CH680512A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Es wurde ein besonders bequemes Verfahren zur Herstellung von Peptidalkoholen gefunden, die am C-terminalen Ende der Peptidkette zwei Alkoholgruppen oder eine Alkoholgruppe und eine Thiolgruppe enthalten. Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von Peptidalkoholen, die einen C-terminalen Threoninol-, Serinol- oder Cysteinolrest enthalten. 



  Zu Beispielen für geelgnete Verbindungen gehören einige der hierin beschriebenen Somatostatin-Verbindungen. 



  Die Festphasenpeptidsynthese hat sich als besonders rasches und günstiges Verfahren zur Herstellung von Peptiden erwiesen und stellt daher ein hierzu heute allgemein übliches Verfahren dar. 



  Hierbei wird bekanntlich zuerst eine Aminosäure über ihre Carboxylgruppe unter Bildung einer Estergruppe oder Amidgruppe an eine Hydroxylgruppe oder Aminogruppe eines unlöslichen Syntheseharzes gebunden, worauf in der gewünschten Sequenz die weiteren Aminosäuren gebunden werden und abschliessend das fertige Polypeptid vom Trägerharz abgespalten wird. 



  Diese Synthese bereitet bei normalen Polypeptiden mit C-terminalen Aminosäuren keine Probleme. Polypeptidalkohole, die an ihrem C-terminalen Ende einen Aminoalkohol anstelle einer Aminosäure enthalten, gehen jedoch nicht ohne weiteres eine Bindung mit Trägerharzen ein, welche Hydroxylgruppen oder Aminogruppen aufweisen, und/oder lassen sich nach beendeter Synthese nicht so leicht vom Trägerharz abspalten. 



  Als mögliche Festphasenverfahren zur Herstellung von Peptidalkoholen wurden bereits folgende Methoden vorgeschlagen: 
 
   a) Eine herkömmliche Herstellung des entsprechenden Polypeptids, das am C-terminalen Ende eine Aminosäure enthält (wie der Ester eines hydroxylgrupoenhaltigen Harzes), und eine anschliessende reduktive Aufspaltung unter Verwendung von Borhydriden, wodurch die Carboxylgruppe zugleich in eine Alkoholfunktion überführt wird (US-A 4 254 023 und US-A 4 254 024). 
   b) Eine Bindung des terminalen Aminoalkohols als Ether an ein Hydroxymethylharz unter Verwendung von Carbonyldiimidazol und eine nach der Synthese des Peptids erfolgende Abspaltung unter Verwendung von HCl/TFA  oder HBr/TFA (Kun-hwa Hsieh und G.R. Marshall, ACS National Meeting, New Orleans, 21.-25. März 1977). 
 



  Diese beiden Methoden erfordern jedoch drastische Bedingungen bei der Aufspaltung. 



  Es wurde nun gefunden, dass sich die Abspaltung des Peptids vom Harz bei gleichzeitiger Bildung des C-terminalen Peptidalkohols dann unter milden Bedingungen durchführen lässt, wenn der C-terminale Aminoalkohol über eine Acetalbindung an das Harz gebunden ist. 



  Erfindungsgemäss wird der Peptidalkohol, der am C-terminalen Ende der Peptidkette 2 Alkoholgruppen oder 1 Alkoholgruppe und 1 Thiolgruppe enthält, durch saure Hydrolyse eines Acetals aus dem Peptidalkohol und einem polymeren Harz, das Formylphenylgruppen enthält, gebildet. Dieses Verfahren wird als die erfindungsgemässe Synthese bezeichnet. 



  Die dabei ablaufende Reaktion lässt sich formelmässig wie folgt darstellen: 
EMI3.1
 



  Darin haben die erwähnten Symbole folgende Bedeutungen:
 
EMI4.1
  ist der Rest eines unlöslichen Syntheseharzes.
 Z ist eine direkte Bindung oder ein Rest, der das Harz mit der (acetalisierten) Formylphenylgruppe verbindet.
 X steht für O oder S.
 R1 ist Wasserstoff oder Methyl.
 Y ist der Rest eines Peptidalkohols, der beispielsweise Schutzgruppen tragen kann. Die gegebenenfalls acetalisierte Gruppe CHO befindet sich dabei in m- oder p-Stellung zum Rest Z. 



