DD232558A5 - Reagens zur bestimmung von glukose, cholesterin, harnsaeure und haemoglobin - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Reagens zur Bestimmung von Glukose, Cholesterin, Harnsaeure und Haemoglobin, vorzugsweise in biologischen Proben, welches 4-Amino-phenazon, eine bekannte Pupperloesung, ein bekanntes Stabilisierungsmittel, ein bekanntes Detergens und gegebenenfalls einen Enzymkatalysator enthaelt. Erfindungsgemaess enthaelt es als weitere Komponente Thymol (para-Isopropyl-meta-kresol).
Description
Hierzu 3 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft ein neues Reagens zur Bestimmung von Glukose, Cholesterin, Harnsäure und Haemoglobin, insbesondere in biologischen Proben.
Zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Glukose, Cholesterin, Harnsäure und Haemoglobin sind mehrere Verfahren bekannt. Auf Grund ihrer einfachen Durchführbarkeit und ihrer Billigkeit sowie aus meßtechnischen Gründen werden am häufigsten die auf einer chemischen Farbreaktion beruhenden Verfahren angwendet.
Zur Messung der obigen Substanzen wird im allgemeinen mit einer Farbreaktion von 1-Phenyl-2,3—dimethyl-3-aminopyrazolin-5-on (im folgenden 4-Amino-phenazon genannt), Phenol, Phenolderivaten und Salizylsäurederivaten gearbeitet. Die mit Phenol—4-amino-phenazon erfolgende Reaktion wurde durch P.Trinder (Ann. Clin. Biochem. 6,24/1969/) zum ersten Mal zur Bestimmung des Blutzuckers verwendet. Die medizinische Bedeutung dieses Verfahrens ist so groß, daß zahlreiche ähnliche Methoden ausgearbeitet wurden.
Der generelle Nachteil dieser Methoden besteht darin, daß die Meßcharakteristik nicht linear und die entstandene Farbe nicht genügend stabil bzw. lichtempfindlich ist (s. Tabelle 1 des zitierten Artikels und Tabelle 3 der vorliegenden Patentanmeldung).
Ziel der Erfindung ist die Ausarbeitung eines neuen, die Nachteile der bekannten Reagentien behebenden Reagens.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß es unter optimalen Bedingungen zu einer ausgezeichneten, sehr gut verwendbaren (stabile, nicht lichtempfindliche, lineare Charakteristik) und eine sehr gute Empfindlichkeit aufweisenden photometrischen Reaktion kommt, wenn man zur Bildung des farbigen Produktes 4-Amino-phenazon und Thymol verwendet.
Die Erfindung betrifft daher ein Reagens zur Bestimmung von Glukose, Cholesterin, Harnsäure und Haemoglobin, vorzugsweise in biologischen Proben, welches 4-Amino-phenazon, eine bekannte Pufferlösung, ein bekanntes Stabilisierungsmittel, ein bekanntes Detergens und gegebenenfalls einen Enzymkatalysator enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als zusätzliche Komponente Thymol (para-lsoprobyl-meta-kresol) enthält.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Reagentien wird Thymol in einem niederen Alkohol, vorzugsweise Äthanol, gelöst; die anderen chemischen Substanzen werden in destilliertem Wasser gelöst, und die alkoholische Lösung und die wäßrigen Lösungen werden miteinander in einem Verhältnis von 1:4 vermischt. Das so hergestellte Reagens enthält das Thymol in einer Konzentration von 2,5 ±0,2 mMoi/l.
