IT8683340A1 - Liposomi fusogenici e metodo per prepararli - Google Patents
Liposomi fusogenici e metodo per prepararliInfo
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Description
DOCUMENTAZIONE
RILEGATA
gip 86-5461
Classe Internazionale : PJcsA K
Descrizione del trovato avente per titolo:
"LIPOSOMI FUSOGENICI E METODO PER PREPARARLI"
a nome INTERNATIONAL GENETIC SCIENCES PARTNERSHIP a Jackson, Mississippi (STATI UNITI D'AMERICA)
dep . il 3 APR. 1986 al n . 83340 A /86
RIASSUNTO
Vengono descritte vescichette fosfolipide (liposomi) contenenti un sale di idrossido di
ammonio quaternario nelle membrane delle vescichette .
Dette vescichette fosfolipide, contenenti il sale
di idrossido di ammonio quaternario nelle loro membrane ed aventi inoltre l'abilit? di attaccarsi
alle cellule, si fonderanno con una membrana
0 MH piasmatica ed indurranno la fusione tra cellule ?N R offrendo un modo conveniente per trasferire in una
cellula una sostanza come un farmaco.
CAMPO DI APPLICAZIONE
Questo trovato si riferisce a liposomi e pi? particolarmente a liposomi contenenti nelle loro membrane un sale di idrossido di ammonio quaternario
che permette a detti liposomi di fondersi con le
cellule di animali o di piante e di microiniettar I mandatario Bl STUD!b*"^^ P. S.a.s. Cavedalis 6 2 - 33100 UDINE 2 gip 86-5461
il proprio contenuto in dette cellule.
SFONDO E TECNICA NOTA
Generalmente i liposomi, come intesi in questo testo, sono delle vescichette composte di molecole fosfolipide .
E' risaputo che i liposomi offrono un mezzo per introdurre farmaci, o altre sostanze regolatrici, nella cellula di un animale, o di una pianta, per modificarne la fisiologia cellulare.
Dal momento in cui ci si ? resi conto che i liposomi possono svolgere un importante ruolo nell'introduzione in una cellula di farmaci o sostanze capaci di modificare la fisiologia cellulare della stessa, si sono proposti vari metodi per creare o preparare liposomi, inclusi liposomi con un grande spazio interno acquoso per imprigionare un farmaco o altre molecole modificatrici che dovr? essere trasferito come descritto nel "Procedure for preparation of liposome with large Internai Aqueous space and high capture by reversephase evaporation" (Procedimento per la preparazione di liposomi con grande spazio interno acquoso ed alta cattura tramite evaporazione a fase inversa) di Szoka e Papahad jopoulos , Proc. Nati. Acad. Sci., USA 75, 1978 pagine 4194-4198. Il mandatari?
BRUNA POCECCO STUDiO G. L. P. S.a.s.
P.le Cavedalis, 6 2 - 33100 UDINE 3 gip 86-5461
1 Altri metodi hanno lo scopo primario di
2 migliorare i procedimenti per imprigionare un
3 farmaco, o simile, nel liposoma, come descritto in
4 "Dehydration-Rehydration Vesicles: A simple method
5 for high yield drug entrapment in Liposomes"
6 (Vescichette di disidratazione e reidratazione:
7 Metodo semplice per l'imprigionamento di farmaci ad
8 alto rendimento in liposomi), di Kirby &
9 Gregoriadis, Bio/Technology, Novembre 1984, pagine
0 979-984.
1 Il brevetto US 4,235,871 descrive un metodo per
2 incapsulare numerose sostanze biologicamente attive
3 entro vescichette sintetiche a lipidi lamellari,
4 fornendo una mistura lipida in un solvente organico
5 ed una mistura acquosa della sostanza per incapsula-6 re ed emulsionare la mistura ottenuta, per rimuovere
0?V ? ??..
7 il solvente organico e sospendere in acqua il gel
8 risultante .
V ?
9 Inoltre, in vari brevetti, si sono suggerite
diverse applicazioni per liposomi come mezzo di re 0
1 trasferimento .
2 Quindi, il suddetto brevetto US descrive parecchi
3 composti attivi e composizioni incapsulate nel
4 liposoma da incorporare nelle cellule.
5 Il brevetto US 4,394,448 riguarda specificatamerfl-mandatario BRUNA POCECCO STUDIO G.L.P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE 4 gip 86-5461
te l'inserimento dell'acido desossiribonucleico
2 (DNA) o frammenti dello stesso in una cellula
3 vivente, cos? che il DNA o frammento venga incapsulato in una vescichetta lipida e detta
5 vescichetta venga messa a contatto con la cellula,
6 provocando cos? l'inserimento.
7 I brevetti US 4,199,565, 4,201,767, 4,261,975 e
8 4,235,877 descrivono 1'incorporamento di un antigene
9 virale o batterico nei liposomi che contengono un
0 tensioattivo caricato positivamente contenente un
1 animino che pu? essere un sale di alogenuro di
2 ammonio quaternario.
3 II brevetto US 4,483,929 descrive una reattivo di
4 liposoma immunoreagente da usare nella determinazio-5 ne di un composto chimico capace di produrre una
6 reazione immunospecifica con un anticorpo noto.
?S.COMA, 7 In tutte le applicazioni conosciute al richieden / 8 te, anche se ? stato dimostrato che i liposomi
9 fosfolipidi sono capaci di introdurre il loro
0 contenuto nelle cellule coltivate oltre che nelle
1 cellule di tessuti specifici di animali interi, ?
2 stato provato che questi liposomi sono dei prtatori
3 relativamente inefficaci.
4 Si pensa che i liposomi della tecnica gi? nota
5 introducono nelle cellule le sostanze portate, cft9i?ndatario BRUMA FOCECCO STUDIO C.L.P. S.a.s.
- 5 gip 86-5461
il farmaco, con processi simili a quelli endocitici.
Perci? solo una piccola percentuale delle
molecole imprigionate nei liposomi raggiunge il citoplasma delle cellule riceventi.
Inoltre, quando si iniettano i liposomi negli
animali come pure nelle persone, si ? trovato che,
sino ad un$ data concentrazione, i liposomi fosfolipidi sono inerti e non immunogenici .
Solamente con concentrazioni relativamente alte i
liposomi sono immunogenici e tossici.
Questi liposomi della tecnica gi? nota, anche se
capaci di agglutinare le cellule, non sono fusogenici e non subiscono e sono incapaci di
fondersi con una membrana piasmatica o di indurre la
fusione tra cellule. \<?N*cow*, Si ? stabilito inoltre che gli inviluppi di certi
virus animali, come quelli ottenuti dal virus
Sendai , sono fusogenici e si ? dimostrato che sono
dei portatori efficienti per l'introduzione di
molecole nelle cellule coltivate, come riferito in
"A new method for reconstitution of highly fusogenic
Sendai virus envelopes" (Nuovo metodo per la ricostituzione di inviluppi di virus Sendai, altamente fusogenici) di Vainstein et al., Biochimica et Biophysica Acta, 733 (1984), paginy mandatarT?
BRUNA POCECCO STUDIO G.L.P. S.a.s. P.le Cavedalis 6 2 - 331 6 gip 86-5461
1 181-1 88.
2 L'attivit? fusogenica di questi virus si pensa
3 sia dovuta alla presenza di glicoproteine virali
4 specifiche negli inviluppi dei virus.
5 Tuttavia pare che la presenza di una proteina
6 negli inviluppi fusogenici virali renda immunogeni-7 che queste vescichette, e quindi poco pratiche per
8 uso in vivo. L'iniezione di inviluppi virali negli
9 animali induce la formazione di anticorpi antivirali
0 specifici, fatto che limita il loro uso come portato
1 biologico in vivo.
2 I testi citati hanno stabilito quindi che,
3 nonostante le vescichette fosfolipide siano state
4 riconosciute come un mezzo potenzialmente importante
5 per incorporare nelle cellule i farmaci ed altre
6 sostanze modificatrici di cellule, per le limitazio-7 ni dei liposomi nella tecnica gi? nota, questo
8 metodo ? stato sperimentato con successo limitato.
9 SCOPI PRIMARI E DESCRIZIONE GENERALE DEL TROVATO
0 Quindi, lo scopo primario del presente trovato ?
1 quello di provvedere liposomi che siano fusogenici e !N e - fa 2 che si fondano con una membrana piasmatica ed
3 inducano la fusione tra cellule.
4 Un altro scopo primario del trovato ? di fornire
5 un metodo per produrre liposomi che si fondano c?)nmandatario BRUNA FQCECCO STUDiO G.L.P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE - 7 gip 86-5461
1 una membrana piasmatica ed inducano la fusione tra
2 cellule .
3 Gli scopi del presente trovato vengono raggiunti incorporando un sale di idrossido di ammonio
5 quaternario nella membrana di un liposoma o durante
6 la preparazione o dopo la sua preparazione.
7 Si ? trovato che la presenza del sale di
8 idrossido di ammonio quaternario nella membrana
9 della vescichetta fosfolipida le permette di
0 fondersi con la membrana piasmatica inducendo la
1 fusione tra le cellule.
2 Se la vescichetta viene riempita con un farmaco o
3 altra sostanza di modificazione cellulare, il
4 contenuto di detta vescichetta verr? microiniettato
5 nella cellula dell'animale o della pianta.
6 L'abilit? del sale di idrossido di ammonio
7 quaternario di convertire le vescichette fosfolipide
8 da non fusogeniche a fusogeniche ? particolarmente
9 sorprendente, in quanto i sali di ammonio quaterna-0 rio, eccetto quelli di idrossido, producono delle
Jf A ,\ 1 vescichette non fusogeniche.
-V | P 2 Quindi, si ? trovato che le vescichette
< ?-;?.?? 3 fosfolipide contenenti sali di alogenuro di ammonio
4 quaternario , sali di acetato di ammonio quaternario
5 e simili , non si fondono con una cellula llenandatario BRUNA POCECCO STUDIO G. L. P. S.a.s.
- 8 gip 86-5461
1 conseguentemente non microiniet tano il contenuto
2 delle vescichette nella cellula.
3 Queste vescichette reagiscono in modo simile a
4 quelle non fusogeniche conosciute, ed apparentemente
5 incorporano nelle cellule il loro contenuto tramite
6 un processo simile a quello endocitico.
7 D'altra parte, le caratteristiche fusogeniche dei
8 liposomi del presente trovato offrono un sistema
9 conveniente per incorporare qualsiasi sostanza di
0 modificazione cellulare capace di essere imprigiona-1 ta in una vescichetta fosfolipida direttamente in
2 una cellula di piante o animali in dosi sostanzial-3 mente quantitative.
4 Il sale di idrossido di ammonio quaternario da
5 incorporare nella parte o membrana della vescichetta
6 fosfolipida, ha la seguente formula:
R, HA 7
8 R?? N _s OH ? 9 R A 0 dove ? un grande gruppo alchilico o una
1 combinazione di radicale alchilico e radicale
2 arilico, cos? da impartire al sale delle caratteri-3 stiche tensioattive.
4 R? , R? ed R? sono radicali alchilici a catena
2 3 4
. - . . , _ _ ^ . , Il mandatario 5 ramificata con da 1 a 20 atomi di carbonio , rorECCO STUDIO G. L. P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE 9 gip 86-5461
radicale arilico, o ed assieme possono essere radicali eterociclici a 5 o 6 elementi, come ad esempio pirrolo o pridina.
I composti particolarmente preferiti sono i tensioattivi come: cetil-benzildimetil-idrossido di ammonio, esadeciltrimetil-idrossido di ammonio, cetiltrimetil-idrossido di ammonio, di-sobutilcresossi etossi etil-dimetilbenzil-idrossido di ammonio, di-isobutil-fenossi etossi etil-dimetilbenzil-idrossido di ammonio, metil-dodecilbenziltrimetil-idrossido di ammonio, metil-dodecil-xilene
bis (trimetil-idrossido di ammonio), N-alchil-( ,
C? ?, C? ) dimetilbenzil-idrossido di ammonio ed
14 16
ottilcresossi etossietil-dimetil-benzil-idrossido di ammonio.
E' essenziale che il sale di idrossido di ammonio quaternario abbia delle caratteristiche tensioattive \V?? e contenga il radicale idrossilico cos? da impartire .?_ f alla vescichetta fosfolipida delle caratteristiche c fusogeniche.
