CH668005A5

CH668005A5 - Fusogene liposome und verfahren zu deren herstellung.

Info

Publication number: CH668005A5
Application number: CH1297/86A
Authority: CH
Inventors: Adolfo Guillermo Gitman; Abraham Loyter
Original assignee: Int Genetic Sciences
Priority date: 1985-04-04
Filing date: 1986-04-03
Publication date: 1988-11-30
Also published as: IL78348A; SE8601408D0; DE3610873A1; ZA862466B; JPS61274739A; ES553703A0; FR2579891A1; IL78348A0; CA1262863A; SE464448B; BR8601554A; SE8601408L; AU5562286A; IT8683340A0; GB2188900A; NZ215696A; GB2188900B; ES8802401A1; BE904536A; FR2579891B1

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung betrifft fusogene Liposome. Liposome bestehen im allgemeinen und besonders in dem hier verwendeten Sinn aus Bläschen aus phospholipiden Molekülen. Es ist heute allgemein anerkannt, dass Liposome ein Mittel bilden, um Arzneimittel oder andere regelnde Substanzen in tierische oder pflanzliche Zellen einzuführen, um dort die Zellphysiologie zu modifizieren. Seit der Erkenntnis, das Liposome eine wichtige Rolle beim Einbringen von Arzneimitteln oder einem die Zellphysiologie modifizierenden Material in eine Zelle spielen, wurden verschiedene Methoden vorgeschlagen, um Liposome zu erzeugen oder herzustellen. So ist beispielsweise die Herstellung von Liposomen mit einem grossen, wässrigen bzw. wasserhaltigen Innenraum zum Einschliessen eines zu transferierenden Arzneimittels oder eines anderen modifizierenden Moleküls beschrieben in «Procedure for Préparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation», durch Szoka und Papahadjopoulos, in Proc. Nati. Acad. Sei., USA 75,1978, S. 4194-4198. Andere Methoden sind primär auf verbesserte Verfahren zum Einschliessen eines Arzneimittels oder dergleichen in Liposome ausgerichtet, wie beispielsweise beschrieben in «Dehydra-tion-Rehydration Vesicles: A Simple Method for High Yield Drag Entrapment in Liposomes», durch Kirby und Grego-riadis in Bio/Technology, November 1984, S. 979—984. In US-PS Nr. 4 235 871 wird ein Verfahren zum Einschliessen einer Vielzahl biologisch aktiver Substanzen in synthetische, oligolamellare Lipidbläschen beschrieben, bei welchem eine Mischung aus Lipid in einem organischen Lösungsmittel und einem wässrigen Gemisch des einzuschliessenden Materials zubereitet, die Mischung emulsifiziert, das organische Lösungsmittel entfernt und der resultierende Gel in Wasser suspendiert wird. Ferner wurden verschiedene Anwendungen für Liposome als Transfermittel in unzähligen Patenten vorgeschlagen. So beschreibt das vorgenannte US-PS Nr. 4 235 871 viele aktive Verbindungen und Zusammensetzungen, welche zum Zwecke des Einbringens in Zellen in Liposome eingekapselt wurden. Die US-PS Nr. 4 394 448 bezieht sich spezifisch auf das Einführen von Deoxyribonuc-leinsäure (DNS) oder Fragmenten davon in eine lebende Zelle, wozu die DNS oder deren Fragmente in ein Lipidbläschen eingekapselt und das Bläschen in Kontakt mit einer Zelle gebracht wird, wobei dann die Einführung erfolgt. Die US-PS Nr. 4 199 565; 4 201 767; 4 261 975 und 4 235 877 beschreiben das Einführen eines viralen oder bakteriellen Antigens in Liposome, welche positiv geladene aminhaltige oberflächenaktive Stoffe, wie beispielsweise quaternäre Ammoni-umhalogenidsalze enthalten. Die US-PS Nr. 4 483 929 beschreibt ein immunoreaktives Liposomreagens zur Verwendung in der Bestimmung einer chemischen Verbindung, welche in der Lage ist, eine immunospezifische Reaktion mit einem bekannten Antikörper einzugehen. Bei allen der Patentinhaberin bekannten Anwendungen und obwohl gezeigt wurde, dass phospholipide Liposome in der Lage sind, ihren Inhalt sowohl in kultivierte Zellen als auch in Zellen bestimmter Gewebe von ganzen Tieren einzuführen, hat sich herausgestellt, dass diese Liposome relativ schlechte Träger sind. Es wird angenommen, dass diese heute bekannten Liposome die mitgetragenen Substanzen, d.h. die Arzneimittel, durch endozytisch vorlaufende Prozesse in die Zellen einbringen. Somit kann nur ein kleiner Prozentsatz der in den Liposomen eingeschlossenen Moleküle das Zellplasma (Zy-toplasma) der Empfangniszellen erreichen. Darüberhinaus wurde festgestellt, dass bei der Injektion von Liposomen in Tieren wie auch in Menschen, die phospholipiden Liposome bis zu einer gewissen Konzentration inert und nicht-immu-nogen sind. Lediglich bei relativ hohen Konzentrationen sind Liposome immunogen und toxisch. Diese bekannten Liposome, obwohl sie sich an Zellen anlagern können, sind nicht fusogen, d.h. sie sind nicht in der Lage, mit einer Zellmembran zu verschmelzen oder gar eine Zellen-Zellen-Fusi-on herbeizuführen.

