NL8600794A

NL8600794A - Fusogene liposomen en werkwijze voor het bereiden daarvan.

Info

Publication number: NL8600794A
Application number: NL8600794A
Authority: NL
Original assignee: Int Genetic Sciences
Priority date: 1985-04-04
Filing date: 1986-03-27
Publication date: 1986-11-03
Also published as: ES553703A0; DE3610873A1; IT1189877B; IT8683340A1; CA1262863A; NZ215696A; JPS61274739A; IT8683340A0; FR2579891A1; CH668005A5; GB2188900A; GB2188900B; GB8608468D0; IL78348A0; BE904536A; ES8802401A1; FR2579891B1; AU5562286A; SE464448B; ZA862466B

Description

• - « - 1 -

Fusogene liposomen en werkwijze voor het bereiden daarvan.

Deze uitvinding heeft betrekking op liposomen. Meer ί in het bijzonder heeft deze uitvinding betrekking op liposomen bevattende een quaternair ammoniumhydroxydezout in de membranen daarvan, hetgeen het mogelijk maakt dat de liposomen 5 versmelten met dier- en plantcellen, en de inhoud daarvan op microschaal inspuiten in de dier- en plantcellen.

In het algemeen zijn liposomen, en zoals de term in deze beschrijving wordt gebruikt, blaasjes die zijn bereid uit fosfolipidemoleculen. Algemeen wordt ingezien, dat liposo-10 men een middel verschaffen voor het toevoeren van geneesmiddelen of andere reguleringsstoffen in een dieren- of planten-cel ter wijziging van de celfysiologie. Sinds men er zich van bewust is, dat liposomen een belangrijke rol kunnen spelen bij het toevoeren van geneesmiddelen of een materiaal dat 15 de cellulaire fysiologie zal veranderen in een cel, zijn uiteenlopende werkwijzen voorgesteld voor het verschaffen of bereiden van liposomen daaronder begrepen liposomen met een grote inwendige waterige ruimte voor het invangen van een geneesmiddel of ander modificerend molecuul dat dient te worden 20 overgebracht zoals is beschreven in "Procedure fos Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation," door Szoka en Papahadjopoulos, Proc.Natl.Acad.Sci., USA 75, 1978, biz.4194-4198. Andere werkwijzen zijn in de eerste plaats gericht op 25 het verbeteren van procedures voor het invangen van een geneesmiddel of dergelijke in het liposoom, zoals is beschreven in "Dehydration-Rehydration Vesicles: A simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes,", door Kirby en Gregoriadis, Bio/Technology, november 1984, biz.979-984. Het 30 Amerikaanse octrooischrift 4.235.871 beschrijft een werkwijze voor het inkapselen van talrijke biologisch werkzame materialen in synthetische oligolamellaire lipideblaasjes door het verschaffen van een mengsel van vet in een organisch oplosmiddel en een waterig mengsel van het materiaal ter inkapse-35 ling, emulgering van het verschafte mengsel, het verwijderen van het organisch oplosmiddel, en het suspenderen van het ontstane gel in water. Voorts wordt een variëteit van toepassingen voor liposomen als een overbrengingsmiddel in talrijke ' ' i r ; - 2 - octrooischriften voorgesteld. Zo worden in het boven vermelde Amerikaanse octrooischrift 4.235.871 talrijke werkzame verbindingen en samenstelling ingekapseld in het liposoom ter opneming in cellen, beschreven. Het Amerikaanse octrooischrift 5 4.394.448 is in het bijzonder gericht op de inbrenging van deoxytribonucleïnezuur (DNA) of fragmenten daarvan in een levende cel zodat het DNA of fragment wordt ingekapseld in een vetblaasje en het blaasje in aanraking wordt gebracht met een cel zodat inbrenging optreedt. In de Amerikaanse octrooischrif-10 ten 4.199.565; 4.201.767; 4.261.975 en 4.235.877 wordt beschreven de opneming van een viraal of bactetiëel antigeen in liposomen die een positief geladen amino-bevattende oppervlak-te-actieve stof bevatten, die een quaternair ammoniumhaloge-nidezout kan zijn. In het Amerikaanse octrooischrift 4.483.929 15 wordt beschreven een immuno-reagerend liposoomreagens voor gebruik in de bepaling van chemische verbinding die in staat is om in een immuno specifieke reactie met een bekend anti-lichaam te treden. In alle aan aanvraagster bekende aanvragen werd beschreven, dat, hoewel is aangetoond dat fosfolipide-20 liposomen in staat zijn een inhoud toe te voeren aan gekweekte cellen en voorts aan cellen van specifieke weefsels van hele dieren, deze liposomen relatief slechte dragers zijn. Men neemt aan, dat deze liposomen uit de stand van de techniek de gedragen stoffen, d.w.z. het geneesmiddel, toevoeren aan 25 cellen onder toepassing van endocyt-achtige werkwijzen. In overeenstemming daarmee bereikt slechts een klein percentage van de moleculen die zijn ingevangen in de liposomen, het cytoplasma van de ontvangende cellen. Bovendien werd, toen liposomen bij dieren werden ingespoten, evenals in mensen, 30 vastgesteld, dat ten hoogste tot een bepaalde concentratie fosfolipide liposomen inert en niet immunogeen zijn. Slechts bij relatief hoge concentraties zijn liposomen immunogeen en toxisch. Deze liposomen uit de stand van de techniek zijn, hoewel zij niet in staat zijn om cellen te agglutineren, niet 35 fusogeen en ondergaan niet en zijn niet in staat tot, het versmelten met een celmembraan of het induceren van cel-celver-smelting.

