CH672733A5

CH672733A5 -

Info

Publication number: CH672733A5
Application number: CH1991/87A
Authority: CH
Inventors: Michel Schneider; Herve Tournier; Bernard Lamy
Original assignee: Bracco Ind Chimica Spa
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1987-05-22
Publication date: 1989-12-29
Also published as: JPH02500192A; AU612371B2; AU1805488A; EP0314764A1; CA1303978C; ZA883449B; IL86409A0; MX9203271A; IL86409A; ATE80294T1; WO1988009165A1; ES2009917A6; EP0314764B2; DE3874485T2; DE3874485D1; EP0314764B1; US5626832A; DE3874485T3; JP2619037B2; US5312615A

Description

DESCRIPTION

La présente invention a pour objet une composition aqueuse injectable dans le système circulatoire d'un patient et destinée à en opacifier certains organes en vue de leur examen diagnostique aux rayons X. Cette composition est constituée d'une suspension, dans un milieu aqueux physiologiquement acceptable, de liposomes sous forme de vésicules à membrane phospholipidique contenant, encapsulée dans ces vésicules, une solution aqueuse d'au moins un composé iodé opaque aux rayons X.

L'utilisation de suspensions de liposomes comme véhicules pour transporter, dans certains organes à étudier, des opacifiants destinés aux examens radioscopiques est connue. Ainsi le document US-A-4.192.859 décrit-il une telle suspension de liposomes constitués de lé-cithine et de stérols et contenant d'environ 20 à 60% en poids d'un agent de contraste destiné aux examens d'organes, notamment des organes en relation avec les systèmes réticulo-endothélial et cardio-vasculaire, de même que les examens lymphographiques. Parmi de tels agents de contraste, ce document cite les corps suivants:

N,N'-bis-[2-hydroxy-1 -(hydroxyméthyl)éthyl]-5-[(2-hydroxy-l -oxopropyl)-amino]-2,4,6-triiodo-l,3-benzènedicarboxamide (Iopa-midol); métrizamide; acide diatrizoïque; sodium diatrizoate; méglu-mine diatrizoate; acide acétrizoïque et ses sels solubles; acide dipro-trizoïque; iodamide, iodipamide de sodium, méglumine iodipamide, acide iodohippurique et ses sels solubles; acide iodométhamique; acide iodopyracétiodo-2-pyridone-N-acétique; l'acide 3,5-diiodo-4-pyridone-N-acétique (Iodopyracet); le sel de diéthylammonium de l'acide précédent; l'acide iothalmique; l'acide métrizoïque et ses sels; les acides ipanoïque, iocétamique, iophénoxique et leurs sels solubles; le tyropanoate de sodium, l'ipodate de sodium ainsi que d'autres composés iodés similaires. La membrane lipidique des liposomes utilisés suivant ce document contient principalement des phospholipides, un stérol, de la lécithine, du phosphate dicétylique ou de la stéarylamine et un solvant organique. Toujours suivant ce document, on peut préparer de tels liposomes en mélangeant dans un récipient les composants lipidiques choisis avec un solvant organique tel que le chloroforme, le dichlorométhane, l'éther éthylique, le tétrachlorure de carbone, l'acétate d'éthyle, le dioxanne, le THF, etc. Puis, après avoir évaporé les composés volatils sous pression réduite, on disperse le mélange lipidique dans une solution tampon contenant une quantité dosée d'un agent opacifiant. On agite ensuite le tout plusieurs heures, ce qui provoque la formation des liposomes, une partie du liquide de dispersion (contenant l'opacifiant) étant alors encapsulée dans les vésicules liposomiques ainsi produites. Puis on soumet la dispersion à une sonication afin de réduire la taille de ces liposomes et la viscosité de la dispersion.

D'autres documents traitent également de la préparation de liposomes contenant des agents opacifiants.

Ainsi, le document FR-A-2.561.101 décrit un procédé de préparation de liposomes pouvant contenir des agents opacifiants aux rayons X. Suivant ce document, on prépare d'abord des «précurseurs» de liposomes en solution organique dont on sépare ensuite partiellement le solvant, cette solution contenant une proportion de lipides destinée à convertir la membrane monomoléculaire des précurseurs en membrane bimoléculaire. On disperse ensuite cette solution dans un milieu aqueux et on élimine totalement le solvant résiduel.

Le document US-A-4.567.034 décrit des opacifiants X et leur incorporation dans les liposomes comme vecteur d'un produit de contraste.

Le document GB-A-134.869 décrit une technique de préparation de liposomes suivant laquelle on enrobe des particules (10 um) d'un agent porteur hydrosoluble (NaCl, saccharose, lactose, etc.) par un agent amphipatique, la dissolution ultérieure du porteur dans un milieu aqueux fournissant des liposomes. L'enrobage se fait en dispersant les particules solides du porteur dans une solution organique du lipide et du produit à encapsuler parmi lesquels on trouve des agents de contraste X. Parmi les agents amphipatiques, on cite les lécithines synthétiques saturées.

Le document GB-A-2.135.268 décrit également un procédé de formation de liposomes pouvant contenir des opacifiants à partir de particules d'un agent porteur hydrosoluble.

Le document GB-A-2.135.647 décrit un procédé de préparation de liposomes quelque peu semblable à celui des deux documents pré5

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cédents, à la différence près, cependant, que les particules du matériau porteur sont insolubles. Il s'agit de microsphères en verre ou en résine synthétique. On revêt ces particules d'un film contenant un lipide et, facultativement, un Surfactant ionique ou du cholestérol, en les mettant en contact avec une solution organique de ces ingrédients, le tout suivi d'une évaporation. Par la suite, en agitant ces sphères dans un milieu de dispersion aqueux à encapsuler, notamment contenant un opacifiant aux rayons X, puis en séparant celles-ci par filtration ou centrifugation, on obtient la solution de liposomes recherchée.

Le document GB-A-2.156.345 décrit des composés diacétylami-nés de l'acide triiodobenzoïque comme agents de contraste X et leur incorporation dans des liposomes.