Es hat sich auch herausgestellt, dass die Hüllen von gewissen tierischen Viren, wie beispielsweise die aus dem Sen-

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dai Virus erhaltenen, fusogen sind und sich als wirksame Träger zum Einführen von Molekülen in gezüchtete Zellen eignen, wie aus «A New Method for Reconstitution of Higly Fusogenic Sendai Virus Envelopes», durch Vainstein u. a., Biochimica et Biophysica Acta, 773 (1984) S. 181 —188 hervorgeht. Es wird vermutet, dass die fusogene Aktivität dieser Viren der Präsenz von spezifischen viralen Glycoproteinen in den Hüllen der Viren zu verdanken ist. Es scheint jedoch, dass die Präsenz eines Proteins in den fusogenen viralen Hüllen diese Bläschen immunogen macht, d.h. unbrauchbar für deren Verwendung in vivo. Die Injektion von viralen Hüllen in Tiere bewirkt die Bildung von spezifischen antiviralen Antikörpern, eine Tatsache, welche ihren Einsatz als biologischer Träger in vivo einschränkt.

Die aufgeführten Literaturstellen zeigen somit auf, dass obwohl phospholipide Bläschen als potentiell wichtige Instrumente zum Einführen von Arzneimitteln oder anderen zellmodifizierenden Substanzen in Zellen erkannt wurden, wegen den Einschränkungen gegenüber bisher bekannten Liposomen, diese Technik nur beschränkten Erfolg haben konnte.

Zweck der vorliegenden Erfindung ist es somit, Liposome zu schaffen, welche fusogen sind und welche mit einer Zellmembran verschmelzen und eine Zellen-Zellen-Fusion einleiten können.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt in der Schaffung eines Verfahrens zur Erzeugung von Liposomen, welche mit einer Zellmembran verschmelzen und eine Zellen-Zellen-Fusion auslösen können.

Die vorgenannten Aufgaben werden erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass in die Membrane eines Liposoms ein quaternäres Ammoniumhydroxidsalz eingelagert wird, und zwar entweder während der eigentlichen Herstellung des Liposoms oder nachdem dieses erzeugt wurde. Es wurde festgestellt, dass die Präsenz eines quaternären Ammoniumhydroxydsalzes der Membrane des phospholipiden Bläschens diesem Bläschen ermöglicht, mit einer Zellmembrane zu verschmelzen (fusionieren) und eine Zellen-Zellen-Fusion auszulösen bzw. einzuleiten. Wenn das Bläschen mit einem Arzneimittel oder einer zellmodifizierenden Substanz beladen ist, gelangt der Inhalt des Bläschens durch Mikroinjektion in die tierische oder pflanzliche Zelle. Die Fähigkeit des quaternären Ammoniumhydroxidsalzes die phospholipiden nicht-fusogenen Bläschen in fusogene Bläschen umzuwandeln, ist speziell überraschend, da quaternäre Ammoniumsalze, wenn es keine Hydroxidsalze sind, zu nicht-fusogenen Bläschen führen. So wurde festgestellt, dass phospholipide Bläschen, welche quaternäre Ammoniumhalogenidsalze, quaternäre Ammoniumazetatsalze und dergleichen enthalten, nicht mit einer Zelle verschmelzen und somit den Bläscheninhalt nicht in eine Zelle mikroinjizieren können. Diese Bläschen reagieren ähnlich wie die bekannten nicht-fusogenen Bläschen, d.h. sie überführen offensichtlich ihren Inhalt in die Zellen mittels eines endozytisch-ähnlichen Prozesses. Die fusogenen Eigenschaften der Liposome gemäss der vorliegenden Erfindung bilden somit andererseits ein geeignetes Mittel, um irgendwelche zellmodifizierende Substanzen, welche in ein phospholipides Bläschen eingekapselt werden können, in bedeutenden quantitativen Mengen direkt in eine pflanzliche oder tierische Zelle einzubringen.

Das quaternäre Ammoniumhydroxidsalz zum Einlagern in die Wand oder Membrane des phospholiden Bläschens hat die Formel:

I2 +

R, - N - R~ OH

1 , 3

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worin Ri eine grosse Alkylgruppe oder eine Kombination eines Alkyl- und Arylrestes darstellt, um dem Salz oberflächenaktive Eigenschaften zu verleihen, und R2, R3 und R4 verästelte Alkylrestketten mit I bis 20 C-Atomen, oder ein Aryl-rest sind, oder R2 und R3 zusammen einen 5-gliedrigen oder 6-gliedrigen heterocyclischen Rest, wie z.B. Pyrrol oder Pyridin bilden. Besonders geeignete Verbindungen sind die oberflächenaktiven Verbindungen wie Cetyl-benzyldimethyl-Ammoniumhydroxid, Hexadecyltrimethyl-ammoniumhy-droxid, Cetyltrimethyl-ammoniumhydroxid, Di-isobutyl-cresoxy-äthoxy-äthyl-dimethyl-benzyl-ammoniumhydroxid, Di-isobutyl-phenoxy-äthoxy-äthyl-dimethylbenzyl-ammoni-umhydroxid, Methyl-dodecylbenzyl-trimethylammoniumhy-droxid, Methyl-dodecyl-xylen-bis-(trimethylammoniumhy-droxid), N-alkyl (C12, Cu, Ci6) dimethylbenzylammonium-hydroxid, und Octylcresoxy-äthoxy-äthyl-dimethyl-benzyl-ammoniumhydroxid. Es ist wichtig, dass das quaternäre Ammoniumhydroxidsalz oberflächenaktive Eigenschaften aufweist und einen Hydroxy-Rest enthält, um dem phospholipiden Bläschen fusogene Eigenschaften zu verleihen. Die Menge des in den Bläschen enthaltenen quaternären Ammoniumhydroxidsalzes liegt normalerweise zwischen etwa 5 bis 750 (ig/1 mg Phospholipid und vorzugsweise zwischen etwa 50 bis 250 |Ag/l mg Phospholipid.