  Aus Gründen der Einfachheit ist bei den im obigen Reaktionsschema angeführten Formeln Ir und IIr jeweils nur eine Substitutionsgruppe am Harz angegeben. An ein Molekül des polymeren Harzes ist jedoch selbstverständlich eine Reihe solcher Gruppen gebunden. Die Abspaltung des Peptidalkohols vom Harz durch Hydrolyse der Acetalgruppe erfolgt, wie bereits oben angegeben, unter sauren Bedingungen, beispielsweise mittels verdünnter Trifluoressigsäure. Diese Hydrolyse kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. 



  Ist Z in der Formel Ir eine direkte Bindung, dann sind die Acetalgruppen tragenden Phenylreste direkt an den Polymerrest gebunden und gehören zum Polymer. Beispiele für solche Verbindungen der Formel Ir sind die Acetale eines formylierten Polystyrolharzes (hierbei ist 
EMI4.2
  in der Formel Ir dann eine Polyäthylenkette). 



  Ist Z ein Rest, dann enthält dieser Rest eine Gruppe, welche aus einer Umsetzung zwischen einer reaktionsfähigen Gruppe,  die direkt oder indirekt an das Polymer gebunden ist, und einer anderen reaktionsfähigen Gruppe, die direkt oder indirekt an die (acetalisierte) Formylphenylgruppe gebunden ist, resultiert. 



  Der Rest Z kann beispielsweise die folgende Formel IIIr haben:
 
 -(D)p-Q1-Q2-(E)q- (Formel IIIr),
 



  worin die einzelnen Symbole folgende Bedeutungen haben:
 
 Q1 = Rest einer reaktionsfähigen Gruppe, die an das Polymer gebunden ist,
 Q2 = Rest einer reaktionsfähigen Gruppe, die an die (acetalisierte) Formylphenylgruppe gebunden ist,
 D = Rest, der die Gruppe Q1 mit dem Polymer verbindet,
 E = Rest, der die Gruppe Q2 mit der (acetalisierten) Formylphenylgruppe verbindet. 



  Die Indices p und q stehen unabhängig voneinander für 0 oder 1. 



  Die Gruppe Q1-Q2 ist vorzugsweise eine Estergruppe oder Amidgruppe, und insbesondere eine Carbonamidgruppe. Q1 steht vorzugsweise für NH, und Q2 bedeutet vorzugsweise CO. 



  Die Gruppen D und E sind unabhängig voneinander beispielsweise Alkylenreste oder Alkylenoxyreste mit 1 bis 5 Kohlerstoffatomen. 



  Beispiele für Verbindungen der Formel Ir, worin Z ein Rest der Formel IIIr ist, sind die Verbindungen, bei denen 
EMI5.1
  für den Rest eines aminomethylierten Polystyrolharzes steht und der Rest der Formel 
EMI6.1
 



  ein Rest der Formel IVr ist 
EMI6.2
 



  worin R Wasserstoff oder Methyl bedeutet und m für 0 oder 1 steht,
 wobei sich die Acetalgruppe wiederum in Stellung m oder p befindet. 



  In einem solchen Fall bedeutet Z die Gruppe 
EMI6.3
 



  während P Polystyrol ist. 



  Der Rest IVr hat vorzugsweise die Formel 
EMI6.4
 



  Anstelle des aminomethylierten Polystyrols können auch andere Polymere verwendet werden, und zwar insbesondere solche mit freien Aminogruppen, wie Polyacrylamide, welche Aminoethylgruppen tragen. 



   Die acetalisierte Formylphenylgruppe ist, wie bereits oben erwähnt, an das Polymer vorzugsweise durch eine Amidbindung gebunden. Hierdurch wird sichergestellt, dass die Bindung des acetalisierten Formylphenylrestes an das Harz während der Synthese des Polypeptids und während dessen Abspaltung vom Polypeptid stabil ist und dass die Abspaltung in der gewünschten Weise an der Acetalbindung erfolgt, so dass einerseits der Peptidalkohol gebildet wird und andererseits der Formylphenylrest am Harz bleibt. 



  Gewünschtenfalls kann der Peptidalkohol auch in einer vom Harz weiteren Entfernung gebunden sein, indem zwischen den reaktionsfähigen Gruppen des Polymers, insbesondere Aminogruppen, und den reaktionsfähigen Gruppen des acetalisierten Formylphenylderivats, insbesondere Carboxylgruppen, sogenannte Abstandshalter eingebaut werden. Für bestimmte Reaktionen am Polypeptidalkohol wird dies zweckmässigerweise vor der Aufspaltung getan, wie durch Oxidation von Cysteinresten. In diesem Fall enthält der Rest D oder E in der Formel IIr zusätzlich den Abstandshalter, wobei Q1 oder Q2 der reaktionsfähige Rest des Abstandshalters ist. 