Die weiteren chemischen Substanzen des Reagens sind folgende:
Phospatpuffer 0,08 ±0,02 Mol/l
4-Amino-phenazon 0,8 ±0,2 mMol/l
Natriumazid 9,85 ±0,1 mMol/l
Äthanol 330,0 ±20 mMol/l
Das erfindungsgemäße Reagens wird folgendermaßen verwendet: Das Thymol und das 4-Amino-phenazon werden mit den zu bestimmenden Substanzen (Glukose, Cholesterin, Harnsäure) in geeigneten Konzentrationen in einem gepufferten Medium in Berührung gebracht. Damit wird durch spezifische enzymatische Reaktionen Wasserstoffperoxid gebildet. Aus dem entstandenen Wassersioffperoxyd wird mit Hilfe von Peroxydase naszierender Sauerstoff freigesetzt, welcher das 4-(2'-lsopropyl-5'-methyl-1',4'nbenzochinon-mono-imino)-phenazon, d.h. das farbige Produkt, bildet. Sofern man mit Substanzen arbeitet, die zur Katalysierung der Zersetzung des Wasserstoffperoxyds an sich fähig sind (2. B. Haemoglobin) ist keine ergänzende enzymatische Reaktion notwendig, und dem Reaktionsgemisch werden nur Wasserstoffperoxyd, das farbbildende 4-Amino-phenazon und das Thymol zugesetzt.
Nachfolgend werden Vorteile und Einzelheiten des erfindungsgemäßen Reagens aufgeführt:
i) Die Farbreaktion erfolgt in einem gut- definierten pH-Bereich (pH = 7,0-8,0-vorzugsweise 7,5).
3) Das Maximum der Lichtabsorption des gebildeten farbigen Produktes fällt in den Wellenlängenbereich von 465-480 mm; es
ist deshalb zweckmäßig, die photometrischen Messungen in diesem Bereich, insbesondere bei 475 mm, durchzuführen. :) Es ist von besonderer Wichtigkeit, daß die photometrisch nachweisbare Farbe verhältnismäßig schnell gebildet wird. Es wurde festgestellt, daß die stabile Farbe bei Raumtemperatur innerhalb von 25 Minuten und bei 37°C innerhalb von
15 Minuten entsteht
i) Zur Einstellung des optimalen pH-Wertes kommen verschiedene Puffer in Betracht, wie tris-Phosphat, Na2HPO4-KH2PO4,
K2HPO4-KH2PO4 und Natriumborat-Salzsäure, ä) Es ist gelungen, die günstige Thymolkonzentration bzw. das Lösungsmittel dafür zu bestimmen. Es ist zweckmäßig, das Thymol in Methanol, Äthanol oder Isopropanol, insbesondere Äthanol, aufzulösen. Die Optimierung der
Thymolkonzentration ist aus der nachfolgenden Tabelle 1 ersichtlich. Der optimale Wert beträgt 2,5mMol/l. Die Messungen wurden mit einer Glukoselösung der angegebenen Konzentration (11,10 und 27,75 mMol/l) durchgeführt.
| rhymolmMol/l | 1,330 | 2,000 | 2,500 | 3,000 | 4,000 | 5,000 |
| Extinktion 11,1 mMol/l | 0,330 | 0,365 | 0,370 | 0,370 | 0,370 | 0,370 |
| Extinktion 27,75 mMol/l | 0,750 | 0,860 | 0,870 | 0,870 | 0,870 | 0,870 |
Es ist ersichtlich, daß im Fall der beiden Glukoselösungen die höchste, nicht mehr anwachsende Extinktion (Farbintensität) bei
einer Thymolkonzentration von 2,5mMol/l erhalten wird.
j Die Optimierung derTConzentration des 4-Ä*mino-phenazons ist aus der Tabelle 2 ersichtlich. Die Messungen wurden auch in diesem Fall mit einer Glukoselösung und einer Thymollösung mit einer Konzentration von 2,5mMol/l durchgeführt.
| 4-Amino-phe"hazon mMol/l | 0,200 | 0,400 | 0,600 | 0,800 | 1,000 |
| Extinktion 11,1 mMol/l | 0,350 | 0,370 | 0,370 | 0,370 | 0,370 |
| Extinktion 27,75 mMol/l | 0,800 | 0,860 | 0,870 | 0,870 | 0,871 |
Nach dieser Tabelle liegt die maximale, nicht mehr ansteigende Extinktion bei einer Konzentration von 0,600mMol/l. Der Sicherheit halber wird zweckmäßig mit einer Konzentration von 0,800 mMol/l gearbeitet.
g) Die zur Messung der Glukose, des Cholesterins und der Harnsäure erforderliche Peroxydkonzentration kann ebenfalls optimiert werden (siehe Tabelle 3). Als optimale Konzentration hat sich eine Konzentration von 15E/ml erwiesen. (1 E = 1 internationale Einheit; die Menge, welche 1 mMol Substrat innerhalb von 1 min ersetzt). Das verwendete Peroxydase darf keine anderen Enzymverunreinigungen in störenden Konzentrationen enthalten.
