandicarbon-, 1,12-Dodecandicarbon-, l-Decen-l,10-dicarbonsäure (traumatic), Pendadecandicar-bon-, Hexadecandicarbon-, Sebacin-, Suberin-, Glutar-, Malon-, Pimellin-, Bernstein-, Apfel-, Malein-, Glutamin-, Aspsartin-, Oxal-, Fumar-, Polyaspartinsäure und dergleichen. Dicarbonsäuren werden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt und umfassen Maleinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure und Adipinsäure. Höhere Polycarbonsäuren können jede Substanz sein, welche zwei oder mehr Carbonsäuregruppen enthalten und umfassen polymere Materialien von hohem Molekulargewicht, wie Polyaspartinsäure mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 50 000. Die Kondensationsreaktionen verlaufen im allgemeinen exotherm, so dass die Reaktionsgemische mit Vorteil auf eine Temperatur gekühlt werden, welche für das zu immobilisierende biologische Material nicht schädlich ist, zum Beispiel etwa 37 °C oder darunter.

Das molare Verhältnis von Polycarbonsäure zu Polyalky-lenimin (PCA:PAI) kann in weiten Grenzen variieren infolge der Variation des Molekulargewichtes der Reaktionsteilnehmer. Im allgemeinen liegt dieses Verhältnis im Bereich von 1:20 bis 1:0,0005. Wenn Polycarbonsäure zugesetzt wird, um die Porosität des Präparates zu erhöhen, wird oft ein beträchtlicher molarer Überschuss an Polycarbonsäure verwendet.

Die Polycarbonsäure kann in einer kondensierenden Menge unter vorpolymerisierenden Bedingungen zum Polyal-

( pei )

nh

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(pei)

kylenimin zugesetzt werden, um ein wasserlösliches Vorpolymer zu bilden. Das Vorpolymer ist im allgemeinen eine viskose Flüssigkeit, zu welcher das Vermiculit, welches das immobilisierte biologische Material enthält, bequem zugesetzt und darin während der Kondensationsreaktion in Suspension gehalten werden kann. Das Kondensierungsmittel wird sodann zugesetzt, um die Kondensation und Verfestigung des Vorpolymer-Vermiculit-Präparates zu bewirken. Das pH des Reaktionsgemisches wird auf einer Höhe gehalten, welches das biologische Material im wesentlichen weder inaktiviert noch anderweitig auf unerwünschte Weise beeinflusst. Der pH kann zwischen etwa 2 bis etwa 12 variieren und liegt vorzugsweise im Bereich zwischen etwa 5 und etwa 10.

Wie oben erwähnt wird mit Vorteil ein Kondensationsmittel verwendet, um die Kondensation der Polyalkyleniminket-ten durch Polycarbonsäuren zu bewirken. Im allgemeinen kann jedes Kondensationsmittel verwendet werden, welches die Reaktion von Aminen mit Carbonsäuren erleichtert oder katalysiert. Beispiele solcher Kondensationsmittel umfassen N-Äthyl-5-phenyl-isoazolium-3-sulfonat, N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-l,2-dihydrochinolin und verschiedene Carbodi-imide. Carbodiimid-Kondensationsmittel, welche in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, weisen die Formel R'-N = C = N-R" auf, in welcher R' und R" Kohlenwasserstoffgruppen mit 3 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit etwa 5 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen darstellen. Derartige Kondensationsmittel umfassen l-Äthyl-3,3-dimethylamino-propyl-carbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid, 1 -Cyclohexyl-3-(2-morpholino-äthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat oder deren Salze. Carbodiimid-Kondensationsmittel werden dem Reaktionsgemisch in kondensierender Menge zugesetzt, welche im allgemeinen eine praktisch stöchiometrische Menge darstellt, d.h. von etwa 0,2- bis 3-mal, vorzugsweise von etwa 0,5- bis 1,5-mal eine stöchiometrische Menge. Jedes Carbodiimid-Molekül reagiert mit einer einzelnen Säuregruppe der Polycarbonsäure. Beispielsweise werden im allgemeinen in dem vorliegenden Verfahren Molverhältnisse von Carbodiimid zu Dicarbonsäure von etwa 2:1 eingesetzt. Nach Zusatz des Kondensationsmittels bei Zimmertemperatur tritt eine merkliche Polymerisation innerhalb 30 Sekunden ein, und sie ist im allgemeinen innerhalb etwa 2 Stunden beendet.

Wenn das Polyäthylenimin durch Zusatz eines Kondensationsmittels insolubilisiert ist, umfasst eine fakultative Nachbehandlungsstufe die Vernetzung des kondensierten, überzogenen Vermiculites mit einem Aminvernetzungsmittel, wie Glutardialdehyd, wie oben beschrieben, um dem Endprodukt zusätzliche Fertigkeit und Stabiliät zu verleihen.