  Der verwendete Abstandshalter kann beispielsweise eine  omega -Ami- nocarbonsäure, wie  epsilon -Aminocapronsäure, sein. 



  Bei Anwendung eines aminomethylierten Polystyrols, eines Rests der Formel IVr und von  epsilon -Aminocapronsäure als Abstandshalter entspricht die Gruppe Z dann beispielsweise der folgenden Formel: 
EMI7.1
 



  Die Verbindungen der Formel Ir können unter Anwendung von Methoden hergestellt werden, wie sie bei der Festphasentechnologie üblich sind, und zwar ausgehend von einer Verbindung der Formel Vr 
EMI8.1
 



  worin A eine Schutzgruppe für die Aminofunktion ist und sich die Acetalgruppe in Stellung m oder p zum Rest Z befindet. Zu diesem Zweck wird zuerst die Schutzgruppe A abgespalten und die frele Aminogruppe dann mit der nächsten N-geschützten Aminosäure usw. so lange umgesetzt, bis alle Aminosäuren an das Harz ln einer Sequenz gebunden sind, die dem gewünschten Peptidalkohol entspricht. 



  Die Aminoschutzgruppen, welche für die verwendeten Aminosäuren oder den Aminoalkohol ausgewählt werden, müssen so beschaffen sein, dass sie sich unter nicht sauren Bedingungen abspalten lassen, da es unter sauren Bedingungen zu einer Hydrolyse der Acetalgruppen kommt. Als derartige Schutzgruppen lassen sich beispielsweise die Gruppen CF3CO- oder FMOC- (9-Fluorenylme- thyloxycarbonyl) verwenden. Diese Schutzgruppen lassen sich in einem basischen Medium unter Anwendung von in der Peptid-Chemie üblichen Methoden abspalten. 



  Es können auch lediglich die Schutzgruppen in den Seitenketten und die Aminoschutzgruppe der als letzte angewandten Aminosäure säurelabil sein und dann gleichzeitig mit der Bildung des Peptidalkohols vom Harz abgespalten werden. 



  Als Schutzgruppe wird die BOC-Gruppe bevorzugt. 



  Als Basen werden vorzugsweise KOH oder Piperidin oder NaBH4 verwendet. 



  Der Aufbau der Peptidkette kann in herkömmlicher Weise, ausgehend von einem Peptidrest mit freien Aminogruppen und einer Aminosäure mit freien oder aktivierten Carboxylgruppen, durchgeführt werden. 



  Die Umsetzung kann unter Zusatz von beispielsweise Hydroxybenzotriazol und Dicyclohexylcarbodiimid erfolgen. 



  Die Verbindungen der Formel Vr können beispielsweise hergestellt werden, indem 
 
   a) ein eine Aldehydgruppe tragendes Harz der Formel IIr 
EMI9.1
 
   worin sich die Gruppe CHO in Stellung m oder p zum Substituenten Z befindet,
 mit einem N-geschützten Aminoalkohol der Formel
 
 HX-CHR1-CH(NHA)-CH2OH,
 
   der gegebenenfalls in aktivierter Form vorliegt, umgesetzt wird oder 
   b) ein Harz der Formel 
EMI9.2
 
    mit einer Verbindung der Formel VIr 
EMI10.1
 
   worin sich die Acetalgruppe in Stellung m oder p zur Gruppe Q min 1-(E)q befindet und die Reste Q min 1 und Q min 2 zwei reaktionsfähige Gruppen sind, die unter Bildung einer Brücke Q1-Q2 miteinander reagieren, umgesetzt wird. 
 



  Die Acetalisierung gemäss Verfahren a) kann in Gegenwart einer Säure als Katalysator durchgeführt werden. Zu hierfür geeigneten Säuren gehören p-Toluolsulfonsäure und p-Trifluormethylsulfonsäure. 



  Gewünschtenfalls kann eine Trimethylsilylgruppe als Schutzgruppe für einen freien Alkohol verwendet werden. 



  Die Veresterung gemäss Verfahren b) kann unter sehr milden Bedingungen durchgeführt werden, wie durch Umsetzung eines Carbonsäurederivats mit einem Polymer, das eine Gruppe OH oder NH2 trägt 



  Die Verbindungen der Formel VIr können durch Acetalisierung einer Verbindung der Formel 
EMI10.2
 



  mit einer Verbindung der Formel  
 



  HX-CHR1-CH(NHA)-CH2OH
 



  hergestellt werden. 



  Diese Acetalisierung kann,wie oben beim Verfahren a) beschrieben, durchgeführt werden. 