Fabelle3
| Peroxydase- aktivität | 8 E/ml | 10 E/ml | 12 E/ml | 14E/ml | 15 E/ml | 17 E/ml |
| Extinktion 27,75 mMol/l | 0,820 | 0,850 | 0,865 | 0,870 | 0,870 | 0,870 |
Aus der obigen Tabelle ist ersichtlich, daß die maximale intensität (Extinktion der mit Glukose gebildeten Farbe bereits bei einer Enzymaktivität von 14E/ml erreicht wird; der Sicherheit halber wird mit einer Aktivität von 15E/ml gearbeitet.
h) Bei der Cholesterinbestimmung wird ein Detergens eingesetzt, um die Löslichkeit zu erhöhen. Zu diesem Zweck kann 9-Lauryläther-polydekanol (Sigma, USA),Triton X-100 (Oktylphenolpolyäthylenglykoläther, LOBA, Österreich) oder Brij35 (Polyoxyäthylenlauryläther, BDH, Großbritannien) verwendet werden
Der optimale Konzentrationsbereich der obigen Mittel liegt bei 0,4-1,2%. .
Die praktische Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Reagenzien wird durch die nachstehenden Verfahren veranschaulicht.
1. Erfahrungen hinsichtlich der quantitativen Meßbarkeit
Die Nachweisbarkeit und quantitative Meßbarkeit von Glukose wird in einem Konzentrationsbereich von 2,775-33,300 mMol/l bestimmt. Die Angaben sind teilweise in der Tabelle 4 und teilweise in der Fig. 1 zusammengefaßt (nach mathematischer Auswertung). Es ist ersichtlich, daß die Meßcharakteristik (im gegebenen Bereich) linear ist. die Farbreaktion verläuft vollständig und die Glukose ist ausgezeichnet meßbar.
Tabe||e4
| X mMol/l | 2,775 | t | 5,550 | 8,325 | 11,100 | 13,875 | 16,650 | 22,200 | 27,750 | 33,300 |
| η | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | |
| y | 0,0950 | 0,1833 | 0,2783 | 0,3683 | 0,4616 | 0,5500 | 0,7300 | 0,9133 | 1,1210 | |
| Y | 0,0951 | 0,1860 | 0,2769 | 0,3679 | 0,4588 | 0,5497 | 0,7316 | 0,9135 | 1,0953 | |
| d% | -0,10 | -1,45 | +0,50 | +0,10 | +0,61 | +0,05 | -0,22 | -0,02 | +2,32 | |
| FR = 246 895 | FL = 1,20746 | ; (F. G.: | 6; 16) | P0,10 . |
In der Tabelle 4 wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:
χ = Konzentration der eingewogenen Glukose;
η = Zahl der parallelen Messungen;
y = durchschnittlicherWertdergemessenen Extinktionen;
Y = die aus der Gleichung der Kalibrationsgeraden berechneten Extinktionen;
d % = der prozentuelle Unterschied zwischen den gemessenen und den berechneten Extinktionen
(berechnet= 100%) " FR = Probe der Regression;
Fl = „F" Probe der Linearität;
F. G. = Freiheitsgrad der Linearität;
P = Wahrscheinlichkeit der Linearität; da dieser Wert größer als 10 % ist, weicht die Kurve von der Geraden
nicht signifikant ab.
2. Die im Vergleich zur Referenzmethode erhaltenen Erfahrungen
Als Referenzmethode diente der internationale anerkannte Boehringer-Hexokinase-UV-Test. Als zuckerhaltige'Lösung wurden in diesem Falle 45 menschliche Blutproben (ohne Wahl) eingesetzt. Aus Fig.2 ist ersichtlich, daß zwischen den nach diesen beiden Methoden erhaltenen Ergebnissen kein Unterschied besteht, da der Korrelationskoeffizient (r = +0,9971 (dem theoretischen Wert von 1,000 äußerst nahe kommt und die Steilheit der Regressionsgeraden von dem theoretischen Wert von 1,000 nur um 0,4% abweicht.
