CN105492019B

CN105492019B - 抗体制剂和方法

Info

Publication number: CN105492019B
Application number: CN201480047476.9A
Authority: CN
Inventors: P·加里代尔; A·兰格; M·格伦德曼
Original assignee: Prothena Biosciences Ltd
Current assignee: Prothena Biosciences Ltd
Priority date: 2013-07-04
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2020-02-11
Anticipated expiration: 2034-07-03
Also published as: EP3016677A2; CN105492019A; SG11201510601TA; EP3524264A1; US20200140534A1; US10513555B2; US20150079074A1; JP2016534052A; CL2015003801A1; JP6404338B2; KR20160030247A; RU2016103079A; AU2014285719A1; PH12015502788A1; CU20170039A7; PE20160868A1; JP2021020941A; CU20160001A7; JP2019011339A; WO2015001504A2

Abstract

本发明提供了可用于预防或治疗共核蛋白病(包括帕金森氏病)的抗体制剂和方法。

Description

抗体制剂和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年7月4日提交的美国临时专利申请号61/843,011和于2014年4月15日提交的美国临时专利申请号61/979,886的权益，为了所有目的，二者均通过引用整体并入本文。

序列表的引用

为“抗体制剂和方法”于2014年7月1日创建的文件446257SEQLIST.txt中所写的序列表为37.9千字节。该文件中包含的信息通过引用并入本文。

背景

共核蛋白病(synucleinopathy)也被称为路易体疾病(LBD)，以多巴胺能系统退化、运动性改变(motor alteration)、认知障碍和形成路易体(LB)和/或路易神经突为特征(McKeith等,Neurology(1996)47:1113-24)。共核蛋白病包括帕金森氏病(包括自发性帕金森氏病)、弥散性路易体病(DLBD)(也称为路易体痴呆(DLB)、阿尔茨海默氏病的路易体变型(LBV)、组合的阿尔茨海默氏病和帕金森氏病、单纯性自主神经衰竭和多系统萎缩(MSA；例如，橄榄体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性和Shy-Drager综合征)。疾病前驱阶段(即，症状前、亚临床、临床前或前运动时期)的多种非运动征象和症状被认为是共核蛋白病的预兆。此类早期征象包括例如REM睡眠行为障碍(RBD)、失去嗅觉和便秘(Mahowald等,Neurology(2010)75:488-489)。路易体疾病依然是老年人群中运动障碍和认知退化的常见原因(Galasko等,Arch.Neurol.(1994)51:888-95)。

α-突触核蛋白是包括β-和γ-突触核蛋白和核突触蛋白(synoretin)在内的蛋白质大家族的一部分。α-突触核蛋白在与突触相关的正常状态表达，并且被认为在神经可塑性、学习和记忆中具有重要作用。多个研究发现α-突触核蛋白在PD发病机理中的重要作用有牵连。蛋白在病理状态下可以聚集形成不溶性纤维。例如，突触核蛋白在LB中聚集(Spillantini等,Nature(1997)388:839-40；Takeda等,J.Pathol.(1998)152:367-72；Wakabayashi等,Neurosci.Lett.(1997)239:45-8))。α-突触核蛋白基因中的突变与稀有家族形式的帕金森氏病共分离(co-segregate)(Kruger等,Nature Gen.(1998)18:106-8；Polyme ropoulos,等,Science(1997)276:2045-7)。转基因小鼠(Masliah等,Science(2000)287:1265-9)和果蝇(Feany等,Nature(2000)404:394-8)中α突触核蛋白的过表达模拟了路易体病的多个病理学方面。此外，已经发现突触核蛋白的可溶性低聚物可能是神经毒性的(Con way KA等,Proc Natl Acad Sci USA(2000)97:571–576；VollesMJ,LansburyPT,Jr Biochemistry(2003)42:7871–7878)。物种和动物模型中α-突触核蛋白的积累以及类似的形态和神经变化与人、小鼠和蝇类中一样多种多样，表明这种分子促使了路易体病的发展。

要求保护的发明的概述

本发明提供了可用于预防和治疗共核蛋白病的抗体制剂，本发明提供了药物制剂，其包含：(a)抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶饰(veneered)或人源化形式或者与9E4特异性竞争结合和/或针对α-突触核蛋白的氨基酸残基118-126内的表位的其片段，其中抗体以约1mg/mL至约100mg/mL的浓度存在；(b)以约10mM至约30mM范围内的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂；(c)以约210mM至约250mM范围内的浓度存在的海藻糖；以及(d)以按重量计约0.005％至约0.05％范围内的浓度存在的聚山梨醇酯20；其中制剂的特征在于pH在约5.5至约7内。一些制剂例如包含抗体，该抗体包括与SEQ ID NO:11至少90％同一并且包括SEQ ID NO:11的三个Kabat CDR的成熟人源化重链可变区，以及与SEQ ID NO:4至少90％同一并且包括SEQ ID NO:4的三个Kabat CDR的人源化轻链。