Le document GB-A-2.157.283 décrit des composés semblables à ceux du document précédent et leur incorporation, aux taux de 20-60%, à des liposomes. Ceux-ci sont conformes à la préparation décrite dans le document US-3.957.971.

Le document EP-A-179.660 décrit un procédé de préparation de suspensions de liposomes suivant lequel on disperse une substance bioactive à encapsuler en présence de lipides en solution organique, on évapore le solvant jusqu'à formation d'un gel et on redisperse celui-ci dans un second milieu aqueux tampon. Par un contrôle approprié des quantités respectives des ingrédients et des conditions opératoires, on arrive à un taux très élevé d'encapsulation et une distribution très uniforme des vésicules liposomiques.

Parmi d'autres documents récents concernant les liposomes, en tant que vecteurs de produits de contraste, on citera encore: A. Havron et al. Radiology (1981), 140, 507; P J. Ryan et al., Biochim. Biophys. Acta (1983), 756, 106; S.E. Seltzer et al., AJR (1984) 143, 575; P J. Ryan et al., Radiology (1984) 152, 759; O.A. Rozenberg, Radiology (1983) 149, 877; S. Benita et al., J. Pharm. Sci. (1984) 73,1751 ; K.T. Cheng et al., Investigative Radiology (1987) 22, 47-55; M.R. Zalutzky et al., Investigative Radiology (1987) 22,141-147.

Bien que l'art antérieur constitué par les documents susmentionnés fournisse des produits performants lors des essais expérimentaux, certains problèmes pratiques d'utilisation restaient à résoudre.

Ainsi, bien que les vésicules liposomiques contenant un agent opacifiant se fixent finalement dans le foie et la rate, elles peuvent également, lors de leur déplacement dans le système circulatoire, être retenues par les capillaires des poumons avec risque d'embolie graisseuse. Par ailleurs, la capacité spécifique d'encapsulation volumique et pondérale en produits iodés des liposomes actuels est relativement faible (le plus souvent inférieure à 1 g d'iode par g de lipides), ce qui nécessite d'injecter une quantité relativement élevée de lipides pour atteindre l'effet opacifiant désiré. A ce sujet, on relève que, dans la pratique, il est habituel de caractériser une préparation de liposomes par le taux d'iode encapsulé en g d'iode/g de lipides (rapport 1/1) quoique, bien entendu, cet iode soit lié à une molécule organique. En ce qui concerne la quantité d'iode nécessaire à un examen aux rayons X, il est admis que l'opacification du foie requiert une concentration de l'ordre de 2-2,5 mg d'iode par g de tissu, soit environ 6 g (poids du foie environ 2,3 kg). En tenant compte du fait que seuls 40% environ de liposomes injectés sont retenus dans le foie, c'est donc un minimum de 15 g d'iode qui doivent être administrés. Cela correspond, pour un rapport 1/1 de 1 (une valeur élevée dans l'état de la technique), à 15 g de lipides, ce qui constitue une dose déjà importante. On voit, par là, l'intérêt majeur d'augmenter la capacité d'encapsulation des liposomes.

A titre d'exemple, on note que, suivant V.J. Caride, dans CRC Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems (1985), 1, 121-153, la capacité d'encapsulation des liposomes de la classe qu'il définit comme «petites vésicules monolamellaires» (small unilamel-lar vesicles, SUV), lesquelles ont un diamètre compris entre 0,02 et 0,5 |im, est de l'ordre de 0,2 à 1,5 1/mole, ce qui correspond, en admettant une masse moléculaire moyenne d'environ 800 (phospholi-pides), à une capacité d'encapsulation d'environ 1 à 2 mg/g de phos-pholipides. Or, il est souhaitable d'élever cette capacité à 5 ml/g ou plus, si possible, de manière que le rapport 1/1, par exemple lors de l'encapsulation de solutions opacifiantes de l'ordre de 300 mg d'iode/ml, puisse dépasser la valeur de 1,5.

Par ailleurs, une partie notable de l'iode que contiennent les suspensions actuelles de liposomes à capacité opacifiante se trouve dissoute dans la phase aqueuse de dispersion et non pas encapsulée à l'intérieur des vésicules (voir par exemple les suspensions décrites dans le document US-A-4,192,859). Une telle situation peut se révéler indésirable car, lors de l'injection à des fins diagnostiques, la portion d'iode non encapsulée ne se fixe pas dans les organes à étudier et ne présente aucune utilité. En conséquence, pour éviter de devoir injecter de l'iode inutilement, il est désirable de pouvoir diminuer autant que possible cette fraction non encapsulée.

La composition définie à la revendication 1 permet de remédier aux inconvénients de manque de capacité d'encapsulation. En effet, au cours de leurs expériences, les présents inventeurs ont constaté avec étonnement qu'en «normalisant» la taille des vésicules de la solution de liposomes dans une certaine gamme de valeurs, c'est-à-dire en éliminant, par calibrage par extrusion, la plus grande partie des vésicules de dimension inférieure à 0,15 (xm, ou dépassant 3 um, de préférence en conservant la majeure partie des vésicules d'une taille comprise entre 0,2 et 1 |im, on augmentait de façon significative le taux d'iode encapsulé. Cet effet résulte d'une augmentation de la capacité d'encapsulation spécifique des vésicules (c'est-à-dire du volume de liquide encapsulé rapporté au poids des lipides des membranes vésiculaires), ce rapport pouvant atteindre, dans certains cas, 10-15 ml/g de lipide.

Par ailleurs, et cela constitue un autre élément inattendu, le processus de calibration des liposomes a permis d'obvier dans une notable mesure au problème de rétention des liposomes dans les capillaires des poumons, la proportion de ceux-ci, décelables dans cet organe, décroissant considérablement dès lors que les liposomes de grande taille, par exemple dépassant 2 à 3 (im, ont été éliminés. On précisera ici que, par «normalisation», on veut dire que, en accord avec les définitions se rapportant aux normes de distribution statistique des particules suivant leur taille, l'opération de normalisation conduit à un rétrécissement de ladite courbe de distribution des vésicules; ainsi, dans la présente invention, leur indice de polydispersité n'est pas supérieur à 4 et, de préférence, la taille de plus de 70% de la totalité des vésicules de la solution de liposomes est comprise entre 0,2 et 2 (im. On verra ci-après, dans la partie consacrée aux techniques de préparation, ce qu'il faut comprendre par indice de polydispersité.