Als für die vorliegende Erfindung geeignete Liposome kommen alle bekannten Liposome in Frage. Solche Liposome umfassen beispielsweise die natürlichen und synthetischen phosphocholinhaltigen Lipide mit einer Fettsäurekette mit 12 bis 20 C-Atomen und einer Fettsäurekette mit wenigstens 8 C-Atomen, wie beispielsweise Dimyristoylphosphati-dylcholin, Dioleoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphos-phatidylcholin, Distearoylphosphatcholin, Phosphatidyl-cholin und Sphingomyelin; ferner Cholesterin und dergleichen. Die Liposome können nach irgend einer der bekannten und publizierten Methoden hergestellt werden, wie z.B. durch Schallbearbeitung (Sonication) von phospholipiden Suspensionen, Umkehr-Evaporation oder durch Dehydration von getrockneten Schichten von phospholipiden Molekülen. Entsprechende Techniken sind beschrieben in «Procedure for Préparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evapo-ration» von Szoka u.a., wie bereits aufgeführt; «Dehydrati-on-Rehydration Vesicles: A Simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes» von Kirby und Gregoria-dis, wie bereits aufgeführt sowie andere Techniken, wie z. B. die Verwendung von Detergentien (siehe Szoka und Papa-hadjopoulos, Annu. Biophys. Bioeng., 9 (1980), S. 467-480).

Zusätzlich kann die zellmodifizierende Substanz, welche im Liposom eingekapselt werden kann und welche durch Mikroinjektion in tierische oder pflanzliche Zellen eingebracht werden kann, und zwar durch Fusion mit den Liposomen gemäss der vorliegenden Erfindung, irgendeine der vorstehend aufgeführten Substanzen sein. Es wurde festgestellt, dass die Substanzen, welche in die Liposome eingekapselt werden und in eine Zelle mikroinjiziert werden können, gemäss der Erfindung auch DNS und DNS-Fragmente einschliessen können; ferner pharmazeutisch aktive Verbindungen und Zusammensetzungen, wie Kohlehydrate, Nucleoti-de, Polynucleotide, und zwar sowohl in natürlicher wie auch synthetischer Form; Grippeimpfstoffe und Antigene sowie weitere Substanzen, welche die Physiologie von tierischen und pflanzlichen Zellen verändern können.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen noch etwas näher erläutert.

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Beispiel 1

Einlagern von quaternärem Ammoniumhydroxidsalz in die Membranen von Liposomen während der Herstellung der Liposome.

2 mg von unbeladenem phospholipidem Phosphotidyl-cholin (PC) und 1 mg Cholesterin wurden aus ihrer chloroformischen Lösung getrocknet. Die trockene Schicht, welche aus dem PC und dem Cholesterin erhalten wurde, wird zusammen mit 1 ml Diathyläther aufgelöst und die erhaltene Lösung wird einer Suspension zugefügt, welche 2 mg Octyl-cresoxy-äthoxyäthyl-dimethyl-benzyl-ammoniumhydroxid (Q-Salz) in Azetatpufferlösung bei einem pH von 7,0 enthält. Die erhaltene Suspension wird dann gründlich verwirbelt, um dann kurzzeitig einer Schallbehandlung in einem Badschallgerät unterworfen zu werden. Umkehrverdampfte, grosse unilamellare Liposome werden dann gemäss der in «Procedure for Préparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation» von Szoka u.a. (s. weiter vorn) beschriebene Methode hergestellt.

Überschüssiges, nicht eingelagertes Q-Salz wird entfernt, durch Zufügen von SM-2 Bio-Perlen unter Anwendung der in «A New Method for Reconstitution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes» von Vainstein u.a. (s. weiter oben) beschriebenen Technik. Auf diese Weise werden etwa 50 — 80 mg SM-2 Bio-Perlen mit den vorstehend beschriebenen Phospholipiden und Q-Salz inkubiert, während 40 — 60 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln, in einem Endvolumen von 1 ml des Azetatpuffers. Eine quantitative Schätzung zeigte, dass etwa 30—40% des beigefügten Q-Salzes in die phospholipide Doppelschicht eingelagert wurde (300—400 (ig Q-Salz/1 mg PC). Für die Herstellung von beladenen Liposomen mit interessierenden Komponenten werden die gewünschten Komponenten, wie z.B. Arzneimittel, Enzyme, RNS oder DNS, dem Puffer, in welchem die Phospholipide suspendiert sind, beigefügt, wie in «Procedure for Préparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation» durch Szoka u.a. (s. weiter oben) beschrieben.

