Przedmiotem wynalazku jest nowy odczynnik do •oznaczania glikozy, cholesterolu, kwasu moczowego i hemoglobiny, zwlaszcza w próbkach biologicznych.Znanych jest kilka sposobów wykazywania i oznaczania ilosciowego glikozy, cholesterolu, kwa¬ su moczowego i hemoglobiny. Ze wzgledu na lat¬ wosc przeprowadzenia i taniosc oraz z przyczyn techniczno-pomiarowych najczesciej stosuje sie me¬ tody polegajace na chemicznym odczynie barwnym.Do pomiaru powyzszych substancji stosuje sie na ogól odczyn barwny z l-fenylo-2,3-dwumetylo- -3-amino-pirazolin-5-onu (zwanego dalej: 4-amino- -fenazon), fenolu, pochodnych fenolu i pochodnych kwasu salicylowego). Reakcja zachodzaca z fenolo- -4-aminofenazonem zostala zastosowana po raz pierwszy przez P. Trinder'a (Ann. Clin. Biochem. 3, 24, 1969) do oznaczania cukru we krwi. Lekarska waznosc tej metodyki jest tak duza, ze do tego celu wypracowano niezliczone. podobne metody.Ogólna wada tych metod polega na tym, ze cha¬ rakterystyka pomiaru nie jest liniowa i powstaja¬ ca barwa nie jest dostatecznie trwala lub jest swiatloczula (por. tablica 1 cytowanego artykulu i tablica III niniejszego opisu patentowego).Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie nowego systemu, usuwajacego wady znanych me¬ tod.Wynalazek polega na nieoczekiwanym rozpozna¬ niu, ze gdy do tworzenia barwnego produktu sto¬ suje sie 4-amino-fenazon i tymol, w optymalnych warunkach zachodzi doskonala, bardzo dobrze na¬ dajaca sie do stosowania (trwala, nie swiatloczula, charakterystyka liniowa) i wykazujaca bardzo do¬ bra czulosc reakcja fotometryczna.Przedmiotem wynalazku jest odczynnik do ozna¬ czania glikozy, cholesterolu, kwasu moczowego, i hemoglobiny, korzystnie w próbkach biologicznych, który zawiera 4-amino-fenazon, znany roztwór bu¬ forowy, znany srodek stabilizujacy, znany detergent i ewentualnie katalizator enzymatyczny, charakte¬ ryzujacy sie tym, ze jako odczynnik zawiera ty¬ mol (para-izopropylo-meta-krezol).Wedlug korzystnej postaci wykonania odczyn¬ ników wedlug wynalazku rozpuszcza sie tymol w nizszym alkoholu, korzystnie w etanolu. Inne sub¬ stancje chemiczne rozpuszcza sie w wodzie desty¬ lowanej i roztwory alkoholowe i wodne miesza sie ze. soba w stosunku 1 : 4. Tak/wytworzpny, odczyn¬ nik zawiera j;ymol.,w stezeniu 2,5+0,2 mmoli/dm3.Stezenie dalszych substancji chemicznych jest w odczynniku nastepujace: bufor fosforanowy 0,08+ 0,02 moli/dm3 4-amino-fenazon 0,#" ±0,2 mmoli/dm3 azydek sodu 9,85±0,1 mmoli/dm3 etanol 330,0±20 mmoli/dm3.Odczynnik wedlug wynalazku stosuje sie naste¬ pujaco: tymol i 4-amino-fenazon doprowadza sie 30 do zetkniecia z oznaczonymi substancjami (gliko- 10 15 20 25 141 984141 984 za, cholesterol, kwas moczowy) w odpowiednich stezeniach w buforowanym srodowisku. Tym sa¬ mym przez specyficzne reakcje enzymatyczne two¬ rzy-sie nadtlenek wodoru. Z powstalego nadtlenku wodoit? uwalnia'* sie za pomoca peryksydazy tlen in statu nascendi, k^óry doprowadza do powstania 4r/2Mzopropylo-5'-mctylo-r,4'-benzochinono-mo- no-iniinp/-fenazonu (\o