Ook werd vastgesteld, dat omhulsels van bepaalde dierlijke virus zoals die welke zijn verkregen uit Sendai 40 virus, fusogeen zijn en daarvan werd aangetoond, dat zij die- - 3 - * nen als een doeltreffende drager voor het toevoeren van moleculen aan gekweekte cellen zoals is vermeld in "A New Method for Reconsititution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes" , door Vainstein en anderen, Biochimica et Biophysics Ac-5 ta, 773 (1984), blz. 181-188. Men neemt aan dat de fusogene werkzaamheid van deze virüs is toe te schrijven aan de aanwezigheid van specifieke virale glycoproteïnen in de virusomhulsels. Er blijkt echter, dat de aanwezigheid van een proteïne in de fusogene virale omhulsels deze blaasjes immuno-10 geen maken en daarom onbruikbaar voor gebruik in vivo. Inspuiting van virale omhulsels in dieren induceert de vorming van specifieke antivirale antilichamen, een feit dat het gebruik daarvan als een biologische drager in vivo beperkt.

De vermelde literatuur stelt daarom vast, dat,.

15 hoewel van fosfolipide blaasjes is ingezien, dat zij een potentieel belangrijk werktuig zijn voor het opnemen van geneesmiddelen en andere celmodificerende materialen in cellen, vanwege de beperkingen van de liposomen volgens de stand van de techniek, proefondervindelijk is gebleken, dat 20 deze techniek slechts beperkt succes had.

Daarom is een eerste doel van de onderhavige uitvinding het verschaffen van liposomen fusogeen zijn en die zullen versmelten met een celmembraan en cel-tot-celfusie zullen induceren.

25 Een ander primair doel van de onderhavige uit vinding is het verschaffen van een werkwijze voor het bereiden van liposomen die met een celmembraan zullen versmelten en cel-met-celversmelting zullen induceren.

De doelen van de onderhavige uitvinding worden 30 bereikt door opneming van een quaternair ammoniumhydroxyde-zout in het membraan van een liposoom hetzij tijdens de bereiding van het liposoom hetzij nadat het liposoom is bereid. Gevonden werd dat de aanwezigheid van het quatemaire ammoniumhydroxydezout in het fosfolipide blaasjesmembraan 35 het mogelijk maakt, dat het blaasje versmelt met een celmembraan en cel-tot-celversmelting induceert. Als het blaasje wordt beladen met een geneesmiddel of andere celmodificerende stof, zal de inhoud van het blaasje op micro-schaal worden ingesloten in de dieren- of plantencel. Het 40 vermogen van het quaternair ammoniumhydroxydezout om de « * - 4 - fosfolipide blaasjes om te zetten uitgaande van niet-fusogene in fusogene blaasjes is bijzonder verrassend omdat quater-naire ammoniumzouten andere dan de hydroxydezouten blaasjes verschaffen die niet-fusogeen zijn. Zo werd gevonden dat 5 fosfolipide blaasjes bevattende quaternaire ammonium- halogenidezouten, quaternaire ammoniumacetaatzouten en dergelijke niet zullen versmelten met een cel en daarom niet op microschaal de inhoud van de blaasjes in een cel inspuiten. Deze blaasjes reageren op een wijze soortgelijk 10 aan de bekende niet-fusogene blaasjes, en nemen blijkbaar de inhoud van blaasjes in cellen op door middel van een endocytachtig proces. Anderzijds maken de fusogene karakteristieken van de liposomen van de onderhavige uitvinding een geschikt middel mogelijk voor het opnemen van een 15 cel-modificerende stof die rechtstreeks in een fosfolipide blaasje rechtstreeks in een planten- of dierencel kan worden opgenomen in vrijwel quantitatieve hoeveelheden.