La quantit? di sale di idrossido di ammonio quaternario contenuto nelle vescichette generalmente varier? da circa 3 a 750 pg/? mg di fosfolipidi e, preferibilmente, da circa 50 a 250 pg di sale di idrossido di ammonio quaternario per ogni 1 mg mandatar,? BRUNA TOCECCO STUDIO G,L.P. S.a.s.
P.le Cavedafis, 6/2 - 33100 UDI E 10 gip 86-5461
1 fosfolipide) .
2 I liposomi utili, secondo il presente trovato,
3 possono essere uno qualsiasi dei liposomi della
4 tecnica gi? nota.
5 I liposomi illustrativi includono lipide naturale
6 e sintetico contenente fosfocolina con una catena di
7 acido grasso avente da 12 a 20 atomi di carbonio e
8 con una catena di acido grasso avente almeno 8 atomi
9 di carbonio, esemplificato da dimiristoilfosfati-0 dilicolina, dioleoilf osfatidilcolina , dipalmitoilf o-1 sfatidilcolina , distearoilf osf atidilcolina ,
2 fosf atidicolina e sfingomielina , oltre che a
3 colesterolo e simili.
4 I liposomi possono essere preparati con uno
5 qualsiasi dei metodi pubblicati ben noti , come
6 "sonicazione" (sonication ) delle sospensioni
7 fosfolipide, evaporazione inversa o disidratazione
8 degli strati secchi delle molecole fosfolipide.
9 Delle tecniche note adatte vengono descritte in
so 0 "Procedure for Preparation of liposomes with large o 1 internai aqueous space and high capture by
2 reversephase evaporation" secondo il suddetto testo
3 di Szoka et al., "Dehydration-Rehydration vescicles:
4 A simple method for high yield drug entrapment in
. ? , . ? . , ? Il mandatario
5 liposomes" secondo il testo gi? citato di Kirby 8L p^cECCO STUD?O C.L.P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDIN - 11 gip 86-5461
Gregoriadis, oltre che ad altre tecniche note, come
l'uso di detergenti (vedi Szoka e Papahadjopoulos, Rivista Annuale di biofisica e bioingegneria, 9
(1980) pagine 467-480).
Inoltre, le sostanze modificatrici di cellule che
possono essere imprigionate entro i liposomi e
possono essere microiniettate nelle cellule di
animali o piante tramite fusione con i liposomi del presente trovato, potranno essere una qualsiasi
delle sostanze suggerite precedentemente.
Si ? trovato che le sostanze che possono essere incapsulate nel liposoma e micro-iniettate in una cellula, secondo il presente trovato, includono DNA
e frammenti di DNA; composti farmaceuticamente
attivi e composizioni degli stessi, come i carboidrati, nucleotidi, polinucleotidi ottenuti sia naturalmente che sinteticamente; vaccini influenzali
ed antigeni oltre che ad altre sostanze che possono co influenzare la fisiologia cellulare di animali e ? '.i \ piante .
IN REALIZZAZIONI ODIERNE PREFERENZIALI DEL TROVATO
Dopo aver descritto il trovato in termini generali , i seguenti due esempi illustreranno le preparazioni preferenziali odierne dei liposomi fusogenici secondo il presente trovato. Ilmandatario BRUNA POCECCO STUDiO C.L.P. S.a.s.
- 12 - gip 86-5461
ESEMPIO 1
Incorporamento di sale di idrossido di
ammonio quaternario in membrane di liposomi
durante la preparazione degli stessi
Dalla loro soluzione di cloroformio vengono
essiccati 2 mg di un fosfolipide non caricato,
fosfotidilcolina (PC), ed 1 mg di colesterolo.
Lo strato secco ottenuto dal PC e dal colesterolo
viene solubilizzato con 1 mi di etere etilico, e la
soluzione ottenuta viene aggiunta ad una sospensione
contenente 2 mg di ottilcresossi etosssietile
dimetile benzile idrossido di ammonio (sale Q) in
tampone acetato, ad un pH di 7,0.
La sospensione ottenuta viene quindi fatta
turbinare vigorosamente e sonicata brevemente in un
bagno sonicatore .
Quindi vengono preparati grandi liposomi unilamellari ad evaporazione inversa, secondo il
(^???,:>??..? metodo descritto nel suddetto testo di Szoka ?<?\ "Procedure for preparation of liposomes".
Viene rimosso l'eccesso non incorporato di sale-Q aggiungendo delle Bio-perle SM-2 ed utilizzando la
tecnica descritta nel testo summenzionato di
Veinstein "A new method for reconstitution etc. ".
Cos? , circa 50-80 mg di Bio-perle SM-2 vengondl mandatario BRUNA TOCECCO STUDiQ G. L. P. S.a.s.
- 13 gip 86-5461
1 incubate, agitando gentilmente, con i suddetti
2 fosfolipidi e con sale-Q a temperatura ambientale
3 per 40-60 minuti, in un volume finale di 1 mi di
4 tampone acetato.
5 Una stima quantitativa ha rivelato che circa il
6 30-40% del sale-Q aggiunto ? incorporato nello
7 strato di spessore bimolecolare fosfolipide (300-400
8 ^g di sale-Q/1 mg PC).
9 Per la preparazione dei liposomi caricati con
0 qualsiasi componente di interesse, i componenti
1 desiderati, come i farmaci, gli enzimi, RNA o DNA,
2 vengono aggiunti al tampone in cui sono sospesi i
3 fosfolipidi, come descritto nel suddetto testo di
4 Szoka "Procedure for preparation of liposomes,
5 etc. ".
6 Il metodo per la preparazione dei liposomi
7 fusogenici, come esposto nell'Esempio 1, non ?
8 consigliabile quando le molecole caricate sono
9 imprigionate entro i liposomi stessi.
0 In alcune condizioni ed ad un certo pH, qualsiasi
1 componente caricato negativamente sar? complessato
0' 2 al sale di idrossido di ammonio quaternario e con
3 questo precipitato.
4 Poich? il sale di idrossido di ammonio quaterna-5 rio ? caricato positivamente , interagir? elettrostfk^andatario BRUNA FOCECCO STUDIO G. L. P. S.a.s.
- 14 - gip 86-5461
1 ticamente con qualsiasi molecola caricata negativa-2 mente, come gli acidi nucleici esemplificati con DNA 3 o RNA che sono altamente caricati negativamente ad 4 un pH neutro.
5 La formazione di tali complessi tra il sale di 6 idrossido di ammonio quaternario caricato positiva-7 mente e le molecole caricate negativamente 8 diminuisce l'efficienza dell'imprigionamento (numero 9 delle molecole imprigionate entro ogni liposoma ) e 0 l'attivit? fusogenica dei liposomi .
1 Quindi, nell'Esempio 2, viene descritta una 2 seconda tecnica per la preparazione di liposomi 3 fusogenici, dove viene evitato il contatto diretto 4 tra il sale di idrossido di ammonio quaternario e le 5 molecole imprigionate.
6 .ESEMPIO 2
7 Inserimento del sale-Q in liposomi caricati 8 gi? preparati
9 I liposomi caricati vengono preparati come 0 descritto nell'Esempio 1 o secondo i metodi 1 pubblicati precedentemente descritti.
2 Tuttavia, al contrario del metodo descritto 3 nell'Esempio 1, il sale-Q non viene aggiunto durante 4 la preparazione dei liposomi ma aggiunto dopo la 5 preparazione di liposomi caricati ad una sospensioni?nandatano BRUMA TOCECCO STUDIO G. L.P. S.a.s.
edalis 6 2 - 3310 D - 15 gip 86-5461
1 contenente liposomi caricati e risigillati. c
2 L'incubazione del sale-Q con una sospensione di'
3 liposomi risigillati d? 1'incorporamento della parte'?'1
4 idrofobica della molecola del sale-Q nello strato
5 spessore bimolecolare del liposoma fosfolipido. -6 Il processo ? il seguente: una sospensione,
7 contenente vescichette fosfolipide (liposomi*)0
8 preparata con 2 mg di fosfotidilcolina ed un mg di
9 colesterolo, sospesi in 400 pi di tampone acetat?,?
10. viene aggiunta ad una provetta contenente 3 mg di
11 sale-Q in 20 pi di tampone acetato. -??
12 La mistura ottenuta viene fatta turbinar^ '
13 vigorosamente, dopodich? ? incubata, agitando <
14 leggermente, per 10-15 minuti a 37?C.
15 L'eccesso non incorporato libero di sale-Q viene
16 rimosso tramite assorbimento nelle Bio-perle SM-2,
17 come descritto precedentemente. -c
18 Una stima quantitativa ha rivelato nuovamente che
-?" - "v' tfn V 19 circa il 30% del sale-Q aggiunto ? stato incorporalo ( sS(r A )c I 20 nello strato di spessore bimolecolare del fosfolipi \ \? . ^ Vj. ? :: / '
J t 21 do .
22 Questo metodo dell'Esempio 2 pu? essere
23 vantaggioso per alcune preparazioni rispetto
24 all'Esempio 1, in quanto le molecole incluse entro^i c
25 liposomi sono in questi imprigionate pYimai mandatario BRUNA FOCECCO STUCCO G. L. P. S.a.s.
16 gip 86-5461
1 dell'aggiunta del sale-Q, quindi non ? possibile si
2 verifichi l'interazione tra la sostanza inclusa ed
3 il tensioattivo aggiunto.
4 Inoltre, le propriet? fusogeniche dei liposomi
5 contenenti sale-O, preparati secondo il metodo
6 dell'Esempio 2, sono superiori a quelle dei liposomi
7 preparati con la tecnica dell'Esempio 1.
8 L'abilit? dei liposomi composti da fosfatidilco-9 lina e colesterolo (liposomi di PC/colesterolo),
0 come descritta nell'Esempio 2, di indurre la fusione
1 tra cellule ? stata studiata incubandoli con
2 eritrociti umani e cellule coltivate di tessuto
3 epatomatico (HTC ) paragonandoli con prove di
* 4 controllo.
tot 5 Il sale-Q, che ? ottilcresossi etossietile
6 dimetile benzile di idrossido di ammonio; sale-C che
7 ? ottilcresossi etossietile dimetilbenzil idrossido
8 di ammonio; sale-C che ? ottilcresossi etossietildi-9 metilbenzil cloruro di ammonio, e sale-B che ?
0 benzildimetilesadecil bromuro di ammonio sono stati
1 incorporati in liposomi gi? formati, come descritto
2 nell 'Esempio 2.
3 In questi esperimenti sono stati incubati o
4 sale-Q libero (5-10 /ig) o sale-C libero (5-10 yig) o
5 sale-B libero (5-10 ug ) o liposomi contenenti queste^ mandatario BRUNA FQCECCO STUDIO G. L. P. S.a.s.
1 7 gip 86-5461
molecole di ammonio quaternario (20 /ug di fosfotig dilcolina) con una sospensione di cellule (10 cellule) per 15 minuti a 370?C.
L'agglutinazione delle cellule e la funzione tra cellule sono state eseguite osservandole sotto microscopio di fase.
I risultati sono tabulati nella Tabella I .
CO Mfy rv
Il mandatario BRUNA FQCECCO STUDIO G. L. ?. S.a.s. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE 1 8 gip 86-5461
TABELLA I
Caratterizzazione dei liposomi contenenti sali fusogenici e non fusogenici di ammonio quaternario
Agglutinazione Fusione tra cellule
Eritrociti umani
incubati con:
Liposomi di PC/colesterolo
Sale-Q libero (Sale OH ) Liposomi PC/colesterolo ++ contenenti sale-Q (sale OH )
Sale-C libero (sale-Cl )
Sale-C PC/ colesterolo
(Sale Cl")
Sale-B libero
Liposomi di PC/colesterolo
contenenti sale-B
0 1N t ' Celleule coltivate di tessuto epatomatico (HTC ) incubate con :
Liposomi PC/colesterolo
Sale-Q libero (sale OH ) Liposomi PC/colesterolo
contenenti sale-Q (sale OH ) ++
Sale-C libero (sale Cl )
Liposomi PC/colesterolo
contenenti sale-C (sale Cl )
Sale-B
Liposomi PC/colesterolo
contenenti sale-B
Il mandatario BSUNA roCECCO STUDJO G. L. P. S.a.s. P.le Cavedalis, ?/2 - 33100 UDINE - 19 gip 86-5461
1 I risultati sommarizzati nella Tabella I
2 stabiliscono che:
3 1) I liposomi composti di PC/colesterolo ma non
4 contenenti alcuna molecola di ammonio quaternario
5 non hanno avuto alcun effetto sulla agglutinazio-6 ne o sulla fusione tra cellule degli ertrociti
7 umani o sulle cellule HTC.