在本发明的一些实施方案中，抗体以约5-100mg/ml，例如5mg/mL至约15mg/mL范围内(例如约10mg/mL)的浓度存在，或者以约25-75mg/mL范围内(例如，约50mg/mL)的浓度存在。在本发明的一些制剂中，抗体以约36mg/mL至约44mg/mL范围内(例如，约40mg/mL)的浓度存在。

在本发明的一些制剂中，柠檬酸盐缓冲剂以约20mM的浓度存在。

在本发明的一些制剂中，海藻糖以约230mM的浓度存在。

如本文所述制备的，本发明的一些代表性制剂：(a)特征在于约335mOsm/kg的摩尔渗透压浓度；(b)包含少于约10％的在制剂中以聚集物存在的抗体；(c)还包含填充剂；(d)是无菌的；和/或(e)在冻融中稳定。如本文所述制备的，本发明的一些代表性制剂：(a)特征在于约295mOsm/kg至约375mOsm/kg的摩尔渗透压浓度；(b)包含少于约10％或少于约5％的在制剂中以聚集物存在的抗体；(c)还包含填充剂；(d)是无菌的；和/或(e)在冻融中稳定。

在本发明的一个方面中，制剂包括：(a)抗体，该抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，其中该抗体以约40mg/mL的浓度存在；(b)以约20mM的浓度存在的柠檬酸缓冲剂；(c)以约230mM的浓度存在的海藻糖；(d)以约0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇酯20；和(e)约6.0的pH。

药物制剂可以包括：(a)抗体，其为抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)或者抗体9E4的嵌合、镶饰或人源化形式或者与9E4特异性竞争结合的其片段，和/或针对α-突触核蛋白的氨基酸残基118-126内的表位的嵌合、镶饰或人源化抗体，其中抗体以约1mg/mL至约100mg/mL的浓度存在；(b)缓冲剂；(c)糖和/或聚醇；和(d)表面活性剂。在一些特定实施方案中，所公开制剂的抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸。

抗体制剂可以是冻干的。例如，代表性冻干制剂可以包括：(a)抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的人源化形式或者其抗原结合片段；(b)组氨酸、柠檬酸盐或琥珀酸盐；(c)海藻糖、蔗糖或者蔗糖和甘露醇的混合物；以及(d)聚山梨醇酯20。冻干制剂在重构时pH可以在约6至约7之间，例如重构时pH 6.0或6.5。冻干制剂通常包含约40mg至约1000mg抗体。冻干制剂通常包含浓度在按重量计约0.005％至约0.05％范围内的聚山梨醇酯20。在重构后，冻干制剂产生水溶液。例如，重构的水溶液可以包括：(a)以约40mg/mL的浓度存在的抗体9E4的人源化形式(例如，抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO:31或32中的任一个的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸)；(b)以约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂；(c)以约230mM的浓度存在的海藻糖；(d)以约0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇酯20；以及(e)约6.0的pH。一种代表性冻干制剂包含约200mg抗体。

还提供了编码用于制备所公开制剂的抗体的核酸。例如，这样的核酸包括含编码SEQ ID NO:29的抗体轻链的核苷酸序列的核酸，和含编码SEQ ID NO:32的抗体重链的核苷酸序列的核酸。例如，SEQ ID NO:17给出的核苷酸序列编码SEQ ID NO:29的人源化9E4轻链可变区元件。又例如，SEQ ID NO:20给出的核苷酸序列编码SEQ ID NO:32的人源化9E4重链可变区元件。

为了产生抗体，可以将所公开的核酸单独地或者组合地(例如，编码人源化9E4轻链的核酸和编码人源化94E重链的核酸的组合)引入到载体中。例如，载体可以包括含编码SEQ ID NO:15-17中的任一个的核苷酸序列的核酸，含SEQ ID NO:18-20中的任一个的核苷酸序列的核酸，或者它们的组合。本发明的代表性载体包括：(a)包含编码SEQ ID NO:29给出的人源化9E4轻链和SEQ ID NO:31给出的人源化9E4重链的核酸序列的载体；和(b)包含编码SEQ ID NO:29的氨基酸序列的核酸和编码SEQ ID NO:32的氨基酸序列的核酸的载体。

还提供了宿主细胞(例如，CHO细胞)，宿主细胞具有引入其基因组的一个或更多个本文所公开核酸。例如，宿主细胞在其基因组中可以包括稳定整合的包含编码SEQ ID NO:15-17中的任意一个的核苷酸序列的核酸；稳定整合的包含编码SEQ ID NO:18-20中的任一个的核苷酸序列的核酸；或者它们的组合。本发明的代表性宿主细胞包括：(a)包含编码SEQID NO:29给出的人源化9E4轻链和SEQ ID NO:31给出的人源化9E4重链的核酸序列的宿主细胞；和(b)包含具有SEQ ID NO:29的核苷酸序列的核酸和具有SEQ ID NO:32的核苷酸序列的核酸的宿主细胞。

