CH674939A5 - - Google Patents
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Description
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CH 674 939 A5
2
Description
La présente invention concerne un procédé avantageux pour la préparation de complexes de mé-talloprotéines biologiquement actifs sans perte d'activité biologique.
Ces nouveaux complexes sont particulièrement utiles pour le ciblage de métalloprotéines à des thérapeutiques sur des tissus ou des organes spécifiques, parce que Pantigénécité de ces métalloprotéines et la réponse immune sont diminuées et/ou leur biodisponibilité et efficacité thérapeutique sont accrues.
Plus précisément, les nouveaux complexes préparés par le procédé de la présente invention sont des complexes formés par des métalloprotéines, de l'albumine humaine purifiée et éventuellement d'une Immunoglobuline purifiée (ou un fragment approprié d'immunoglobuline) du type IgG. En particulier, on utilise des fragments d'anticorps réagissant avec un antigène (Fab) tissulaire spécifique tel que la myosine. Le complexe métalloprotéine-albumine-anti-myosine correspondant est particulièrement utile pour le ciblage du complexe métalloprotéique sur la myosine, qui est une protéine du muscle cardiaque.
Les complexes métalloprotéiques de la présente invention ont des propriétés thérapeutiques utiles, en particulier pour débarrasser l'organisme de radicaux libres oxygène qui sont toxiques. Ces propriétés utiles sont attestées par une diminution des ef-fects néfastes attribués aux radicaux libres oxygène dans les arythmies, les nécroses tissuiaires, l'exposition de l'organisme à des radiations, et les empoisonnements dus à certains produits chimiques (paraquat) ou certains médicaments cytotoxiques (anthracyclines).
Le domaine d'application de la présente invention ne se limite pas à des complexes métalloprotéiques spécifiques, mais ii concerne plus particulièrement les métalloprotéines connues sous la dénomination de peroxyde dismutases. Les métaux préférés dans cette invention sont le cuivre et le zinc. La structure des apoprotéines correspondantes est illustrée par les exemples de chaînes polypeptidiques monomériques donnés ci-après.
Il existe de très nombreuses descriptions de métalloprotéines utilisables dans la présente invention, et cela aussi bien dans des publications scientifiques que dans des brevets. II y a lieu, par exemple, de se référer à «Peroxydide dismutase» de Larry W. OBERLEY, ed. CRC Press Inc., Vol. l-ll-III (1982, 1985), à «Aspects biologiques et cliniques des peroxydes et de la peroxyde dismutase» de W. H. BANNISTER et J. V. BANNISTER, eds., 1980 par Elsevier North Holland Inc., au brevet US N° 4 340 675 (20 juillet 1982) accordé à J. T. JOHAN-SEN et au brevet canadien N° 1 168 150 (29 mai 1984) accordé à M. J. POZNANSKY.
En particulier, il a été montré que les dismutases cuivre-zinc sont des dimères ayant un poids moléculaire d'environ 32 000 et qu'elles possèdent 2 atomes gramme de cuivre et 2 atomes grammes de zinc par mole. Les dimères sont constitués de deux sous-unités identiques réunies par des liens non-cova-lents. On sait que la structure des sous-unités est spécifique de l'espèce ou de l'origine de la métallo-protéine.
On sait en outre que l'activité biologique est perdue si les métaux - en particulier le cuivre - sont enlevés pour former l'apoprotéine correspondante. On sait également qu'une inactivation totale et une perte de métal complète ont lieu à pH bas (< 3,5) en présence d'agents chélateurs. Par ailleurs, même en absence d'agents chélateurs, il y a une perte partielle d'activité biologique (dismutase) à pH bas sous dialyse (J. C. DUNBAR et J. T. JOHANSEN, Carlsberg Res. Commun, 47 163 [1982]).
Il n'est donc pas surprenant que K. WONG ait trouvé des pertes importantes d'activité (30 à 40%) au cours de la présentation d'un complexe avec de l'albumin (Agents and Actions, 10, 231 [1980]). Ces pertes proviennent vraisemblablement de l'étape de purification par dialyse et/ou des conditions du traitement de la métalloprotéine d'origine bovine (peroxyde dismutase Cu-Zn) utilisée.
D'autres exemples de l'inactivation biologique de métalloprotéines due à la perte des métaux sont connus de ceux versés dans l'art (voir K. H. BEEM et col., Biochemistry 16,1931, 1977).