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Je nach der Art des gewählten Polymers kann eine Vielzahl von Kondensations- und Vernetzungsmitteln aus denen ausgewählt werden, die dem Fachmann bekannt sind, um das Präparat zu festigen. Durch Verwendung der beschriebenen erfindungsgemässen Verfahrens ist es möglich, eine grosse Vielzahl biologischer Materialien zu immobilisieren, um neue biokatalytische Präparate zu erzeugen. In den folgenden Beispielen werden die Immobilisierungsverfahren in mehr Einzelheiten beschrieben. Diese Beispiele beschreiben die Art und das Verfahren zur Durchführung und Verwendung der vorliegenden Erfindung und erläutert verschiedene Ausführungsformen der Erfindung.

Beispiel 1

80 g aspartasehaltige E.-coli-Zellpaste, welche etwa 75 Gewichtsprozent Wasser enthielt, wurde aus frischen asparta-sehaltigen E. coli hergestellt. Um die Paste zu erzeugen,

wurde das Fermentationsmedium durch Auflösen von 24 g Hefeextrakt, 30 g Fumarsäure, 2 g Natriumcarbonat, 2 mM Magnesiumsulfat und 0,1 mM Calciumchlorid in 1 Liter Wasser zubereitet und der pH auf etwa 7,2 mit Ammoniumhydroxid eingestellt. Dieses Medium wurde mit 1 ml einer Kultur von E. coli (ATCC No. 31976) geimpft, welche während 12 bis 16 Stunden bei 37 °C in einem 0,5% Mononatriumgluta-mat enthaltenden Peptonmedium inkubiert worden war, geimpft.

Das geimpfte Medium wurde während 12 bis 14 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 5000 Touren pro Minute während 30 Minuten gewonnen.

80 g aspartasehaltiges E. coli wurden zu 20 g Vermiculit-Partikel zugesetzt. Nach dem die Zellpaste in das Vermiculit absorbieren gelassen worden war, wurden 10 g Polyäthylenimin zum Gemisch zugesetzt und gerührt bis zur gleichmässi-gen Verteilung. Glutardialdehyd (20 g einer 25%igen Lösung in Wasser) wurde sodann zugesetzt und gemischt bis harte Partikel entstanden. Ein zweiter Ansatz des Materials wurde nach denselben Verfahren hergestellt. Beide Ansätze des Materials wurden über Nacht trocknen gelassen.

Das Material wurde in eine Säule mit einem Endbettvolumen von 353 cm3 eingefüllt. Die Säule wurde sodann verwendet, um Ammoniumfumarat in L-Aspartinsäure umzuwandeln. Eine 1,5 M Lösung von Ammoniumfumarat mit 1 mM Magnesiumsulfat, pH 8,5, wurde bei 37 °C mit 360 cmVStunde (1,0 SVh_1) hindurchgeleitet. Die ausfliessende Flüssigkeit wurde auf Aspartase-Aktivität überprüft durch Messung des Verschwindens der Fumarsäure auf einem Spektrophotometer bei 240 nm. Die Säule wurde während 151 Tagen kontinuierlich in Betrieb gehalten. Während dieser Zeit wurden Proben der aus der Säule ausfliessenden Flüssigkeit untersucht, um die prozentuale Umwandlung des Substrates zu bestimmen. Die Resultate sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Tag Prozent Umwandlung von 1,5 M Ammoniumfumarat

(1 Durchgang bei 1 SV/Stunde)

1

98,2

6

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91,3

Beispiel 2

Das allgemeine Vorgehen von Beispiel 1 wurde wiederholt unter Verwendung von 120 g Zellpaste und 15 g Polyäthylenimin. Ein Ansatz an immobilisiertem Material wurde in einem Säulenreaktor von 173 cm3 Bettvolumen eingefüllt. Die Säule erreichte eine 99%ige Umwandlung einer 1,8 M Ammoniumfumaratlösung bei 360 cm VStunde (2,08 SVh_l). Die Produktivität dieser Säule wird berechnet mit 493 g erzeugte L-Aspartinsäure/Liter Bettvolumen an immobilisierten Zellen/Stunde bei 37 °C (3,7 Mol/Liter/Stunde).

Beispiel 3

Zehn Ansätze von immobilisierten E.-coli-Zellen (100 g Vermiculit/Ansatz) wurden nach dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 2 hergestellt.

