CH669673A5

CH669673A5 -

Info

Publication number: CH669673A5
Application number: CH1983/85A
Authority: CH
Inventors: Ferenc Dr Farago; Tamas Dr Jancso; Ivan Daroczi; Gabriella Dr Zajka
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar
Priority date: 1983-09-02
Filing date: 1985-05-08
Publication date: 1989-03-31
Also published as: FI843428L; PL249428A1; CS658084A2; IN163164B; DD232558A5; HU188953B; CS254978B2; SU1505444A3; DE3432348A1; PL141984B1; FI843428A0; FI77941C; FI77941B

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein neues Reagens zur Bestimmung von Glukose, Cholesterin, Harnsäure und Hämoglobin, insbesondere in biologischen Proben.

Zum Nachweis und quantitativer Bestimmung von Glukose, Cholesterin, Harnsäure und Hämoglobin sind mehrere Verfahren bekannt. Aufgrund der einfachen Durchführbarkeit und Billigkeit sowie aus messtechnischen Gründen finden am ver-breitetsten die auf einer chemischen Farbreaktion beruhenden Methoden Anwendung.

Zur Messung der obigen Substanzen wird im allgemeinen die Farbreaktion mit l-Phenyl-2,3-dimethyl-4-amino-pyrazoIin--5-on (weiterhin: 4-Amino-phenazon genannt), Phenol, Phenolderivaten und Salizylsäurederivaten verwendet. Die mit Phenol--4-amino-phenazon stattfindende Reaktion wurde durch P. Trinder [Ann. Clin. Biochem, 6, 24 (1969)] zum ersten Mal zur Bestimmung des Blutzuckers verwendet. Die ärztliche Wichtigkeit dieser Methodik ist so gross, dass zu diesem Zweck zahllose ähnliche Methoden ausgearbeitet wurden.

Der allgemeine Nachteil dieser Methoden besteht darin, dass die Messcharakteristik nicht linear ist und die entstandene Farbe nicht genügend stabil bzw. lichtempfindlich ist (s. Tabelle 1 des zitierten Artikels und Tabelle 3 der vorliegenden Patentschrift).

Das Ziel der Erfindung ist die Ausarbeitung eines neuen, die Nachteile der bekannten Methoden behebenden Systems.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass falls man zur Bildung des farbigen Produktes 4-Amino--phenazon und Thymol verwendet, unter optimalen Bedingungen eine ausgezeichnete, sehr gut verwendbare (stabile, nicht lichtempfindliche, lineare Charakteristik) und eine sehr gute Empfindlichkeit aufweisende photometrische Reaktion stattfindet.

Die Erfindung betrifft ein Reagens zur Bestimmung von Glukose, Cholesterin, Harnsäure und Hämoglobin, insbesondere in biologischen Proben, welches 4-Amino-phenazon, eine Pufferlösung, ein Stabilisierungsmittel für die Bestimmung von Cholesterin, ein Detergens und gegebenenfalls einen Enzymkatalysator enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es als Reagens Thymol (para-Isopropyl-meta-kresol) enthält.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der erfindungs-gemässen Reagentien wird Thymol in einem niederen Alkohol, vorzugsweise Äthanol, gelöst; die anderen chemischen Substanzen werden in destilliertem Wasser gelöst und die alkoholischen und wässrigen Lösungen werden miteinander in einem Verhältnis von 1:4 vermischt. Das so hergestellte Reagens enthält das Thymol in einer Konzentration von 2,5 ± 0,2 mMol/1.

Die Konzentration der weiteren chemischen Substanzen ist im Reagens wie folgt:

Phosphatpuffer 0,08 ± 0,02 mMol/1

4-Amino-phenazon 0,8 ± 0,2 mMol/1

Natriumazid 9,85 ± 0,1 mMol/1

Äthanol 330,0 ± 20 mMol/1

Das erfindungsgemässe Reagens wird folgendermassen verwendet: das Thymol und 4-Amino-phenazon werden mit den zu bestimmenden Substanzen (Glukose, Cholesterin, Harnsäure) in geeigneten Konzentrationen in einem gepufferten Medium in Berührung gebracht. Damit wird durch spezifische enzymati-sche Reaktionen Wasserstoffperoxyd gebildet. Aus dem entstandenen Wasserstoffperoxyd wird mit Hilfe von Peroxydase nascierender Sauerstoff freigesetzt, welcher das 4-(2' -Isopropyl--5' -methyl-1' ,4' -benzochinon-mono-imino)-phenazon (d.h. das farbige Produkt) zustandebringt. Im Falle von Substanzen, welche zur Katalysierung der Zersetzung des Wasserstoffperoxyds an sich fähig sind (z.B. Hämoglobin), ist keine ergänzende en-zymatische Reaktion notwendig, und dem Reaktionsgemisch wird nur Wasserstoffperoxyd, das farbbildende 4-Amino-phen-azon und das Thymol zugesetzt.

Das erfindungsgemässe neue Reagens besitzt mehrere Vorteile, welche wie folgt zusammengefasst werden können:

a) Die Farbreaktion findet in einem gut-definierten pH-Bereich statt (Ph = 7,0-8,0 — vorzugsweise 7,5).

b) Das Maximum der Lichtabsorption des gebildeten farbigen Produktes fällt in den Wellenlängebereich von 465-480 nm; es ist deshalb zweckmässig, die photometrischen Messungen in diesem Bereich — insbesondere bei 475 nm — durchzuführen.

c) Es ist von besonderer Wichtigkeit, dass die photometrisch nachweisbare Farbe verhältnismässig rasch gebildet wird. Es wurde festgestellt, dass die stabile Farbe bei Raumtemperatur innerhalb von 25 Minuten und bei 37°C binnen 15 Minuten entsteht.

d) Zur Einstellung des optimalen pH-Wertes kommen verschiedene Puffer in Betracht (wie tris-Phosphat, Na2PHC>4--KH2PO4, K2HPO4-KH2PO4 und Natriumborat-Salzsäure).

e) Es ist gelungen, die günstige Thymolkonzentration bzw. das Lösungsmittel davon zu bestimmen. Es ist zweckmässig das Thymol in Methanol, Äthanol oder Isopropanol — insbesondere Äthanol — aufzulösen. Die Optimalisierung der Thymolkonzentration wird in der Tabelle 1 angegeben; der optimale Wert beträgt 2,5 mMol/1. Die Messungen werden mit einer Glukoselösung der angegebenen Konzentration (11,10 und 27,75 mMol/1) durchgeführt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

669 673

TABELLE 1

Thymol mMol/1

1,330

2,000

2,500

3,000

4,000

5,000

Extinktion 11,1 mMol/1

0,330

0,365

0,370

0,370 5

Extinktion 27,75 mMol/1

0,750

0,860

0,870

tionale Einheit; die Menge, welche 1 mMol Sulbstrat innerhalb von 1 Minute ersetzt.) Die verwendete Peroxydase darf andere Enzymverunreinigungen in störenden Konzentrationen nicht enthalten.

TABELLE 3

Es ist ersichtlich, dass im Falle der beiden Glukoselösungen die höchste, nicht mehr steigende Extinktion (Farbenintensität) bei einer Thymolkonzentration von 2,5 mMol/1 erhalten wird.

f) Die Optimalisierung der Konzentration des 4-Amino-phe-nazons wird in der Tabelle 2 angegeben. Die Messungen werden auch in diesem Falle mit einer Glukoselösung und einer Thy-mollösung der Konzentration von 2,5 mMol/1 durchgeführt.

Peroxydase-

8

10

12

14

15

17

aktivität

E/ml

27,75 mMol/1

0,820

0,850

0,865

0,870

TABELLE 2

4-Amino-

-phenazon 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 mMol/1

Extinktion 11,1 mMol/1

Extinktion 27,75 mMol/1

0,350 0,370 0,370 0,370 0,370 0,800 0,860 0,870 0,870 0,871

Nach dieser Tabelle wird die maximale, sich nicht mehr ändernde Extinktion bei einer Konzentration von 0,600 mMol/1 erhalten. Der Sicherheit halber wird die Konzentration von 0,800 mMol/1 als optimal betrachtet.