8 2) Tutte le molecole di ammonio quaternario usate
9 (sale-Q, sale-C, sale-B ) sia nella loro forma
0 libera che incontrati in liposomi, sono state
1 capaci di indurre l'agglutinazione tra cellule.
2 Si crede che ci? sia dovuto all'adesione delle
3 molecole del sale di ammonio quaternario caricate
4 positivamente alle membrane delle cellule
5 negativamente .
6 3) Solo il sale-Q, cio? il sale di idrossido, sia
o\> .C0/^ 7 nella forma libera che incorporato nei liposomi,
8 ? stato capace di indurre la fusione tra cellule.
9 L'induzione della fusione tra cellule tramite
0 liposomi contenenti sale-Q ? stata molto pi? alta
1 di quella con il sale-Q libero.
2 I sali di cloruro di ammonio quaternario o di
3 bromuro di ammonio quaternario non hanno indotto
4 la fusione tra cellule nonostante essi siano
5 capaci di unirsi a membrane piastomatiche , c?b^anda tarlo BRUNA ? SCEICCO STUDIO G. L P. S.a.s. P.Ie C
20 gip 86-5461
1 si pu? osservare dalla loro abilit? di indurre
2 l'agglutinazione tra cellule.
3 La fusione di liposomi contenenti un sale di
4 idrossido di ammonio quaternario con cellule viene
5 dimostrata anche dalla loro abilit? di microinietta-6 re il loro contenuto nel citoplasma delle cellule di
7 animali e piante. Si sono usati tre sistemi per
8 accertare la fusione di liposomi contenenti sale-Q
9 con, e la microiniezione dei loro contenuti in,
0 cellule viventi, come segue:
1 1) La tossina catena di ricina-A ? stata inclusa
2 entro i liposomi e questi liposomi caricati sono
3 stati incubati con cellule in cultura come HTC.
4 La ricina-A inibisce la sintesi della proteina
5 delle cellule e di conseguenza uccide le cellule
6 solo quando presente entro la cellula.
7 Al contrario dell'intera molecola di ricina
8 (ricina contenente subunit? sia A che B), la
9 catena di ricina-A non pu? da sola penetrare
?,??^? 0 nelle cellule. 7 n 1 Quindi, quando presente fuori dalle cellule, non
2 possiede alcun effetto letale.
3 2) L'SV^Q-DNA, cio? DNA estratto dal virus SV , ?
4 stato incluso entro i liposomi. I liposomi
5 caricati con SV -DNA sono stati incubati con uft?nanc,atarl0
40 BRUMA FOCCCCO STUBSO G.L. ?. S.a.s.
- 21 gip 86-5461
1 cultura di HTC.
2 E' stata osservata la microiniezione dell'SV -40
3 DNA nelle cellule HTC con l'apparizione di una
4 specifica proteina, 1'antigene SV^Q-T.
5 La sintesi dell'antigene SV^ -T ? indotta solo
6 quando 1 'SV^ -DNA ? introdotto nel citoplasma
7 cellulare da cui viene trasferito al nucleo
8 cellulare .
9 E' stato notato anche (a) che l'apparizione
0 dell'antigene SV^Q-T si ? verificata solo in
1 cellule viventi, poich? necessita la sintesi di
2 proteina attiva; (b) che le molecole libere
3 SV^Q-DNA, quando incubate con cellule viventi, rv 4 sono incapaci di penetrare nelle cellule e di
^ 0 1 N 5 conseguenza queste molecole libere non inducono
6 la sintesi dell'antigene-T.
7 3 ) Le molecole proteiche contrassegnate fluorescen-8 temente, cio? albumina da siero bovino contrasse-9 gnata fluorescentemente (BSA), sono state incluse
0 entro i liposomi.
1 I liposomi caricati sono stati quindi incubati
2 sia con protoplasti di piante che con una
3 sospensione di cellule di piante. E' stata
4 osservata una microiniezione indotta da fusione
5 seguendo l ' apparenza di fluorescenza intracellu-11 mandatar!o BRUNA r OC E CCO STUDIO C. L. P. S.a.s. vedalis 6 2 - 33100 UDINE 22 gip 86-5461
lare.
(a) Microiniezione, indotta da fusione, di una catena di ricina-A tramite liposomi fusogenici
I risultati sommarizzati nella Tabella II mostrano che solo i liposomi caricati con una catena di ricina-A e contenenti il sale (sale-Q ) di idrossido di ammonio quaternario hanno causato una forte inibizione di sintesi proteica ed un alto grado di eliminazione del HTC.
Nessuna eliminazione ? stata osservata sia con liposomi non caricati che con catena di ricina-A libera.
Come si pu? osservare, un'eliminazione molto esigua oltre il livello delle prove di controllo ? stata causata dai liposomi contenenti il sale (sale-C) di cloruro di ammonio quaternario, indicando cos? che non si ? verificata nessuna o sostanzialmente nessuna fusione tra liposoma e cellula.
H mandatario BRUNA FOCECCO STUDIO G.L.?. S.a.s.
P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE
TABELLA II
Abilit? dei liposomi fusogenici caricati con ricina-A di inibire la sintesi proteica ed eliminare HTC
HTC incubato con: Inibiz?one della HTC eliminato sintesi proteica
% %
Liposomi di PC/colesterolo
0 0
Catena di ricina-A libera 5 4
Liposomi di PC/colesterolo caricati i con Ricina-A 6 7 ro co t Liposomi di PC/colesterolo contenti
sale-Q (sale OH ) 5 8
Liposomi di PC/colesterolo caricati
con catena di ricina-A e contenti
sale-Q (sale OH ) 90 95
Liposomi di PC/colesterolo caricati
con catena di ricina-A e contenenti 17 14
sale-C (sale CI )
(Q I? 1 X) 00 PRO* ?\ ,ft? i CJ1 <J\
0)
ifl '5118'J
24 gip 86-5461
1 La catena di ricina-A ? stata prima imprigionata
2 entro liposomi di PC/colesterolo usando la tecnica
3 descritta nel testo gi? citato di Szoka et al.
4 "Procedure for preparation of liposomes, etc . ", dopo
5 di che ? stato incorporato il sale di ammonio
6 quaternario (o sale 0H~ o sale CI ) nello strato di
7 spessore biomolecolare del liposoma, come descritto.
8 Negli esperimenti sono stati incubati per 30
9 minuti ad una temperatura di 37?C, 10-20 ^ig di
0 liposomi con 10^ cellule, cio? un periodo durante il
1 quale i liposomi hanno interagito con le cellule.
2 Al termine del periodo di incubazione, le cellule
3 sono state lavate e nuovamente incubate in un mezzo
4 di crescita per altre 12 ore ed in seguito sono
5 state stimate la sintesi proteica (tramite
3
6 incorporamento di leucina- H) e la viabilit? delle COMA.
7 cellule (macchinandole di blue Trypan ). $
\
8 (b) Microiniezione, indotta da fusione, di SV^ -DNA
U.'Nt 9 I risultati della Tabella III mostrano che si
0 possono usare i liposomi fusogenici per microiniet-
1 tare dei geni attivi (molecole di DNA) nelle cellule
2 in cultura, come HTC.
3 Tutte le condizioni sperimentali e l'incubazione
4 con HTC sono state ottenute come descritto nella
Ilmandatario 5 Tabella II per la ricina-A. BRUNA FOCECCO STUDIO C.L.?. S.a.s. P.le Cavedaiis, 6/2 - 33100 UDINE - 25 - gip 86-5461
Nei liposomi ? stato imprigionato SV^ -DNA, come descritto nel testo citato di Szoka et al.
"Procedure for preparation of liposomes, etc. ".
L'apparizione dell 1antigene SV -T ? stata
40
stimata, come sopra descritto, con l'uso di un anticorpo specifico anti-antigene SV^ -T contrassegnato fluorescentemente.
\ ' f r i v l?i .?S \ Z \
Il mandatario BRUITA FCC ECCO STUCiO G. L. P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100
TABELLA III
Abilit? dei liposomi fusogenici caricati (liposomi contenenti sale-Q) di microiniettare SV? -DNA 40
HTC incubato con liposomi Cellule positive di antigene caricati di SV? -DNA SV -T {percentuale del totale)
40 40
i (V> CT\ Liposomi di PC/colesterolo 0 I
PC/colesterolo contenente
sale-Q (sale OH ) 10 15
PC/colesterolo contenente sale-C (sale CI ) 0
ta X) CD
?\ i VJ1 cr> D/ /?
- 27 gip 86-5461
1 L'antigene T specifico ? apparso nel nucleo del
2 10-15% delle cellule incubate con liposomi caricati
3 con SV^Q-DNA e contenenti sale-Q (sale OH ). Nessun
4 antigene T ? apparso nelle cellule incubate con il
5 PC/colesterolo caricato con SV,, -DNA ma contenente
40
6 il sale-C (sale CI ).
7 (c) Iniezione, indotta da fusione, di albumina di
8 siero bovino BSA fluorescente in protoplasti di
9 piante di Petunia Hybrida e sospensione di
0 cellule di pianta
1 Sono stati preparati dei protoplasti di cellule
2 di Petunia Hybrida tramite i metodi convenzionali
c OH Me 3 come descritti nei testi citati.
4 Entro i liposomi ? stato imprigionato del BSA
5 fluorescente, come descritto per la catena di
6 ricina-A, e quindi ? stato incorporato un sale-Q
7 nella membrana del liposoma caricato, come sopra
8 descritto .
9 Nell'esperimento sono stati incubati 10-20^ug di
0 liposomi caricati con 5 x 10^ protoplasti o cellule
1 di pianta.
2 Dopo 30-60 minuti di incubazione a 28?C, in
3 seguito all'apparizione di fluorescenze intracellu-4 lari, ? stata effettuata una microscopia fluorescen-11 mandatario 5
BRUNA FCC ECCO STUDIO G. L. ?. S.a.s. Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE
TABELLA IV
Iniezione, indotta da fusione, di BSA fluorescente in protoplastic di piante di Petunia
Hybrida e sospensione di cellule di pianta
Apparizione di fluorescenza intracellulare (% del totale
delle cellule)
Protoplastic di Petunia incubati con
liposomi caricati di BSA fluorescente ru 00
PC/colesterolo 0
PC/colesterolo contenente sale-Q (sale OH ) 80
Sospensione di cellule di Petunia incubate
con liposomi caricati di BSA fluorescente
PC/colesterolo 0
5? PC/colesterolo contenente sale-Q ( sale OH ) 60
3 _ io c: ? H? ? ? i? - 3,
C? ? Q1 3 cu. ?? n s i r?i ?r U1 R o\ o ?
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v'
- 29 gip 86-5461
1 Dai risultati della Tabella IV ? ovvio che i
2 liposomi contenenti sale-Q {sale OH ) possono
3 microiniettare i loro contenuti anche nei protopla-4 sti di piante.
5 L'apparizione di fluorescenze pu? risultare solo
6 dalla fusione tra i liposomi caricati ed i
7 protoplasti di piante. Qualsiasi altro processo
8 condurrebbe ad un'altra forma di apparizione di
9 fluorescenza .
0 I risultati della Tabella IV mostrano che, oltre
1 alla fusione (o microiniezione) con i protoplasti di
2 piante, i liposomi caricati sono stati capaci di
3 fondersi e microiniettare il loro contenuto nelle
4 cellule di piante contornate dalla parete di una
5 cellula .
6 Per la presenza del sale altamente caricato, i
S f
7 liposomi pare siano capaci di penetrare attraverso
8 la parete della cellula e di fondersi con la m 25??? \
\>/
' I fi ? )r 9 membrana piasmatica.
0 Applicazione dei liposomi contenenti un sale di
1 idrossido di ammonio quaternario
2 Dopo aver illustrato la preparazione dei liposomi
3 contenenti sali di idrossido di ammonio quaternarUor,anciatario 1 rOCECCO STUDIO G. L. P. S.a.s.