本发明还提供了制备药物制剂的方法。在本发明的一个方面，此类方法包括：(a)培养哺乳动物细胞，哺乳动物细胞具有稳定并入其基因组的编码小鼠、嵌合、镶饰或人源化9E4抗体的轻链和重链的核酸，以使得细胞将抗体分泌到细胞培养基中，以及从细胞培养基中纯化抗体；以及(b)制备制剂，该制剂包括：(i)抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶饰或人源化形式或者与9E4特异性竞争结合的其片段，其中抗体以约10mg/mL至约50mg/mL的浓度存在；(ii)以约20mM至约30mM范围内的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂；(iii)以约210mM至约250mM范围内的浓度存在的海藻糖；以及(iv)以按重量计约0.005％至约0.05％范围内的浓度存在的聚山梨醇酯20；其中该制剂的特征在于pH在约5.5至约6.5的范围内。可用于此目的的哺乳动物细胞包括：(a)具有稳定并入其基因组的编码SEQ ID NO:29给出的人源化9E4轻链和SEQ ID NO:31给出的人源化9E4重链的核酸序列的宿主细胞；和(b)具有稳定并入其基因组的具有SEQ ID NO:29的核苷酸序列的核酸和具有SEQ ID NO:32的核苷酸序列的核酸的宿主细胞。在本发明的一些方面，所公开的制备药物制剂的方法包括评估制剂中抗体的至少一种性质如物理稳定、化学稳定性和/或生物学活性的步骤。

还提供了治疗性或预防性治疗患有共核蛋白病或者具有患共核蛋白病的风险的人患者的方法，该方法包括向患者施用有效剂量的本发明制剂。一些适用于治疗的患者可能患有帕金森氏病。

所公开的治疗性和预防性治疗方法包括联合疗法(即，施用所公开抗体制剂和一种或更多种额外的药物物质)，因此引起了协同效果。两种药物物质同时施用或者以任何顺序按顺序施用。例如，可以在施用第二药物物质之前、与第二药物物质同时或者在施用第二药物物质之后施用本发明药剂。本发明制剂可以与例如左旋多巴、benzaseride、卡比多巴、多巴胺激动剂、COMT抑制剂、MAO抑制剂、金刚烷胺或抗胆碱能剂同时或相继施用。

根据所公开的治疗性或预防性治疗方法，本发明制剂可以以多剂量施用，例如，以约每日一次至约每年一次范围内的频率，例如以约每隔一周一次至约每三周一次范围内的频率，或者例如每月一次或者每四周一次的频率。在一个方面，本发明的抗体制剂以约0.3mg/kg至约30mg/kg药物物质的剂量静脉内施用。示例性给药方案包括约0.3mg/kg、约1.0mg/kg、约3.0mg/kg、约10mg/kg和约30mg/kg的人源化9E4药物作为单剂量或者每四周一次静脉内施用。

例如，治疗性或预防性治疗患有共核蛋白病(例如，帕金森氏病)或者具有患共核蛋白病的风险的人患者的方法可以包括向患者施用有效剂量的药物制剂，该药物制剂包括：(a)抗体，该抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，其中抗体以约40mg/mL的浓度存在；(b)以约20mM的浓度存在的柠檬酸缓冲剂；(c)以约230mM的浓度存在的海藻糖；(d)以约0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇酯20；和(e)约6.0的pH。在此类方法中，剂量通常为以约每周一次至约每28天一次或者约每季度一次的频率静脉内或皮下施用约0.3mg/kg至约30mg/kg抗体(例如，约0.5mg/kg至约8mg/kg，或者约8mg/kg至约30mg/kg)。

本发明还提供了药物产品，该药物产品包括：(a)小瓶，该小瓶包含约200mg粉末形式抗体；(b)用于重构抗体的说明；和(c)用于制备输注用重构抗体的说明，其中例如，(i)抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸；以及(ii)重构说明需要利用注射用水重构到约5mL的可提取体积。

附图简述

图1是人源化9E4抗体的DSC温谱图，示出了与升高或降低含1.5mg/ml人源化9E4抗体(形式H3L3)的溶液的温度相关的能量流(卡路里/℃)。抗体溶液以插入框内示出的顺序按顺序加热和冷却。对线进行编号以指示与插入框中示出的5个温度转变中的每一个相关的线。

图2是描绘了作为pH的函数的人源化9E4抗体(形式H3L3)的转变温度的图。不同符号示出了通过RALS、IF和DSC确定的转变温度。在每个pH下观察两个或三个DSC转变温度，每个用不同符号表示。