En raison des découvertes ci-dessus et par un choix approprié des composés iodés opacifiants dissous dans la solution encapsulée suivant la revendication 1, on est parvenu aux compositions opacifiantes suivant les revendications 2, 3 et 4. De plus, en soumettant une telle solution à certains traitements appropriés (décrits ci-après), on parvient à éliminer une grande partie de l'iode dissous dans la phase aqueuse de suspension. On notera encore que la viscosité de la composition de l'invention, qui peut, dans certaines formes d'exécution, être inférieure à 30 ou de l'ordre de 20 à 30 mPa • s à 37° C, est nettement plus faible que celle des suspensions de l'art antérieur (ainsi, les suspensions décrites dans le document US-A-4,192,859 peuvent, pour des contenus en iode de 60%, atteindre des viscosités de plusieurs centaines de mPa • s). Il est en effet évident que la viscosité des suspensions de liposomes décroît lorsque le taux de lipides diminue et que, pour garder le rapport 1/1 constant, il faut augmenter d'autant la capacité d'encapsulation de ceux-ci.

Par ailleurs, la présence de composés opacifiants iodés contribue également à élever la viscosité des solutions (par exemple, une solution aqueuse d'iopamidol à 300 g d'iode par 1 présente une viscosité de 8,8 mPa • s à 20° C et 4,7 mPa ■ s à 37° C), et toute diminution de la concentration du composé iodé dans le milieu de dispersion des liposomes contribuera à abaisser cette viscosité.

La membrane lipidique des liposomes de la composition de l'invention peut être constituée des composés amphipatiques habituellement utilisés dans la pratique usuelle des suspensions liposomiques.

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De tels composés sont décrits dans les références susmentionnées. On préfère utiliser des phospholipides tels que les lécithines de soja hydrogénées (par exemple le produit NC-95H de Nattermann Chemie), la dipalmitoylpliosphatidyl choline (DPPC), la distéaroyl-phosphatidyl choline (DSPC), la sphingomyéline (SM) et l'acide di-palmitoyl-phosphatidique (DPPA). Contrairement à la pratique habituelle dans le domaine des liposomes (voir les références citées dans l'introduction), on préfère ne pas utiliser de cholestérol parmi les lipides utilisés dans la présente invention, celui-ci n'étant pas indispensable à leur stabilisation. La proportion des lipides par rapport à la phase tampon de dispersion est généralement de l'ordre de 0,1 à 10%, de préférence environ 2 à 6%. La proportion de liquide encapsulé par rapport aux lipides (rapport v/1) n'est pas inférieure à 5 ml/g et peut atteindre exceptionnellement 20 ml/g. De préférence, elle se situe entre 5 et 15 ml/g, le plus souvent entre 7 et 12 ml/g.

Comme composés organiques iodés opaques aux rayons X, on peut utiliser la plupart des composés connus par les références précitées; cependant, certains opacifiants conviennent mieux que d'autres en ce qui concerne la capacité effective d'encapsulation de leurs solutions aqueuses dans les vésicules liposomiques et la stabilité de ces vésicules au stockage. En effet, certains des agents opacifiants en solution s'encapsulent plus difficilement que d'autres lors de la formation des liposomes et, par ailleurs, certains d'entre eux diffusent plus facilement que d'autres au-dehors de la membrane liposomique, au stockage ou lors des manipulations.

Pour ces raisons, on préfère utiliser, comme agents opacifiants, les moyens de contraste ioniques dérivés de l'acide triiodobenzoïque, tels que, par exemple, les sels de sodium et/ou de méglumine de l'acide diatrizoïque, et, de préférence, les moyens de contraste non ioniques tels que, en tant qu'exemple non limitatif, l'iopamidol ou l'ioméprol. Les agents de contraste sont utilisés sous forme de solution aqueuse de concentration comprise entre 100 et 450 g d'iode/1, de préférence de 250 à 380 g 1/1. Avec de telles solutions et la composition suivant l'invention, on parvient à des taux d'iode encapsulé pouvant aller jusqu'à 6 g d'iode/g de phospholipide.

De manière générale, dans la composition de l'invention, le volume occupé par les vésicules liposomiques représente environ 5 à 60% du volume total de la suspension et peut, dans certains cas spéciaux, dépasser ces valeurs (jusqu'à 70-80%).

Pour préparer la composition suivant l'invention, c'est-à-dire pour augmenter la capacité d'encapsulation des vésicules liposomiques et, par exemple, conférer à une suspension aqueuse de liposomes dont les vésicules ont une membrane phospholipidique un pouvoir d'encapsulation d'un liquide aqueux opacifiant supérieur à 1,5 g d'iode par g de lipide (1/1 > 1,5), on procède à une normalisation de la taille des ces vésicules, c'est-à-dire qu'on sélectionne une proportion importante des vésicules dont la taille est comprise dans un intervalle donné et qu'on élimine les autres, ou que, par un moyen quelconque, on transforme celles-ci (les autres) en nouvelles vésicules dont les dimensions correspondent à l'intervalle choisi. Par le terme de «proportion importante» en ce qui concerne la normalisation de la taille des liposomes, on se réfère à la notion d'indice ou facteur de polydispersité P utilisé lors de la mesure des dimensions de particules et la distribution de ces particules par spectroscopie par diffraction (voir Instructions d'utilisation de l'appareil Coulter Na-no-Sizer (marque déposée) Coulter Electronics Ltd., Grande-Bretagne). L'échelle des valeurs de P s'étale entre 0 et 10. Une valeur de 1 correspond à des particules monodimensionnelles. Une valeur de 8, par exemple, indique que le rapport des dimensions entre les plus grandes et les plus petites particules est d'environ 4.