30 gip 86-5461
1 ed aver dimostrato l'abilit? dei liposomi contenenti
2 tale sale nelle membrane della vescichetta di
3 fondersi con le cellule ed indurre la loro reciproca
4 fusione microiniettando il contenuto delle
5 vescichette nella cellula, verranno ora dimostrate
6 varie applicazioni dei liposomi discussi in questo
7 trovato.
8 (1) Uso del sale-0 (OH ) libero o dei liposomi
9 contenenti tale sale (OH ) come reagente per
0 indurre la fusione tra le cellule
1 La fusione tra cellule animali, come dimostrato
2 per i liposomi qui discussi, ? della massima
3 importanza per gli studi dell'espressione del gene.
4 Inoltre, la fusione del protoplasto di pianta
5 presenta molte applicazioni commerciali che possono
COA
6 portare allo sviluppo di nuove specie di piante con
7 propriet? migliorate.
8 (2) L'uso di liposomi fusogenici per la microinie-9 zione di vari componenti in cellule, cresciute
0 in cultura, di animali e piante
1 I liposomi fusogenici caricati possono essere
2 usati per microiniettare proteina DNA ed RNA
3 (enzimi, ormoni) e farmaci nelle cellule di cultura.
4 Inoltre, possono essere usati per microiniettare
5 organelli o qualsiasi altro componente o molecola mandatario B-TJKA FOCE CCO STUDiO G. L. P. S.a.s.
31 gip 86-5461
che possono essere imprigionati entro i liposomi.
La microiniezione di DNA, RNA o organelli nelle
cellule, specialmente in protoplasti o cellule di
piante, comporta una sostanziale applicazione commerciale cos? come pure l'intero campo dell'ingegneria genetica delle cellule di piante ed
animali .
Inoltre, basandosi sugli esperimenti con cellule
di piante ed animali, i liposomi contenenti un sale
di idrossido di ammonio quaternario saranno capaci
di fondere e microiniettare il loro contenuto in
qualsiasi cellula con cui possono essere incubati.
Quindi, questi liposomi potranno fondersi con protoplasti di batteri, di lievito ed alghe.
(3) Uso di liposomi fusogenici per 11introduzione di
vari componenti nelle cellule in vivo, cio?
tessuti o cellule di animali interi
fi. I liposomi fusogenici possono essere usati, dopo 3? iniezione in animali di laboratorio o essere umani,
Q> IN
come mezzo di introduzione di farmaci, ormoni o
proteine, come enzimi e DNA.
Questo metodo pu? essere usato per farmaci,
enzimi e per terapia di geni.
I liposomi non fusogenici caricati vengono usati
. . ^ r Il mandatario oggigiorno come portatori di farmaci per terapie FCC'CCO STUDiG G. L. P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6 2 - 33100 UDINE - 32 gip 86-5461
1 Tuttavia, i liposomi fusogenici possono essere 2 molto pi? efficaci di quelli non fusogenici come 3 portatori biologici poich? essi iniettano il loro 4 contenuto direttamente nel citoplasma cellulare. 5 (4) Uso dei liposomi fusogenici per lo sviluppo di 6 un nuovo sistema di analisi sensitiva, non 7 isotopica, per diagnosi
8 I liposomi contenenti sali di idrossido di 9 ammonio quaternario si fonderanno con altri 0 liposomi.
1 La fusione tra liposomi porta alla fuoriuscita 2 del loro contenuto.
3 Tale fuoriuscita ? dovuta specificatamente 4 all'interazione e fusione tra i liposomi.
5 Per la presenza delle molecole positivamente 6 caricate di sale di idrossido di ammonio quaterna-7 rio, i liposomi che contengono tali molecole di 8 ammonio quaternario non possono interagire e si 9 respingono a vicenda.
0 Come summenzionato, possono interagire e fondersi 1 solo con liposomi da cui fuoriesce il sale di 2 idrossido di ammonio quaternario.
3 Tuttavia, due qualsiasi molecole capaci di 4 interagire tra loro con alta affinit?- potranno 5 costringere i liposomi contenenti il sale manda tarlo BRUNA PCCZCC? STUDIO G. L. ?. S.a.s.
- 33 gip 86-5461
1 idrossido di ammonio quaternario a fondersi tra loro
2 sopraffando le forze di repulsione della carica
3 positiva .
4 Quindi, se viene incorporato un antigene
5 specifico nelle membrane del liposoma contenente il
6 sale di idrossido di ammonio quaternario, un
7 anticorpo, preparato contro tale antigene,
8 costringer? i liposomi ad interagire.
9 L'interazione tra liposomi contenenti il sale di
0 idrossido di ammonio quaternario condurr? alla
1 fusione ed alla liberazione del contenuto liposoma-2 le.
3 Qualsiasi stima quantitativa del processo di
4 liberazione (liberazione di colorante fluorescente o \?.\A 5 qualsiasi altro reagente) sar? una misura dell'in m 6 terazione tra antigene/anticorpo.
7 Perci? la fusione tra liposomi contenenti il sale
8 di idrossido di ammonio quaternario pu? essere usata
9 per stimare quantitativamente l'interazione tra un
0 anticorpo ed il suo antigene o ormone ed il suo
1 appropriato recettore.
2 Questo sistema quindi pu? essere usato per
3 stimare qualsiasi piccola quantit? di antigene o
4 ormone presente in qualsiasi fluido biologico.
5 Al tecnico di questo campo sar? ovvio che|| Mandatario BSUNA PGCECCO STUD-O G. L. P. S.a.s.
- 34 - gip 86-5461
possibile apportare varie modifiche entro l'ambito
della suddetta descrizione; tali modifiche sono possibili per un tecnico in questo campo e formano
una parte del presente trovato, essendo incluse
nelle rivendicazioni aggiunte.
RIVENDICAZIONI
1 - Vescichette fosfolipide contenenti un sale di idrossido di ammonio quaternario nelle proprie membrane, detto sale essendo presente in dose sufficiente da rendere fusogeniche le vescichette.
2 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione
1 , nelle quali detto sale di idrossido di ammonio quaternario appartiene al gruppo che consiste di: cetilbenzildimetil idrossido di ammonio, esadecilc o*r. trimetil idrossido di ammonio, cetiltrimetil idrossido di ammonio, di-isobutilcresossietossietildimetibenzil idrossido di ammonio, metildodecil- IN 0' benzil-trimetic idrossido di ammonio, metildodecilxilene bis (trimetil-idrossido di ammonio) e ottilcresossietossietil . dimetilbenzil idrossido di
ammonio .
3 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione
1 , nelle quali detto sale di idrossido di ammonio quaternario ? ottilcresossietossietil dimetilbenzil
Il mandatario idrossido di ammonio.
STUDto C. I. P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE - 35 - gip 86-5461
1 4 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione
2 1 , nelle quali detto fosfolipide appartiene al
3 gruppo che consiste di: fosfatidicolina , dimiri-4 stoilf osfatidilcolina , dioleoilf osfatidilcolina ,
5 di palmitoilfosf atidilcolina , distearoilfosfatidilco-6 lina, sfingomielina , colesterolo e misture degli
7 stessi .
8 5 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione
9 1, aventi incapsulati entro s? stesse i1 DNA o
0 frammento di DNA.
1 6 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione
2 1, aventi incapsulati entro s? stesse un composto o
3 composizione farmaceuticamente attivo.
4 7 - Metodo per rendere fusogenica una vescichetta
5 fosfolipida , che presenta 1'incorporamento, nella
6 membrana di detta vescichetta, di un sale di
/rv 7 idrossido di ammonio quaternario.
8 8 - Metodo come alla rivendicazione 7, in cui detto V 9 sale di idrossido di ammonio quaternario appartiene
0 al gruppo che consiste di: cetil benzildimetil
1 idrossido di ammonio, esadeciltrimetil idrossido di
2 ammonio, cetiltrimetil idrossido di ammonio, di-3 isobutil cresossi etossi etil dimetibenzil idrossido
4 di ammonio, di-isobutil fenossi etossi etil
5 dimetilbenzil idrossido di ammonio, metil d?deci]^Bndatario STUDIO &
36 gip 86-5461
1 benzil trimetil idrossido di ammonio, metil dodecil
2 xilene bis (trimetil idrosssido di ammonio), e
3 ottilcresossi etossietil dimetilbenzil idrossido di ammonio .
5 9 - Metodo come alla rivendicazione 7, in cui detto
6 sale di idrossido di ammonio quaternario ?
7 ottilcresossi etossietil dimetilbenzil idrossido di
8 ammonio .
9 10 - Metodo come alla rivendicazione 7, in cui detto
0 sale di idrossido di ammonio quaternario ?
1 incorporato durante la formazione di detto
2 fosfolipide .
3 11 - Metodo come alla rivendicazione 7, in cui detto
4 sale di idrossido di ammonio quaternario ?
5 incorporato nella membrana di detta vescichetta dopo
6 la formazione del fosfolipide.
7 p. INTERNATIONAL GENETIC SCIENCES PARTNERSHIP
8 Udine, 2 Aprile 1986.
^?COMV
0 / N l
Il mandatario BR ?? LO, CUCCO STU .a.5. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE - 4 - gip 86-5461
1 cellule di tessuti specifici di animali interi, ? 2 stato provato che questi liposomi sono dei prtatori 3 relativamente inefficaci.
4 Si pensa che i liposomi della tecnica gi? nota 5 introducono nelle cellule le sostanze portate, cio? 6 il farmaco, con processi simili a quelli endocitici.
7 Perci? solo . una . piccola percentuale delle 8 molecole imprigionate nei liposomi raggiunge il 9 citoplasma delle cellule riceventi.
0 Inoltre, quando si iniettano i liposomi negli 1 animali come pure nelle persone, si ? trovato che, 2 sino ad una data concentrazione, i liposomi 3 fosfolipidi sono inerti e non immunogenici .
4 Solamente con concentrazioni relativamente alte i 5 liposomi sono immunogenici e tossici.
6 Questi liposomi della tecnica gi? nota, anche se 7 capaci di agglutinare le cellule, non sono .
8 fusogenici e non subiscono e sono incapaci di 9 fondersi con una membrana piasmatica o di indurre la 0 fusione tra cellule.
1 Si ? stabilito inoltre che gli inviluppi di certi 2 virus animali, come quelli ottenuti dal virus 3 Sendai , sono fusogenici e si ? dimostrato che sono 4 dei portatori efficienti per l'introduzione di 5 molecole nelle cellule coltivate, come riferito J[Umandatan0
? B?UI-.?A FOCECCO STUDIO G.L.P. S.a.s.
P.le Cavedalis 6 2 - 3310 5 gip 86-5461
1 "A new method for reconstitution of highly fusogenic 2 Sendai virus envelopes" (Nuovo metodo per la 3 ricostituzione di inviluppi di virus Sendai , altamente fusogenici) di Vainstein et al., 5 Biochimica et Biophysica Acta, 733 (1984), pagine 6 181-188.
7 L'attivit? fusogenica di questi virus si pensa 8 sia dovuta alla presenza di glicoproteine virali 9 specifiche negli inviluppi dei virus.
0 Tuttavia pare che la presenza di una proteina 1 negli inviluppi fusogenici virali renda immunogeni-2 che queste vescichette, e quindi poco pratiche per 3 uso in vivo. L'iniezione di inviluppi virali negli 4 animali induce la formazione di anticorpi antivirali 5 specifici, fatto che limita il loro uso come portato 6 biologico in vivo.
7 I testi citati hanno stabilito quindi che, 8 nonostante le vescichette fosfolipide siano state 9 riconosciute come un mezzo potenzialmente importante 0 per incorporare nelle cellule i farmaci ed altre 1 sostanze modificatrici di cellule, per le limitazio-2 ni dei liposomi nella tecnica gi? nota, questo 3 metodo ? stato sperimentato con successo limitato. 4 SCOPI PRIMARI E DESCRIZIONE GENERALE DEL TROVATO 5 Quindi, lo scopo primario del presente trovatoli^mandatario BRUNA FOCECCO STUDIO G.L.P. s.a.s.
6 gip 86-5461
quello di provvedere liposomi che siano fusogenici e che si fondano con una membrana piasmatica ed inducano la fusione tra cellule.
Un altro scopo primario del trovato ? di fornire un metodo per produrre liposomi che si fondano con una membrana piasmatica ed inducano la fusione tra cellule.
Gli scopi del presente trovato vengono raggiunti incorporando un sale di idrossido di ammonio quaternario nella membrana di un liposoma o durante la preparazione o dopo la sua preparazione.