L'intérêt qu'il y aurait à préparer des complexes de métalloprotéines avec de l'albumine, des anticorps, divers agents tels que le Ficoll, le polyéthylè-ne glycol, etc. a été examiné par M. J. POZNANSKY et R. L. JULIANO, Pharmac. Reviews 36, 277-336(1984).
Dans tous les cas antérieurs, on a utilisé un dimère métalloprotéique approprié pour préparer le complexe recherché en faisant réagir un agent de réti-culation en présence d'une protéine vectrice appropriée (albumine) et/ou de l'anticorps choisi. Le complexe a ensuite été soigneusement purifié pour enlever les protéines ou les réactifs n'ayant pas réagi.
L'invention a trait à un nouveau procédé où l'apoprotéine monomérique ou dimétrique (sans métaux) est soumise à un traitement de réticulatlon en présence d'une protéine vectrice (albumine) et, éventuellement, d'un fragment d'anticorps réagissant avec un antigène donné et d'un agent de réticulation choisi dans le groupe comprenant le glutaraldéhyde, les carbodiimides (en particulier l'EDCI, c'est-à-dire l'éthyl-1 -(diméthylamino-3 propyl)-3 carbodi-imide), l'anhydride cis-aconitique, les anhydrides mixtes, le chlorure de l'acide cyanurique ou les imi-doesters pour former l'apoprotéine-albumine correspondante ou éventuellement le complexe mixte apoprotéine-albumine-anticorps. Cela est généralement réalisé dans des conditions douces à pH neutre et même froid. Dans le présent procédé, la réaction de réticulation est bloquée par l'addition d'un réactif aproprié (de la glycine dans le cas où l'on utilise le glutaraldéhyde) et le complexe obtenu est purifié par dialyse, par Ultrafiltration à travers des tamis moléculaires ou par Chromatographie d'exclusion sur gel.
Le complexe de l'apoprotéine purifié ainsi obtenu a un poids moléculaire qui dépend de la quantité d'agent de réticulation utilisée et de la durée pendant laquelle on a laissé s'effectuer la réaction de réticulation.
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Après avoir déterminé le poids moléculaire moyen, on reconstitue le complexe métallique purifié par l'addition de solutions appropriées de métaux (solution de cuivre, puis solution de zinc dans le cas de métalloprotéines Cu-Zn) dans des conditions soigneusement contrôlées de pH conformément à la procédure de BEEM et col. (J. Biol. Chem. 249, 7298; 1974 - Biochemistry 16,1931 ; 1977). Le complexe métalloprotéique reconstitué est biologiquement actif et prêt à une utilisation thérapeutique.
Un aspect surprenant et imprévu de la présente invention est la possibilité d'utiliser des apoprotéi-nes comme produits de départ, car on sait bien que les métaux - en particulier le zinc - ont un effet stabilisant sur le site actif de protéines (voir H. M. STEINMAN, Peroxyde dismutase, cité plus haut, Vol. I, chapitre 2) et le fait que l'on peut reconstituer l'activité biologique du complexe de l'apoprotéine.
Un autre aspect avantageux de la présente invention est que les apoprotéines utilisées comme produits de départ peuvent être produits directement par des biotechnologies de recombinaison sans faire appel à des purifications conséquentes.
Un autre avantage du présent procédé est la possibilité de reconstituer l'activité biologique du produit final avec des métaux autres que le zinc, par exemple le cobalt ou le 65Zn radioactif que l'on utilise pour étudier les propriétés pharmacocinéti-ques du complexe (voir S. N. GIRI et H. P. MISRA, Med. Biology 62, 285,1984).