Par ailleurs, le facteur s permettant de calculer la largeur W de la courbe de distribution des particules, c'est-à-dire la gamme des dimensions de la plupart d'entre elles, suivant la relation W = sdw (où dw est la grandeur des particules donnée par l'appareil), est fourni en divisant P par 5 pour des particules supérieures à 250 nm et par 4 pour des particules entre 100 et 250 nm. Dans la présente invention, on fait référence à la valeur de l'indice de polydispersité P et on admet que, pour des valeurs de P égales ou inférieures à 4, la majorité des vésicules correspond à la grandeur mesurée.

Ainsi, le procédé, résumé à la revendication 4, illustre un moyen pour parvenir à une composition telle que définie à la revendication 5 1. On a en effet constaté que ce sont les liposomes dont les vésicules ont, en majorité, une taille située entre environ 0,15 et 3 jxm, de préférence entre 0,2 et 1 |im, qui présentent une capacité d'encapsulation particulièrement élevée. Par le terme «majorité», on veut exprimer le fait qu'au moins 70% des vésicules liposomiques ont un dialo mètre conforme à l'intervalle choisi.

Quoique la raison exacte pour laquelle les vésicules liposomiques comprises dans cet intervalle ont la capacité d'intégrer un volume aussi élevé n'ait pas été élucidée, on peut avancer les arguments suivants. D'une part, les liposomes inférieurs à cette limite présentent 15 un rapport volume/surface défavorable (en effet, plus le diamètre d'une sphère décroît, plus ce rapport devient petit) et, d'autre part, les vésicules dépassant sensiblement 2 |im sont souvent plurilamellaires et en conséquence la masse de leur membrane, pour une contenance donnée, est plus élevée. Il semble que, par extrusion à travers 20 une membrane correctement calibrée, les liposomes plurilamellaires se réarrangent au moins en partie en liposomes plus petits et de membrane monolamellaire; une proportion importante de ces liposomes «réarrangés» correspond alors aux dimensions optimales convenant à la composition suivant l'invention.

25 Généralement, la normalisation d'une solution de liposomes s'effectue par forçage sous pression à travers une membrane filtrante. Les pressions mises enjeu par cette «extrusion» peuvent varier entre une fraction de bar et plusieurs bars. De préférence, pour des membranes de porosité comprise entre environ 0,4 et 2 jxm, on met en jeu 30 des pressions d'extrusion de 0,5 à 10 bar. On peut ainsi assurer des débits de filtration de l'ordre de 1 à 20 ml/s/cm2. Il est bien entendu que l'augmentation du rapport 1/1 consécutif au traitement d'extrusion se produit lorsque la phase aqueuse de dispersion contient un composé opacifiant iodé en proportion appréciable. Il est évident 35 que si cette phase est dépourvue d'iode, il ne peut y avoir une augmentation de l'iode encapsulé par passage de la phase extérieure vers l'intérieur des vésicules.

On a constaté que la température d'extrusion joue un rôle sur la concentration en agents opacifiants de la solution encapsulée dans 40 les vésicules. Ainsi, si on effectue l'extrusion à température ordinaire, il peut se produire une certaine diminution du rapport 1/1. Par contre, et c'est là un élément inattendu additionnel, si on procède à une température supérieure à la température de transition des phospholipides constituant la paroi des liposomes, on observe une aug-45 mentation de ce rapport. De préférence, on travaille à des températures comprises entre 50 et 90° C, par exemple vers 75° C. On peut imaginer que l'effet inattendu observé résulte d'un ramollissement des vésicules provoqué par l'élévation de température.

Pour abaisser autant que possible la quantité d'iode non encap-50 sulée contenue dans la suspension, c'est-à-dire la portion d'agent opacifiant dissoute dans la phase aqueuse tampon dans laquelle les liposomes sont suspendus, on a avantageusement recours à l'ultra-centrifugation ou à l'ultrafiltration, celles-ci provoquant une séparation physique entre les vésicules elles-mêmes et ladite phase aqueuse. 55 Une fois cette séparation réalisée, on redisperse les liposomes dans une nouvelle phase aqueuse de dispersion. En répétant cette opération, on peut diminuer la proportion d'agent opacifiant dans le milieu extérieur jusqu'à une teneur choisie, par exemple de l'ordre de 2 mg/ml ou même 0,2 mg/ml, sans que la perte en liposome (inévita-60 ble à chaque opération) devienne importante. De manière générale, on procède à de telles centrifugations sous des accélérations centrifuges de plusieurs milliers de g, par exemple entre 10 000 et 250 000 g. On peut également obtenir de tels résultats par microfiltration ou dialyse suivant les techniques habituelles. On peut effectuer des opé-65 rations de microfiltration en faisant circuler la suspension à traiter dans un jeu de tubes dont la paroi présente une porosité contrôlée déterminée, par exemple des pores de 0,1 |im et plus (dans le cas de l'ultrafiltration mentionnée plus haut, les pores des membranes sont

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inférieurs à 0,1 [im). Au fur et à mesure que le volume de la suspension soumise à la filtration diminue (par passage d'une partie de celle-ci à travers les pores des tubes), on la remplace par du solvant frais, par exemple un mélange tampon ou une solution aqueuse physiologiquement acceptable. Par ces techniques, on élimine la majorité des substances indésirables contenues dans le liquide de dispersion, notamment l'iode dissous. Par ailleurs, la microfiltration permet d'éliminer dans le filtrat certains solutés indésirables, notamment les vésicules résiduelles très petites, ce qui a pour effet d'augmenter le rapport 1/1.