Si ? trovato che la presenza del sale di idrossido di ammonio quaternario nella membrana della vescichetta fosfolipida le permette di fondersi Con la membrana piasmatica inducendo la fusione tra le cellule.
Se la vescichetta viene riempita con un farmaco o altra sostanza di modificazione cellulare, il contenuto di detta vescichetta verr? microiniettato nella cellula dell'animale o della pianta.
L'abilit? del sale di idrossido di ammonio quaternario di convertire le vescichette fosfolipide da non fusogeniche a fusogeniche ? particolarmente sorprendente, in quanto i sali di ammonio quaternario, eccetto quelli di idrossido, producono del'?L?ranclatar'0
BRUNA FOCECCO STl!DSO G.L.P. S.a.s.
- 10 UDINE - 7 gip 86-5461
1 vescichette non fusogeniche.
2 Quindi, si ? trovato che le vescichette 3 fosfolipide contenenti sali di alogenuro di ammonio 4 quaternario, sali di acetato di ammonio quaternario 5 e simili, non si fondono con una cellula e 6 conseguentemente non microiniet tano il contenuto 7 delle vescichette nella cellula.
8 Queste vescichette reagiscono in modo simile a 9. quelle non fusogeniche conosciute, ed apparentemente 0 incorporano nelle cellule il loro contenuto tramite 1 un processo simile a quello endocitico.
2 D'altra parte, le caratteristiche fusogeniche dei 3 liposomi del presente trovato offrono un sistema 4 conveniente per incorporare qualsiasi sostanza di 5 modificazione cellulare capace di essere imprigiona-6 ta in una vescichetta fosfolipida direttamente in 7 una cellula di piante o animali in dosi sostanzial-8 mente quantitative.
9 Il sale di idrossido di ammonio quaternario da 0 incorporare nella parte o membrana della vescichetta 1 fosfolipida, ha la seguente formula:
2
3 R1 N'2? R*, "OH
4 R
4
5 dove R^ ? un grande gruppo alchilico o Una l? mandatario
BrlUNA FOCECCO STUDIO G. L. P. S.a.s.
P.le Cavedalis, 6 2 - 33100 UDINE 8 gip 86-5461
combinazione di radicale alchilico e radicale arilico, cos? da impartire al sale delle caratteristiche tensioattive.
R , R ed R sono radicali alchilici a catena c J
ramificata con da 1 a 20 atomi di carbonio, o un radicale arilico, o ed R^ assieme possono essere radicali eterociclici a 5 o 6 elementi, come ad esempio pirrolo o pridina.
I composti particolarmente preferiti sono i tensioattivi come; cetil-benzildimet il-idrossido di ammonio, esadeciltrimetil-idrossido di ammonio, cetil trimetil-idrossido di ammonio, di-sobutilcresossi etossi etil-dimetilbenzil-idrossido di ammonio, di-isobutil-fenossi etossi etil-dimetilbenzil-idrossido di ammonio, metil-dodecilbenziltrimetil-idrossido di ammonio, metil-dodecil-xilene bis (trimetil-idrossido di ammonio), N-alchil-( , C, C?_) dimetilbenzil-idrossido di ammonio ed 14 16
ottilcresossi etossietil-dimetil-benzil-idrossido di ammonio.
E ' essenziale che il sale di idrossido di ammonio quaternario abbia delle caratteristiche tensioattive e contenga il radicale idrossilico cos? da impartire alla vescichetta fosfolipida delle caratteristiche il mandatario fusogeniche . BRUNA POCECCO STUDiO G. L. P. S.a.s.
P.te Cavedaiis, 6/2 - 33100 UDINE 9 gip 86-5461
La quantit? di sale di idrossido di ammonio quaternario contenuto nelle vescichette generalmente varier? da circa 3 a 750 ^g/1 mg di fosfolipidi e, preferibilmente, da circa 50 a 250 ^ug di sale di idrossido di ammonio quaternario- per ogni 1 mg di fosfolipide.
I liposomi utili, secondo il presente trovato, possono essere uno qualsiasi dei liposomi della tecnica gi? nota.
I liposomi illustrativi includono lipide naturale e sintetico contenente fosfocolina con una catena di acido grasso avente da 12 a 20 atomi di carbonio e con una catena di acido grasso avente almeno 8 atomi di carbonio, esemplificato da dimiristoilfosfatidilicolina, dioleoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfo-? sfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina, fosfatidicolina e sfingomielina , oltre che a colesterolo e simili.
I liposomi possono essere preparati con uno qualsiasi dei metodi pubblicati ben noti, come "sonicazione" (sonication ) delle sospensioni fosfolipide, evaporazione inversa o disidratazione degli strati secchi delle molecole fosfolipide.
Delle tecniche note adatte vengono descritte in % "Procedure for Preparation of liposomes with largii mandatario BRUNA POCECCO STILI ?O 0. L. P. S.a.s.
1 0 gip 86-5461
internai aqueous space and high capture by reversephase evaporatici" secondo il suddetto testo di Szoka et al., "Dehydration-Rehydration vescicles: A simple method for high yield drug entrapment in liposomes" secondo il testo gi? citato di Kirby & Gregoriadis, oltre che ad altre tecniche note, come l'uso di detergenti (vedi Szoka e Papahadjopoulos, Rivista Annuale di biofisica e bioingegneria, 9 (1980) pagine 467-480).
Inoltre, le sostanze modificatrici di cellule che possono essere imprigionate entro i liposomi e possono essere microiniettate nelle cellule di animali o piante tramite fusione con i liposomi del presente trovato, potranno essere una qualsiasi delle sostanze suggerite precedentemente.
Si ? trovato che le sostanze che possono essere incapsulate nel liposoma e micro-iniettate in una cellula, secondo il presente trovato, includono DNA e frammenti di DNA; composti farmaceuticamente attivi e composizioni degli stessi, come i carboidrati, nucleotidi, polinucleotidi ottenuti sia naturalmente che sinteticamente; vaccini influenzali ed antigeni oltre ,che ad altre sostanze che possono influenzare la fisiologia cellulare di animali e piante. Il mandatario BRUNA FQCECCO STUDIO C. P. S.a.s.
6 - 3 1 UD - 11 - gip 86-5461
REALIZZAZIONI ODIERNE PREFERENZIALI DEL TROVATO
Dopo aver descritto il trovato in termini generali, i seguenti due esempi illustreranno le preparazioni preferenziali odierne dei liposomi fusogenici secondo il presente trovato.
ESEMPIO 1
Incorporamento di sale di idrossido di ammonio quaternario in membrane di liposomi durante la preparazione degli stessi Dalla loro soluzione di cloroformio vengono essiccati 2 mg di un fosfolipide non caricato, fosfotidilcolina (PC), ed 1 mg di colesterolo.
Lo strato secco ottenuto dal PC e dal colesterolo viene solubilizzato con 1 mi di etere etilico, e la soluzione ottenuta viene aggiunta ad una sospensione contenente 2 mg di ottilcresossi etosssietile dimetile benzile idrossido di ammonio (sale 0) in tampone acetato, ad un pH di 7,0.
La sospensione ottenuta viene quindi fatta turbinare vigorosamente e sonicata brevemente in un bagno sonicatore.
Quindi vengono preparati grandi liposomi unilamellari ad evaporazione inversa, secondo il metodo descritto nel suddetto testo di Szoka Il mandatario "Procedure for preparation of liposomes" . BSUNA FOCECCO
STUD!O C. L. P. S.a.s.
P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE - 1 2 - gip 86-5461
Viene rimosso l'eccesso non incorporato di sale-Q aggiungendo delle Bio-perle SM-2 ed utilizzando la tecnica descritta nel testo summenzionato di Veinstein "A new method for reconstitution etc.".
*
Cos?, circa 50-80 mg di Bio-perle SM-2 vengono incubate, agitando gentilmente, con i suddetti fosfolipidi e con sale-Q a temperatura ambientale per 40-60 minuti, in un volume finale di 1 mi di tampone acetato.
Una stima quantitativa ha rivelato che circa il 30-40% del sale-Q aggiunto ? incorporato nello strato di spessore bimolecolare fosfolipido (300-400 ^g di sale-Q/1 mg PC).
Per la preparazione dei liposomi caricati con qualsiasi componente di interesse, i componenti desiderati, come i farmaci, gli enzimi, RNA o DNA, vengono aggiunti al tampone in cui sono sospesi i fosfolipidi, come descritto nel suddetto testo di Szoka "Procedure for preparation of liposomes, etc. ".
Il metodo per la preparazione dei liposomi fusogenici, come esposto nell'Esempio 1, non ? consigliabile quando le molecole caricate sono imprigionate entro i liposomi stessi.
In alcune condizioni ed ad un certo pH, qualsias1!mandatario B^UNA FOCECCO STJt?O c. l. p. s.a.s P ie C
- 13 - gip 86-5461
componente caricato negativamente sar? complessato al sale di idrossido di ammonio quaternario e con questo precipitato.
Poich? il sale di idrossido di ammonio quaternario ? caricato positivamente, interagir? elettrostaticamente con qualsiasi molecola caricata negativamente, come gli acidi nucleici esemplificati con DNA o RNA che sono altamente caricati negativamente ad un pH neutro.
La formazione di tali complessi tra il sale di idrossido di ammonio quaternario caricato positivamente e le molecole caricate negativamente diminuisce l'efficienza dell'imprigionamento (numero delle molecole imprigionate entro ogni liposoma ) e l'attivit? fusogenica dei liposomi.
Quindi, nell'Esempio 2, viene descritta una seconda tecnica per la preparazione di *liposomi fusogenici, dove viene evitato il contatto diretto tra il sale di idrossido di ammonio quaternario e le molecole imprigionate.
ESEMPIO 2
Inserimento del sale-Q in liposomi caricati gi? preparati
I liposomi caricati vengono preparati come descritto nell ' Esempio 1 o secondo i m?ft?4!|anp3CECCO STUDIO G. L. P. S.a.s.
P.le Cgvedalis, 6/2 - 33100 UDINE 14 gip 86-5461
pubblicati precedentemente descritti.
Tuttavia, al contrario del metodo descritto nell'Esempio 1, il sale-Q non viene aggiunto durante la preparazione dei liposomi ma aggiunto dopo la preparazione di liposomi caricati ad una sospensione contenente liposomi caricati e risigillati.
L'incubazione del sale-Q con una sospensione di liposomi risigillati d? 1'incorporamento della parte idrofobica della molecola del sale-Q nello strato di spessore bimolecolare del liposoma fosfolipido.
II processo ? il seguente: una sospensione, contenente vescichette fosfolipide (liposomi) preparata con 2 mg di fosfotidilcolina ed un mg di colesterolo, sospesi in 400 yul di tampone acetato, viene aggiunta ad una provetta contenente 3 mg di sale-Q in 20yul di tampone acetato.
La mistura ottenuta viene fatta turbinare vigorosamente, dopodich? ? incubata, agitando leggermente, per 10-15 minuti a 37?C.
L'eccesso non incorporato libero di sale-Q viene rimosso tramite assorbimento nelle Bio-perle SM-2, come descritto precedentemente.
Una stima quantitativa ha rivelato nuovamente che circa il 30% del sale-Q aggiunto ? stato incorporato nello strato di spessore bimolecolare del fosfolipi-^ mandatario
BSUNA FQCECCO STUDIO G.L.P. S.a.s.
P.le Cavedaiis, 6 2 - 331 15 gip 86-5461
do .
Questo metodo dell 'Esempio 2 pu? essere vantaggioso per alcune preparazioni rispetto all'Esempio 1, in quanto le molecole incluse entro i liposomi sono in questi imprigionate prima dell'aggiunta del sale-Q, quindi non ? possibile si verifichi l'interazione tra la sostanza inclusa ed il tensioattivo aggiunto.
Inoltre, le propriet? fusogeniche dei liposomi contenenti sale-Q, preparati secondo il metodo ?dell'Esempio 2, sono superiori a quelle dei liposomi preparati con la tecnica dell'Esempio 1.
L'abilit? dei liposomi composti da fosf atidilcolina e colesterolo (liposomi di PC/colesterolo), come descritta nell'Esempio 2, di indurre la fusione tra cellule ? stata studiata incubandoli con eritrociti umani e cellule coltivate di tessuto epatomatico ( HTC ) paragonandoli con prove di controllo .