Das Verfahren zur Herstellung von fusogenen Liposomen wie anhand von Beispiel 1 beschrieben, wird nicht empfohlen, wenn geladene Moleküle in den Liposomen eingeschlossen sind. Unter gewissen Bedingungen und bei einem gewissen pH, bilden alle negativ geladenen Komponenten mit dem quaternären Ammoniumhydroxidsalz einen Komplex und werden zusammen mit diesem ausgefällt. Da das quaternäre Ammoniumhydroxidsalz positiv geladen ist, wird es elektrostatisch mit allen negativ geladenen Molekülen zusammenwirken, wie beispielsweise mit den Nucleinsäuren, z.B. DNS oder RNS, welche bei neutralem pH stark negativ geladen sind. Die Bildung solcher Komplexe zwischen dem positiv geladenen quaternären Ammoniumhydroxidsalz und den negativ geladenen Molekülen vermindert den Einfangwirkungsgrad (Anzahl der Moleküle, welche in jedes Liposom eingeschlossen werden) und die fusogene Aktivität der Liposome. Demgemäss wird in Beispiel 2 eine zweite Technik zur Herstellung von fusogenen Liposomen erläutert, bei welcher ein direkter Kontakt zwischen dem quaternären Ammoniumhydroxidsalz und den eingeschlossenen Molekülen vermieden wird.

Beispiel 2

Einlagern von Q-Salz in bereits hergestellte, beladene Liposome.

5 Beladene Liposome werden wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt oder gemäss weiter oben beschriebenen bekannten und publizierten Methoden. Im Gegensatz zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wird das Q-Salz nicht während der Herstellung der Liposome beigefügt, sondern es 10 wird nach der Herstellung von beladenen Liposomen einer Suspension beigefügt, welche beladene, wiederverschlossene Liposome enthält. Die Inkubation von Q-Salz mit einer Suspension von wiederverschlossenen Liposomen resultiert im Einlagern des hydrophoben Teils des Q-Salz-Moleküls in die Doppelschicht des phospholipiden Liposoms.

Es wird wie folgt vorgegangen: Eine Suspension, enthaltend phospholipide Bläschen (Liposome), hergestellt aus 2 mg PC und 1 mg Cholesterin, suspendiert in 400 ^1 Azetat-2o pufferlösung, wird in ein Reagenzglas enthaltend 3 mg Q-Salz in 20 |il Azetatpuffer eingegeben. Die erhaltene Mischung wird stark umgerührt und nachher unter leichtem Schütteln während 10—15 Minuten inkubiert. Überschüssiges, freies, nichteingelagertes Q-Salz wird durch Adsorption 25 mittels SM-2 Bio-Perlen entfernt, wie weiter oben beschrieben. Eine quantitative Schätzung ergab erneut, dass etwa 30% des beigefügten Q-Salzes in die Hülle des Phospholipids eingelagert wurde.

30 Diese Methode nach Beispiel 2 kann für gewisse Präparate gegenüber jener nach Beispiel 1 von Vorteil sein, indem Moleküle, welche in den Liposomen eingeschlossen sind, im Innern der Liposome eingeschlossen werden, bevor das Q-Salz beigegeben wurde; somit kann keine Interaktion zwi-35 sehen dem eingeschlossenen Material und der zugefügten oberflächenaktiven Substanz stattfinden. Zudem sind die fusogenen Eigenschaften der das Q-Salz tragenden, nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellten Liposome denjenigen der nach der Technik von Beispiel 1 hergestellten Liposomen 40 überlegen.

Die Fähigkeit der aus Phosphatidylcholin und Cholesterin aufgebauten Liposome (PC/Cholesterin-Liposome) wie in Beispiel 2 beschrieben, nämlich eine Zellen-Zellen-Fusion 45 einzuleiten, wurde studiert durch Inkubation mit menschlichen Erythrozyten und mit gezüchteten Hepatomgewebezel-len (HGZ), im Vergleich mit Kontrollen. Q-Salz als Octyl-cresoxy-äthoxyäthyl-dimethyl-benzyl-ammoniumhydroxid; C-Salz als Octylcresoxy-äthyläthoxy-dimethyl-benzyl-50 ammoniumchlorid und B-Salz als Benzyldimethyl-hexadecyl-ammoniumbromid wurden nach der Methode von Beispiel 2 in bereits gebildete Liposome eingelagert. Bei diesen Versuchen wurde entweder freies Q-Salz (5—10 (ig), oder freies C-Salz (5 — 10 p.g), oder freies B-Salz (5 — 10 ng), oder diese 55 quaternären Ammoniummoleküle tragenden Liposome (20 p.g PC) mit einer Zellensuspension (106 Zellen) während 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Zellenagglutination und Zellen-Zellen-Fusion wurden durch Beobachtung mit einem Phasenmikroskop verfolgt. Die Resultate sind in Tabelle I 60 wiedegegeben.