g) Die zur Messung der Glukose, des Cholesterins und der Harnsäure erforderliche Peroxydkonzentration wird ebenfalls optimalisiert (siehe Tabelle 3). Als optimale Konzentration hat sich die Konzentration von 15 E/ml erwiesen. (IE = 1 internaEs ist aus der obigen Tabelle ersichtlich, dass die maximale 15 Intensität (Extinktion) der mit Glukose gebildeten Farbe bereits bei einer Enzymaktivität von 14 E/ml erreicht wird; der Sicherheit halber wird eine Aktivität von 15 E/ml verwendet.

h) Bei der Cholesterinbestimmung wird ein Detergens eingesetzt um die Lösbarkeit zu erhöhen. Zu diesem Zweck kann

OCi

9-Lauryläther-polydekanol (Sigma, USA), Triton X-100 (Oktyl-phenolpolyäthylenglykoläther, LOBA, Österreich) oder Brij 35 (Polyoxyäthylenlauryläther, BDH, England) verwendet werden.

Der optimale Konzentrationsbereich der obigen Mittel be-25 trägt 0,4-1,2%.

Die praktische Anwendbarkeit der erfindungsgemässen Reagenzien wird durch die nachstehenden Verfahren veranschaulicht.

30 1. Mit den Kalibrationen erhaltene Erfahrungen

Die Nachweisbarkeit und quantitative Messbarkeit der Glukose wird in einem Konzentrationsbereich von 2,775-33,300 mMol/1 bestimmt. Die Angaben werden teilweise in der Tabelle 4 und teilweise auf der Abbildung 1 zusammengefasst (nach 35 mathematischer Auswertung). Es ist aus den obigen Angaben ersichtlich, dass die Messcharakteristik — im gegebenen Bereich — linear ist. Die Farbenreaktion verläuft vollständig und die Glukose ist ausgezeichnet messbar.

TABELLE 4

x mMol/1

2,775

5,550

8,325

11,100

13,875

16,650

22,200

27,750

33,300

n

3

T

0,0950

0,1833

0,2783

0,3683

0,4616

0,5500

0,7300

0,9133

1,1210

Y

0,0951

0,1860

0,2769

0,3679

0,4588

0,5497

0,7316

0,9135

1,0953

d%

-0,10

-1,45

+ 0,50

+ 0,10

+ 0,61

+ 0,05

-0,22

-0,02

+ 2,32

Fr =

246 895;

Fl = 1,20746;

(F.G.: 6;

16)

P0,10

In der Tabelle 4 werden die folgenden Abkürzungen verwen-

55 det:

x

= Konzentration der eingewogenen Glukose;

n

= Zahl der parallelen Messungen;

T

= durchschnittlicher Wert der gemessenen Extinktionen;

Y

= aus der Gleichung der Kalibrationsgerade berechneten

60

Extinktionen;

d%

= der prozentuelle Unterschied zwischen den gemessenen

und berechneten Extinktionen (berechnet = 100%);

Fr

= Probe der Regression;

Fl

= «F» Probe der Linearität;

65 F.G.

= Freiheitgrad der Linearität;

P

= Wahrscheinlichkeit der Linearität; da dieser Wert grösser als 10% ist, weicht die Kurve von der Gerade nicht signifikant ab.

669 673

4

2. Die mit dem Vergleich zur Referenzmethode erhaltenen

Erfahrungen

Als Referenzmethode dient der international anerkannte Boehringer Hexokinase UV-Test. Als zuckerhaltige Lösung werden in diesem Falle 45 menschliche Blutproben (ohne Wahl) eingesetzt. Es ist aus der Abbildung 2 ersichtlich, dass es zwischen den nach diesen zwei Methoden erhaltenen Ergebnissen keinen Unterschied gibt, da der Korrelationskoeffizient (r = + 0,9971) dem theoretischen Wert von 1,000 ganz nahe kommt und die Steilheit der Regressionsgerade von dem theroretischen Wert von 1,000 nur um 0,4% abweicht.