Het quaternaire ammoniumhydroxydezout ter opneming in de wand of membraan van het fosfolipide blaasje 20 heeft de formule als is weergegeven op het formuleblad, waarbij R1 een groot alkylgroep of een combinatie van alkyl-en arylgroep is teneinde de kenmerken van een oppervlakte-actieve stof te geven aan het zout, en R2, en R^ alkyl-radikalen met vertakte keten van 1 tot 20 koolstofatomen, 25 of een arylradikaal zijn, of R2 en R3 tezamen kunnen vormen een uit 5-atomen of 6-atomen bestaand heterocyclisch radikaal bijvoorbeeld pyrrool of pyridine. Verbindingen met bijzondere voorkeur zijn de oppervlakte-actieve stoffen cetylbenzyl-dimethylammoniumhydroxyde, hexadecyltrimethylammonium-30 hydroxyde, cetyltrimethylammoniumhydroxyde, di-isobutyl- cresoxyethoxyethyldimethylbenzylammoniumhydroxyde, di-isobutyl-fenoxyethoxyethyldimethylbenzylammoniumhydroxyde, methyl-dodecylbenzyltrimethylammoniumhydroxyde, methyldodecylxyleen-bis (trimethylammoniumhydroxyde) , N-alkyl (Cl2, C14,C ) dimethyl-35 benzylamminiumhydroxyde en octylcresoxyethoxyethyldimethyl-benzylammoniumhydroxyde. Het is wezenlijk, dat het quaternaire ammoniumhydroxydezout oppervlakte-actieve karakteristieken heeft en het hydroxyradikaal bevat teneinde fusogene karakteristieken te geven aan het fosfolipide blaasje. De 40 hoeveelheid in de blaasjes opgenomen quaternaire ammonium- i ; - * V -V ':'f - 5 - hydroxydezout zal onder normale omstandigheden liggen in het traject van ongeveer 5 tot 750 ug/l mg fosfolipide en bij voorkeur van ongeveer 50 tot 250 ug quaternaire ammoniumhydroxydezout per 1 mg fosfolipde.

5 De liposomen die bruikbaar zijn in overeenstemming met de onderhavige uitvinding kunnen elk liposoom uit de stand van de techniek zijn. Illustratieve liposomen sluiten in het natuurlijk en synthetisch fosfocholine-bevattend vet met één vetzuurketen van 12 tot 20 koolstofatomen en één 10 vetzuurketen van tenminste 8 koolstofatomen bijvoorbeeld dimyristoylfosfatidylchloride, dioleoylfosfatidylcholine, dipalmitoylfosfatidylcholine, distearoylfosfatidylcholine, fosfatidylcholine en sfingomyeline; en voorts choleterol en dergelijke. De liposomen kunnen worden bereid onder toe-15 passing van elke bekende gepubliceerde werkwijzen zoals sonicatie van fosfolipide suspensies, omgekeerde verdamping of door hydratatie van gedroogde lagen van fosfolipide moleculen. Geschikte technieken zijn beschreven in "Procedure fos Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous 20 Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation," van Szoka en anderen, zoals in het voorafgaande vermeld; "Dehydration-Rehydration Vesicles: A Simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes," door Kirby en Gregoriadis, zoals in het voorafgaande vermeld, en voorts 25 andere bekende technieken zoals toepassing van detergentia (zie Szoka en Papahadjopoulos, Annu.. Rev. Biophys. Bioeng., 9_ (1980), blz. 467-480) . Aanvullend kan de celmodificerende stof, die kan worden ingevangen in het liposoom en die op microschaal kan worden ingespoten in dieren- of planten-30 cellen via versmelting met de liposomen van de onderhavige uitvinding, elke eerder voorgestelde stof zijn. Gevonden werd, dat stoffen, die in het liposoom kunnen worden inge-kapseld en in een cel op microschaal kunnen worden ingespoten in overeenstemming met de onderhavige uitvinding, 35 insluiten DNA en DNA-fragmenten; farmaceutisch werkzame verbindingen en preparaten daarvan zoals koolhydraten, nucleotiden, polynucleotiden, zowel in de natuur voorkomend als synthetisch; influenza vaccins en antigenen, en voorts andere stoffen, die de fysiologie van dieren- en planten-40 cellen kunnen aantasten.

- 6 -

Na deze beschrijving van de uitvinding in algemene termen volgen nu twee voorbeelden die hierbij de voor-keur-toebereidingen van de fusogene liposomen volgens de onderhavige uitvinding toelichten.

5 Voorbeeld I

Opneming van quaternair ammoniumhydroxydezout in liposoommembranen tijdens liposoorobereiding.

2 mg van een ongeladen fosfolipide, fosfotidyl-choline (PC), en 1 mg cholesterol werden gedroogd van hun 10 chloroformoplossing. De droge laag verkregen van het PC en cholesterol werd gesolubiliseerd met 1 ml diethylether, en de verkregen oplossing werd toegevoegd aan een suspensie bevattende 2 mg octylcresoxyethoxyethyldimethylbenzyl-ammoniumhydroxyde (Q-zout) in acetaatbuffer, bij een pH 15 van 7/0. De verkregen suspensie werd daarna krachtig in een wervel geroerd en kort gesoniceerd in een badsonicator.

Na omgekeerde verdamping werden daarna grote unilamellaire liposomen vervolgens bereid in overeenstemming met de werkwijze beschreven in "Procedure fos Preparation of 20 Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High

Capture by Reverse-Phase Evaporation," door Szoka en anderen, zie hierboven.

Overmaat, niet-opgenomen Q-zout werd verwijderd door de toevoeging van SM-2 biokorrels onder toepassing van 25 de techniek beschreven in "A New Method fos Reconsititution of Highly Fusogenic Sendai Virus Envelopes," door Vainstein en anderen, zie hierboven. Zo werden ongeveer 50-80 mg SM-2 bio-korrels geincubeerd met de bovenbeschreven fosfo-lipiden en Q-zout gedurende 40-60 minuten bij kamertempe-30 ratuur onder zachtjes schudden, in een eindvolume van 1 ml acetaatbuffer. Een quantitatieve bepaling gaf te zien, dat ongeveer 30-40% van het toegevoegde Q-zout was opgenomen in de fosfolipide dubbellaag (300-400 yg Q-zout/1 mg PC). Ter bereiding van liposomen beladen met enige component 35 van belang, werden de gewenste componenten zoals geneesmiddelen, enzymen, RNA of DNA toegevoegd aan de buffer, waarin de fosfolipiden waren gesuspendeerd, zoals beschreven in "Procedure fos Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase 40 Evaporation," door Szoka en anderen, zie hierboven.