3. Die Empfindlichkeit, die Reproduzierbarkeit und die Verzerrung des Verfahrens wurden auf Grund der erhaltenen Meßergebnisse bestimmt. Diese statischen Kalkulationen ergaben die folgenden Ergebnisse: Empfindlichkeit: ±0,17mMol/l (auf Glukose bezogen)
Genauigkeit: ±0,09mMol/l (auf Glukose bezogen)
Verzerrung: ±0,35% (auf Glukose bezogen).
Das erfindungsgemäße Reagens weist jedoch noch weitere Vorteile auf. So ist es einerseits zur Quantitativen Bestimmung von in biologischen Proben menschlichen und tierischen Ursprungs (z.B. Blut, Urin, Liquor) vorkommender bzw. vorkommendem Glukose, Cholesterin, Harnsäure bzw. Haemoglobin und andererseits zur Bestimmung des Glukosegehaltes in Getränken für den menschlichen Verzehr (z.B. alkoholische Getränke, Säfte, Erfrischungsgetränke bzw. zur Untersuchung von anderen, glukose-, cholesterin- oder harnsäurehaltigen Lösungen geeignet.
Es sei darauf hingewiesen, daß das erfindungsgemäße Reagens den bekannten Testmitteln klar überlegen ist. Aus einem zahlenmäßigen Vergleich geht hervor, daß bei der erfindungsgemäßen Testmethode die Farbe mindestens 240 Minuten lang vollständig unverändert bleibt, wohingegen bei den bekannten Methoden nach einer relativ kurzen Maximumphase (45min) eine kontinuierlich abnehmende Farbintensität zu beobachten ist (Fig. 3).
Das erfindungsgemäße Reagens und dessen Anwendung werden in den nachstehenden Beispielen näher beschrieben, ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele zu beschränken.
Α-Lösung: In 0,1 Mol/l einer Phosphatpuffer-Lösung (pH = 7,5; Na2HPO4 · 2H2O und KH2PO4) werden die folgenden Substanzen aufgelöst:
Glukosidase: 12,5 E/ml
Peroxydase: 18E/mol
4-Amino-phenazon: 1,0mMol/l
Natriumazid 12,3mMol/l
B-Lösung: 12,5mMol/l Thymol in 96%igem Äthanol (mit destilliertem Wasser).
Das Reagens wird hergestellt, indem man die A-und die B-Lösung in einem Verhältnis von 4:1 miteinander vermischt.
Die Standardisierung wird mit einer 11,1 mMol/l Glukoselösung (in kalt gesättigter Benzoesäure gelöst) durchgeführt.
Bestimmung: lnProbierröhrchenwerdenje3,0ml Reagens, 0,02 ml Standard bzw. in weitere Probierröhrchen 0,02ml Blutserum eingewogen.
Die Substanzen werden vermischt und stehengelassen (bei Raumtemperatur 30 Minuten lang oder bei 37°C 15 Minuten lang).
Im letzteren Fall wird die nach-IOminutiger Kühlung gebildete Farbe mit einer Blindprobe photometrisch verglichen
(Küvettendicke 1cm; Wellenlänge475nm).
Die Blutserumkonzentration (in Glukose mMol/l) wird nach der nachstehenden Gleichung berechnet:
Extinktion der Probe x 11,1
Standar dextinktion
Das Verfahren ist im Bereich von 0-30 mMol/l linear.
Α-Lösung: In einem Phosphatpuffer (0,1 Moi/I; pH = 7,5) werden die folgenden Substanzen gelöst:
| Peroxydase: | 18 E/ml, |
| Chf'esterinesterase: | 12,5 E/ml, |
| Chloresterinoxydase: | 6 E/ml, |
| 4-Amino-phenazon: | 1,0 mMol/l, |
| Natriumazid: | 12,3 mMol/l, |
| 9-Lauryläther: | 5,0 g/l oder |
| Triton Χ-1ΠΠ· | C nl\ r\Aar |
3-Lösung: 12,5 mMol/l (in 96%igem frischdestilliertem Äthanol).