Comme milieux constituant la phase extérieure de suspension des liposomes, on peut utiliser des solutions compatibles avec les tissus vivants et les liquides du système circulatoire. Comme exemple de telles solutions, on cite les solutions de sel, les solutions aqueuses tamponnées ou non au Tris, phosphate, etc. (pH aux environs de la neutralité) et les solutions hypertoniques contenant une ou plusieurs substances choisies parmi le sel, le glucose, des agents opacifiants, des agents tampons, etc. Une solution typique (0,8 Osm) contient du glucose (0,7 M), du NaCl (0,9%) et du Tris (10 mM).

Pour la préparation des suspensions de liposomes utilisables comme produits de départ dans la présente invention, on peut utiliser les techniques connues, notamment celles décrites dans les références citées plus haut.

De préférence, on utilise la méthode REV [voir F. Szoka et al., (1978), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75, 4194] et celle décrite dans le document EP-A-179.660.

Par l'application de ces méthodes, on obtient des suspensions initiales de liposomes ayant, en général, les paramètres suivants :

— tampon 0,9% NaCl, 10 mM Tris, pH 7-7,5;

— lipides environ 1%;

— concentration globale d'iode 20-30 mg/ml;

— concentration d'iode dans les liposomes 1-2 g/g de lipides (solution d'iopamidol à 300 g/1).

En soumettant de telles solutions de départ aux opérations susmentionnées, on obtient des compositions opacifiantes conformes à l'invention.

Lors de son utilisation comme agent opacifiant par injection à des animaux de laboratoire, la composition suivant l'invention s'est montrée très efficace par son pouvoir opacifiant spécifique et sa sélectivité. En particulier, on a observé une réduction de 30 à 40 fois de la rétention d'iode dans les poumons. Il est particulièrement notable qu'avec la présente composition, on puisse obtenir, avec un taux pondéral d'iode global inférieur à 20%, des résultats diagnostiques équivalents ou supérieurs à ceux obtenus avec des suspensions de l'art antérieur (voir par exemple US-A-4.192.859) où la concentration globale en iode peut atteindre 60% en poids de suspension de liposomes.

La partie expérimentale qui suit illustre l'invention.

Exemple 1:

On a préparé tout d'abord une solution contenant 57 mg d'acide dipalmitoylphosphatidique (DPPA, Fluka) et 543 mg de dipalmi-toylphosphatidylcholine (DPPC, Fluka) dans 42 ml de chloroforme. A 20 ml de cette solution, on a ajouté 20 ml de chloroforme et 40 ml d'éther diisopropylique, puis, après agitation, 12 ml d'une solution aqueuse à 76% (p/v) de méglumine diatrizoate, un agent opacifiant iodé (Bracco). Le mélange obtenu, chauffé à 50° C, a été soumis 5 minutes aux ultrasons (Braun Labsonic 1510). On a ensuite concentré l'émulsion à 45° C dans un évaporateur rotatif jusqu'à obtention d'un gel. On a introduit alors dans le ballon un mélange d'environ 8 ml de la solution aqueuse à 76% de méglumine diatrizoate et 4 ml d'eau distillée et on a poursuivi l'évaporation sous rotation. Après obtention d'un mélange homogène, on a rajouté un mélange d'environ 20 ml de la solution à 76% de méglumine diatrizoate et 8 ml d'eau distillée et les dernières traces de solvants ont été éliminées par évaporation. Le volume de la solution de liposomes obtenue (solution A) a été ajusté à 40 ml à l'aide d'eau distillée.

On a déterminé ensuite la quantité de méglumine diatrizoate effectivement encapsulée à l'intérieur des liposomes. Un aliquot de la préparation obtenue (5 ml) a été centrifugé durant 25 minutes à 235 000 g. Les vésicules ont été reprises dans 10 ml d'une solution saline (0,9% NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,2) puis soumises à une seconde centrifugation (15 min, 26 000 g). Ces phases de centrifuga-tion suivies de remises en suspension ont été répétées encore quatre fois, ce qui permet d'éliminer entièrement le méglumine diatrizoate non encapsulé. Après une dernière remise en suspension dans 5 ml, un aliquot de la solution obtenue (0,9 ml) a été ajouté à 0,1 ml d'une solution à 10% de dodécylsulfate de sodium puis chauffé à 40° C durant 5 min. Par mesure de la densité optique à 260 nm de cette solution, on a déterminé qu'à ce stade la préparation finale contenait 21,4 mg/ml de méglumine diatrizoate, correspondant à 10,4 mg d'iode par ml. En faisant abstraction des pertes de lipides, on détermine que cette préparation contiendrait également 7,14 mg/ml de phospholipides, soit un rapport iode/phospholipides de 1,45.

Le reste de la solution A a été porté à 15° C, puis extrudé à chaud à travers un filtre de polycarbonate (Nuclépore) d'une porosité de 1 micron. La solution obtenue a été ensuite refroidie à température ambiante puis soumise à une série de centrifugations suivies de remises en suspension, comme décrit plus haut. L'analyse spec-trophotométrique du surnageant obtenu après le cinquième lavage a montré une concentration résiduelle d'iode dans la phase extérieure inférieure à 0,2 mg/ml. A ce stade, le culot de liposomes a été suspendu dans un volume total de 7 ml de tampon. Pour déterminer la concentration totale d'iode dans la préparation finale, on a incubé, comme décrit ci-dessus, durant 5 minutes à 40° C un aliquot de cette préparation en présence de dodécylsulfate de sodium. L'analyse spectrophotométrique a montré que la préparation finale contenait 128,5 mg/ml de méglumine diatrizoate correspondant à 62,5 mg d'iode par ml et présentant un rapport 1/1 de 1,75. L'extrusion a donc conduit à une augmentation de 20% de l'iode encapsulé.

Exemple 2:

A 100 ml d'éther diisopropylique, on a ajouté 100 ml d'un mélange de phospholipides contenant les corps suivants, en parties en poids: DPPC 3/DPPA 1/DSPC 1, ce mélange étant dissous dans du chloroforme à raison (en poids) de 7,1 mg/ml.