*.-*** \ r 1 4 - 7 -

De werkwijze voor de bereiding van fusogene liposomen zoals beschreven in voorbeeld I, wordt niet aanbevolen wanneer geladen moleculen worden ingevangen in de liposomen. Onder bepaalde omstandigheden en bij een bepaalde 5 pH zal elke negatief geladen component worden gecomplexeerd met het quaternaire ammoniumhydroxydezout en daarmee neerslaan. Omdat het quaternaire ammoniumhydroxydezout positief geladen is, zal het in elektrostatische wisselwerking treden met elk negatief geladen molecuul, zoals de nucleïne-10 zuren bijvoorbeeld DNA of RNA die sterk negatief geladen zijn bij neutrale pH. De vorming van dergelijke complexen tussen het positief geladen quaternaire ammoniumzout en de negatief geladen moleculen doet het invangingsrendement (aantal moleculen ingevangen in elk liposoom) en de fusogene 15 werkzaamheid van de liposomen afnemen. Dienovereenkomstig wordt in voorbeeld II een tweede techniek ter bereiding van fusogene liposomen beschreven waarin rechtstreeks contact tussen het quaternaire ammoniumhydroxydezout en de ingevangen moleculen wordt vermeden.

20 Voorbeeld II

Inbrenging van Q-zout in al bereide, beladen liposomen._' _-

Beladen liposomen werden bereid zoals beschreven in voorbeeld I of in overeenstemming met eerder gepubli-25 ceerde hierboven beschreven werkwijzen.In tegenstelling met de in voorbeeld I beschreven werkwijze werd het Q-zout echter niet toegevoegd tijdens de bereiding van de liposomen maar na de bereiding van de beladen liposomen toegevoegd aan een suspensie die beladen, opnieuw luchtdicht afgesloten 30 liposomen bevatten. Incubatie van Q-zout met een suspensie van weer luchtdicht afgesloten liposomen leidde tot de opneming van het hydrofobe deel van het Q-zoutmolecule in de liposoom fosfolipide dubbellaag (bilayer).

De werkwijze werd als volgt uitgevoerd: Een 35 suspensie bevattende fosfolipide blaasjes (liposomen) bereid uit 2 mg PC en 1 mg cholesterol, gesuspendeerd in 400 ul acetaatbuffer werd toegevoegd aan een buis bevattende 3 mg Q-zout in 20 μΐ acetaatbuffer. Het verkregen mengsel werd krachtig in wervelvorm geroerd, waarna het 10-15 minuten 40 lang bij 37°C onder zachtjes schudden werd geincubeerd.

"V *· - 8 -

Overmaat vrij niet opgenomen Q-zout werd verwijderd door adsorptie aan SM-2 bio-korrels als in het voorafgaande beschreven. Een quantitatieve bepaling gaf opnieuw te zien, dat ongeveer 30% van het toegevoegde Q-zout was opgenomen 5 in de fosfolipide dubbellaag.

Deze werkwijze volgens voorbeeld II kan voordelig zijn voor bepaalde bereidingen boven de werkwijze volgens voorbeeld I omdat moleculen die zijn ingesloten in de liposomen worden ingevangen in het liposoom voor de toevoe-10 ging van het Q-zout; en daarom kan geen wisselwerking optreden tussen het ingesloten materiaal en de toegevoegde oppervlakte-actieve stof. Bovendien zijn fusogene eigenschappen van liposomen die het onder toepassing van de werkwijze volgens voorbeeld II bereide Q-zout dragen, beter 15 dan die van liposomen die zijn bereid onder toepassing van de techniek volgens voorbeeld I.

Het vermogen van liposomen samengesteld uit fosfatidylcholine en cholesterol (PC/cholesterol liposomen) zoals beschreven in voorbeeld II ter inducering van cel-cel-20 versmelting werd onderzocht door incubatie met mens-erythro-cyten en met hepatomaweefsel gekweekte cellen (HTC) in vergelijking met vergelijkingsmaterialen. Het Q-zout dat octylcresoxyethoxyethyldimethylbenzylammoniumhydroxyde was; C-zout dat octylcresoxyethoxyethyldimethylbenzyl-25 ammoniumchloride was, en B-zout dat benzyldimethylhexadecyl-ammoniumbromide was, werden opgenomen in al gevormde liposomen, zoals is beschreven in voorbeeld II. In deze experimenten werden ofwel vrij Q-zout (5-10 yg) ofwel vrij C-zout (5-10 yg) ofwel vrij B-zout (5-10 yg) ofwel liposomen 30 die deze ammonium quaternaire moleculen (20 yg PC) droegen, g geincubeerd met een celsuspensie (10 cellen) gedurende 15 minuten bij 37°C. Agglutinering van de cellen en cel-cel-versmelting werden gevolgd door waarneming in een fase-microscoop. De resultaten zijn in tabelvorm weergegeven 35 in tabel A.