3. Die Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Verzerrung des Verfahrens werden aufgrund der erhaltenen Messergebnisse bestimmt. Diese statistischen Kalkulationen ergeben die folgenden Ergebnisse:

Empfindlichkeit: ± 0,17 mMol/1 (auf Glukose bezogen) Genauigkeit: ± 0,09 mMol/1 (auf Glukose bezogen) Verzerrung: ± 0,35% (auf Glukose bezogen).

Das erfindungsgemässe Reagens verfügt ausser den Obenangeführten auch über weitere wesentliche Vorteile: das Reagens ist einerseits zur quantitativen Bestimmung von in biologischen Proben menschlichen und tierischen Ursprungs (z.B. Blut,

Urin, Liquor) vorkommenden Glukose, Cholesterin, Harnsäure bzw. Hämoglobin (roter Blutfarbstoff) und andererseits zur Bestimmung des Glukosegehaltes in Getränken zum menschlichen Verzehr (z.B. alkoholische Getränke, Säfte, erfrischende Getränke) bzw. zur Messung von anderen, glukose-, cholesterin-oder harnsäurehaltigen Lösungen geeignet.

Es soll betont werden, dass das erfindungsgemässe Reagens den bekannten Testen klar überlegen ist. Es geht aus einem zah-lenmässigen Vergleich hervor, dass nach der erfindungsgemäs-sen Testmethode die Farbe mindestens 240 Minuten lang vollständig unverändert bleibt, dagegen wird nach den bekannten Methoden nach einer kurzen Maximumphase (nach 45 Minuten) eine kontinuierlich abnehmende Farbenintensität beobachtet (Abbildung 3).

Das erfindungsgemässe Reagens und die Anwendung davon werden in den nachstehenden Beispielen illustriert, ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele einzuschränken.

Beispiel 1

Bestimmung von Glukose im Blutserum

A-Lösung: In 0,1 Mol/1 einer Phosphatpuffer-Lösung /pH = 7,5; Na2HPCV2H20 und KH2PO4) werden die folgenden Substanzen aufgelöst:

Glukosidase: 12,5 E/ml

Peroxydase: 18 E/ml

4-Amino-phenazon: 1,0 mMol/1

Natriumazid 12,3 mMol/1

B-Lösung: 12,5 mMol/1 Thymol in 96%igem Äthanol (mit destilliertem Wasser).

Das Reagens wird so hergestellt, dass man die A- und B-Lösung in einem Verhältnis von 4:1 miteinander vermischt.

Die Standardisierung wird mit einer 11,1 mMol/1 Glukoselösung (in kalt gesättigter Benzoesäure gelöst) durchgeführt.

Bestimmung: In Probierröhrchen werden je 3,0 ml Reagens, 0,02 ml Standard bzw. in weitere Probierröhrchen 0,02 ml Blutserum eingewogen.

Die Substanzen werden vermischt und stehengelassen (bei Raumtemperatur 30 Minuten lang oder bei 37°C 15 Minuten lang). Im letzteren Falle wird die nach lOminütiger Kühlung gebildete Farbe mit einer Blindprobe photometrisch verglichen (Küvettendicke 1 cm; Wellenlänge 475 nm).

Die Blutserumkonzentration (in Glukose mMol/1) wird nach der nachstehenden Gleichung berechnet.:

Extinktion der Probe ,. .

X 11,1

standarde Extinktion

Das Verfahren ist im Bereich von 0-30 mMol/1 linear.

Beispiel 2

Bestimmung des Gesamtcholesteringehaltes im Blutserum

A-Lösung: In einem Phosphatpuffer (0,lMol/l; pH 7,5) werden die folgenden Substanzen aufgelöst:

Peroxydase

18 E/ml

Cholesterinesterase

12,5 E/ml

Cholesterinoxydase

6 E/ml

4-Amino-phenazon

1,0 mMol/1

Natriumazid

- 12,3 mMol/1

9-Lauryläther

5,0 g/1

oder

Triton X-100

5 g/1

oder

Brij-35

5 gl

B-Lösung: 12,5 mMol/l (in 96%igem frischdestilliertem Äthanol).

Das Reagens wird so hergestellt, dass man die A- und B-Lö-sung vor Gebrauch miteinander in einem Verhältnis von 4:1 vermischt.