TABELLEI

Charakterisierung von fusogene und nichtfusogene quaternäre Ammoniumsalze tragenden Liposomen

Agglutination

Zellen-Zellen-Fusion

Menschliche Erythrozyten inkubiert mit: PC/Cholesterin Liposomen freiem Q-Salz (OH-Salz)

+

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TABELLE I (Fortsetzung)

Agglutination

Zellen-Zellen-Fusion

Menschliche Erythrozyten inkubiert mit: PC/Cholesterin Liposome, welche Q-Salz tragen (OH "Salz)

freiem C-Salz (CPSalz)

PC/Cholesterin C-Salz (CPSalz)

freies B-Salz

PC/Cholesterin Liposomen, welche B-Salz tragen

HTC inkubiert mit:

PC/Cholesterin Liposomen freiem Q-Salz (OH"Salz)

PC/Cholesterin Liposomen, welche Q-Salz tragen

(OH "Salz)

freiem C-Salz (CPSalz)

PC/Cholesterin Liposomen, welche C-Salz tragen

(CPSalz)

B-Salz

PC/Cholesterin Liposome, welche B-Salz tragen

+ + +

~h +

+ + + + + +

+++

+ ++ +

Die in Tabelle I zusammengefassten Resultate zeigen:

(1) Liposome, zusammengesetzt aus PC/Cholesterin, welche keine quaternäre Ammoniummoleküle enthalten, haben keinerlei Einwirkung auf die Agglutination (Zusammenkleben) oder Zellen-Zellen-Fusion der menschlichen Erythrozyten oder der HGZ-Zellen.

(2) Sämtliche verwendeten quaternären Ammoniummoleküle (Q-Salz, C-Salz und B-Salz), entweder in ihrer freien Form oder in Liposome eingelagert, waren in der Lage, eine Zellen-Zellen-Agglutination einzuleiten. Es wird angenommen, dass dies mit der Bindung der positiv geladenen quaternären Ammoniumsalzmoleküle an die negativ geladenen Zellmembranen zusammenhängt.

(3) Nur das Q-Salz, d.h. das Hydrosalz, entweder in freier Form oder in Liposome eingelagert, war in der Lage, eine Zellen-Zellen-Fusion einzuleiten. Die festgestellte Zellen-Zellen-Fusion durch Q-Salz tragende Liposome war wesentlich ausgeprägter als bei freiem Q-Salz. Die quaternären Ammoniumchlorid- und -bromidsalze vermochten keine Zellen-Zellen-Fusion einzuleiten, dies obwohl sie sich an Zellmembranen binden können, wie aus ihrer Fähigkeit eine Zellen-Zellen-Agglutination herbeizuführen geschlossen werden kann.

Die Fusion von quaternäre Ammoniumhydroxidsalze tragenden Liposomen mit Zellen ergibt sich auch aus ihrer Fähigkeit, ihren Inhalt durch Mikroinjektion in das Zellplasma von tierischen oder pflanzlichen Zellen einzubringen. Es wurden drei Systeme verwendet, um die Fusion von Q-Salz tragenden Liposomen mit lebenden Zellen sowie die Mikroinjektion von deren Inhalt in diese Zellen festzustellen, nämlich:

(1) Die A-Kette des Toxins Ricin wurde in Liposome eingeschlossen und die so beladenen Liposome wurden mit Zellkulturen, beispielsweise HGZ inkubiert. Das Ricin A löst eine Zellproteinsynthese aus und tötet somit Zellen nur ab, wenn es sich im Innern der Zelle befindet. Im Gegensatz zum vollständigen Ricinmolekül (Ricin, welches sowohl A-wie auch B-Untereinheiten enthält), kann die A-Kette des Ricins nicht selbst in die Zellen eindringen. Wenn sie sich somit ausserhalb der Zelle befindet, hat sie keinerlei lethale (tödliche) Wirkung.

30 (2) Die SV40-DNS, nämlich DNS extrahiert aus dem Virus SV40, wurde in die Liposome eingeschlossen. Die mit SV40-DNS beladenen Liposome wurden mit gezüchteten HGZ inkubiert. Die Mikroinjektion von SV40-DNS in die HGZ-Zellen wurde beobachtet, und zwar durch das Auftre-35 ten eines speziellen Proteins, dem SV4o-T-Antigen. Die Synthese von SVto-T-Antigen wird nur eingeleitet, wenn SV40-DNS in das Zytoplasma der Zellen eingeführt wird, von welchem es in den Zellkern eingebracht wird.

40 Es sei auch festgestellt, dass (a) SV4o-T-Antigen nur in lebenden Zellen gebildet wurde, da dazu eine aktive Proteinsynthese notwendig ist; und (b) freie SVw-DNS-Molekü-le, wenn diese mit lebenden Zellen inkubiert wurden, unfähig sind, in die Zellen einzudringen, so dass diese freien Molekü-45 le keine Synthese des T-Antigens bewirken können.

(3) Fluoreszierend markierte Proteinmoleküle, nämlich fluoreszierend markiertes Rinderserum-Albumin RSA, wurde in die Liposome eingeschlossen. Die beladenen Liposome so wurden dann entweder mit pflanzlichen Protoplasten oder einer Suspension von pflanzlichen Zellen inkubiert. Dabei wurde eine durch Fusion hervorgerufene Mikroinjektion beobachtet, indem dem Auftreten intrazellulärer Fluoreszenz gefolgt wurde.