- 9 -

TABEL A

Karakterisering van liposomen die fusogene en niet-fusogene quaternaire ammoniumzouten dragen

Agglutinering Cel-celver- 5 _ smelting

Mens-erythrocyten geincubeerd roet;_ PC/cholesterolliposomen

Vrij Q-zout (OH zout) + + 10 PC/cholesterolliposomen die Q-zout dragen (OH zout) + +++

Vrij C-zout (Cl zout) + PC/cholesterol C-zout (Cl zout) + 15 Vrij B-zout + - PC/cholesterolliposomen die B-zout dragen + - HTC geincubeerd met: 20 PC/cholesterolliposomen

Vrij Q-zout (OH zout) + + PC/cholesterolliposomen die Q-zout dragen (OH zout) + +++

Vrij C-zout (Cl zout) + - 25 PC/cholesterolliposomen die C-zout dragen (Cl zout) + B-zout + PC/cholesterolliposomen die B-zout dragen + 30

De in tabel A samengevatte resultaten stellen vast ï (1) Liposomen die waren samengesteld uit PC/cholesterol maar niet de ammonium guaternair moleculai droegen 35 hadden geen enkel effect op de agglutinering of cel-cel-versmelting van de mens-erythrocyten of de HTC cellen.

(2) Alle gebruikte ammonium quaternaire moleculen (Q-zout, C-zout en B-zout), hetzij in hun vrije vorm hetzij opgenomen in liposomen, waren in staat om cel-cel- 4Q agglutinering te induceren. Men neemt aan, dat is toe te schrijven aan de bevestiging van de positief geladen quaternaire ammoniumzoutmoleculen aan de negatief geladen cel-membranen.

t r » - 10 - (3) Alleen het Q-zout, d.w.z. het hydroxydezout, hetzij in vrije vorm hetzij opgenomen in liposomen, was in staat cel-celversmelting te induceren. Inductie van cel- -celversmelting door liposomen die Q-zout droegen was veel 5 hoger dan door vrij Q-tzout. De quaternaire ammoniumchloride-en bromidezouten induceerden cel-celversmelting niet ondanks het feit dat zij in staat waren zich te binden aan celmem-branen, zoals kan worden afgeleid uit een vermogen om cel-celglutinering te induceren.

10 Versmelting van liposomen die een quaternair ammoniumzout dragen, met cellen is ook te zien uit hun vermogen om hun inhoud op microschaal in te spuiten in het cytoplasma van die dieren- en plantencellen. Drie systemen zijn toegepast ter verzekering van de versmelging van 15 liposomen die Q-zout dragen, met, en microinspuiting van hun inhoud in levende cellen, één en ander als volgt: (1) De toxine ricine A-keten werd ingesloten in de liposomen, en deze beladen liposomen werden geincu-beerd met cellen in kweek zoals HTC. Ricine A belemmert 20 celproteïnesynthese, en doodt dientengevolge cellen alleen wanneer het aanwezig is binnen de cel. In tegenstelling tot het gehele molecule van ricine (ricine bevattende beide subeenheden A en B) kan de ricine A keten zelf niet cellen binnenkomen. Daarom heeft het, wanneer het buiten de 25 cel aanwezig is, geen enkel lethaal effect.

(2) Het SV^q-DNA, namelijk DNA geëxtraheerd uit het virus SV^g, werd ingesloten in de liposomen. Liposomen beladen met SV^g-DNA werden geïncubeerd met gekeekt HTC. Microinspuiting van het SV^g-DNA in de HTC cellen werd waar- 30 genomen door het vóórkomen van een specifiek proteïne, het SV^g-T-antigeen. Synthese van SV^g-T-antigeen wordt geïnduceerd alleen wanneer SV4Q-DNA wordt toegevoerd aan het cel-sitoplasma vanwaaruit het wordt overgebracht naar de celkern.

35 Ook wordt opgemerkt dat (a) voorkomen van SV^g-T- antigeen zich alleen voordoet in levende cellen, omdat het werkzam proteïnesynthese vereiste; en (b) vrije SV^g-DNA moleculen zijn, wanneer zij geincubeerd zijn met levende cellen, niet in staat om de cellen binnen te komen en daarom 40 induceren deze vrije moleculen synthese van het T-antigeen - 11 - niet.

(3) Fluorescerend gelabeleerde protexnemoleculen, namelijk fluorescerend gelabeleerd runderserumalbumine, BSA; werden ingesloten in de liposomen. Beladen liposomen 5 werden daarna geïncubeerd met ofwel planten-protoplasten ofwel een suspensie van plantencellen. Versmelting-bemiddelde microinspuiting werd waargenomen door het optreden van intracellulaire fluorescentie te volgen.