Exemples
I) 10 mg d'un peptide dont la formule est: R-Ala-Thr-Lys-Ala-Val-Cys-Val-Leu-Lys-Gly-Asp-Gly-Pro-Val-GIn-Gly-Ser-lle-Asn-Phe-Glu-Gln-Lys-Glu-Ser-Asp-Gly-Pro-Val-Lys-Val-Trp-Gly-Ser-lle-Lys-Gly-Leu-Thr-GIu-Gly-Leu-His-Gly-Phe-His-Val-His-Gln-Phe-Gly-Asn-Asp-Thr-Ala-Glv-Cvs-Thr-Ser-Ala-Glv-Pro-His-Phe-Asn-Pro-Leu-Ser-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-Glu-Glu-Arg-His-Val-Gly-Asp-Leu-Gly-Asn-Val-Thr-Ala-Asp-Lys-Asp-Gly-Val-Ala-Asp-Val-Val-Ile-Glu-Asp-Ser-Val-lle-Ser-Leu-Ser-Gly-Asp-His-Cys-Ile-Ile-Gly-Arg-Ther-Leu-Val-Val-His-Glu-Lys-Ala-Asp-Asp-Leu-Gly-Lys-Gly-Gly-Asn-Glu-Glu-Ser-Thr-Lys-Thr-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ara-Leu-Ala-Cvs-GIv-Val-lle-GIv-lle-Ala-GIn-OH où R = H (obtenu à l'aide de E. coli transformé par recombinaison) ou R = Ac (obtenu à partir d'érythro-cytes humains par une dialyse contre 1 litre d'EDTA x 103M pH 3,8 suivie par une purification sur une colonne Sephadex G-25) (i! y a un pont disulfure entre les deux Cvs soulignés) et 500 mg d'albumine humaine purifiée (dégraissée) ont été ajoutés à 10 I d'un tampon phosphate de sodium 0,02M pH 7,4. Puis, on a ajouté 100 ni d'une solution de glutaraldé-hiyde (25%) dans de l'eau distillée.
On a laissé la réaction s'effectuer à 4°C pendant 4 heures, puis on l'a bloquée par l'addition de 120 mg de glycine. Le mélange a été dialysé contre une solution contenant 0,13 M/l de NaCI et 0,16 M/l de glycine. La solution a été changée plusieurs fois. Enfin, on a procédé à une filtration sur une colonne d'agar
Bio-Gel A ayant une limite d'exclusion de 500 000 datons avec une élution par un tampon phosphate de sodium 0,02 M pH 7,4 contenant 0,13 M/l de NaCI. Le produit obtenu a été congelé dans un mélange éthanol-neige carbonique et lyophilisé.
Le poids moléculaire apparent moyen du complexe apoprotéine-albumine déterminé par filtration sur gel était de 300 000 (intervalle: 100 000-500 000). Le rapport dimère : albumine est d'environ 1:10.
Pour reconstituer le complexe métallique, on a ajouté du Zn2+ et du Cu2+ de manière à ce que leur concentration soit double de la concentration molaire du complexe apoprotéine-albumine. Le mélange a ensuite été laissé pendant 2 heures à 4°C. Le pH a été ajusté à 7,8 par l'addition de KOH 1 M/l contenant une quantité de Cu2+ et Zn2+ double du nombre de moles de complexe. La solution a été passé à travers une colonne Sephadex G-25 équilibrée avec le tampon phosphate salin pH 7,8.
Le complexe métalloprotéine-albumine ainsi obtenu a été lyophilisé. Son activité dismutase était de 900 u/mg de produit sec.
II) Un peptide de la formule est: H-Val-Gln-Ala-Val-Ala-Val-Leu-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Val-Ser-Gly-Val-Val-Lys-Phe-Glu-Gln-Ala-Ser-Glu-Ser-Pro-Thr-Thr-Val-Ser-Tyr-Glu-Ile-Ala-Gly-Asn-Ser-Pro-Asn-Ala-Glu-Arg-Gly-Phe-His-lle-His-Glu-Phe-Gly-Asp-Ala-Thr-Asn-Glv-Cvs-Val-Ser-Ala-Glv-Pro-His-Phe-Asn-Pro-Lys-Lys-Thr-His-Gly-Ala-Pro-Thr-Asp-Glu-Val-Arg-His-Val-Gly-Asp-Met-GIy-Asn-Val-Lys-Thr-Asp-Glu-Asn-Gly-Vai-Ala-Lys-Gly-Ser-Phe-Lys-Asp-Ser-Leu-Ile-Lys-Leu-Ile-Gly-Pro-Thr-Ser-Val-Val-Gly-Arg-Ser-Val-Val-Ile-His-Ala-Gly-Gln-Asp-Asp-Leu-Gly-Lys-Gly-Asp-Thr-Glu-Glu-Ser-Leu-Lys-Thr-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Arg-Pro-Ala-Cvs-Glv-Val-lle-GIv-Leu-Thr-Asn-OH
(où il y a un pont disulfure entre les deux Ç^s soulignés), obtenu conformément au procédé du brevet US N° 340 675 (20 juillet 1982) et dialysé contre de l'EDTA 1 x 103 à pH 3,8 comme dans l'exemple I a été soumis à une réticulation par du glutaraldéhyde en présence d'albumine humaine purifiée selon la procédure de l'exemple I. Le complexe apoprotéine-albumine a été purifié et le produit obtenu a été incubé en présence de CU2+, Zn2+ comme dans l'exemple I pour donner un complexe métalloprotéine-albumine ayant une activité d'environ 800 u/mg de produit sec.