55 (a) Durch Fusion bewirkte Mikroinjektion der A-Kette des Ricins in fusogene Liposome

Die in Tabelle II zusammengefassten Resultate zeigen, dass nur mit der A-Kette des Ricins beladene Liposome, 60 welche zudem quaternäres Ammoniumhydroxidsalz (Q-Salz) eingelagert haben, eine starke Einleitung der Proteinsynthese sowie ein hochgradiges Abtöten in HGZ bewirken. Kein Abtöten wurde bei unbeladenen Liposomen oder mit freien A-Ketten des Ricins festgestellt. Wie feststellbar 65 ist, erfolgte nur eine sehr geringe Abtötung durch Liposome,. welche das quaternäre Ammoniumchloridsalz (C-Salz) tragen, wobei auch keine oder praktisch keine Liposom-Zellen-Fusion erfolgte.

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TABELLE II

Fähigkeit von mit Ricin A beladenen fusogenen Liposomen eine Proteinsynthese aufzulösen und

HGZ Zellen abzutöten

Auslösen der Proteinsynthese (%)

abgetötete HGZ (%)

HGZ inkubiert mit:

PC/Cholesterin Liposome

0

Freie Ricin-A-Kette

5

4

PC/Cholesterin Liposome, beladen mit Ricin A

6

7

PC/Cholesterin Liposome mit eingelagertem Q-Salz (OH--

Salz)

5

8

PC/Cholesterin Liposome, beladen mit Ricin-A-Kette und

mit eingelagertem Q-Salz (OH-Salz)

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PC/Cholesterin Liposome, beladen mit Ricin-A-Kette und

mit eingelagertem C-Salz (Cl~Salz)

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Zuerst wurde die Ricin-A-Kette in PC/Cholesterin Liposome eingeschlossen, unter Anwendung der in «Procedure for Préparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation» von Szoka u.a. (siehe weiter oben) beschriebenen Technik, danach wurde quaternäres Ammoniumsalz (entweder die OH- oder die Cl~ Salze) wie oben beschrieben, in die Hülle der Liposome eingelagert. Bei den Experimenten wurden 10—20 ug Liposome mit 106 Zellen inkubiert, und zwar während 30 Minuten bei 37 °C, wobei während dieser Zeit die Liposome mit den Zellen reagierten. Am Ende der Inkubationsperioden wurden die Zellen gewaschen und in einem Nährmedium während weiterer zwölf Stunden inkubiert, wonach die Proteinsynthese (durch Zugabe von 3H-Leucin) und die Lebensfähigkeit von Zellen (durch Zugabe von

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(b) Durch Fusion bewirkte Mikroinjektion von SV40-DNS

Die Resultate in Tabelle III zeigen, dass fusogene Liposome zum Mikroinjizieren von aktiven Genen (DNS Moleküle) in Kulturzellen, wie beispielsweise HGZ verwendet werden können. Die Experimentierbedingungen und die Inkubation mit HGZ entsprechen jenen, die in Tabelle II für Ricin-A beschrieben wurden. SV40-DNS wurde in Liposome eingeschlossen, und zwar gemäss Beschreibung in «Procedure for Préparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation» von Szoka u.a. (siehe oben). Das Auftreten von SV^-T-Antigen wurde wie oben beschrieben, geschätzt, unter Verwendung von speziellen, fluoreszierend markierten Anti-SVio-T-Antigen Antikörpern.

Trypanblau) geschätzt wurden.

TABELLE III

Fähigkeit von beladenen fusogenen Liposomen (Q-Salz tragende Liposome) zur Mikroinjektion von SV40-DNS

HGZ inkubiert mit SV40-DNS beladenen Liposomen

SV40-T-Antigen positive Zellen (in % aller Zellen)

PC/Cholesterin Liposome

PC/Cholesterin, welche Q-Salz tragen (OH-Salz)

PC/Cholesterin, welche C-Salz tragen (Cl-Salz)

Das spezielle T-Antigen trat im Kern von 10—15% der Zellen auf, welche mit SV40-DNS beladenen und Q-Salz (OH~Salz) tragenden Liposomen inkubiert wurden. Es trat kein T-Antigen in Zellen auf, welche mit SV40-DNS belade-nem, jedoch C-Salz (Cl-Salz) tragendem PC/Cholesterin inkubiert wurden.

(c) Durch Fusion bewirkte Injektion von fluoreszierendem RSA (Rinderserum Albumin) in Petunia Hybrida Pflanzen-Protoplaste und pflanzliche Zellensuspension

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Protoplaste von Zellen der Petunia hybrida wurde gemäss den aus der Literatur bekannten Methoden hergestellt. Fluoreszierendes RSA wurde in die Liposome eingeschlossen, wie bereits für die Ricin-A-Kette beschrieben, wonach Q-Salz in der weiter oben beschriebenen Weise in die Membran der beladenen Liposome eingelagert wurde. Beim Versuch wurden 10—20 ug beladene Liposome mit 5 x 105 Protoplasten oder Pflanzenzellen inkubiert. Nach 30—60 Minuten Inkubationszeit bei 28 °C konnte das Erscheinen intrazellulärer Fluoreszenz unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.