  Während des Aufbaus und der Abspaltung des Peptidalkohols vom Harz können weitere Umsetzungen bewerkstelligt werden, beispielsweise eine Entfernung von Schutzgruppen, wie S-Schutzgruppen, oder eine Oxidation von Cysteinresten. 



  Solche Umsetzungen können auch nach erfolgter Abspaltung des Peptidalkohols in flüssiger Phase durchgeführt werden. 



  Unter Anwendung der erfindungsgemässen Synthese lassen sich in einfacher Weise pharmakologisch wirksame und sonstige Peptide herstellen, die am C-terminalen Ende zwei Alkoholgruppen oder eine Alkoholgruppe und eine Thiolgruppe enthalten. 



  In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben und die [ alpha ]20_D-Werte nicht korrigiert. Es werden darin die folgenden Abkürzungen verwendet:
 
 BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
 But = tert.-Butyl
 DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid
 Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
 Thr-ol = Threoninolrest = CH3-CHOH-CH(CH2OH)-NH-
 HOBT = N-Hydroxybenzotriazol 
 



  Bei allen erhaltenen Peptiden handelt es sich um Polyacetate-Polyhydrate mit einem Peptidgehalt von 70 bis 90%. 



  Durch HPLC-Analyse ergibt sich, dass die Peptide weniger als 5% an anderen Peptiden enthalten. 



  Die erfindungsgemässen Synthesen können wie folgt durchgeführt werden. 


 Beispiel S 1
 Herstellung von Octreotid ( = SMS) 
 


 1) Herstellung des Ankeracetals (N-CF3CO-Threoninol-acetal der p-Formylphenoxy-essigsäure) 
 



   105 g (1,0 Mol) L-Threoninol werden in 200 ml Methanol unter Stickstoffspülung vorgelegt. Zu der erhaltenen klaren Lösung wird bei 0 DEG C eine Lösung aus 200 ml Trifluoressigsäuremethylester in 250 ml Methanol zugetropft. Dabei wird die Innentemperatur mittels Eisbad auf ca. 10 DEG C gehalten. Nach 1,5 Stunden ist in der Reaktionslösung kein Threoninol mehr nachweisbar. Eindampfen bei 40 DEG C ergibt einen weissen kristallinen Rückstand. Dieser wird in 200 ml Essigsäureethylester bei 70 DEG C gelöst und mit 100 ml Hexan gefällt. Dann wird auf 0 DEG C abgekühlt, mit Hexan gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält das N-Trifluoracetyl-threoninol. 



  50,3 g (0,25 Mol) des erhaltenen Produkts werden in 1,25 Liter Tetrahydrofuran gelöst und tropfenweise mit 75 ml Trimethylchlorsilan versetzt. Sofort anschliessend wird eine Mischung aus 70 ml Triethylamin und 250 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Es entsteht eine weisse Suspension, die 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird. Dann wird filtriert und das Filtrat bei 40 DEG C unter Bildung eines \ls eingedampft. 



  Das \l wird in 1,5 Liter Methylenchlorid gelöst und bei Raumtemperatur portionenweise mit 90,4 g p-Formyl-phenoxyessigsäure versetzt. Dann werden portionenweise insgesamt 9 ml Trifluormethansulfonsäuretrimethylsilylester zugegeben. Es wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann filtriert und der Rückstand gut mit Methylenchlorid gewaschen. 



  Das Filtrat wird bei 40 DEG C eingedampft und ergibt als Rückstand ein orangerotes harzartiges Produkt. Dieses Produkt wird über Kieselgel chromatographiert. Die Elution wird mit Essigsäureethylester durchgeführt. Durch Eindampfen der gewünschten Fraktionen wird die oben erwähnte Verbindung mit einer Reinheit von 97% (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) erhalten. 


 2) Aufbau des geschützten Octapeptids 
 



  Man suspendiert 17,2 g aminomethyliertes Polystyrol (Brand Dow 0,7 Gewichtsprozent N, was 0,50 mMol Aminomethylgruppen pro g Harz entspricht) werden in 80 ml Methylenchlorid/Dimethylformamid 4:1 suspendiert. Dazu werden sukzessive 4,17 g des Endprodukts der Stufe 1), 1,6 g Hydroxybenzotriazol (HOBT) und 4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) gegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur ist der Kaisertest negativ. Das Gemisch wird filtriert und gewaschen. Das gewaschene Harz wird in 100 ml Tetrahydrofuran/Methanol 3:1 suspendiert und portionenweise mit 10,4 g Natriumborhydrid versetzt. Es wird 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und gewaschen. Das Harz wird wieder in Methylenchlorid/Dimethylformamid (4:1) suspendiert und mit 5,57 g FMOC-Cys(S-t-Bu)OH, 1,74 g Hydroxybenzotriazol (HOBT) und 3,6 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) versetzt.