III) On a utilisé comme produit de départ un peptide sans métal comme celui de l'exemple I ou II. On a mélangé doucement à 4°C pendant 4 heures 2 mg de peptide, 50 mg d'albumine humaine, 2 mg d'anticorps antimyosine dont on avait enlevé la portion Fc par de la pepsine (voir L. HUDSON et F. C. HAY, «Immunologie Pratique», Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1976) et 50 ni de glutaraldéhyde (25%). Puis, on a ajouté 300 mg de glycine pour bloquer la réaction. On a ensuite dialysé pendant une nuit à 4°C contre une solution à 1% de NaCI et 1% de glycine. Le peptide qui n'avait pas réagi et les petits polymères ont été éliminés par Ultrafiltration avec des filtres Amicon XM 300. La reconstitution du complexe métallique a ensuite été effectuée comme dans l'exemple I, ce qui a permis d'obtenir un com5
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plexe métalloprotéine-albumine-antimyosine biologiquement actif avec uri activité dismutase de 500 unités par mg de produit sec.
Il apparaîtra clairement à ceux versés dans l'art que la description qui précède n'est donnée qu'à titre d'illustration, et que de nombreuses modifications et changements peuvent être effectués sans se départir de l'esprit de la présente invention et sans sortir de son domaine d'application. Par exemple, on peut utiliser des anticorps différents de ceux de l'exemple III, on peut utiliser d'autres agents de réticulation ou d'autres conditions expérimentales que celles décrites. Par conséquent, l'invention ne doit avoir d'autres limitations que celles découlant des revendications.
Claims (12)
1. Procédé pour l'obtention de complexes métallo-protéine-albumine biologiquement actifs sans perte d'activité biologique, caractérisé en ce qu'il consiste à faire réagir un agent de réagir un agent de réticulation sur une apoprotéine sans métal en présence d'albumine humaine, à purifier ledit complexe sans métal et à restituer l'activité biologique en ajoutant les métaux voulus audit complexe.
2. Procédé pour l'obtention de complexes métallo-protéine-albumine-anticorps biologiquement actifs sans perte d'activité biologique, caractérisé sur une apoprotéine sans métal en présence d'albumine humaine et d'un fragment d'anticorps, à purifier ledit complexe sans métal et à restituer l'activité biologique en ajoutant les métaux voulus.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'apoprotéine sans métal est choisie dans le groupe de peptides ayant la séquence d'acides aminés suivante: R-Ala-Thr-Lys-Ala-Val-Cys-Val-Leu-Lys-Gly-Asp-Pro-Val-GIn-GIy-Ser-lle-Asn-Phe-Glu-GIn-Lys-Glu-Ser-Asp-Gly-Pro-Val-Lys-Val-Trp-Gly-Ser-IIe-Lys-Gly-Leu-Thr-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Phe-His-Val-His-Gln-Phe-Gly-Asn-Asp-Thr-Ala-Glv-Cvs-Thr-Ser-Ala-Glv-Pro-His-Phe-Asn-Pro-Leu-Ser-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-Glu-Glu-Arg-His-Val-GIy-Asp-Leu-Gly-Asn-Val-Thr-Ala-Asp-Lys-Asp-Gly-Val-Ala-Asp-Val-Val-Ile-Glu-Asp-Ser-Val-Ile-Ser-Leu-Ser-Gly-Asp-His-Cys-lle-lle-Gly-Arg-Thr-Leu-Val-Val-His-Glu-Lys-Ala-Asp-Asp-Leu-Gly-Lys-Gly-Gly-Asn-Glu-Glu-Ser-Thr-Lys-Thr-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Arg-Leu-Ala-Cvs-GIv-Val-lle-Glv-lle-Ala-GIn-OH