Das Reagens wird hergestellt, indem man die A- und die B-Lösung vor dem Gebrauch in einem Verhältnis von 4:1 miteinander /ermischt.
Die Standardisierung erfolgt mit einem in Äthanol gelösten Cholesterinstandard (5,3mMol/l).
Bestimmung: Zu jeweils 2,0 ml Reagens werden 0,02 ml Standardlösung bzw. Serum zugefügt. Das Gemisch wird gerührt und sei Raumtemperatur 30 Minuten lang oder bei 37°C 15 Minuten lang stehengelassen. Dienach lOminutiger Abkühlung äntstandene Farbe wird photometrisch mit dem Blindversuch verglichen (Küvettendicke 1 cm; Wellenlänge: 475nm).
Berechnung: Blutserumcholesterinkonzentration (mMol/l) =
Extinktion der Probe - ς ?
Standard ext ink ti on _.
Das Verfahren ist im Bereich von 0-13mMol/l linear.
VLösung: In einem Phosphatpuffer (0,1 Mol/l; pH 7,5) werden die folgenden Substanzen gelöst: 3eroxydase: 18 E/ml
Jrikase: 6 E/ml
1-Amino-phenazon: 1,0 mMol/l
Vlatriumazid: 12,3 mMol/l
3-Lösung: 12,5 mMol/l Thymol (in 96%igem Äthanol) Das Reagens wird hergestellt, indem man die Lösungen A und B in einem Verhältnis von 4:1 miteinander vermischt.
Die Standardisierung erfolgt mit einem Harnsäurestandard (595/λΜοΙ/Ι).
Bestimmung: Jeweils 0,2ml Reagens werden 0,2ml Standard bzw. Serumprobe zugefügt. Das Gemisch wird vermischt und sntweder 60 Minuten lang bei Raumtemperatur oder 30 Minuten lang bie 37°C stehengelassen. Die entstehende Farbe wird mit dem Blindversuch photometrisch_yerglichen (Küvettendicke 1 cm; Wellenlänge 475nm).
Berechnung: Harnsäurekonzentration des Blutserums (μ/l) =
Extinktion der Probe ^
Standardextinktion
Das Verfahren ist im Bereich von Ο-900/χΜοΙ/Ι linear.
Claims (3)
- Patentansprüche:1. Reagens zur Bestimmung von Glukose, Cholesterin, Harnsäure und Heamoglobin, vorzugsweise in biologischen Proben, welches 4-Amino-phenazon, eine bekannte Pufferlösung, ein bekanntes Stabilisierungsmittel, ein bekanntes Detergens und gegebenenfalls einen Enzym katalysator enthält, gekennzeichnet dadurch, daß es als weitere Komponente Thymol (para-Isopropyl-meta-kresol) enthält.
- 2. Reagens nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es das Thymol in einem niederen Alkanol, vorzugsweise Äthanol, gelöst enthält, und zwar in einer Konzentration von 2,30-2,70 mMol/l, vorzugsweise von 2,5mMol/l.
- 3. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß es
0,6-1,0 mMol/l, vorzugsweise 0,8 mMol/l 4-Amino-phenazon,0,0&-0,1 Mol/l einer Pufferlösung, vorzugsweise 0,08Mol/l Na2HPO4-KH2PO4, 9,75-9,9BmMoIZI1VOrZUgSWeISeS1SSmIvIoI/!, Natriumazid als Stabilisator, 310-350 mMol/l, vorzugsweise 330 mMol/l, Äthanol,0,2-1,0%, vorzugsweise 0,4%, Detergens vom Polyoxyäthylenäther-Typ,8-12 E/ml, vorzugsweise 10 E/ml, Glukoseoxydase und13-17 E/ml, vorzugsweise 15 E/ml, Peroxydase oder8-12 E/ml, vorzugsweise 10 E/ml, Cholesterinesterase und4-6 E/ml, vorzugsweise 5 E/ml, Cholesterinoxydase und13-17E/ml, vorzugsweise 15E/ml, Peroxydase oder4-6E/ml, vorzugsweise 5 E/ml, Urikase und13-17 E/ml, vorzugsweise 15 E/ml, Peroxydase enthält.
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