Il sale-Q, che ? ottilcresossi etossietile dimetile benzile di idrossido di ammonio; sale-C che ? ott ilcresossi etossietile dimetilbenzil idrossido di ammonio; sale-C che ? ottilcresossi etossietildimetilbenzil cloruro di ammonio, e sale-B che ? benzildimetilesadecil bromuro di ammonio sono statil mandatario
BRUNA FOCECCO STUDIO C. L. P. S.a.s.
- 16 - gip 86-5461
incorporati in liposomi gi? formati, come descritto nell'Esempio 2.
In questi esperimenti sono stati incubati o
sale-Q libero (5-10 jag ) o sale-C libero (5-10 yug ) o
sale-B libero (5-10 pg ) o liposomi contenenti queste molecole di ammonio quaternario (20 jig di fosfotig dilcolina) con una sospensione di cellule (10 cellule) per 15 minuti a 370?C.
L'agglutinazione delle cellule e la funzione tra cellule sono state eseguite osservandole sotto microscopio di fase.
I risultati sono tabulati nella Tabella I.
.
l! mandatario BRUMA FOCSCCO STUDIO G. L. P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE 17 gip 8b?}4bi
TABELLA I
Caratterizzazione dei liposomi contenenti sali fusogenici e non fusogenici di ammonio quaternario
Agglutinazione Fusione tra cellule
Eritrociti umani
incubati con:
Liposomi di PC/colesterolo
Sale-Q libero (Sale OH ) Liposomi PC/colesterolo ++ contenenti sale-Q (sale OH )
Sale-C libero (sale-Cl )
Sale-C PC/ colesterolo
(Sale Cl?)
Sale-B libero
Liposomi di PC/colesterolo
contenenti sale-B
Celleule coltivate di tessuto epatomatico (HTC) incubate con:
Liposomi PC/colesterolo
Sale-Q libero (sale OH ) Liposomi PC/colesterolo
contenenti sale-Q (sale OH ) ++
Sale-C libero (sale Cl )
Liposomi PC/colesterolo
contenenti sale-C (sale Cl )
Sale-B ? Liposomi PC/colesterolo
contenenti sale-B
Il mandatario BSUNA FOCECCO
S7JDIO G. L. P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6 2 - 33100 UDINE - 18 - gip 86-5461
1 I risultati sommarizzati nella Tabella I 2 stabiliscono che:
3 1) I liposomi composti di PC/colesterolo ma non contenenti alcuna molecola di ammonio quaternario
5 non hanno avuto alcun effetto sulla agglutinazio-6 ne o sulla fusione tra cellule degli ertrociti 7 umani o sulle cellule HTC.
8 2) Tutte le molecole di ammonio quaternario usate 9 (sale-Q, sale-C, sale-B ) sia nella loro forma 0 libera che incontrati in liposomi, sono state 1 capaci di indurre l'agglutinazione tra cellule. 2 Si crede che ci? sia dovuto all'adesione delle 3 molecole del sale di ammonio quaternario caricate 4 positivamente alle membrane delle cellule 5 negativamente .
6 3) Solo il sale-Q, cio? il sale di idrossido, sia 7 nella forma libera che incorporato nei liposomi, 8 ? stato capace di indurre la fusione tra cellule.
9 L'induzione della fusione tra cellule tramite 0 liposomi contenenti sale-Q ? stata molto pi? alta 1 di quella con il sale-Q libero.
2 I sali di cloruro di ammonio quaternario o di
3 bromuro di ammonio quaternario non hanno indotto 4 la fusione tra cellule nonostante essi siano
5 capaci di unirsi a membrane piastomatiche, coiflemandatario BRUNA FOCECCO STUDIO G.L.P. S.a.s.
- 19 - gip 86-5461
1 si pu? osservare dalla loro abilit? di indurre 2 l'agglutinazione tra cellule.
3 La fusione di liposomi contenenti un sale di 4 idrossido di ammonio quaternario con cellule viene 5 dimostrata anche dalla loro abilit? di microinietta-6 re il loro contenuto nel citoplasma delle cellule di 7 animali e piante. Si sono usati tre sistemi per 8 accertare la fusione di liposomi contenenti sale-Q 9 con, e la microiniezione dei loro contenuti in, 0 cellule viventi, come segue:
1 1) La tossina catena di ricina-A ? stata inclusa 2 entro i liposomi e questi liposomi caricati sono 3 stati incubati con cellule in cultura come HTC. 4 La ricina-A inibisce la sintesi della proteina 5 delle cellule e di conseguenza uccide le cellule 6 solo quando presente entro la cellula.
7 Al contrario dell'intera molecola di ricina 8 (ricina contenente subunit? sia A che B), la 9 catena di ricina-A non pu? da sola penetrare 0 nelle cellule.
1 Quindi, quando presente fuori dalle cellule, non 2 possiede alcun effetto letale.
3 2) L'SV^ -DNA, cio? DNA estratto dal virus SV , ? 4 stato incluso entro i liposomi. I liposomi ? mandatario 5 caricati con SV^Q-DNA sono stati incubati con u?a-u>JA r0r-ECC0
STUDsO G. L. P. S.a.s.
P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE 20 gip 86-5461
1 cultura di HTC.
2 E' stata osservata la microiniezione dell'SV^ -40 3 DNA nelle cellule HTC con l'apparizione di una 4 specifica proteina, l?antigene SV^Q-T.
5 La sintesi dell 'antigene SV? -T ? indotta solo a 40
6 quando 1 'SV^ -DNA ? introdotto nel citoplasma 7 cellulare da cui viene trasferito al nucleo 8 cellulare.
9 E' stato notato anche (a) che l'apparizione 0 dell 'antigene SV, -T si ? verificata solo in 1 cellule viventi, poich? necessita la sintesi di 2 proteina attiva; (b) che le molecole libere 3 SV -DNA, quando incubate con cellule viventi,
40
4 sono incapaci di penetrare nelle cellule e di 5 conseguenza queste molecole libere non inducono 6 la sintesi dell-'antigene-T .
7 3) Le molecole proteiche contrassegnate fluorescen-8 temente, cio? albumina da siero bovino contrasse-9 gnata fluorescentemente (BSA ), sono state incluse 0 entro i liposomi.
1 I liposomi caricati sono stati quindi incubati 2 sia con protoplasti di piante che con una 3 sospensione di cellule di piante. E' stata 4 osservata una microiniezione indotta da fusione 5 seguendo l'apparenza di fluorescenza intracelli!l-mandatar,?
ff$LNA PCCECCO STJCIO G. L. P. S.a.s.
P.le Cavedalis 6 2 - 3310 21 gip 86-5461
1 lare.
2 (a) Microiniezione, indotta da fusione, di una 3 catena di ricina-A tramite liposomi fusogenici I risultati sommarizzati nella Tabella II 5 mostrano che solo i liposomi caricati con una catena 6 di ricina-A e contenenti il sale (sale-Q ) di 7 idrossido di ammonio quaternario hanno causato una 8 forte inibizione di sintesi proteica ed un alto 9 grado di eliminazione del HTC.
0 Nessuna eliminazione ? stata osservata sia con 1 liposomi non caricati che con catena di ricina-A 2 libera.
3 'Come si pu? osservare, un'eliminazione molto 4 esigua oltre il livello delle prove di controllo ? 5 stata causata dai liposomi contenenti il sale 6 (sale-C ) di cloruro di ammonio quaternario, 7 indicando cos? che non si ? verificata nessuna o 8 sostanzialmente nessuna fusione tra liposoma e 9 cellula.
Il mandatario BSUMA !OCECCO STJD?O G. L. P. S.a.s,
P.le Cavedalis 6 2
TABELLA II
Abilit? dei liposomi fusogenici caricati con ricina-A di inibire la sintesi proteica ed eliminare HTC
HTC incubato con: Inibizione della HTC eliminato sintesi proteica
% %
Liposomi di PC/colesterolo
0 0
Catena di ricina-A libera 5 4
Liposomi di PC/colesterolo caricati i con Ricina-A 6 7 ro ro
Liposomi di PC/colesterolo contenti
sale-Q (sale OH ) 5 8
Liposomi di PC/colesterolo caricati
con catena di ricina-A e contenti
sale-Q (sale OH ) 90 95
Liposomi di PC/colesterolo caricati
con catena di ricina-A e contenenti 17 14
sale-C (sale CI )
i/i
c: n O 03
& _ M ?a 2*3 00 O 0>
7?2. I 9 ft V PI ?
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i
23 gip 86-5461
La catena di ricina-A ? stata prima imprigionata entro liposomi di PC/colesterolo usando la tecnica descritta nel testo gi? citato di Szoka et al. "Procedure for preparation of liposomes, etc. ", dopo di che ? stato incorporato il sale di ammonio quaternario (o sale OH o sale C1 ) nello strato di spessore biomolecolare del liposoma, come descritto.
Negli esperimenti sono stati incubati per 30 minuti ad una temperatura di 37?C, 10-20 ^ig di liposomi con 10^ cellule, cio? un periodo durante il quale i liposomi hanno interagito con le cellule.
Al termine del periodo di incubazione, le cellule sono state lavate e nuovamente incubate in un mezzo di crescita per altre 12 ore ed in seguito sono state stimate la sintesi proteica (tramite
3
incorporamento di leucina- H) e la viabilit? delle cellule (macchinandole di blue Trypan ).
(b) Microiniezione, indotta da fusione, di SV^ -DNA I risultati della Tabella III mostrano che si possono usare i liposomi fusogenici per microiniettare dei geni attivi (molecole di DNA) nelle cellule in cultura, come HTC.
Tutte le condizioni sperimentali e l'incubazione con HTC sono state ottenute come descritto nella Tabella II per la ricina-A. Il mandatario
BflUk?A FOCECCO STUD;Q C. L. P. S.a.s.
P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE ? - 24 - gip 86-5461
Nei liposomi e stato imprigionato SV^ -DNA, come descritto nel testo citato di Szoka et al. "Procedure for preparation of liposomes, etc.".
L'apparizione dell 'antigene SV^Q-T ? stata stimata, come sopra descritto, con l'uso di un anticorpo specifico anti-antigene SV^Q-T contras" segnato fluorescentemente.
Il mandatario ?????? POCECCO STUDIO G. L. P. S.a.s.
P.le Cavedalis, ?/2 - 33100 UDINE
TABELLA III
Abilit? dei liposomi fusogenici caricati (liposomi contenenti sale-Q) di microiniettare SV -DNA
HTC incubato con liposomi Cellule positive di antigene caricati di SV. -DNA
40 SV -T (percentuale del totale)
ro? vn Liposomi di PC/colesterolo
PC/colesterolo contenente
sale-Q (sale OH ) 10 - 15
PC/colesterolo contenente sa
le-C (sale CI )
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26 gip 86-5461
L'antigene T specifico ? apparso nel nucleo del 10-15% delle cellule incubate con liposomi caricati con SV^0~DNA e contenenti sale-Q (sale OH ). Nessun antigene T ? apparso nelle cellule incubate con il PC/colesterolo caricato con SV^ -DNA ma contenente il sale-C (sale C1 ).
(c) Iniezione, indotta da fusione, di albumina di siero bovino BSA fluorescente in protoplasti di piante di Petunia Hybrida e sospensione di cellule di pianta
Sono stati preparati dei protoplasti di cellule di Petunia Hybrida tramite i metodi convenzionali come descritti nei testi citati.
Entro i liposomi ? stato imprigionato del BSA fluorescente, come descritto per la catena di ricina-A, e quindi ? stato incorporato un sale-0 nella membrana del liposoma caricato, come sopra descritto.
Nell'esperimento sono stati incubati 10-20 jxg di
5
liposomi caricati con 5 x 10 protoplasti o cellule di pianta.
Dopo 30-60 minuti di incubazione a 28?C, in seguito all'apparizione di fluorescenze intracellulari, ? stata effettuata una microscopia fluorescen-II mandatario te . BRUNA POCECCO
STUDIO G. L. P. S.a.s.
P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE
TABELLA IV
Iniezione, indotta da fusione, di BSA fluorescente in protoplastic di piante di Petunia
Hybrida e sospensione di cellule di pianta
Apparizione di fluorescenza intracellulare (% del totale delle cellule)
Protoplastic di Petunia incubati con i liposomi caricati di BSA fluorescente IV)
0 1 PC/colesterolo 0
PC/colesterolo contenente sale-Q ( sale OH ) 80
Sospensione di cellule di Petunia incubate
con liposomi caricati di BSA fluorescente
PC/colesterolo
t/i 0
e:
S 5 PC/colesterolo contenente sale-Q (sale OH 60
o = = 50
M
3 ?