Der Biokatalysator wurde sodann in eine Säule mit 12,5 Liter Bettvolumen eingefüllt. Ammoniumfumarat (1,8 M) wurde bei 37 °C mit verschiedenen Durchlaufgeschwindigkeiten durch die Säule geführt, und die ausfliessende Flüssigkeit in bezug auf die Umwandlung des Ammoniumfumarates wie in Beispiel 1 untersucht. Tabelle II zeigt die Resultate dieser Untersuchung.

Tabelle II

Fliessgeschwindigkeit (1/h)

Prozent Umwandlung

(Fumarsäure)

kg/h

(L-Aspartinsäure)

Mol/l/h (L-Aspartinsäure)

12,50

99,1

2,97

1,79

18,75

87,5

4,38

2,63

25,00

95,0

5,69

3,42

62,50

56,0

8,38

5,04

Beispiel 4

Das allgemeine Verfahren von Beispiel 3 wurde mit einem frischen Ansatz an E.-coli-Zellen wiederholt, mit Ausnahme, dass die frischen Zellen 29% mehr Aktivität aufwiesen als diejenigen des vorgehenden Ansatzes. Wenn das Substrat durch die Säule mit 62,5 Liter/Stunde (wie in Beispiel 3) hindurchgeführt wurde, betrug die Menge an erzeugter Aspartinsäure 10,56 kg/Stunde (6,35 Mol/Liter/Stunde). Dies bedeutet eine 27%ige Zunahme der Produktivität gegenüber Beispiel 3.

Beispiel 5

Das Enzym Tryptophansynthetase kann im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, um die Umwandlung von Indol und Serin in Tryptophan zu katalysieren. Vermicu-lit-Partikel (2 g) und 4 ml rohe Tryptophansynthetase-Extraktlösung aus E.-coli-Zellen wurden miteinander vermischt. Der Extrakt wurde in das Vermiculit absorbieren gelassen. Polyäthylenimin (1 g) wurde sodann zum Gemisch zugesetzt, um die Vermiculit-Partikel zu überziehen. Glutardialdehyd (2 Mol einer 25%igen Lösung in Wasser) wurde sodann zugesetzt und vermischt, bis harte überzogene Partikel entstanden. Die ganze Materialmenge wurde sodann in eine Säule eingefüllt und mit einer Substratlösung gewaschen, welche aus 0,05 M Serin, 0,05 M Indol, 0,005 M Glutathion, 0,005 M zweibasischen Kaliumphosphat und 200 mg Pyrido-xal-5-phosphat/Liter bestand und der pH auf 7,8 eingestellt. Die Säule wurde sodann wiederholt in einem ansatzweisen Umlaufsystem verwendet, um 80 mg L-Tryptophan in 24 Stunden zu erzeugen.

Beispiel 6

9 g ganze Hefezellen R. rubra, welche das Enzym Phenyl-alanin-ammoniak-lyase enthielten, wuden mit 3 g Vermiculit-

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Partikel vermischt, in die Partikel absorbieren und die Partikel gut überziehen gelassen, dann auf 10 °C gekühlt. Eine Polysaccharid-Überzugslösung wurde zubereitet durch Zusetzen von 0,8 g «Kelco»-Polysaccharid (K9A50)-Pulver in 100 ml deionisiertes Wasser bei 80 °C und Rühren während 10 Minuten. Das Pulver löste sich auf und 1 g Kaliumchlorid wurde zu der Lösung zugesetzt. Die Lösung wurde auf 50 °C abkühlen gelassen, wobei alles gelöst blieb. Die warme Lösung wurde sodann über das kalte Vermiculit-Material unter Mischen gegossen. Das Polysaccharid bildete sehr rasch ein Gel, welches die Vermiculit-Partikel überzog, die R. rubra enthielten. Die Partikel wurden in 100 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, verbracht und kräftig unter Rühren gewaschen. Die Partikel wurden sodann aus der Pufferlösung entfernt. Die Lösung wies keinerlei Anzeichen von Trübung auf und war praktisch frei von Hefezellen, was darauf hinwies. "> dass die Immobilisierung erfolgreich verlaufen war. Die Partikel wurden in 50 ml 0,1 M Ammoniumcinnamat bei pH 9,3 verbracht und die Lösung auf PAL-Aktivität geprüft durch Überwachung der Erzeugung von L-Phenylalanin. Das immobilisierte Zellmaterial war erfolgreich in der Erzeugung von 10 L-Phenylalanin; steigende Mengen von L-Phenylalanin wurden in der Reaktionslösung im Laufe der Zeit festgestellt.