znaczy barwnego produktu).W przypadku substancji, które same sa zdolne do katalizowania rozkladu nadtlenku wodoru (np. he¬ moglobina), nie jest potrzebna uzupelniajaca reak¬ cja enzymatyczna, i doi mieszaniny reakcyjnej do¬ daje sie tylko nadtlenek wodoru, barwotwórczy 4- -amino-fenazón i tymol.Nowy odczynnik wedlug wynalazku ma kilka za¬ let, które mozna zreasumowac nastepujaco: a) Reakcja barwna zachodzi w dobrze okreslo¬ nym zakresie pH (pH = 7,0—8,0, korzystnie 7,5). b) Maksimum absorpcji swietlnej utworzonego pro¬ duktu barwnego przypada w zakresie dlugosci fal 465—480 nm; dlatego celowe jest przeprowadzenie pomiarów fotometrycznych w tym zakresie, w szcze¬ gólnosci 475 nm. c) Szczególnie wazne jest, ze wykrywalna foto- metrycznie barwa zostaje utworzona stosunkowo szybko. Stwierdzono, ze trwala barwa powstaje w temperaturze pokojowej w ciagu 25 minut i w temperaturze 37°C w ciagu 15 minut. d) Do nastawienia optymalnej wartosci pH na¬ daje sie rozmaite bufory (takie jak trój-fosforan, NafHP04—KH2P04, K2HP04—KH2P04 i boran so¬ du — kwas solny). e) Udalo sie okreslic korzystne stezenie tymolu i jego rozpuszczalnik. Celowe jest rozpuszczenie ty¬ molu w metanolu, etanolu lub izopropanolu, w szczególnosci w etanolu. Optymalizowanie stezenia tymolu jest podane w tablicy I. Wartosc optymal¬ na wynosi 2,5 mmoli/dm3. Pomiary przeprowadza sie za pomoca roztworu glikozy o podanym steze¬ niu (11,10 i 27,75 mmoli) dm3. 10 20 25 30 35 40 f) Optymalizowanie stezenia 4-amino-fenazonir podano w tablicy II. Pomiary przeprowadza sie rów¬ niez w tym przypadku za pomoca roztworu gliko¬ zy i roztworu tymolu o stezeniu 2,5 mmoli/dm3.Wedlug tej tablicy maksymalna, nie zmieniajaca sie juz ekstynkcje otrzymuje sie przy stezeniu 0,600 mmoli/dm3. Dla pewnosci jako optymalne traktuje sie stezenie 0,800 mmoli/dm8. a g) Optymalizuje sie równiez stezenie nadtlenku potrzebne do pomiaru glikozy, cholesterolu i kwa¬ su moczowego (por. tablica III). Optymalne oka¬ zalo sie stezenie 15E/cm8. (1E = 1 jednostka mie¬ dzynarodowa; ilosc substancji, która wymienia 1 mmol substratu w ciagu 1 minuty). Zastosowana peroksydaza nie moze zawierac innych zanieczysz¬ czen enzymatycznych w stezeniach przeszkadzaja¬ cych.Z powyzszej tablicy widac, ze maksymala in¬ tensywnosc (ekstynkcje) utworzonej za pomoca gli¬ kozy barwy osiaga sie juz przy aktywnosci enzy¬ mu wynoszacej 14E/cm3; dla pewnosci stosuje sie aktywnosc 15E/cms. h) Przy oznaczaniu cholesterolu stosuje sie de¬ tergent aby zwiekszyc rozpuszczalnosc. Do tego ce¬ lu mozna stosowac 9-laurylo-etero-polidekanol (Sig¬ ma, St. Zjedn. Am.), Triton X-100 (oktylofenolopo- lietylenoglikoloeter, LOBA, Austria), albo Brij 35 (poUoksyetylenolauryloeter, BDH, Anglia). Opty¬ malny zakres stezenia powyzszych srodków wyno¬ si 0,4^1,2%.Praktyczna mozliwosc stosowania odczynników wedlug wynalazku przedstawiaja nastepujace pro^ cesy. 1) Doswiadczenia otrzymane za pomoca wzorco- wan. Wykrywalnosc i ilosciowa mieszalnosc gliko¬ zy oznacza sie w zakresie stezenia 2,775—33,300 