(a) Versmelting-bemiddelde microinspuiting van ricine 10 A keten door fusogene liposomen._

De in tabel B samengevatte resultaten geven weer, dat alleen liposomen beladen met ricine A keten en het quaternaire ammoniumhydroxy dezout (Q-zout) dragend, sterke belemmering van protexnesynthese en een hoge graad van 15 doding in HTC veroorzaakten. Geen doding werd waargenomen hetzij met ongelade liposomen hetzij met vrij ricine A keten. Zoals te zien is, werd zeer weinig doding boven de vergelijkingsmaterialen veroorzaakt door liposomen die het quaternaire ammoniumchloridezout (C-zout) droegen, hetgeen 20 een aanwijzing was voor geen, of vrijwel geen liposoom-ce1versmeIting.

TABEL B

Vermogen van fusogene liposomen beladen met ricine A om protexnesynthese te belemmeren en HTC te doden 25 Belemmering van HTC ge- protexnesynthese dood HTC geïncubeerd met:__ (¾)_(%)_ PC/cholesterol liposomen 0 0

Vrije ricine A keten 5 4 30 PC/cholesterol liposomen beladen met ricine A 6 7 PC/cholesterol liposomen die Q-zout dragen (OH zout) 5 8 PC/cholesterol liposomen beladen 35 met ricine A keten en Q-zout dragend (0H~ zout) 90 95 PC/cholesterol liposomen beladen met ricine A keten en C-zout dragend (Cl zout) 17 14

Ricine A keten werd eerst ingevangen met PC/ cholesterol liposomen onder toepassing van de techniek beschreven in '‘Procedure for Preparation of Liposomes with 40 y » - 12 -

Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation," door Szoka en anderen, zie hierboven, waarna het quaternaire ammoniumzout (hetzij de OH hetzij de Cl” zouten) was opgenomen in de liposoom dubbellaag, 5 zoals boven beschreven. Bij de experimenten werd 10-20 ug liposomen geïncubeerd met 10^ cellen gedurende 30 minuten bij 37°C, gedurende welke periode de liposomen wisselwerking hadden met de cellen. Aan het einde van de incubatieperioden werden de cellen gewassen en verder geïncubeerd en kweek-10 medium gedurende nog eens 12 uren, waarna proteïnesynthese (door H-leucine-opneming) en levensvatbaarheid van cellen (door de vlekkenproef met Trypan blauw) werden bepaald.

(b) Versmelting-bemiddelde microinspuiting van sv4q-dna._ 15 De resultaten in tabel C toonden aan dat fusogene liposomen konden worden gebruikt voor de microinspuiting van werkzame genen (DNA moleculen) in cellen in een kweek zoals HTC. Alle experimentele omstandigheden en incubatie met HTC waren als beschreven als in tabel B voor ricine A.

20 SV^q-DNA werd ingevangen in liposomen zoals beschreven in "Procedure for Preparation of Liposomes with Large Internal Aqueous Space and High Capture by Reverse-Phase Evaporation," door Szoka en anderen, zie hierboven. Het voorkomen van SV^-T-antigeen werd bepaald als boven beschreven onder toe-25 passing van specifiek, fluorescent gelabeleerd anti-SV^Q-T-antigeen antilichaam.

TABEL C

Vermogen van beladen fusogene liposomen (liposomen dragende Q-zout) ter microinspuiting van 30 SV4q-DNA

HTC geïncubeerd met liposomen SV4Q-T-antigeen positieve beladen met SV4q-DNA cellen (% van totaal) PC/cholesterol liposomen 0 PC/cholesterol dragende Q-zout 35 (OH” zout) 10-15 PC/cholesterol dragende C-zout (Cl” zout) 0

Het specifiek T-antigeen verscheen in de kern van 40 10-15% cellen die geïncubeerd waren met liposomen die be- -1 . i - 13 - laden waren met SV^q-DNA en Q-zouten droegen (OH zout).

Geen T-antigeen trad op in cellen die geïncubeerd waren met het PC/cholesterol dat beladen was met SV^-DNA maar het C-zout (Cl zout) droegen.

5 (c) Versmelting-bemiddelde inspuiting van fluor escerende BSA in Petunia Hybrida plantproto- plasten en plantencelsuspensie._

Protoplasten van cellen van Petunia hybrida werden bereid onder toepassing van conventionele werkwijzen zoals 10 is beschreven in de literatuur. Fluorescerende BSA werd ingesloten in liposomen zoals is beschreven voor ricine A keten, en daarna werd Q-zout opgenomen in het membraan van de beladen liposomen zoals boven is beschreven. Bij het experiment werden 10-20 tg beladen liposomen geïncubeerd met 5 15 5 x 10 protoplasten of plantencellen. Na 30-60 minuten incubatie bij 28°C, werd het optreden van intracellulaire fluorescentie gevolgd onder toepassing van fluorescentie-microscopie.