On a ajouté ensuite 30 ml d'une solution aqueuse à 61,2% d'iopamidol (300 mg d'iode par ml) et on a soumis le tout 6 min à une sonication par ultrasons à 50° (appareil à ultrasons Braun Labsonic 1510). Puis on a évaporé la solution laiteuse au Rotavapor (45"I 1064 Pa) pour éliminer les solvants volatils. On a redispersé le gel formé dans 100 ml de la solution d'iopamidol. On a alors soumis des échantillons de cette préparation à des essais d'extrusion à travers des membranes (Nuclépore) de 0,8 p.m, 1 |im ou 2 |im à 75° C et sous une pression d'environ 5 bar.

Les diverses préparations extrudées ou non extradées ont été alors soumises à une ultracentrifugation (235000 g; 30 min); après quoi, on a redispersé les vésicules liposomiques dans un tampon (0,9% NaCl, 10 mM Tris, pH 7,2) (essais 1 et 2). Suivant une variante, on a utilisé, comme phase de dispersion, un milieu iso-osmo-laire à la solution d'iopamidol, c'est-à-dire constitué de 0,7 M glucose, 15 mM NaCl, 1 mM Tris (essai 3). On a ensuite répété un certain nombre de fois cette étape de purification (élimination de l'iode dissous dans la phase dispersive), avec l'une ou l'autre de ces solutions, la centrifugation se faisant sous 26000 g, 15 min, jusqu'à une teneur résiduelle en iode de la phase de dispersion inférieure à 0,2 mg/ml. Cette teneur a été mesurée par spectrophotométrie à 260 nm. En général, un nombre d'étapes de centrifugation suivie de redispersion de quatre, ou moins, est suffisant pour atteindre le degré de purification désiré.

A ce stade, on a déterminé la quantité d'iode encapsulé comme décrit à l'exemple 1 par traitement d'un aliquot au dodécylsulfate de sodium (SDS). On a ajouté 0,1 ml de SDS aqueux à 10% à 0,9 ml de la solution de liposomes, on a chauffé 5 min à 40°, puis on a procédé à la lecture spectrophotométrique (le témoin étant un échantillon identique sans iode encapsulé). La densité optique correspondant à

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

672 733

6

1 ng d'iode/ml de solution est de 0,054 à 260 nm. Au moyen d'un compteur de particules (Coulter Nano-Sizer), on a déterminé la taille moyenne des vésicules liposomiques ainsi que leur polydispersité.

Les résultats de ce tableau montrent qu'une seule opération d'extrusion conduit à une augmentation significative du taux d'iode encapsulé et à une diminution de l'index de polydispersité P. Par ailleurs, le taux d'iode encapsulé I/l(de même que le degré d'homogénéisation de la taille des vésicules) augmente lorsque la dimension des pores de la membrane filtrante diminue.

Dans d'autres essais, on est parvenu à augmenter la teneur en iode encapsulé jusqu'à environ 6 mg/mg de lipides.

Exemple 3:

On a préparé, conformément à E. Sponton et al. [Intern. J. Phar-maceutics (1985), 23,299], une solution contenant 543 mg de dipal-mitoylphosphalidylcholine (Fluka), 57 mg d'acide dipalmitoylphos-phatidique (Fluka) et des traces de 14C-tripalmitine (Amersham, 0,1 jxCi) dans du chloroforme (42 ml). On a placé 14 ml de cette solution dans un ballon de 200 ml et on a évaporé à sec dans un éva-porateur rotatif, sous vide partiel à 25° C. On a ajouté ensuite 25 ml d'une solution à 61,2% d'iopamidol (Bracco) (correspondant à 300 mg d'iode par ml), préalablement chauffée à 55° C environ, puis on a laissé incuber 2 h à température ambiante. On a soumis alors ce mélange à cinq centrifugations successives (une centrifugation à 235 000 g pendant 30 min, suivie de quatre centrifugations à 29 000 g, 30 min à 4° C), chacune de ces centrifugations étant suivie de remise en suspension dans une solution saline (NaCl 0,9%, Tris-HCl 10 mM, pH 7,2). On a déterminé ensuite spectrophotométriquement à 260 nm (voir l'exemple précédent) la concentration résiduelle d'iopamidol dans les eaux du dernier lavage, ainsi que celle de la solution encapsulée, après rupture des vésicules liposomiques par le dodécylsulfate de sodium (SDS). On a ainsi mesuré 0,08 mg d'iode par ml dans les eaux de lavage résiduelles, et 7,8 mg d'iode encapsulé par ml de solution de liposomes dans la composition lavée (25 ml). Par analyse à l'aide d'un compteur à scintillation (Beckman LS 8100) d'un aliquot de la composition finale (voir l'exemple 4), on a déterminé que la concentration des lipides était de 5,2 mg/ml (ce qui correspond à 65%) des lipides de départ).

On a répété la préparation des liposomes décrite ci-dessus de manière à obtenir, en tout, 375 ml de suspension contenant 7,7 mg d'iode encapsulé par ml et 5,5 mg de lipides par ml (rapport iode/ phospholipides 1,39). On a alors soumis cette préparation à une dia-filtration à 10° C à l'aide d'un module de microfiltration (Type MD 020 CP2N, porosité de 0,2 um, Enka, Wuppertal, RFA), le volume

Les résultats figurent au tableau ci-dessous. Les essais 1 et 2 concernent des échantillons de suspensions dans une solution saline; les essais 3 concernent des suspensions en milieu glucose.

de liquide traversant la membrane et éliminé dans le filtrat étant continuellement remplacé par adjonction, dans la suspension de 30 liposomes, d'une solution saline fraîche (NaCl 0,9%, Tris-HCl 10 mM, pH 7,2). Après élimination de 1,5 1 de filtrat, on a concentré la solution diafiltrée, ce qui a fourni 97 ml de liposomes microfiltrés, la majorité des vésicules de taille inférieure à 0,2 |im ayant été éliminée. L'analyse montre que cette préparation contient 24,9 mg d'iode 35 encapsulé par ml et 16,4 mg de lipides par ml, soit un rapport iode encapsulé/phospholipides de 1,52. La microfiltration a donc permis d'augmenter le rapport iode encapsulé/phospholipides de 1,39 à 1,52, soit une augmentation d'environ 9%.