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01
in
- 28 gip 86-5461
1 Dai risultati della Tabella IV ? ovvio che i 2 liposomi contenenti sale-Q (sale OH ) possono 3 microiniettare i loro contenuti anche nei protopla-4 sti di piante.
5 L'apparizione di fluorescenze pu? risultare solo 6 dalla fusione tra i liposomi caricati ed i 7 protoplasti di piante. Qualsiasi altro processo 8 condurrebbe ad un'altra forma di apparizione di 9 fluorescenza .
0 I risultati della Tabella IV mostrano che, oltre 1 alla fusione (o microiniezione) con i protoplasti di 2 piante, i liposomi caricati sono stati capaci di 3 fondersi e microiniettare il loro contenuto nelle 4 cellule di piante contornate dalla parete di una 5 cellula .
6 Per la presenza del sale altamente caricato, i 7 liposomi pare siano capaci di penetrare attraverso 8 la parete della cellula e di fondersi con la 9 membrana piasmatica.
0 Applicazione dei liposomi contenenti un sale di 1 idrossido di ammonio quaternario
2 Dopo aver illustrato la preparazione Liposomi 3 contenenti sali di idrossido di ammonio :ernariti mandatario
B^.UNA FOCECCO STiJLKQ G. L. p. s.a.s.
29 gip 86-5461
1 ed aver dimostrato l'abilit? dei liposomi contenenti 2 tale sale nelle membrane della vescichetta di ?3 fondersi con le cellule ed indurre la loro reciproca 4 fusione microiniet tando il contenuto delle 5 . vescichette nella cellula, verranno ora dimostrate 6 varie applicazioni dei liposomi discussi in questo 7 trovato.
8 (1) Uso del sale-Q (OH ) libero o dei liposomi 9 contenenti tale sale (OH ) come reagente per 10 indurre la fusione tra le cellule
11 La fusione tra cellule animali, come dimostrato 12 per i liposomi qui discussi, ? della massima 13 importanza per gli studi dell'espressione del gene.
14 Inoltre, la fusione del protoplasto di pianta 15 presenta molte applicazioni commerciali che possono 16 portare allo sviluppo di nuove specie di piante con 17 propriet? migliorate.
18 (2) L'uso di liposomi fusogenici per la microinie-19 zione di vari componenti in cellule, cresciute 20 in cultura, di animali e piante
21# I liposomi fusogenici caricati possono essere 22 usati per microiniettare proteina DNA ed RNA 23 (enzimi, ormoni) e farmaci nelle cellule di cultura.
24 Inoltre, possono essere usati per microiniettare 25 organelli o qualsiasi altro componente o molecoDamandatari?
BRUNA PCCECCO STUDiO G.L.P. S.a.s.
30 gip 86-5461
che possono essere imprigionati entro i liposomi.
La microiniezione di DNA, RNA o organelli nelle cellule, specialmente in protoplasti o cellule di piante, comporta una sostanziale applicazione commerciale cos? come pure l'intero campo dell'ingegneria genetica delle cellule di piante ed animali .
Inoltre, basandosi sugli esperimenti con cellule di piante ed animali, i liposomi contenenti un sale di idrossido di ammonio quaternario saranno capaci di fondere e microiniettare il loro contenuto in qualsiasi cellula con cui possono essere incubati.
Quindi, questi liposomi potranno fondersi con protoplasti di batteri, di lievito ed alghe.
(3) Uso di liposomi fusogenici per l'introduzione di vari componenti nelle cellule in vivo, cio? tessuti o cellule di animali interi
I liposomi fusogenici possono essere usati, dopo iniezione in animali di laboratorio o essere umani, come mezzo di introduzione di farmaci, ormoni o proteine, come enzimi e DNA.
Questo metodo pu? essere usato per farmaci, enzimi e per terapia di geni.
I liposomi non fusogenici caricati vengono usati Il mandatario oggigiorno come portatori di farmaci per terapie. POCECCO
STUPRO G.L.P. S.a.s.
P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE 31 gip 86-5461
Tuttavia, i liposomi fusogenici possono essere molto pi? efficaci di quelli non fusogenici come portatori biologici poich? essi iniettano il loro contenuto direttamente nel citoplasma cellulare.
(4) Uso dei liposomi fusogenici per lo sviluppo di un nuovo sistema di analisi sensitiva, non isotopica, per diagnosi
I liposomi contenenti sali di idrossido di ammonio quaternario si fonderanno con altri liposomi.
La fusione tra liposomi porta alla fuoriuscita del loro contenuto.
Tale fuoriuscita ? dovuta specificatamente all'interazione e fusione tra i liposomi.
Per la presenza delle molecole positivamente caricate di sale di idrossido di ammonio quaternario, i liposomi che contengono tali molecole di ammonio quaternario non possono interagire e si respingono a vicenda.
Come summenzionato, possono interagire e fondersi solo con liposomi da cui fuoriesce il sale di idrossido di ammonio quaternario.
Tuttavia, due qualsiasi molecole capaci di interagire tra loro con alta affinit? potranno costringere i liposomi contenenti il sale ^mandatario BRUNA POCECCO STUDIO G.L.P. S.a.s.
is 6 2 - 33100 UDINE 32 gip 86- 5461
1 idrossido di ammonio quaternario a fondersi tra loro 2 sopraffando le forze di repulsione della carica 3 positiva .
4 Quindi, se viene incorporato un antigene 5 specifico nelle membrane del liposoma contenente il 6 sale di idrossido di ammonio quaternario, un 7 anticorpo, preparato? contro tale antigene, 8 costringer? i liposomi ad interagire.
9 L'interazione tra liposomi contenenti il sale di 0 idrossido di ammonio quaternario condurr? alla 1 fusione ed alla liberazione del contenuto liposoma-2 le.
3 Qualsiasi stima quantitativa del processo di 4 liberazione {liberazione di colorante fluorescente o 5 qualsiasi altro reagente) sar? una misura dell'in-6 terazione tra antigene/anticorpo.
7 Perci? la fusione tra liposomi contenenti il sale 8 di idrossido di ammonio quaternario pu? essere usata 9 per stimare quantitativamente l'interazione tra un 0 anticorpo ed il suo antigene o ormone ed il suo 1 appropriato recettore.
2 Questo sistema quindi pu? essere usato per 3 stimare qualsiasi piccola quantit? di antigene o 4 ormone presente in qualsiasi fluido biologico.
5 Al tecnico di questo campo sar? ovvio che ^mandatario BRUMA POCECCO STUDiO G. L. P. S.a.s.
- 100 UDINE 33 gip 86-5461
possibile apportare varie modifiche entro l'ambito della suddetta descrizione; tali modifiche sono possibili per un tecnico in questo campo e formano una parte del presente trovato, essendo incluse nelle rivendicazioni aggiunte.
il mandatario BSUNA FOCECCO STUDIO G. L. P. S.B.S.
P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE 34 gip 86-5461
1 ?' RIVENDICATO:
2 1 - Vescichette fosfolipide contenenti un sale di 3 idrossido di ammonio quaternario nelle proprie 4 membrane, detto sale essendo presente in dose 5 sufficiente da rendere fusogeniche le vescichette. 6 2 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione 7 1, nelle quali detto sale di idrossido di ammonio 8 quaternario appartiene al gruppo che consiste di : 9 cetilbenzildimet il idrossido di ammonio, esadecil-0 trimetil idrossido di ammonio, cetil trimetil 1 idrossido di ammonio, di-isobutilcresossietossi-2 etildimetibenzil idrossido di ammonio, metildodecil-3 benzil-trimetic idrossido di ammonio, metildodecil-4 xilene bis (trimetil-idrossido di ammonio) e 5 ottilcresossietossietil dimetilbenzil idrossido di 6 ammonio.
7 3 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione 8 1 , nelle quali detto sale di idrossido di ammonio 9 quaternario ? ottilcresossietossietil dimetilbenzil 0 idrossido di ammonio.
1 4 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione 2 1 , nelle quali detto fosfolipide appartiene al 3 gruppo che consiste di: fosf atidicolina , dimiri-4 stoilfosf atidilcolina , dioleoilfosf atidilcolina , 5 dipalmi toilfosfat idilcol ina , distearoilfosf atidilco-11 mandata?>
BRUNA fOCECCO STL'D.O G.L.P. S.a.s.
le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE 35 gip 86-5461
1 lina, sf ingomielina , colesterolo e misture degli 2 stessi.
3 5 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione 4 1 , aventi incapsulati entro s? stesse il DNA o 5 frammento di DNA.
6 6 - Vescichette fosfolipide come alla rivendicazione 7 1, aventi incapsulati entro s? stesse un composto o 8 composizione farmaceuticamente attivo.
9 7 - Metodo per rendere fusogenica una vescichetta 10 fosfolipida, che presenta 1'incorporamento , nella 1 membrana di detta vescichetta, di un sale di 2 idrossido di ammonio quaternario.
13 8 - Metodo come alla rivendicazione 7, in cui detto 14 sale di idrossido di ammonio quaternario appartiene 15 al gruppo che consiste di: cetil benzildimetil 16 idrossido di ammonio, esadeciltrimetil idrossido di 17 ammonio, cetiltrimetil idrossido di ammonio, di? 18 isobutil cresossi etossi etil dimetibenzil idrossido 19 di ammonio, di-isobutil fenossi etossi etil 20 dimetilbenzil idrossido di ammonio, metil dodecil-21 benzil trimetil idrossido di ammonio, metil dodecil 22 xilene bis (trimetil idrosssido di ammonio), e 23 ottilcresossi etossietil dimetilbenzil idrossido di 24 ammonio.
__ . .. . . . limandatario 25 9 - Metodo come alla rivendicazione 7, in cui detJ^^ PQCECCO
STTD?O G. L. P. S.a.s.
P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE 1 - 36 - gip 86-5461
1 sale di idrossido di ammonio quaternario ? 2 ottilcresossi etossietil dimetilbenzil idrossido di 3 ammonio.
4 10 - Metodo come alla rivendicazione 7, in cui detto 5 sale di idrossido di ammonio quaternario ? 6 incorporato durante la formazione di detto 7 fosfolipide .
8 11 - Metodo come alla rivendicazione 7, in cui detto 9 sale di idrossido di ammonio quaternario ? 0 incorporato nella membrana di detta vescichetta dopo 1 la formazione del fosfolipide.
Il mandatario BRUNA FOCECCO STUDIO G. L. P. S.a.s.
p.le Caveda??s, 6/2 - 33100 UDINE DICHIARAZIONE E MANDATO DI PROCURA ASSOCIATI No. del registro 1810 PER LA DOMANDA ORIGINALE ED IN PENDENZA dell'agente incaricato
Come inventore qui sotto nominato, con questo documento io dichiaro che :
La mia residenza, recapito postale e cittadinanza sono come dichiarati qui di segui^ to vicino al mio nome,
Credo di essere l'originale, primo e solo inventore (se qui sotto viene dato un solo nome) o un inventore originale, primo ed associato (se qui sotto vengono elencati pi? nomi) dell'argomento rivendicato e per il quale viene richiesto un brevetto del trovato avente per titolo:
LIP0S0MI FUSOGENICI E METODO PER PREPARARLI
la cui specifica (contrassegno unico)
(XX) ? qui allegata.
( ) ? stata depositata il _ come no. di serie di domanda _ ed ? stata emendata il _
(se applicabile)
Con questo documento dichiaro di aver riesaminato e di aver compreso il contenuto della specifica identificata qui sopra, incluse le rivendicazioni come emendate da qualsiasi emendamento qui sopra riferito.
Riconosco il dovere di divulgare le informazioni pertinenti all'esame di questa dc> manda secondo il Titolo 37 del Codice delle Regole Federali, 1.56 (a).