Die Standardisierung wird mit einem in Äthanol gelösten Cholesterinstandard (5,2 mMol/1) durchgeführt.

Bestimmung: Zu je 2,0 ml Reagens werden 0,02 ml Standardlösung bzw. Serum zugefügt. Das Gemisch wird gerührt und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang oder bei 37°C 15 Minuten lang stehengelassen. Die nach lOminütiger Abkühlung entstandene Farbe wird photometrisch mit dem Blindversuch verglichen (Küvettendicke 1 cm; Wellenlänge 475 nm).

Berechnung: Blutserumcholesterinkonzentration (mMol/1) =

Extinktion der Probe x 5,2

standarde Extinktion

Das Verfahren ist im Bereich von 0-13 mMol/1 linear.

Beispiel 3

Bestimmung von Harnsäure im Blutserum

A-Lösung: In einem Phosphatpuffer (0,1 Mol/1; pH 7,5) werden die folgenden Substanzen aufgelöst:

Peroxydase 18 E/ml

Urikase 6 E/ml

4-Amino-phenazon 1,0 mMol/1

Natriumazid 12,2 mMol/1

B-Lösung: 12,5 mMol/1 Thymol (in 96%igem Äthanol).

Das Reagens wird so hergestellt, dass man die Lösungen A und B miteinander in einem Verhältnis von 4:1 vermischt.

Die Standardisierung wird mit einem Harnsäurestandard (595 ixMol/1) durchgeführt.

Bestimmung: Zu je 0,2 ml Reagens werden 0,2 ml Standard bzw. Serumprobe zugefügt. Das Gemisch wird vermischt und entweder 60 Minuten lang bei Raumtemperatur oder 30 Minuten lang bei 37°C stehengelassen. Die entstandene Farbe mit mit dem Blindversuch photometrisch verglichen (Küvettendicke 1 cm; Wellenlänge 475 nm).

Berechnung: Harnsäurekonzentration des Blutserums (H.Mol/1) =

Extinktion der Probe x 595

standarde Extinktion

Das Verfahren ist im Bereich von 0-900 p.Mol/1 linear.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

v

3 Blätter Zeichnungen

Claims

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2

PATENTANSPRÜCHE

1. Reagens zur Bestimmung von Glukose, Cholesterin, Harnsäure und Hämoglobin, insbesondere in biologischen Proben, welches 4-Amino-phenazon, eine Pufferlösung, ein Stabilisierungsmittel und für die Bestimmung von Cholesterin ein De-tergens enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es als Reagens Thymol enthält.
2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Enzymkatalysator enthält.
3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es das Thymol in einem niederen Alkanol, vorteilhaft Äthanol, gelöst, in einer Konzentration von 2,30 bis 2,70 mMol/1, vorzugsweise 2,5 mMol/1, enthält.
4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es

0,6 bis 1,0 mMol/1, vorteilhaft 0,8 mMol/1, 4-Amino-phenazon,

0,06 bis 0,1 Mol/1 einer Pufferlösung, vorteilhaft 0,08 Mol/1 Na2HP04-KH2P04,

9,75 bis 9,95 mMol/1, vorteilhaft 9,85 mMol/1, Natriumazid als Stabilisator,

310 bis 350 mMol/1, vorteilhaft 330 mMol/1, Äthanol, 0,2 bis 1,0%, vorteilhaft 0,4%, Detergens des Polyoxyäthy-lenäther-Typs,

8 bis 12 E/ml, vorteilhaft 10 E/ml, Glukoseoxydase und 13 bis 17 E/ml, vorteilhaft 15 E/ml, Peroxydase, oder 8 bis 12 E/ml, vorteilhaft 10 E/ml, Chlolesterinesterase und 4 bis 6 E/ml, vorteilhaft 5 E/ml, Chlolesterinoxydase und 13 bis 17 E/ml, vorteilhaft 15 E/ml, Peroxydase, oder 4 bis 6 E/ml, vorteilhaft 5 E/ml, Urikase und 13 bis 17 E/ml, vorteilhaft 15 E/ml, Peroxydase enthält.