mmoli/dm8. Dane zestawiono czesciowo w tablicy IV i czesciowo na ilustracji 1 (po obliczeniu ma- Tablica 1 tymol mmol/dm3 ekstynkcja 11,1 mmol/dm3 « ekstynkcja 27,75 mmol/dm3 1,330 0,330 0,750 2,000 0,365 0,860 2,500 0,370 0,870 3,000 0,370 0,870 4,000 0,370 0,870 5,000 0,370 0,870 Widocze jest, ze w przypadku obydwóch roztwo- tematycznym). Z powyzszych danych widac, ze cha- rów glikozy najwyzsza, nie wzrastajaca juz eks- rakterystyka pomiaru, w danym zakresie, jest li- tynkcje (intensywnosc barw) otrzymuje sie przy ste- niowa. Reakcja barwna przebiega calkowicie i gli- zeniu tymolu wynoszacym 2,5 mmoli/dm3. 50 koza jest doskonale mieszalna.Tablica II 4-amino-fenazon mmol/dm3 ekstynkcja ; 11,1 mmol/dm3 ekstynkcja 27,75 mmoli/dm3 0,200 0,350 0,800 0,400 0,370 0,860 0,600 0,370 0,870 0,800 0,370 0,870 1,000 0,370 0,871141 984 Tablica III Aktywnosc peroksydazy ekstynkcja 27,75 mmol/dm3 8E/cm3 0,820 10E/cm3 0,850 12E/cm3 0,865 14E/cms 0,870 15E/cms 0,870 17E/cm8 0,870 Tablica IV X mMol/ /dm3 n V y d% 2,775 3 0,0950 0,0951 -0,10 5,550 3 0,1833 0,1860 -1,45 8,325 3 0,2783 0,2769 + 0,50 11,100 3 0,3683 0,3679 +0,10 13,875 3 0,4616 0,4588 +0,61 16,650 3 0,5500 0,5497 + 0,05 22,200 3 0,7300 0,7316 -0,22 27,750 3 0,9133 0,9135 -0,02 33,300 3 1,1210 1,0953 +2,32 F0 - 246 895; FO - 1,20746; (F.G.: 6; 16); P 0,10 | W tablicy IV zastosowano nastepujace skróty: x = stezenie odwazonenj glikozy; n = liczba równoleglych pomiarów; y = przecietna wartosc mierzonych ekstynkcji*, Y = ekstynkcje wyliczone z równania prostej wzorcowania; d°/o = procenntowa róznica miedzy zmierzonymi i obliczonymi ekstynkcjami (obliczona = 100°/»); FR = próba regresji; FL = „F" próba liniowosci; F.G. = stopien swobody liniowosci; P = prawdopodobienstwo liniowosci; poniewaz wartosc ta jest wieksza niz 10%, krzywa nie rózni sie istotnie od prostej. 2) Doswiadczenia otrzymane za pomoca porów¬ nania do metody referencji. Jako metoda referen¬ cji sluzy uznany w skali miedzynarodowej test ul¬ trafioletowym heksokinazy Bochringer'a. Jako roz- twór~~zawierajacy cukier stosuje sie w tym przy¬ padku 45 próbek krwi ludzkiej (bez wyboru). Z ilustracji 2 widac, ze miedzy wynikami otrzyma¬ nymi wedlug tych dwóch metod nie ma róznicy, poniewaz wspólczynnik korelacji (r = +0,9971) jest zupelnie zblizony do wartosci teoretycznej 1,000 i stromosc krzywej regresji rózni sie od wartosci te¬ oretycznej 1,000 tylko o 0,4°/o. 3) Czulosc, odtwarzalnosc i znieksztalcenie pro¬ cesu oznacza sie na podstawie otrzymanych wy¬ ników pomiarów. Te kalkulacje statystyczne daja nastepujace wyniki: Czulosc: ±0,17 mmol/dm* (w odniesieniu do gli¬ kozy), dokladnosc: ±0,09 mmol/dm8 (w odniesieniu do gli¬ kozy), znieksztalcenie: ±0,35°/o (w odniesienoiu do gliko¬ zy).Odczynnik wedlug wynalazku dysponuje oprócz wyzej wymienionych równiez dalszymi istotnymi zaletami: odczynnik nadaje sie z jednej strony do ilosciowego oznaczania wystepujacych w próbkach biologicznych pochodzenia ludzkiego i zwierzecego (np. krew, mocz, plyn mózgowo-rdzeniowy) glikozy, cholesterolu, kwasu