图3是描绘了不具有储存期的冻干并且重构的制剂F1-F4(如表10中所述)的显微可见的颗粒计数(≥2.0mm、≥10.0mm和≥25.0mm)的柱状图。

图4是描述了冻干、在40℃下储存1个月并且重构后的F1-F4(如表10中所述)的显微可见的颗粒计数(≥2.0mm、≥10.0mm和≥25.0mm)的柱状图。

图5是描述了冻干、在40℃下储存2个月并且重构后的F1-F4(如表10中所述)的显微可见的颗粒计数(≥2.0mm、≥10.0mm和≥25.0mm)的柱状图。

图6是描述了冻干、在40℃下储存3个月并且重构后的F1-F4(如表10中所述)的显微可见的颗粒计数(≥2.0mm、≥10.0mm和≥25.0mm)的柱状图。

图7是描述了作为制剂(F1-F4，如表10中所述)和在40℃下以冻干形式储存时间的函数的单体人源化9E4抗体(形式H3L3)的损失。

序列简述

SEQ ID NO:1是m9E4VL可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是人VL受体序列的可变区的氨基酸序列(NCBI目录号AAY33350)。

SEQ ID NO:3是Hu9E4VLv1可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是Hu9E4VLv2可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是Hu9E4VLv3可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是m9E4VH可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是人VH受体序列可变区的氨基酸序列(NCBI目录号AAC50998)。

SEQ ID NO:8是Hu9E4VHv1可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是Hu9E4VHv2可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10是Hu9E4VHv3可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11是Hu9E4VHv4可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12是野生型人α-突触核蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13是人源化9E4轻链恒定区的氨基酸序列，具有N-末端精氨酸。

SEQ ID NO:14是人源化9E4重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15是编码Hu9E4VLv1可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:16是编码Hu9E4VLv2可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:17是编码Hu9E4VLv3可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:18是编码Hu9E4VHv1可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:19是编码Hu9E4VHv2可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:20是编码Hu9E4VHv3可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:21是编码Hu9E4VHv4可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO:22是Hu9E4VL信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:23是编码Hu9E4VL信号肽的核苷酸序列。

SEQ ID NO:24是Hu9E4VH信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25是编码Hu9E4VH信号肽的核苷酸序列。

SEQ ID NO:26是Hu9E4VL共有氨基酸序列。

SEQ ID NO:27是Hu9E4VH共有氨基酸序列。

SEQ ID NO:28是人源化9E4轻链恒定区的氨基酸序列，不具有N-末端精氨酸。

SEQ ID NO:29是人源化9E4轻链的氨基酸序列，其包括(a)可变区(形式3)和(b)具有N-末端精氨酸的恒定区。

SEQ ID NO:30是人源化9E4轻链的氨基酸序列，其包括(a)可变区(形式3)和(b)不具有N-末端精氨酸的恒定区。

SEQ ID NO:31是人源化9E4重链的氨基酸序列，其包括(a)可变区(形式3)和(b)恒定区。

SEQ ID NO:32是人源化9E4重链的氨基酸序列，其包括(a)可变区(形式3)和(b)BIP形式重链G1m3同种型恒定区。

SEQ ID NO:33是BIP形式重链G1m3同种型恒定区的氨基酸序列。

定义

术语“抗体”包括完整抗体及其结合片段。通常，片段与得到它们的完整抗体竞争同靶标的特异性结合。片段包括单独重链、单独轻链、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Fv、单链抗体和单结构域抗体。术语“抗体”还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人造杂交抗体(参见，例如Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等,J.Immunol.,148:1547-53(1992))。

基础抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括两个相同多肽链对，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重链”(约50-70kDa)。每个链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。当最初表达时，可变区通常与可切割信号肽连接。不具有信号肽的可变区有时候称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区意指不具有轻链信号肽的轻链可变区。每个链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。恒定区可以包括CH1区、铰链区、CH2区和CH3区中任一个或全部。

轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，并且分别定义了抗体同种型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10或更多个氨基酸的“D”区(一般地参见，Fundamental Immunology(Paul,W.编辑,第2版.Raven Press,N.Y.,1989),第7章)(为了所有目的，其通过引用整体并入本文)。

每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点。除双功能或双特异性抗体外，两个结合位点相同。所有链表现出相同的一般结构：通过三个超变区连接的相对保守的框架区(FR)，也称为互补决定区或CDR。来自每一对的两个链的CDR通过框架区比对，能够与特异性表位结合。从N-末端到C-末端，重链和轻链均包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4区。每个区域氨基酸的分配根据以下文献的定义：Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1987and 1991),或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等,Nature 342:878-883(1989)。Kabat还提供了广泛使用编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链之间或不同轻链之间的相应残基分配相同编号。