TABELLE IV

Durch Fusion bewirkte Injektion von fluoreszierendem Rinderserum-Albumin in Pflanzenprotoplaste und pflanzlichen Zellensuspension der Petunia Hybrida

Auftreten von intrazellulärer Fluoreszenz (in % aller Zellen)

Petunia Protoplaste, inkubiert mit fluoreszierenden RSA beladenen Liposomen

PC/Cholesterin 0

PC/Cholesterin, welches Q-Salz trägt (OH"Salz) 80

7

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TABELLE IV (Fortsetzung)

Auftreten von intrazellulärer Fluoreszenz (in % aller Zellen)

Petunia Zellensuspension, inkubiert mit fluoreszierenden RSA beladenen Liposomen

PC/Cholesterin 0

PC/Cholesterin, welches Q-Salz trägt (OH ~ Salz) 60

Aus den Resultaten in Tabelle IV geht hervor, dass die Q-Salz (OH-Salz) tragenden Liposome ihren Inhalt ebenfalls is durch Mikroinjektion in Pflanzenprotoplaste einbringen können. Das Auftreten von Fluoreszenz kann nur von der Fusion der beladenen Liposome mit den Pflanzenprotopla-sten herrühren. Jedes andere Verfahren würde zu einer anderen Erscheinungsform der Fluoreszenz führen. Die Resultate in Tabelle IV zeigen, dass zusätzlich zur Fusion (oder Mikroinjektion) mit Pflanzenprotoplasten die beladenen Liposome auch fähig waren, mit pflanzlichen Zellen zu fusionieren, bzw. ihren Inhalt durch Mikroinjektion in diese Zellen einzubringen, welche von einer Zellwand umgeben sind. 25 Durch die Präsenz von hochaufgeladenem Q-Salz, scheinen die Liposome in der Lage zu sein, durch die Zellwand durchzudringen und mit der Zellmembrane zu fusionieren.

Anwendung der ein quaternäres Ammoniumhydroxidsalz 30 tragenden Liposome

Bisher wurde die Herstellung der quaternäre Ammoniumhydroxidsalze enthaltenden Liposome sowie die Fähigkeit der Liposome, welche in der Bläschenmembrane quaternäres Ammoniumhydroxidsalz eingelagert haben, mit Zellen 35 zu fusionieren und eine Zellen-Zellen-Fusion auszulösen und den Inhalt der Bläschen durch Mikroinjektion in die Zelle einzubringen, näher beschrieben. Nachstehend seien verschiedene Anwendungen von erfindungsgemässen Liposomen erläutert. 40

(1) Verwendung des freien Q-Salzes (OH-) oder der Liposome, welche Q-Salz (OH-) tragen, als Reagens zur Auflösung von Zellen-Fusion.

Die Zellen-Zellen-Fusion bei tierischen Zellen mittels der beschriebenen Liposome ist von allergrösster Wichtigkeit für 45 das Studium des Gen-Verhaltens. Ferner hat die Pflanzen-protoplast-Fusion verschiedene kommerzielle Anwendungen, welche zur Entwicklung neuer Pflanzensorten mit verbesserten Eigenschaften führen können.

(2) Verwendung von fusogenen Liposomen zur Mikroin- 50 jektion von verschiedenen Komponenten in tierische und pflanzliche Zellen einer Kultur.

Beladene, fusogene Liposome können für die Mikroinjektion von DNS, RNS Proteinen (Enzyme, Hormone) und Arzneimittel in Zellen einer Kultur verwendet werden. Sie 55 können zusätzlich für die Mikroinjektion von Organellen oder anderen Komponenten oder Molekülen, welche in Liposome eingeschlossen werden können, verwendet werden.

Die Mikroinjektion von DNS, RNS oder Organellen in Zellen, insbesondere in Pflanzenprotoplaste oder pflanzliche 60 Zellen, findet eine wichtige kommerzielle Anwendung, wie auch das gesamte Gebiet der Gentechnologie im Zusammenhang mit pflanzlichen oder tierischen Zellen. Darüberhinaus, gestützt auf Versuche mit pflanzlichen und tierischen Zellen, sind ein quaternäres Ammoniumhydroxidsalz tragende Li- 65 posome in der Lage, ihren Inhalt durch Mikroinjektion in jegliche Zellen einzubringen, mit denen sie inkubiert werden können. Somit können diese Liposome mit Bakterien, Hefe und Algenprotoplasten fusionieren.

(3) Verwendung von fusogenen Liposomen zur Abgabe verschiedener Komponenten in Zellen in vivo, namentlich in das Gewebe oder Zellen von lebenden Tieren.

Fusogene Liposome können nach deren Injektion in Versuchstiere oder Menschen als Träger für die Abgabe von Arzneimitteln, Hormonen oder Proteinen, wie beispielsweise Enzyme oder DNS, verwendet werden. Diese Methode kann bei der therapeutischen Behandlung mit Arzneimitteln, Enzymen oder Genen angewendet werden. Fusogene Liposome sind jedoch als biologische Träger weit wirksamer als nichtfusogene Liposome, da sie ihren Inhalt direkt in das Zyto-plasma der Zellen injizieren.

(4) Verwendung von fusogenen Liposomen für die Entwicklung eines neuen, isotopfreien, empfindlichen Testsystems für diagnostische Zwecke.