Non so e non credo che l'invenzione sia mai stata conosciuta o usata negli Stati Uni ti prima della mia o nostra invenzione, o brevettata o descritta in qualsiasi pubbl^ cazicne Stampata in qualsiasi Paese prima della mia o nostra invenzione o per pi? di un anno prima di questa domanda o, per quanto riguarda l'argomento comune, per pi? di un anno prima della mia o nostra domanda antecedente degli Stati Uniti, se alcuna, qui sotto descritta:
Controllare l'appropriata casella se applicabile: Questa domanda ? una cont^ nuazione, divisionale, una continuazione in parte (come descritto nella specifica allegata a pagina...) della mia antecedente domanda USA, No. di serie depositata il
e che l'invenzione non era di uso pubblico o in vendita negli USA per pi? di un anno prima di questa domanda o di detta domanda antecedente relativa al contenuto comune dell'invenzione; che l'invenzione non ? stata brevettata o oggetto di un certificato d'inventore emesso prima della data di questa domanda o di detta domanda antecedente relativa a detto contenuto comune, in qualsiasi Paese fuori dagli USA per una domanda depositata da me o dai miei rappresentanti legali o cessionari pi? di dodici (12) mesi prima di questa domanda o detta antecedente domanda relativa al contenuto comune dell'invenzione, eccetto come qui di seguito esposto.
Pagina 1 di tre
Il mandatario BRUNA POCCCCO STUDIO G. L.P. S.a.s. P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE DICHIARAZIONE E MANDATO DI PROCURA ASSOCIATI
Con questo documento rivendico i benefici di priorit? all'estero secondo il Titolo 35 del Codice degli USA 119, di qualsiasi domanda /e estera /e di brevetto o certi_ ficato d'inventore qui di seguito elencati, ed ho inoltre identificato qui di segui to qualeiasi domanda estera di brevetto o certificato d'inventore aventi una data di deposito antecedente alla domanda per cui viene rivendicata la priorit?:
Precedente domanda /e estera /e Priorit? rivendicata
(No.) (Stato) Depositata il. 19... SI?( ) NO ( )
( No.) (Stato) Depositata il. 19... SI' ( ) NO ( )
(No.) (Stato) Depositata il . 19... SI' ( ) NO ( )
Con questo documento rivendico il beneficio secondo il Titolo 35 del Codice degli USA 120, di qualsiasi domanda /e US elencata /e qui di seguito, e poich? il contenuto di ognuna delle rivendicazioni di questa domanda non ? rivelato nelladomanda US antecedente nel modo previsto dal primo paragrafo del Titolo 35 del Codice degli USA 112, io riconosco il dovere di divulgare le informazioni pertinenti, come definite nel Titolo 37 del Codice delle Regole Federali 1.56 (a), divenute disponibili tra la data di deposito della domanda /e antecedente /i e la data di deposito nazionale o internazionale PCT di questa domanda:
No. di serie della domanda .
Data di deposito .
Categoria - brevettata, in pendenza, abbandonata .
No. di serie della domanda .
Data di deposito..
Categoria - brevettata , in pendenza, abbandonata .
MANDATO DI PROCURA: Come inventore designato, con questo documento nomino la seguente persona /e come mio agente con pieni poteri di sostituirmi per perseguire questa domanda e sbrigare tutti gli affa i ad essa pertinenti presso l'Ufficio Brevetti & Marchi: ALFRED W. BREINER - No. di registrazione 18,679
Inviare la corrispondenza a : BREINER & BREINER, 115 North Henry Street,
P.O. Box 19290, Alexandria, Virginia 22320-0290 Chiamate telefoniche a: ALFRED W. BREINER AL (703) 684-6885
Pagina 2 di 3
Il mandatario BRUNA FOCECCO ST Jr.lO G. L. P. S.a.s.
DICHIARAZIONE E MANDATO DI PROCURA ASSOCIATI
Con questo documento dichiaro che tutte le affermazioni qui contenute fatte secondo la mia propria conoscenza sono vere e che tutte le dichiarazioni fatte, relative ad informazioni ed opinioni sono fatte in buona fede: ed inoltre che tutte queste dichiarazioni sono state fatte sapendo che le dichiarazioni intenzionalmente false e simili cosi fatte sono punibili con multe e carcerazione o entrambi, secondo la Sez. 1001 del Titolo 18 del Codice degli USA, e che tali dichiarazioni intenzionalmente false potrebbero mettere a repentaglio la validit? della domanda o qualsiasi brevetto concesso a tale scopo.
Cognome e nome dell'inventore o primo inventore - Firma Data
ADOLFO GUILLERMO GITMAN 21.3.1985 Residenza: Cittadinanza:
Kadish Luz 8/64, Ramat Sharet Israeleana
Indirizzo postale:
Jerusalem, Israele
Cognome e nome del secondo inventore associato Firma Data
ABRAHAM LOYTER 21.3.1985 Residenza: Cittadinanza:
9 Hachim Street Israeleana
Indirizzo postale:
Jerusalem, Israele
/
? 6 ?"J. T86
Pagina 3 di 3
ijf mandatario BfW Ea STc's/iO1 GJLTP.
P.le Cavedalis 6 .
N. 1018/86 ? ? / F 8t>
AUTENTI CAZIONE DELLA FIRMA
Io iL sottoscritto Y. ROTTENBERG
Notaio in Gerusalemme
certifico che il 27 Marzo 1986
? apparso davanti a me nel mio Ufficio il Sig.
SAMUEL SIMON ASCULAI, che io personalmente conosco
(la e?i identit? ? stata da me provata dal suo Libretto di identificazione (Passaporto) N. Z 5054262 emesso dal Consolato GeneraLe degli Stati Uniti a TORONTO - CANADA IL 20/6/84 e che ha firmato per libera volont? il suddetto documento (il documento allegato marcato 1018/86/A)
(il documento seguente).
A testimonianza di quanto detto io certifico la firma del Sig. SAMUEL SIMON ASCULAI con La mia firma e il mio sigillo, questo il 27 Marzo 1986
Tasse pagate
Nel caso che sia presente pi? di una persona, ognuna di dette persone dovr? essere separatamente e specificatamente nominata cos? da provarne l'identit?.
Nota: cancellare quello che non ? applicabile.
I l/ mandatario
STUD
P.le Cavedalis, 6/2 - 33100 UDINE
?39 / F 86
UTILIT?' REGOLARE
Dal PTO-438
Rev. 8/78
No.. di serie 719862 Data del brevetto No. del brevetto
(serie del 1979
No. di serie Data di deposito Classe Sottoclasse Unit? del gruppo Esaminatore di tecnica
06/719,862 04.04.85 435 128
RICHIEDENTI:
Adolfo G. GITMAN, Jerusalem, ISRAELE; Abraham LOYTER, Jerusalem, ISRAELE.
DATI DI CONTINUIT?' *************
VERIFICATI
DOMANDE ESTERE/PCT *************
VERIFICATE
Priorit? rivendicata all'estero s? no Stato o nazione Fogli dei disegni
COME DEPOSITATA
Condizioni del 35 USC 119 soddisfatte s? no
Verificato e riconosciuto - Iniziali esaminatore ILX 0
Totale delle rivendicazioni Rivendicazione indipendenti Tassa di deposito ricevuta No. di registro dell'agente incaricato
11 $ 300.00 1810
^INDIRIZZI : BREINER & BREINER
?\o 115 North Henry St.
P.O. Box 19290
ALEXANDRIA, VA 22320-0290
TITOLO: LIPOSOMI FUSOGENICI E METODO PER PREPARARLI
Questo documento certifica che quanto qui allegato ? una copia vera e tratta dai registri dell'Ufficio Brevetti e Marchi degli Stati Uniti della domanda come depositata originalmente ed identificata qui sopra.
Con l?autorit? del
COMMISSARIO BREVETTI E MARCHI
(firma)
Funzionario attestante
Data 21 Marzo 1986
DOMANDA
di
ADOLFO GUILLERMO GITMAN e ABRAHAM LOYTER
PER
LIPOSOMI FUSOGENICI E METODO PER PREPARARLI
Si sappia che NOI, ADOLFO GUILLERMO GITMAN, e ABRAHAM LOYTER, cittadini israeleani, residenti a Kadish Luz 8/64, Ramat Sharet, Jerusalem, ISRAELE; e 9 Hachim Street, Jerusalem, ISRAELE, rispettivamente, hanno inventato certi nuovi ed utili miglioramenti nei
LIPOSOMI FUSOGENICI E METODO PER PREPARARLI
di cui quanto segue ? una specifica:
11 mandatario BRUNA POCECCO STUDIO G. L. P. S.a.s.
1 gip 86-5461
1 CAMPO DI APPLICAZIONE
2 Questo trovato si riferisce a liposomi e pi? 3 particolarmente a liposomi contenenti nelle loro membrane un sale di idrossido di ammonio quaternario 5 che permette a detti liposomi di fondersi con le 6 cellule di animali o di piante e di microiniettare 7 il proprio contenuto in dette cellule.
8 SFONDO E TECNICA NOTA
9 Generalmente i liposomi, come intesi in questo 0 testo, sono delle vescichette composte di molecole 1 fosfolipide .
2 E' risaputo che i liposomi offrono un mezzo per 3 introdurre farmaci, o altre sostanze regolatrici, 4 nella cellula di un animale, o di una pianta, per 5 modificarne la fisiologia cellulare .
6 Dal momento in cui ci si ? resi conto che i 7 liposomi possono svolgere un importante ruolo 8 nell'introduzione in una cellula di farmaci o 9 sostanze capaci di modificare la fisiologia 0 cellulare della stessa, si sono proposti vari metodi 1 per creare o preparare liposomi, inclusi liposomi 2 con un grande spazio interno acquoso per imprigiona-3 re un farmaco o altre molecole modificatrici che 4 dovr? essere trasferito come descritto nel 5 "Procedure for preparation of liposome with larg^1mandatar'?
J BRUNA POCECCO STLiD?O G.L.P. S.a.s.
" 2 gip 86-5461
Internai Aqueous space and high capture by reversephase evaporatici" (Procedimento per la preparazione di iiposomi con grande spazio interno acquoso ed alta cattura tramite evaporazione a fase inversa) di Szoka e Papahadjopoulos, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 75, 197.8 pagine 4194-4198.
Altri- metodi hanno lo scopo primario di migliorare i procedimenti per imprigionare un farmaco, o simile, nel liposoma, come descritto in "Dehydration-Rehydration Vesicles: A simple method for high yield drug entrapment in Liposomes" (Vescichette di disidratazione e reidratazione Metodo semplice per l'imprigionamento di farmaci ad alto rendimento in Iiposomi), di Kirby & Gregoriadis, Bio/Technology , Novembre 1984, pagine 979-984.
II brevetto US 4,235,871 descrive un metodo per incapsulare numerose sostanze biologicamente attive entro vescichette sintetiche a lipidi lamellari, fornendo una mistura lipida in un solvente organico ed una mistura acquosa della sostanza per incapsulare ed emulsionare la mistura ottenuta, per rimuovere il solvente organico e sospendere in acqua il gel risultante .
Inoltre , in vari brevetti , si sono suggerite diverse applicazioni per Iiposomi come mezzo di5' mandatario
BRUNA FOCECCO STUD!O G. L. P. S.a.s.
Cavedalis, 6 2 - 33100 UDINE
Claims (2)
- 3 gip 86-54611 trasferimento.
- 2 Quindi, il suddetto brevetto US descrive parecchi 3 composti attivi e composizioni incapsulate nel 4 liposoma da incorporare nelle cellule.5 II brevetto US 4,394,448 riguarda specificatamen-6 te l'inserimento dell'acido desossiribonucleico 7 (DNA) o frammenti dello stesso in una cellula 8 vivente, cos? che il DNA o frammento venga 9 incapsulato in una vescichetta lipida e detta 0 vescichetta venga messa a contatto con la cellula, 1 provocando cos? l'inserimento.2 I brevetti US 4,199,565, 4,201,767, 4,261,975 e 3 4,235,877 descrivono 1'incorporamento di un antigene 4 virale o batterico nei liposomi che contengono un 5 tensioattivo caricato positivamente contenente un 6 ammino che pu? essere un sale di alogenuro di 7 ammonio quaternario.8 II brevetto US 4,483,929 descrive una reattivo di 9 liposoma immunoreagente da usare nella determinazio-0 ne di ?un composto chimico capace di produrre una 1 reazione immunospecifica con un anticorpo noto.2 In tutte le applicazioni conosciute al richieden-3 te, anche se ? stato dimostrato che i liposomi 4 fosfolipidi sono capaci di introdurre il loro5 contenuto nelle cellule coltivate oltre che nelld! mandatarioBRUNA POCECCO STUDSO G.L.P. S.a.s.
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