百分比序列同一性通过Kabat编号惯例最大比对的抗体序列确定。在比对后，如果主题抗体区(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区比较，则主题抗体区域和参考抗体区域之间的百分比序列同一性是由主题抗体区域和参考抗体区域二者中的相同氨基酸占据的位置的数目除以两个区域比对位置的总数(缺口不计数)乘以100以转换成百分比。

为了将氨基酸置换分类为保守的或非保守的，将氨基酸如下分组：组I(疏水侧链)：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；组II(中性亲水侧链：Cys、Ser、Thr；组III(酸性侧链)：Asp、Glu；组IV(碱性侧链)：Asn、Gln、His、Lys、Arg；组V(影响链方向的残基)：Gly、Pro；和组VI(芳香族侧链)：Trp、Tyr、Phe。保守置换涉及同一类氨基酸之间的置换。

非保守置换构成了这些类别中一类的成员与另一类的成员的交换。

本发明抗体通常以至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰M^-1的亲和常数以其指定靶标结合。这样的结合是特异性结合，因为可检测到更高的量级，并且可以与至少一种不相干靶标的非特异性结合区分开。特异性结合可以是由于在特定官能团或特定空间配合(例如，锁和钥型)之间形成了键的结果，而非特异性结合通常是由于范德华力的结果。但是特异性结合并未必然意味着单克隆抗体结合一种并且仅一种靶标。

术语“症状”是指由对象感知到的疾病的主观证据，例如步态改变、“征象”是指由医生观察的疾病的客观证据。

如果对象具有至少一种已知的风险因子(例如，遗传的、生物化学的、家族史的或环境暴露)，则处于增加的疾病风险之下，与不具有风险因子的个体相比，风险因子使具有该风险因子的个体处于统计学上显著更大的形成疾病的风险之下。统计学上显著意指p≤0.05。

除非从上下文另外明显地，否则术语“约”包括设定值的平均值的标准偏差和/或设定值的+/-5％之内的值，无论是哪一个更大。

术语“9E4抗体”是指其中每个CDR基本上未9E4的CDR的任何抗体，因此包括小鼠、嵌合、镶饰和人源化9E4。

除非从上下文另外明显地，否则对范围的参考包括范围内的任何整数。

详述

I.概括

9E4是与人α-突触核蛋白的氨基酸残基118-126内的表位结合的抗体。抗体的人源化形成描述在WO/2013/063516中，为了所有目的，其通过引用整体并入本文。本申请提供并入了9E4的嵌合、镶饰或人源化形式(有时候也称为9E4抗体)的液体或冻干制剂。制剂被设计为具有赋予抗体以稳定性的组分的组合，如下文将详细描述的。

II.靶分子

天然人野生型α-突触核蛋白是具有以下氨基酸序列的140个氨基酸的肽：

MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH

GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL

GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (SEQ ID NO:12)

(Ueda等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:11282-6)；GenBank目录号:P37840。该蛋白质具有三个公认的结构域：覆盖氨基酸1-61的KTKE重复结构域；氨基酸60-95的NAC(非淀粉样蛋白组成分)结构域；和约氨基酸98至140的C-末端酸性结构域。

除非从上下文另外明显地，否则提到α-突触核蛋白或其片段包括上文指出的天然人野生型氨基酸序列及其人等位基因变体，特别是与路易体疾病相关的那些(例如，变体E46K、A30P和A53T，第一个字母指示SEQ ID NO:12中的氨基酸，数字指示SEQ ID NO:12中的密码子位置，第二个字母指示等位基因变体中的氨基酸)。此类变体可以任选地单独存在或者与本发明下文所述的任何方面任意组合。增强α-突触核蛋白聚集的诱发突变E83Q、A90V、A76T也可以单独存在或者与彼此和/或与人等位基因变体E46K、A30P和A53T组合。

III.路易体疾病

路易体疾病(LBD)以多巴胺能系统退化、运动性改变、认知障碍和形成路易体(LB)为特征(McKeith等,Neurology(1996)47:1113-24)。路易体是在神经细胞中发现的球形蛋白质沉积物。其在脑中的存在破坏脑的正常功能，妨碍化学信使(包括乙酰胆碱和多巴胺)的作用。路易体疾病包括帕金森氏病(包括自发性帕金森氏病)、弥散性路易体病(DLBD)(也称为路易体痴呆，DLB)、阿兹海默病的路易体变型(LBV)、组合的阿兹海默病和帕金森氏病和多系统萎缩(MSA；例如，橄榄体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性和Shy-Drager综合征)。DLBD具有阿兹海默病和帕金森氏病二者的症状。DLBD不同于帕金森氏病主要在于路易体的位置。在DLBD中，路易体主要在皮质中形成。在帕金森氏病中，其主要在黑质中形成。其他路易体疾病包括单纯性自主神经衰竭、路易体吞咽困难、偶发性LBD和遗传性LBD(例如，α-突触核蛋白基因、PARK3和PARK4的突变)。