moczowego lub hemoglobiny (czerwony barwnik krwi) i z drugiej strony do oz- 25 30 35 40 45 50 naczania zawartosci glikozy w napojach do spozycia przez czlowieka (np. napoje alkoholowe, soki, napo¬ je orzezwiajace) lub do pomiaru innych roztworów zawierajacych glikozy, cholesterol albo kwas mo¬ czowy.Nalezy zaznaczyc, ze odczynnik wedlug wynalaz¬ ku wyraznie przewyzsza znane testy. Z porówna¬ na ilosciowego wynika, ze wedlug metody tes¬ towej wedlug wynalazku barwa pozostaje calkowi¬ cie niezmieniona co najmniej w ciagu 240 minut, natomiast wedlug znanych metod po krótkiej fa¬ zie maksimum (po 45 minutach) obserwuje sie ma¬ lejaca w sposób ciagly intensywnosc barwy (ilu¬ stracja 3).Odczynnik wedlug wynalazku i jego zastosowa¬ nie ilustruja nastepujace przyklady, nie ogranicza¬ jac zakresu ochrony do tych przykladów.Przyklad I. Oznaczanie glikozy w surowicy krwi.Roztwór A: W 0,1 mola/dm3 roztworu buforowe¬ go fosforanu (pH = 7,5; NatHP04-2HtO i KH2P04) rozpuszcza sie nastepujace substancje: glikozydaze: peroksydaze: 4-amino-fenazon: azydek sodu: 12,5 E/cm3 18 E/cm* 1,0 mmol/dm3 12,3 mmol/dm3.Roztwór B: 12,5 mmoli/dm3 tymolu w 96*/* — wym etanolu (z woda destylowana).Odczynnik wytwarza sie tak, ze miesza ze so¬ ba roztwór A i B w stosunku 4:1.Wzorcowanie przeprowadza sie za pomoca roz¬ tworu glikozy 11,1 mmoli/dm3 (rozpuszczonej w na¬ syconym na zimno kwasie benzoesowym).Oznaczenie: w probówkach odwaza sie po 3 cm5 odczynnika, 0,02 cm3 wzorca lub w dalszych probów¬ kach 0,02 cm3 surowicy krwi.Substancje miesza sie i pozostawia w temperatu¬ rze pokojowej w ciagu 30 minut albo w tempera¬ turze 37°C w ciagu 15 minut. W tym ostatnim przypadku utworzona po 10-minutowym oziebia¬ niu barwe porównuje sie fotometrycznnie ze slepa próba (grubosc kuwety 1 cm, dlugosc fali 475 nm).Stezenie surowicy krwi [w glikozie mmol/dm1]7 oblicza sie wedlug nastepujacego równania: ekstynkcja próbki Xll,l. ekstynkcja wzorcowa Proces jest w zakresie 0—30 mmoli/dm3 linio¬ wy.Przyklad II. Oznaczanie ogólnej zawartosci cholesterolu w surowicy krwi.Roztwór A: w buforze fosforanowym (0,1 mol/ /dm3; pH = 7,5) rozpuszcza sie nastepujace substan¬ cje: peroksydaza 18 E/cm3 cholesterosteraza 12,5 E/cm3 cholesteroksydaza 6 E/cm3 4-aminofenazon 1,0 mmol/dm3 azydek sodu 12,3 mmol/dm3 eter 9-laurylowy 5,0 g/dm3 albo Triton X-100 5 g/dm3 albo Brij — 35 5 g/dm3.Roztwór B: 12,5 mmoli/dm3 tymolu (w 96*Vo-wym swiezo destylowanym etanolu).Odczynnik wytwarza sie tak, ze roztwór A i B przed uzyciem miesza sie ze soba w stosunku 4:1.Wzorcowanie przeprowadza sie za pomoca wzorca cholesterolu rozpuszczonego w etanolu [5,2 mmoli/ /dm3].Oznaczenie: Kazdorazowo do 2,0 cm3 odczynnika dodaje sie 0,02 cm* roztworu wzorcowego lub su¬ rowicy. Mieszanine poddaje sie wymieszaniu i po¬ zostawia w temperaturze pokojowej w ciagu 30 minut albo w temperaturze 37°C w ciagu 15 minut.Barwe powstala po 10-minutowym oziebianiu po¬ równuje sie fotometrycznie ze slepa próba (grubosc kuwety 1 cm, dlugosc fali: 475 nm).Obliczenie: stezenie cholesterolu w surowicy krwi (mmol/dm3) = ekstynkcja próbki X5,2. ekstynkcja wzorcowa Proces jest w zakresie 0—13 mmoli liniowy.Przyklad III. Oznaczanie kwasu moczowego w surowicy krwi.Roztwór A: w buforze fosforanowym (0,1 mol/ /dm3; pH 7,5) rozpuszcza sie nastepujace substan¬ cje: peroksydaza 18 E/cm3 urykaza 6 E/cm8 4-amino-fenazon 1,0 mmol/dm8 azydek sodu 12,3 mmol/dm3 984 8 Roztwór B: 12,5 mmoli/dm3 tymolu (w 96°/o-wym etanolu). Odczynnik wytwarza sie tak, ze roztwory A i B miesza sie ze soba w stosunku 4:1. Wzorco¬ wanie przeprowadza sie za pomoca wzorca kwasu 5 moczowego (595 p,moli/dm8).Oznaczenie: Kazdorazowo do 0,2 cm8 odczynni¬ ka dodaje sie 0,2 cm3 wzorca lub próbki surowicy.Mieszanine poddaje sie zmieszaniu i pozostawia w ciagu 60 minut w temperaturze pokojowej albo 10 w ciagu 30 minut w temperaturze 37°C. Powstala barwe porównuje sie ze slepa próba fotometrycz¬ nie (grubosc kuwety 1 cm, dlugosc fali 475 nm).Obliczenie: stezenie kwasu moczowego w suro¬ wicy krwi (^mol/dm3) ekstynkcja próbki X595. ekstynkcja wzorcowa Proces jest w zakresie 0—900 ^moli/dm3 liniowy. 20 Zastrzezenia patentowe 1. Odczynnik do oznaczania glikozy, cholesterolu, kwasu moczowego i hemoglobiny, korzystnie w 25 próbkach biologicznych, który zawiera 4-aminofe- nazon, znany roztwór buforowy, znany srodek sta¬ bilizujacy, znany detergent i ewentualnie kataliza¬ tor enzymatyczny, znamienny tym, ze jako odczyn¬ nik zawiera tymol (paraizopropylo-meta-krezol). 2. Odczynnik wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zawiera tymol rozpuszczony w nizszym alka- nolu, korzystnie w etanoiu, w stezeniu 2,30—2,70 mmoli/dm3 korzystnie 2,5 mmoli/dm8. 3. Odczynnik wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zawiera 0,6—1,0 mmoli/dm8, korzystnie 0,8 mmoli/ /dm3 4-amino-fenazonu, 0,06—0,1 mmoli/dm8 roz¬ tworu buforowego, korzystnie 0,08 mmoli/dm8 Na2HP04—KH2P04, 9,75—9,95 mmoli/dm8 korzyst¬ nie 9,85 mmoli/dm3, azydku sodu jako stabilizatora, 310—350 mmoli/dm8, korzystnie 330 mmoli/dm3 eta¬ nolu, 0,2—1,0%, korzystnie 0,4°/o, detergentu typu eteru polioksyetylenowego, 8—12 E/cm8, korzyst¬ nie 10 E/cm3, glikozooksydazy i 13—17 E/cm8, ko¬ rzystnie 15 E/cm3 perkosydazy albo 8—12 E/cm3, ko¬ rzystnie 10 E/cm8 cholesteroesterazy i 4—6 E/cm3, korzystnie 5 E/cm3, chlolesteroksydazy i 13—17 E/cm3 korzystnie 15 E/cm3 peroksydazy, albo 4—6 E/cm3, korzystnie 5 E/cm3 urykazy i 13—17 E/cm3, korzyst¬ nie 15 E/cm8 peroksydazy, gdzie E oznacza ilosc substancji, która wymienia 1 mmol substratu w ciagu 1 minuty.141 984 o ^. c s Ul -^ UJ 1.100 1,000 0,900 0,800 (• 0,700 0,600 0,500 (¦ 0,400 0.300 0.200 I- 0.100 0,000 \V C^ 555 1,11 1,65 22,20 27,75 33,3 _i i i_ m Mol/L to' fNJ 10,0 9.0 5 8'° 1 7'° E 6.0 ro 5.0 1 4.0 $ 3,0 2,0 1.0 mMol/l ^y=6,736mMoL/l *%^' 1 x Cy c^ r 0,9971 T=- a237%. x= 6,752 1.0 3,0 50 I E0 TQ0 mMol/l metoda Boehringera -*nr^ metoda wedtug wynalazku 2: metoda (Sclavo) 3: metoda (Galenopharm) 60 90 120 150 180 210 240 j i i i i i k—•—i—i—i •— minuty Fic. 3 PL PL PL PL PL PL PL