Quaternäre Ammoniumhydroxidsalze tragende Liposome können mit anderen Liposomen fusionieren. Die Fusion zwischen Liposomen führt zum Austritt (Leck) ihres Inhalts. Dieser Austritt beruht auf der Interaktion und der Fusion zwischen den Liposomen. Dank dem Vorhandensein von positiv geladenen quaternären Ammoniumhydroxidsalz-Molekülen, erfolgt keine Interaktion zwischen Liposomen, welche diese quaternären Ammoniummoleküle tragen, und sie stossen sich gegenseitig ab. Wie oben angeführt, können sie nur zusammenwirken und fusionieren mit Liposomen, deren quaternäres Ammoniumhydroxidsalz austritt. Irgendwelche Molekülpaare, deren Moleküle sich mit hoher Affinität anziehen, werden allerdings Liposome, welche das quaternäre Ammoniumhydroxidsalz tragen, dazu bewegen, untereinander zu fusionieren, indem die Abstosskräfte der positiven Ladung überwunden werden. Wenn somit ein spezifisches Antigen in die Membrane von Liposomen, welche das quaternäre Ammoniumhydroxidsalz tragen, eingelagert ist, wird ein gegen dieses Antigen präparierter Antikörper die Liposome dazu zwingen, miteinander zusammenzuwirken. Diese Interaktion zwischen quaternäres Ammoniumhydroxidsalz tragenden Liposomen wird zur Fusion und der Abgabe des Inhalts der Liposome führen. Jede quantitative Beurteilung des Abgabeprozesses (Abgabe von fluoreszierendem Farbstoff oder eines anderen Reagenses) ist ein Mass für die Interaktion Antigen-Antikörper. Somit kann die Fusion zwischen quaternäres Ammoniumhydroxidsalz tragenden Liposomen dazu verwendet werden, die Interaktion zwischen dem Antikörper und seinem Antigen oder dem Hormon und seinem entsprechenden Empfänger quantitativ zu beurteilen. Dieses Verfahren kann somit dazu verwendet werden, das Vorhandensein auch von kleinsten Mengen Antigen oder Hormon in irgendeinem biologischen Fluid festzustellen und quantitativ abzuschätzen.

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Claims

668005

PATENTANSPRÜCHE

1. Fusogenes Liposom, dadurch gekennzeichnet, dass in die Membrane des Liposoms ein quaternäres Ammoniumhy-droxidsalz in einer solchen Menge eingelagert ist, dass das Liposom fusogen ist.
2. Liposom nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternäre Ammoniumhydroxidsalz aus der Gruppe bestehend aus Cetyl-benzylidimethyl-ammoniumhydro-xid, Hexadecyltrimethyl-ammoniumhydroxid, Cetyltrime-thyl-ammoniumhydroxid, Di-Isobutyl-cresoxyäthoxy-äthyl-dimethylbenzyl-ammoniumhydroxid, Di-Isobutyl-phenoxy-äthoxyäthyl-dimethylbenzyl-ammoniumhydroxid, Methyl-dodecylbenzyl-trimethyl-ammoniumhydroxid, Methyl-dode-cylbencyl-trimethyl-ammoniumhydroxid, Methyl-dodecyl-xylen-bis-(trimethyl-ammoniumhydroxid) und Octylcresoxy-äthoxyäthyl-dimethyl-benzyl-ammoniumhydroxid ausgewählt ist.
3. Liposom nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternäre Ammoniumhydroxidsalz Octylcresoxy-äthoxyäthyl-dimethyl-benzyl-ammoniumhydroxidist.
4. Liposom nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Phospholipid enthält, das aus der Gruppe bestehend aus Phosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcho-lin, Dioleoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidyl-cholin, Distearoylphosphatidylcholin, Sphingomyelin, Cholesterin oder Mischungen davon ausgewählt ist.
5. Liposom nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass darin DNS oder ein DNS-Fragment eingeschlossen ist.
6. Liposom nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass darin eine pharmazeutisch aktive Verbindung oder Zusammensetzung eingeschlossen ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines fusogenen Liposoms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in die Membrane des Liposoms ein quaternäres Ammoniumhydroxidsalz eingelagert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternäre Ammoniumhydroxidsalz aus der Gruppe bestehend aus Cetyl-benzyldimethyl-ammoniumhydro-xid, Hexadecyltrimethyl-ammoniumhydroxid, Cetyltrime-thyl-ammoniumhydroxid, Di-Isobutyl-cresoxy-äthoxy-äthyl-dimethylbenzyl-ammoniumhydroxid, Di-Isobutyl-phenoxy-äthoxy-äthyl-dimethylbenzyl-ammoniumhydroxid, Methyl-dodecylbenzyl-trimethyl-ammoniumhydroxid, Me-thyl-dodecylxylen-bis-(trimethyl-ammoniumhydroxid) und Octylcresoxy-äthoxyäthyl-dimethyl-benzyl-ammoniumhy-droxid ausgewählt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als quaternäres Ammoniumhydroxidsalz Octylcresoxy-äthoxyäthyl-dimethyl-benzyl-ammoniumhydroxid ausgewählt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass quaternäres Ammoniumhydroxidsalz während der Bildung des Liposoms eingelagert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das quaternäre Ammoniumhydroxidsalz nach der Bildung des Liposoms in die Liposommembrane eingelagert wird.