IV.人源化9E4抗体

A.结合特异性和功能性质

本发明的人源化抗体与人α突触核蛋白特异性结合。一些人源化抗体的亲和力(即，Ka)优选地在小鼠抗体9E4的亲和力的5或2倍之内。一些人源化抗体的亲和力与小鼠9E4抗体相同(在实验误差内)或大于后者。优选的人源化抗体与小鼠抗体9E4结合于相同表位或者与小鼠抗体9E4竞争同人α突触核蛋白的结合。

在一些方面，人源化9E4形成双特异性抗体的一个臂，双特异性抗体的另一个臂是与血脑屏障上表达的受体(例如，胰岛素受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体、瘦素受体或脂蛋白受体或优选地运铁蛋白受体)结合的抗体(Friden等,PNAS 88:4771-4775,1991；Friden等,Science 259:373-377,1993)。此类双特异性抗体可以通过受体介导的转胞吞作用转移穿过血脑屏障。可以通过改造双特异性抗体以降低其与血脑屏障受体的亲和力来进一步增强双特异性受体的脑摄取。降低的受体亲和力导致脑中更广的分布(参见，例如Atwal等.Sci.Trans.Med.3,84ra43,2011；Yu等Sci.Trans.Med.3,84ra44,2011)。

示例性双特异性抗体还可以是例如：(1)双可变域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链包括两个通过短肽键串联的可变域(Wu等,Generation and Characterization of aDual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig^TM)Molecule,于:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(2)Tandab，其为两个单链抗体的融合，得到对每种靶抗原具有两个结合位点的四价双特异性抗体；(3)flexibody，其为scFv与双体抗体的组合，得到多价分子；(4)基于“蛋白激酶A”中的“二聚化和对接结构域(docking domain)”的所谓的“对接锁定(dock and lock)”分子，其当应用于Fab时，可以产生由与一个不同的Fab片段连接的两个相同的Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(5)所谓的蝎形分子(Scorpion molecule)，其包括与人Fc区域的两端融合的两个scFv。可用于制备双特异性抗体的平台的实例包括但不限于BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、Fcab和Mab2(F-star)、Fc-改造的IgGl(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab)。

B.人源化抗体

人源化抗体是一种基因工程化抗体，其中来自非人“供体”抗体的CDR被嫁接到人“受体”抗体序列中(参见，例如，Queen等,US5,530,101和5,585,089；Winter等,US 5,225,539,Carter,US 6,407,213,Adair,US 5,859,205 6,881,557,Foote,US 6,881,557)。受体抗体序列可以是例如成熟人抗体可变区序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列(例如，Kabat,1991的轻链和重链可变区共有序列，同上)或者种系可变区序列。重链的优选受体序列是NCBI目录号AAC50998(GI:1791009)的人成熟重链可变区或来源于种系IGHV3-7'01或IGHV3-7'02的其他成熟重链可变区(克隆名V3-7或VH3-11)(Glas等,Clin ExpImmunol.107:372-80,1997)，或者并入这些种系序列中的一个中的成熟重链可变区序列。对于轻链，优选的受体序列是NCBI目录号AAY33350(GI:63102889)的轻链成熟可变区或来源于种系IGKV1D-39或IGKV1-39的其他成熟轻链序列(克隆名O2或O12)(Kramer等,Eur JImmunol.35:2131-45,2005)，或者并入这些种系序列中的一个中的成熟轻链可变区序列。因此，本发明的人源化抗体包括这样的抗体，其具有Kabat定义的来自小鼠9E4抗体(供体抗体)的三个轻链和三个重链CDR，以及完全地或基本上来自人抗体序列的成熟可变区框架序列和恒定区(如果存在的话)。同样地，人源化重链包括这样的重链，其具有Kabat定义的来自小鼠9E4抗体的重链的三个重链CDR，以及完全地或基本上来自人抗体重链序列的成熟重链可变区序列和重链恒定区序列(如果存在的话)。同样地，人源化轻链包括这样的轻链，其具有Kabat定义的来自小鼠9E4抗体的轻链的三个轻链CDR，以及完全地或基本上来自人抗体轻链序列的成熟轻链可变区序列和轻链恒定区序列(如果存在的话)。当至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的Kabat定义的相应残基相同时，抗体链的成熟可变区框架序列或抗体链的恒定区序列分别基本上来自人成熟可变区框架序列或者人恒定区序列。

根据其对CDR构象和/或抗原结合的可能影响，可以选择人成熟可变区框架序列的某些氨基酸用于置换。通过建立模型、检查特定位置的氨基酸的特征或者对特定氨基酸的置换或突变的影响进行经验观察，来研究此类可能的影响。