TABEL D

20 Versmelting-bemiddelde inspuiting van fluorescerende runderserumalbumine in Petunia Hybrida plant-protoplasten en plantencelsuspensie_

Optreden van intracellulaire fluorescentie (% 25 van totale cellen)_

Petunia protoplasten geïncubeerd met fluorescerend met BSA beladen liposomen_ PC/cholesterol 0

30 PC/cholesterol dragende Q-zout (OH

zout) 80

Petunia celsuspensie geïncubeerd met fluorescerende met BSA bela-den liposomen_ 35 PC/cholesterol 0 PC/cholesterol dragende Q-zout (OH zout) 60

Uit de resultaten in tabel D blijkt dat liposomen 40 dragende Q-zout (OH zout) ook op microschaal een inhoud kunnen inspuiten in plantprotoplasten. Het optreden van fluorescentie kan alleen voortkomen uit versmelting van de beladen liposomen met de plantprotoplasten. Elke andere werkwijze - 14 - zou leiden tot een andere vorm van optreden van fluorescentie. De resultaten in tabel D geven weer, dat naast versmelting (of microinspuiting) bij plantprotoplasten, beladen liposomen in staat waren te versmelten en hun inhoud op 5 microschaal in te spuiten in plantencellen die waren omringd door celwand. Tengevolge van de aanwezigheid van hoog geladen Q-zout bleken de liposomen in staat te zijn door de celwand heen te gaan en te versmelten met het celmembraan.

Toepassingen van de liposomen dragende en 10 quaternair ammoniumhydroxydezout._

Na een toelichting van de bereiding van liposomen bevattende quatemaire ammoniumhydroxydezouten en na aantonen van het vermogen van de liposomen bevattende het quaternaire ammoniumhydroxydezout in de blaasjesmembranen 15 om te versmelten met cellen en cel-tot-celversmelting te induceren, waarbij micro-inspuiting van het gehalte van de blaasjes in de cel plaatsvond, worden uiteenlopende toepassingen van de in deze uitvinding beschreven liposomen vermeld.

20 (1) Toepassing van het vrije Q-zout (OH') of liposomen dragende Q-zout (OH )als een reagens bij inducering van cel-celversmel- ting.______

Dierencel-celversmelting als aangetoond voor de 25 onderhavige beschreven liposomen is van overheersend belang voor genuitdrukkingsonderzoeken. Verder heeft plant-protoplastenversmelting vele commerciële toepassingen die kunnen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe plantensoorten met verbeterde eigenschappen.

30 (2) Toepassing van fusogene liposomen voor microinspuiting van uiteenlopende componenten in dieren- en plantencellen die in een kweek zijn gegroeid.__

Beladen, fusogene liposomen konden worden gebruikt 35 voor de microinspuiting van DNA, RNA proteïnen (enzymen, hormonen), en geneesmiddelen, in cellen in kweek. Bovendien konden zij worden gebruikt voor microinspuiting van organellen of andere componenten of moleculen die konden worden ingesloten in de liposomen. Microinspuiting van DNA, 40 RNA, of organellen in cellen, in het bijzonder in plantpro- J .. ,· V .

-15- toplasten of plantencellen, binnen aanzienlijk commerciële toepassingen evenals het gehele terrein van genetische sleutelarij aan planten- en dierencellen. Voorts zullen gebaseerd op experimenten met planten- en dierencellen, 5 liposomen die een quaternair ammoniurahydroxydezout dragen, in staat zijn te versmelten en op microschaal een inhoud in te spuiten in alle cellen waarmee zij kunnen worden ge-incubeerd. Dienovereenkomstig zullen deze liposomen in staat zijn te versmelten met bacteriën, gist en algenproto-10 plasten.

(3) Toepassing van fusogene liposomen voor de levering van uiteenlopende componenten in cellen in vivo, namelijk weefsel of cellen van hele dieren_ 15 Fusogene liposomen konden na inspuiting in laboratoriumdieren of menswezens worden gebruikt als een middel voor de levering van geneesmiddelen, hormonen, of proteïnen zoals enzymen en DNA. Deze werkwijze kon worden gebruikt voor geneesmiddel, enzym en voor gen-therapie.

20. Niet-fusogene, beladen liposomen worden gewoonlijk gebruikt als dragers van geneesmiddelen. Fusogene liposomen kunnen echter veel doeltreffender dan niet-fusogene liposomen worden gebruikt als biologische dragers, omdat zij een inhoud rechtstreeks in celcytoplasma inspuiten.

25 (4) De toepassing van fusogene liposomen voor de ontwikkeling van een nieuw, niet-isotoop, gevoelig proefsysteem voor diagnostische doeleinden._

Liposomen die quaternaire ammoniumhydroxyde zouten 30 dragen zullen versmelten met andere liposomen. Versmelting tussen liposomen leidt tot het weglekken van de inhoud daarvan. Dit lekken is in het bijzonder toe te schrijven aan de wisselwerking en versmelting tussen de liposomen. Tengevolge van de aanwezigheid van de positief geladen quater-35 naire ammoniumhydroxydezoutmoleculen, treden liposomen die deze ammonium quaternaire moleculen dragen niet in wisselwerking en stoten elkaar af. Zoals boven werd opgemerkt, kunnen zij alleen met liposomen waarbij het quaternaire ammoniumhydroxydezout weglekt, in wisselwerking treden en 40 versmelten. Elke twee moleculen die in staat zijn om met y «* - 16 - hoge affiniteit met elkaar in wisselwerking te treden, zullen echter liposomen die het quaternaire ammoniumhydroxyde-zout dragen, dwingen met elkaar te versmelten door de afstotende krachten van de positieve lading te overwinnen.