40

Exemple 4:

On a préparé des solutions de liposomes (3 batch) suivant la technique décrite à l'exemple 2 à partir de 120 mg de lipides (NC-95H/DPPA = 9:1 en poids), ces lipides contenant, en outre, 1,5 (xCi 45 de 14C-tripalmitine (lipide traceur radioactif). Comme solution d'iode (300 mg/ml), on a utilisé une solution à 61,2% en poids d'iopamidol dans un tampon 8 mM Tris, pH 7,2,10~3M EDTA disodi-que, cette solution étant filtrée, avant emploi, à travers des filtres de 0,45 [im

50 Deux des suspensions de liposomes obtenus au moyen des ingrédients ci-dessus ont été extradées à 75° C, à travers des membranes de porosité, respectivement, 2 nm et 0,8 [im. La troisième solution (témoin) n'a pas été extradée. Les trois solutions, étiquetées respectivement E-2, E-0,8 et T, ont été encore purifiées par ultracentrifuga-55 tion comme décrit à l'exemple 2, puis suspension dans une solution de sel (0,9% NaCl, 10 mM Tris, pH 7,2), centrifugation et resuspension étant répétées 4 fois. On a ainsi obtenu, mesurées par analyse comme décrit à l'exemple 2, les valeurs respectives suivantes en ce qui concerne, successivement: dimension moyenne des vésicules (po-60 lydispersité) et contenu en iode encapsulé en mg par mg de lipides

T: 521 nm(5); 2,39 E-2: 351 nm(3); 2,72 E-0,8: 323 nm(2);2,53

65 On a injecté ces liposomes dans la veine caudale de rats de laboratoire (Sprague-Dawley), à raison de 120 mg d'iode par kg. Une heure après l'injection, on a sacrifié les animaux et recueilli le sang dans des tubes héparinisés, ainsi que les organes, foies et poumons

Essai

Porosité membrane (nm)

Taille moyenne vésicules (nm)

Polydispersité

Iode encapsulé (g/g de lipides)

1

1A

Etat initial 2 |im

610 555

5 5

2,23 2,49

2

2A 2B 2C

Etat initial 1 [wn 0,8 nm 0,8 nm (4 extrusions)

662 482 468 346

5 4 3 3

3,02 3,75 3,81 3,75

3

3A 3B

Etat initial 2 nm à temp. ambiante* 2 nm à 75° C

919 708

883

5 3

3

3,61 3,12

3,96

* L'extrusion a été effectuée dans cet essai à température ambiante au lieu de 75° C.

7

672733

qui, après avoir été séchés et pesés, ont été brûlés dans un appareil à combustion approprié (Packard Oxidizer). Le C02 produit par cette combustion a été recueilli et analysé par scintillation. Le sang a été également analysé après mise en solution (aliquots de 0,25 ml) dans un mélange 1:1 (v/v) de toluène/isopropanol (1 ml) et décoloration par H202 (0,5 ml, 32%). Aux divers échantillons, on a ajouté 10 ml de Dimilume (liquide de scintillation) et on a mesuré leur radioactivité au moyen d'un compteur à scintillation (Beckman LS-8100).

Les résultats, réunis dans le tableau ci-dessous, sont exprimés en pourcents de la dose injectée retenus par le sang ou les organes étudiés (chaque résultat est une moyenne de 3 mesures).

Echantillon

Sang

Foie

Poumon

T

1,0

41,5

12,3

E-2

1,6

43,2

0,5

E-08

1,4

47,9

0,3

On constate, d'après les résultats ci-dessus, que l'homogénéisation de la dimension des vésicules entre les limites diamétrales correspondant aux plages de porosité des membranes 0,8 et 2 |im conduit à une diminution spectaculaire de la capture de ces vésicules par les poumons.

Exemple 5:

On a préparé, comme décrit à l'exemple 4 (échantillon E-08), des suspensions de liposomes dont l'analyse a fourni les valeurs suivantes: 32,5 mg de lipides et 70,2 mg d'iode/ml de suspension, ce qui 5 correspond à 2,16 mg d'iode encapsulé par mg de lipides.

On a procédé à l'injection de cette suspension à quatre groupes de rats Sprague-Dawley (cinq animaux dans chaque groupe) à raison de 250 mg d'iode/kg.

A titre comparatif, des quantités d'iode équivalentes, mais non 10 encapsulées dans des liposomes, ont été injectées à des rats témoins.

Les animaux ont été sacrifiés, par groupes, après Vi h, 1 h, 4 h et 24 h, et le sang été récolté et conservé dans des tubes héparinisés. • Les organes (foies, rates, reins et poumons) ont été prélevés et pesés. 15 Des aliquots de ces organes ont été homogénéisés dans de l'ammoniaque 7 mM (5 ml) pour déterminer la quantité de sang résiduel suivant la méthode décrite par Meijer et al. [Clin. Chim. Acta (1962), 7, 638],

La quantité d'iode retenue par les divers organes ci-dessus a été 20 déterminée par fluorescence aux rayons X au moyen d'un appareil Philips PW 1410 à anode de Cr, E = 50 kV; I = 50 mA. Les résultats corrigés pour la teneur en sang résiduel figurent dans le tableau ci-dessous et comprennent également des mesures effectuées sur des animaux non traités.

Tableau (jig d'iode/g de tissus)

Temp. après

Foie

Rate

Reins

Poumons

Sang

inject, (h)

: Animaux

—

0,12

0,19

0,06

0,12

—

non traités

Iode non

0,5

190

18

530

110

170

encapsulé

1

180

11

380

48

46

4

90

8

33

13

1

24

1

1,5

0,8

1

0,2

Iode

0,5

2400

5900

300

600

encapsulé

1

2700

6600

280

200

100

4

2200

6200

60

160

7

24

800

3500

15

50

0,6

Les résultats ci-dessus montrent combien l'administration de l'iode via les liposomes favorise sa rétention par le foie et la rate et, par la suite, son élimination relativement lente par les reins.