例如，当小鼠成熟可变区框架残基和选择的人成熟可变区框架残基之间的氨基酸不同时，在合理预测到小鼠氨基酸如下时，可以将人框架氨基酸替换成来自小鼠抗体的等同框架氨基酸：

(1)与抗原直接非公价结合，

(2)与CDR区相邻，

(3)与CDR区其他相互作用(例如，在CDR区的约

之内)，

(4)介导重链和轻链之间的相互作用。

本发明提供了包括小鼠9E4抗体的人源化形式的制剂，抗体包括三个示例的人源化轻链成熟可变区(Hu9E4VLv1-v3；SEQ ID NO:3-5)和四个示例的人源化重链成熟可变区(Hu9E4VHv1-v4；SEQ ID NO:8-11)。SEQ ID NO:4包括小鼠9E4轻链的三个Kabat CDR和AAY33350的成熟可变区框架。SEQ ID NO.3和5包括表2中所示回复突变。SEQ ID NO:11包括小鼠9E4轻链的三个Kabat CDR和AAC50998的成熟可变区框架。SEQ ID NO:8-10包括表3中所示回复突变。

本发明提供了包含本文所公开的多种人源化9E4抗体的制剂，其中人源化重链成熟可变区表现出与SEQ ID NO:8-11至少90％、95％或99％的同一性，人源化轻链成熟可变区表现出与SEQ ID NO:3-5至少90％、95％或99％的同一性，但是其中指定SEQ ID NO:的任何变化发生在成熟可变区框架，而非Kabat CDR。在一些此类抗体中，位置L36被Y或F占据，和/或位置L83被F或L占据，和/或位置H73被N或D占据，和/或位置H93被A或S占据(这里以及本申请别处的所有位置通过Kabat编号)。在一些此类抗体中，保留了Hu9E4VLv1-v3和Hu9E4VHv1-v4中的一些或所有回复突变。换言之，重链位置H73和H93之一或其二者分别被D和A占据。同样地，在一些抗体中，轻链位置L36和L83之一或其二者分别被F和L占据。在一些抗体中，位置H73、H93、L36和L83中的1、2、3或全部4个分别被D、A、F和L占据。在一些抗体中，重链成熟可变区框架中的0、1或2个位置相对于SEQ ID NO:11而改变，轻链成熟可变区框架中的0、1或2个位置相对于SEQ ID NO:4而改变。

本发明提供了制剂，其中一些抗体包括含SEQ ID NO:11的三个Kabat CDR的人源化重链和含SEQ ID NO:4的三个Kabat CDR的人源化轻链，前提是位置L36(Kabat编号)被F或Y占据和/或L83(Kabat编号)被L或F占据和/或位置H73(Kabat编号)被D或N占据和/或位置H93(Kabat编号)被S或A占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号被F占据并且位置L83(Kabat编号)被L占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据并且位置H73(Kabat编号)被D占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据并且位置H93(Kabat编号)被S。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据并且位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据,位置L83(Kabat编号)被L占据，并且位置H73(Kabat编号)被D占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据,位置L83(Kabat编号)被L占据，并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据,位置L83(Kabat编号)被L占据，并且位置H93(Kabat编号被A占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据,位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据,位置L83被F占据,位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据,位置H73(Kabat编号)被占据D，并且位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据,位置L83(Kabat编号)被L占据，位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L36(Kabat编号)被F占据,位置L83(Kabat编号)被L占据，位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置L83(Kabat编号)被L占据。在一些此类抗体中，位置L83(Kabat编号)被L占据并且位置H73(Kabat编号)被D占据。在一些此类抗体中，位置L83(Kabat编号)被L占据并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L83(Kabat编号)被占据L并且位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置L83(Kabat编号)被L占据，位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L83(Kabat编号)被L占据，位置H73(Kabat编号)被D占据，并且位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置H73(Kabat编号)被D占据。在一些此类抗体中，位置H73(Kabat编号)被D占据并且位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置H73(Kabat编号)被D占据并且位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置H93(Kabat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置H93(Kabat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置L36被Y占据，位置L83被F占据,位置H73被N占据，并且位置H93被S占据。表1中列出了一些在位置L36、L83、H73和H93及其组合处具有期望残基的示例性抗体。

表1：在位置L36、L83、H73和H93(Kabat编号)处具有期望残基的示例性抗体

示例性抗体	L36	L83	H73	H93
					1	F	F	N	A
2	F	L	N	A
					3	F	F	D	A
4	F	F	N	S
					5(形式3)	F	L	D	A
6	F	L	N	S
					7(形式1)	F	F	D	S
8	F	L	D	S
					9	Y	L	N	A
10	Y	L	D	A
					11	Y	L	N	S
12	Y	L	D	S
					13	Y	F	D	A
14	Y	F	D	S
					15(形式2)	Y	F	N	S