où R est un H ou un Acétyl et où il y a un pont disulfure entre les deux Cvs soulignées.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'apoprotéine sans métal a la séquence d'acides aminés suivante: H-Val-Gln-Ala-Val-Ala-Val-Leu-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Val-Ser-Gly-Val-Val-Lys-Phe-Glu-Gln-Ala-Ser-Glu-Ser-Glu-Pro-Thr-Thr-Val-Ser-Tyr-Glu-Ile-Ala-Gly-Asn-Ser-Pro-Asn-Ala-Glu-Arg-Gly-Phe-His-Ile-His-Glu-Phe-Gly-Asp-Ala-Thr-Asn-Glv-Cvs-Val-Ser-Ala-Glv-Pro-His-Phe-Asn-Pro-Phe-Lys-Lys-Thr-His-GIy-Ala-Pro-Thr-Asp-Glu-Val-Arg-His-Val-Gly-Asp-Met-Gly-Asn-Val-Lys-Thr-Asp-Glu-Asn-Gly-Val-Ala-Lys-Gly-Ser-
Phe-Lys-Asp-Ser-Leu-Ile-Lys-Leu-Ile-Gly-Pro-
Thr-Ser-Val-Vai-Giy-Arg-Ser-Val-Val-lls-His-Ala-Gly-Gln-Asp-Asp-Leu-Gly-Lys-Gly-Asp-Thr-Glu-Ser-Leu-Lys-Thr-Gly-Asn-Ala-GIy-Pro-Arg-Pro-Ala-Cvs-Glv-Val-lle-GIv-Leu-Thr-Asn-OH où il y a un pont disulfure entre les deux Çys soulignés.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que l'agent de réticulation est choisi dans le groupe comprenant le glutaraldéhyde, les carbodiimides, l'anhydride cis-aconitique, le chlorure de l'acide cyanurique et les imidoesters.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'agent de réticulation est le glutaraldéhyde.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que les métaux sont Cu2+ et Zn2+.
8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé par le fait que le fragment d'anticorps est un fragment d'anticorps antimyosine.
9. Complexe métalloprotéine-albumine ou métallo-protéine-albumine-anticorps biologiquement actif obtenu par le procédé selon la revendication 1 ou 2, ayant la structure monomérique suivante: R-Ala-Thr-Lys-Ala-Val-Cys-Val-Lys-Gly-Asp-Gly-Pro-Val-Gln-Gly-Ser-Ile-Asn-Phe-Glu-Gln-Lys-Glu-Ser-Asp-Gly-Pro-Val-Lys-Val-Trp-Gly-Ser-Ile-Lys-Gly-Leu-Thr-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Phe-His-Val-His-Gln-Phe-GIy-Asn-Asp-Thr-Ala-Glv-Cvs-Thr-Ser-Ala-Glv-Pro-His-Phe-Asn-Pro-Leu-Ser-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-Glu-GIu-Arg-His-Val-GIy-Asp-Leu-Gly-Asn-Val-Thr-Ala-Asp-Lys-Asp-Gly-Val-Ala-Asp-Val-Val-Ile-Glu-Asp-Ser-Val-lIe-Ser-Leu-Ser-Gly-Asp-His-Cys-lle-lie-Gly-Arg-Thr-Leu-Val-Val-His-Glu-Lys-Ala-Asp-Asp-Leu-Gly-Lys-Gly-Gly-Asn-Glu-GIu-Ser-Thr-Lys-Thr-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Arg-Leu-Ala-Cvs-GIv-Val-lle-Glv-lle-Ala-Gln-OH
où les deux Cvs soulignés, où les métaux sont Cu2+ et Zn2+, où la teneur en albumine humains : métallo-protéine est comprise entre 20:1 et 1:1.
10. Complexe métalloprotéine-albumine-anticorps biologiquement actif obtenu par le procédé selon la revendication 1 ou 2, ayant la structure monométrique suivante:
H-Val-Gln-Ala-Val-Ala-Val-Leu-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Val-Ser-Gly-Val-Val-Lys-Phe-Glu-Gln-Ala-Ser-Glu-Ser-Glu-Pro-Thr-Thr-Val-Ser-Tyr-Glu-Ile-Ala-Gly-Asn-Ser-Pro-Asn-Ala-Glu-Arg-Gly-Phe-His-Ile-His-Glu-Phe-Gly-Asp-Ala-Thr-Asn-Glv-Cvs-Val-Ser-Ala-Glv-Pro-His-Phe-Asn-Pro-Phe-Lys-Lys-Thr-His-Gly-Ala-Pro-Thr-Asp-Glu-Val-Arg-His-Val-Gly-Asp-Met-Gly-Asn-Val-Lys-Thr-Asp-GIu-Asn-Gly-Val-Ala-Lys-Gly-Ser-Phe-Lys-Asp-Ser-Leu-lle-Lys-Leu-lle-Gly-Pro-Thr-Ser-Val-Val-Gly-Arg-Ser-Val-Val-Ils-His-Ala-GIy-Gln-Asp-Asp-Leu-GIy-Lys-Gly-Asp-Thr-Glu-Ser-Leu-Lys-Thr-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Arg-Pro-Ala-Cvs-GIv-Val-lle-GIv-Leu-Thr-Asn-OH où il y un pont disulfure entre les deux Cvs soulignés, où les métaux sont le Cu2+ et le Zn2+, où la teneur en albumine humaine : métalloprotéine est comprise entre 20:1 et 1:1.