Il est intéressant, pour mettre en évidence les progrès techniques considérables réalisés par la présente invention, de mettre en parallèle les résultats réalisés par celle-ci et ceux de l'état de la technique.

Pour établir cet état de la technique, on a fait appel à certaines des références citées dans l'introduction. La comparaison en question est effectuée à l'aide du tableau ci-après dans lequel on a rassemblé une série de paramètres inhérents aux suspensions de liposomes. Les noms des auteurs des références figurent en tête de colonne.

Exemple 6:

Les liposomes préparés comme décrit dans l'exemple 4 (échantillon E-08) ont été injectés par voie intraveineuse à la dose de 250 mg d'iode/kg à des rats Sprague-Dawley qui ont été soumis à un examen de tomographie computérisée du foie avant et après l'injection.

55 On a utilisé un tomographe Siemens Somatom 2, l'examen étant fait dans les conditions suivantes:

— matrix de 256 x 256

— champ de vue 14 cm

6o — épaisseur de la couche examinée 2 mm

— temps de scansion 5 s

— rayons X: 125 kV mAs 230

On a enregistré les images avant l'injection de la suspension de

65 liposomes, puis 5', 10', 15', 30', 60', 90', 2 h, 3 h et 4 h après l'injection et on a observé une augmentation du contraste du foie, exprimée en Hounsfield Units (HU), comprise entre 50% et 130% durant la période comprise entre 30 min et 4 h.

672 733

8

Tableau: (Propriétés des liposomes contenant des opacifiants aux rayons X)

Havron et al.

Ryan (1) et al.

Seltzer et al.

Ryan (2) et al.

Rozenberg et al.

Benita et al.

Cheng et al.

Zalutsky et al.

Invention (exemple type)

Lipides

Soja/ lécithine/ cholestérol/ stéaryl-amine

Phosphati-dylcholine/ cholestérol

Lécithine/ cholestérol/ stéaryl-amine

Phosphati-dylcholine/ cholestérol

Soja/ lécithine/ cholestérol

Lécithine d'œuf/phos-phatidygly-

cérol/ cholestérol

Lécithine/ cholestérol/ stéaryl-amine

NC-95H/ DPPA (lécithine de soja)

Agent opacifiant

(mgl,/ml)

Diatrizoate (370)

Diatrizoate (146)

Ioséfamate

Diatrizoate

Iohexol (+d'autres)

Diatrizoate ou iotrol

Iopamidol (300)

Rapport en poids iode/ lipide (g/g)

0,14

0,9

0,4

1,5

0,2

0,25

3-4

Volume encapsulé

(ml/g)

0,4

6,2

1

T—

2,7

0,6

7-12

Claims

672733 REVENDICATIONS

1. Composition aqueuse injectable, destinée à opacifier des organes pour examen aux rayons X, constituée d'une suspension, dans un milieu aqueux physiologiquement tolérable, de vésicules li-posomiques à membrane lipidique contenant, encapsulé dans ces vésicules, au moins un composé organique iodé opaque aux rayons X en solution aqueuse, caractérisée par le fait que les vésicules des liposomes ont une taille moyenne comprise entre 0,15 et 3 |im, et que le rapport du poids de l'iode encapsulé dans les vésicules liposomiques au poids des lipides de ladite membrane est de 1,5 à 6 g/g.

2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que la polydispersité de la taille des vésicules dans la gamme considérée n'est pas supérieure à 4.

3. Composition suivant la revendication 1 dont la concentration en lipides en suspension dans ledit milieu aqueux est comprise entre 20 et 60 g/1, caractérisée par le fait que sa viscosité à 37° C ne dépasse pas 30 mPa • s.

4. Composition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que le composé organique iodé est choisi parmi l'iopamidol, l'io-méprol, l'iohexol, l'iopentol, l'iopromide, l'iosimide, l'ioversol, l'io-trolan, l'iotasul, l'iodixanol, l'iodécimol, le l,3-bis-(N-3,5-bis-(2,3-dihydroxypropylaminocarbonyl)-2,4,6,triiodo-phényl)-N-hydroxy-acétyl-amino)-propane.

5. Procédé pour préparer une composition aqueuse suivant la revendication 1 par augmentation de la capacité d'encapsulation d'une suspension aqueuse de liposomes comprenant des vésicules à membrane lipidique contenant, encapsulé, au moins un agent organique iodé opacifiant aux rayons X, en solution dans un liquide aqueux, caractérisé par le fait qu'on soumet ces liposomes en suspension dans ledit liquide aqueux à une extrusion à travers une membrane filtrante à porosités comprises entre 0,4 et 3 |im, de manière à normaliser la taille desdites vésicules dans une gamme de valeurs correspondant à la grandeur des pores de ladite membrane.

6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait qu'après normalisation par extrusion, l'indice de polydispersité des vésicules n'est pas supérieur à 4.

7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on soumet la suspension de liposomes normalisée à une ultracen-trifugation ou à une ultrafiltration afin de séparer ou concentrer les-dites vésicules dudit liquide aqueux, puis qu'on redisperse ces vésicules ainsi séparées ou concentrées dans un nouveau milieu de dispersion libre d'iode dissous, cette opération ayant pour effet de réduire le taux d'iode non encapsulé.

8. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait qu'après normalisation, la taille d'au moins 70% des vésicules liposomiques est comprise entre 0,2 et 2 |im.

9. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on soumet la suspension de liposomes normalisée à une microfil-tration, cette opération ayant pour effet d'éliminer une quantité résiduelle des liposomes dont la taille est inférieure à ladite gamme, ainsi que de réduire la concentration en iode non encapsulé du milieu de suspension aqueux.

10. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé par le fait qu'on opère à une température supérieure à la température de transition des lipides constituant la membrane liposomique, ces conditions ayant pour résultat d'augmenter la concentration de l'iode encapsulé.

11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé par le fait que cette température est comprise entre 50 et 90° C.