  Hierauf wird die FMOC-Schutzgruppe mit Piperidin (2x 20 Minuten Kontaktzeit) abgespalten. 



  In analoger Weise werden sukzessive die N-FMOC-geschützten Aminosäuren Thr-OH, Lys(BOC)-OH, D-Trp-OH, Phe-OH, Cys(S-t-Bu)OH und D-Phe-OH mittels HOBT/DCCI angekuppelt, wodurch man das FMOC-geschützte Oktapeptid-Harz erhält. Die Endbeladung beträgt 0,26 mMol/g. 


 3) Oxidation und Abspaltung 
 



  Das erhaltene Harz wird in 100 ml Trifluorethanol/Methylenchlorid 1:1 suspendiert und mit 50 ml Tributylphosphin versetzt. Rühren 70 Stunden bei Raumtemperatur. Dann wird filtriert, gewaschen und mit 100 ml eines 1:1-Gemisches aus Tetrahydrofuran und einer einnormalen Amminacetatlösung versetzt. Dazu werden 1,1 ml 30%iges wässriges Wasserstoffperoxid gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Dann wird das Harz gewaschen und mit einem Gemisch aus 20 ml Trifluoressigsäure, 80 ml Methylenchlorid, 10 ml Wasser und 2 ml Thioanisol versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden gerührt und filtriert und dann mit Trifluoressigsäure und Methylenchlorid gewaschen. Zum Filtrat werden 200 ml Diethylether gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert. Der Rückstand wird in einem wässrigen Puffer gelöst und dann beispielsweise unter Verwendung von Duolit entsalzt.

   Durch anschliessendes Gefriertrocknen des Acetats erhält man die Titelverbindung als Essigsäuresalz. 

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung eines Peptidalkohols, der am C-terminalen Ende der Peptidkette zwei Alkoholgruppen oder eine Alkoholgruppe und eine Thiolgruppe aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der Peptidalkohol durch saure Hydrolyse aus einem Acetal des Peptidalkohols und einem Formylphenylreste enthaltenden Harz hergestellt wird.

2.

Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Peptidalkohols der Formel EMI17.1 worin Y der Rest eines Peptidalkohols ist, R1 Wasserstoff oder Methyl ist und X für O oder S steht, dadurch gekennzeichnet, dass ein Harz der Formel Ir EMI17.2 welches den Peptidalkohol trägt, worin EMI17.3 der Rest eines unlöslichen Syntheseharzes ist und Z eine direkte Bindung oder ein Rest ist, der das Harz mit der acetalisierten Formylphenylgruppe verbindet, wobei sich die acetalisierte Gruppe CHO in Stellung m oder p zum Rest Z befindet und an ein Molekül des Harzpolymers eine Anzahl an acetalisierten Formylphenylgruppen gebunden ist, unter sauren Bedingungen hydrolysiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest EMI17.4 ein Polystyrolrest ist.

4.

Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest Z eine Gruppe der folgenden Formel ist -(D)p-Q1-Q2-(E)q- worin die einzelnen Symbole folgende Bedeutungen haben: Q1=Rest einer reaktionsfähigen Gruppe, die an das Polymer gebunden ist, Q2 = Rest einer reaktionsfähigen Gruppe, die an die acetalisierte Formylphenylgruppe gebunden ist, D = Rest, der die Gruppe Q1 mit dem Polymer verbindet, E = Rest, der die Gruppe Q2 mit der acetalisierten Formylphenylgruppe verbindet, wobei die Indices p und q unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen.

5.

Verbindungen der Formel Ir EMI18.1 worin die angegebenen Symbole folgende Bedeutungen haben EMI19.1 ist der Rest eines unlöslichen Syntheseharzes, Z ist eine direkte Bindung oder ein Rest, der das Harz mit der acetalisierten Formylphenylgruppe verbindet, X steht für O oder S, R1 ist Wasserstoff oder Methyl und Y ist der Rest eines Peptidalkohols, der gegebenenfalls Schutzgruppen tragen kann, wobei sich die acetalisierte Gruppe CHO in Stellung m oder Stellung p zum Rest Z befindet und an ein Molekül des Harzpolymers eine Anzahl an acetalisierten Formylphenylgruppen gebunden ist, als Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2.