5 Dienovereenkomstig zal, als een specifiek antigen wordt opgenomen in de liposoommembranen die het quaternaire ammoniumhydroxydezout dragen, een antilichaam, dat tegen een dergelijk antigen is bereid, de liposomen dwingen om in wisselwerking te treden. De wisselwerking tussen liposomen die het 10 quaternaire ammoniumhydroxydezout dragen, zal leiden tot versmelting en in vrijheidstelling van de liposomeninhoud.

Elke quantitatieve bepaling van de vrijmakingswerkwijze (vrijmaking van fluorescerende kleurstof of elk ander reagens) zal een mate zijn voor de antigen-antilichaamwisselwerking.

15 Zo kan versmelting tu-sen liposomen die een quaternair ammoniumhydroxydezout dragen, worden toegepast ter quantitatieve bepaling van de wisselwerking tussen het antilichaam en zijn antigen of hormoon en zijn geschikte ontvanger.

Dit systeem kan daarom worden gebruikt ter bepaling van 20 kleine hoeveelheden antigen of hormoon die aanwezig zijn in elke biologische vloeistof.

Zoals aan de deskundige duidelijk zal zijn, kunnen uiteenlopende modificaties worden gemaakt binnen het kader van de voorafgaande beschrijving. Dergelijke wijzigingen 25 die binnen het vermogen van de deskundige liggen, maken deel uit van de onderhavige uitvinding en worden omvat door bijgaande conclusies.

-conclusies-

Claims

1. Fosfolipide blaasjes, gekenmerkt doordat zij een quaternair ammoniumhydroxydezout bevatten in het membraan van het blaasje, waarbij het zout aanwezig is in een hoeveelheid die voldoende is om de blaasjes 5 fusogeen te maken.

2. ... Fosfolipide blaasjes volgens conclusie 1, gekenmerkt, doordat zij het quaternair ammonium- zout bevatten, dat cetylbenzyldimethylammoniumhydroxyde, 10 hexadecyltrimethylammoniumhydroxyde, cetyltrimethylammonium-hydroxyde,di-isobutylcresoxyethoxyethyldimethylbenzyl-ammoniumhydroxyde, di-isobutylfenoxyethoxyethyldimethyl-benzylammoniumhydroxyde, methyldodecylbenzyItrimethyl-ammoniumhydroxyde, methyldodecylxyleenbis(trimethy1ammo-15 niumhydroxyde), octylcresoxyethoxyethyldimethylbenzylammonium-hydroxyde of een mengsel daarvan is.

3. Fosfolipide blaasjes volgens conclusie ^gekenmerkt, doordat 2ij het quaternaire ammonium- 20 hydroxydezout bevatten, dat octylcresoxyethoxyethyldimethyl-benzylammoniumhydroxyde is.

4. Fosfolipide blaasjes volgens conclusie 1, g e -kenmerkt doordat het fosfolipide fosfatidylcholine, 25 dimyristoylfosfatlidylcholine, dioleoylfosfatidylcholine, dipalmitoylfosfatidylcholine, distearoylfosfatidylcholine, sfingomyelin, cholesterol, of een mengsel daarvan is.

5. Fosfolipide blaasjes volgens conclusie 1, g e -30 kenmerkt doordat daarin DNA of een DNA fragment is ingekapseld.

6. Fosfolipide blaasjes volgens conclusie ^gekenmerkt doordat daarin is ingekapseld een farmaceu- 35 tisch werkzame verbinding of preparaat.

7. Werkwijze voor het fusogeen maken van een fosfolipide blaasje, met het kenmerk, dat men in het } * - 18 - membraan van het blaasje een quaternair ammoniumhydroxyde-zout opneemt.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, m e t het 5 kenmerk, dat men daarbij een quaternair ammonium-hydroxydezout gebruikt, dat cetylbenzyldimethylammonium-hydroxyde, hexadecyltrimethylammoniumhydroxyde, cetyltri-methylammoniumhydroxyde, di-isobutylcresoxyethoxyethyldi-methylbenzylammoniumhydroxyde, di-isobutylfenoxyethoxyethyl- 10 dimethylbenzylammoniumhydroxyde, methyldodecylbenzyltri-methylammoniumhydroxyde, methyldodecylxyleenbis(trimethyl-ammoniumhydroxyde), octylcresoxyethoxyethyldimethylbenzyl-ammoniumhydroxyde of een mengsel daarvan is.

9. Werkwijze volgens conclusie 7, m e t het k e n m e r k, dat men een quaternair ammoniumhydroxydezout gebruikt, dat octylcresoxyethoxyethyldimethylbenzylammonium-hydroxyde is. 20

10- Werkwijze volgens conclusie 7, m e t het kenmerk, dat men een quaternair ammoniumhydroxydezout gebruikt, dat tijdens de vorming van het fosfolipide is opgenomen.

11. Werkwijze volgens conclusie 7, m e t het kenmerk, dat het quaternaire ammoniumhydroxydezout in het blaasjesmembraan is opgenomen na de vorming van het fosfolipide. t V' F_0_R_M_U_L_E_B_L_A_D Γ *2 ‘ + R1 - N - R3 "OH R4 INTERNATIONAL GENETIC SCIENCES PARTNERSHIP, Jackson, Mississippi Ver.St.v.Amerika