11. Complexes cuivre-zinc-protéine-albumine ou
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cuivre-zinc-protéine-albumine-anticorps, où la protéine a la structure suivante: R-Ala-Thr-Lys-Ala-Val-Cys-Val-Leu-Lys-Gly-Asp-Gly-Pro-Val-Gln-Gly-Ser-IIe-Asn-Phe-GIu-Gln-Lys-Glu-Ser-Asp-Gly-Pro-Val-Lys-Val-Trp-Gly-Ser-Ile-Lys-Gly-Leu-Thr-Glu-Gly-Leu-His-Gly-Phe-His-Val-His-Gln-Phe-Gly-Asn-Asp-Thr-Ala-Glv-Cvs-Thr-Ser-Ala-Glv-Pro-His-Phe-Asn-Pro-Leu-Ser-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-Glu-Glu-Arg-His-Val-Gly-Asp-Leu-Gly-Asn-Val-Thr-Ala-Asp-Lys-Asp-Gly-Val-AIa-Asp-Val-Val-Ile-Glu-Asp-Ser-Val-Ile-Ser-Leu-Ser-Gly-Asp-His-Cys-Ile-Ile-Gly-Arg-Thr-Leu-Val-Val-His-Glu-Lys-Ala-Asp-Asp-Leu-GIy-Lys-Gly-Gly-Asn-Glu-Glu-Ser-Thr-Lys-Thr-Gly-Asn-Ala-Gly-Ser-Ara-Leu-Ala-Cvs-GIv-Val-lle-Glv-lle-Ala-GIn-OH où R est un H ou un Acétyl, où il y un pont disulfure entre les deux Cvs soulignés, où l'anticorps est un anticorps antimyosine et où la teneur en albumine humaine : métalloprotéine est comprise entre 20:1 et 1:1.
12. Complexes cuivre-zinc-protéine-albumine ou cuivre-zinc-protéine-albumine-anticorps où la protéine a ia structure suivante: H-Val-Gln-Ala-Val-Ala-Val-Leu-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Vai-Ser-Gly-Val-Val-Lys-Phe-Glu-Gln-Ala-Ser-Giu-Ser-Glu-Pro-Thr-Thr-Val-Ser-Tyr-Glu-Ile-Ala-Gly-Asn-Ser-Pro-Asn-Ala-Glu-Arg-Gly-Phe-His-Ile-His-Glu-Phe-Gly-Asp-Ala-Thr-Asn-Glv-Cvs-Val-Ser-Ala-Glv-Pro-His-Phe-Asn-Pro-Phe-Lys-Lys-Thr-His-Gly-Ala-Pro-Thr-Asp-Glu-Val-Arg-His-Val-Gly-Asp-Met-Gly-Asn-Val-Lys-Thr-Asp-Glu-Asn-Gly-Val-AIa-Lys-GIy-Ser-Phe-Lys-Asp-Ser-Leu-Ile-Lys-Leu-Ile-Gly-Pro-Thr-Ser-Val-Val-Gly-Arg-Ser-Val-Val-Ils-His-Ala-Gly-Gln-Asp-Asp-Leu-Gly-Lys-Gly-Asp-Thr-Glu-Ser-Leu-Lys-Thr-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Arg-Pro-Ala-Cvs-GIv-Val-lle-GIv-Leu-Thr-Asn-OH où il y a un pont disulfure entre les eux Cys soulignés, où l'anticorps est un anticorps antimyosine et où la teneur en albumine humaine : métalloprotéine est comprise entre 20:1 et 1:1.
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