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Immobilisierung von biologischen Materialien durch Herstellung eines insolubilisierten biologischen Materialpräparates, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Vermiculit-Partikel zu einem wässrigen Medium eines biologischen Materials zusetzt,

b) dieses wässrige Medium von biologischem Material in das Vermiculit absorbieren lässt, und c) das erhaltene Vermiculit mit einem Polymer überzieht.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das überzogene Vermiculit der Stufe (c) mit einem Vernetzungsmittel vernetzt oder mit einem Kondensie-rungsmittel kondensiert wird.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polyalkyleniminen, Polysacchariden, Polyacrylamid, Polyurethan, Alginat und Carageenan.
4. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das mit Polymer überzogene Vermiculit mit einer vernetzenden Menge eines Amin-Vernetzungsmit-tels vermischt, um das biologische Material innerhalb des überzogenen Vermiculites zu immobilisieren.
5. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyalkyleniminpolymer mit einer kondensierenden Menge einer Polycarbonsäure vermischt wird, um ein partiell polymerisiertes, vorkondensiertes, wasserlösliches Polymer zu bilden, bevor es mit dem Vermiculit vermischt wird.
6. Verfahren nach Patentanspruch 2 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das überzogene Vermiculit durch Zusatz einer kondensierenden Menge eines Carbodiimidkondensa-tionsmittels unter kondensierenden Bedingungen kondensiert wird.
7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das insolubilisierte biologische Materialpräparat modifiziert wird durch eine Nachbehandlung mit einem Amin-Vernetzungsmittel, um dem Präparat zusätzliche Festigkeit und Stabilität zu verleihen.
8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 2,4,5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyalkyleniminpolymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyäthylen-imin, Polypropylenimin, Polybutylenimin und Polypentylen-imin und vorzugsweise Polyäthylenimin.
9. Verfahren nach Patentanspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Polycarbonsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Maleinsäure, Bernsteinsäure und Adipinsäure.
10. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Carbodiimid-Kondensierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus l-Äthyl-3,3-dimethyl-aminopropylcarbodiimid-hydrochlorid, Dicyclohexyl-carbo-diimid und l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodi-imidmetho-p-toluol-sulfonat und deren Salzen.
11. Verfahren nach Patentanspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Amin-Vernetzungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glutar-dialdehyd, Diiso-cyanate, Polyisocyanaten, 2,4,6-Trichlor-5-triazin, Bisoxiran, Bisimidat, Divinylsulfon und l,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol.
12. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an biologischem Material, welche zum Vermiculit zugesetzt wird, 0,001 bis 2 g, berechnet auf der Trockengewichtsbasis, pro Gramm Vermiculit beträgt.
13. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis von Polyalkylenimin zu Polycarbonsäure 1:20 bis 1:0,0005 beträgt.
14. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Carbodiimid in einer Menge im Bereich von der 0,2- bis 3fachen stöchiometrischen Menge, insbesondere in einer Menge im Bereich von der 0,5- bis 1,5fachen stöchiometrischen Menge in bezug auf die Polycarbonsäure verwendet wird.
15. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass dasimmobilisierte biologische Material ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Enzymen, mikrobiologischen Zellen, Antigenen, Antikörpern, Antibiotika, Co-Enzymen, Bakterien, Hefen, Pilzen, Pflanzenzellen, tierischen Zellen und Gewebekulturen, z.B. mikrobiell erzeugte Aspartase oder Tryptophansynthetase.
16. Insolubilisiertes biologisches Materialpräparat, hergestellt nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein biologisch aktives Material, absorbiert in Partikel von Vermiculit, enthält, welche innerhalb eines Polymers immobilisiert sind.
17. Insolubilisiertes biologisches Materialpräparat nach Patentanspruch 16, hergestellt nach einem der Patentansprüche 2 bis 15.
18. Verfahren zur Herstellung von Aspartinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass man unter Aspartinsäure erzeugenden Bedingungen ein Substrat, welches Ammoniumfumarat enthält, mit einem nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 2 hergestellten insolubilisierten biologischen Materialpräparat von Aspartase oder aspartasehaltigen mikrobiellen Zellen in Berührung bringt.
19. Verfahren zur Erzeugung von Tryptophan, dadurch gekennzeichnet, dass man unter tryptophanerzeugenden Bedingungen ein Substrat, welches Indol und Serin enthält, mit einem nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 2 hergestellten insolubilisierten biologischen Materialpräparat von Tryptophansynthetase oder trypophansynthetasehaltigen mikrobiellen Zellen in Berührung bringt.
20. Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, dadurch gekennzeichnet, dass man unter L-phenylalaniner-zeugenden Bedingungen ein Substrat, welches Ammonium-cinnamat enthält, mit einem nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 hergestellten insolubilisierten biologischen Materialpräparat von Phenylalanin-ammoniak-lyase oder Phenylalanin-ammoniak-lyase enthaltenden mikrobiellen Zellen in Berührung bringt.