表2：V_H回复突变体

表3：V_L回复突变体

V<sub>L</sub>变体	V<sub>L</sub>外显子受体序列	供体框架残基
			Hu9E4VLv1	NCBI目录号AAY33350	L36
Hu9E4VLv2	NCBI目录号AAY33350	无
			Hu9E4VLv3	NCBI目录号AAY33350	L36,L83

在一些抗体中，重链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些抗体中，轻链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些此类抗体中，重链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且轻链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些此类抗体中，重链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且轻链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

可以在成熟可变区框架中，例如，在不与CDR接触的残基中进行其他氨基酸置换。通常在变体人源化序列中进行的替换相对于被替换氨基酸是保守的。在一些抗体中，相对于Hu9E4VLv1-v3和Hu9E4VHv1-v4的替换(无论是否为保守的)对于所得抗体的结合亲和力或效力(相对于Hu9E4VLv1-v3和Hu9E4VHv1-v4)没有显著影响，即，其能够与人α突触核蛋白结合。

变体通常由于少量(例如，通常为轻链或重链成熟可变区框架或者其二者中的不超过1、2、3、5或10个)替换、缺失或插入而不同于Hu9E4VLv1-v3和Hu9E4VHv1-v4的重链和轻链成熟可变区序列。

下文所述的制剂可以包含上文、或者在本申请的序列表或别处描述的任何人源化9E4链，其轻链和重链任意组合，形成与人α-突触核蛋白特异性结合的人源化9E4抗体。

C.嵌合抗体和镶饰抗体

本发明还提供了非人抗体(特别是9E4)的嵌合形式和镶饰形式。

嵌合抗体是这样的抗体，其中非人抗体(例如，小鼠)的轻链和重链成熟可变区与不同物种的抗体的轻链和重链恒定区组合。通常，轻链和重链恒定区是人源的，但是恒定区根据需要可以来源于不同的非人物种，例如大鼠(例如，以有利于在适当的动物模型中测试非人抗体)。此类抗体基本上或者完全保留了由可变区提供的非人(例如，小鼠)抗体的结合特异性，并且为约三分之二的人(或不同非人物种)序列。

镶饰抗体是人源化抗体的一种类型，其保留了非人抗体的一些并且通常全部的CDR和一些非人可变区框架残基，但是将可能有助于B-或T-细胞表位的其他可变区框架残基(例如，暴露残基(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991))替换成了来自人抗体序列的相应位置的残基。得到这样的抗体，其中CDR完全或者基本上来自非人抗体，并且非人抗体的可变区框架被通过置换变得更像人的。本发明包括9E4的镶饰形式。

D.恒定区的选择

嵌合、镶饰或人源化抗体的重链和轻链可变区可以与人恒定区的至少一部分连接。恒定区的选择部分地取决于是否期望抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或不提依赖性细胞毒性。例如，人同位素IgG1和IgG3具有补体依赖性细胞毒性，而人同种型IgG2和IgG4不具有。人IgG1和IgG3还诱导比人IgG2和IgG4更强的细胞介导的效应子功能。轻链恒定区可以是λ或κ。示例性人轻链κ恒定区具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列。一些此类轻链κ恒定区可以由核酸序列编码。SEQ ID NO:13的N-末端精氨酸可以省略，在这种情况下，轻链κ恒定区具有EQ ID NO:28的氨基酸序列。一些此类轻链κ恒定区可以由核酸序列编码。示例性人IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列(具有或不具有C-末端赖氨酸)或者SEQ ID NO:31的重链恒定区元件。一些此类重链恒定区可以有核酸序列编码。抗体可以表达为包含两个重链和两个轻链的四聚体，表达为独立地重链、轻链，表达为Fab、Fab'、F(ab')2和Fv，或者表达为单链抗体，其中重链和轻链成熟可变区间隔区连接。

人恒定区在不同个体之间表现出同种异型变异和同族同种异型变异，即，不同个体的恒定区可能在一个或更多个多态性位置不同。同族同种异型和同种异型的区别在于识别同族同种异型的血清与一个或更多个其他同种型的的非多态性区域结合。因此，例如，另一个重链恒定区是IgG1G1m3同种型并且具有编码SEQ ID NO:32的恒定区的氨基酸序列。另一个重链恒定区具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列。另一个重链恒定区具有编码SEQ ID NO:32的恒定区的氨基酸序列，只是其缺少C-末端赖氨酸。另一个重链恒定区具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列，只是其缺少C-末端赖氨酸。

在一部分或全部分子中，轻链和/或重链的氨基酸或羧基端的一个或多个氨基酸(例如，重链的C-末端赖氨酸)可以失去和/或衍生化。可以在恒定区进行置换以降低或增加效应子功能，例如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见，例如，Winter等,美国专利号5,624,821；Tso等,美国专利号5,834,597；和Lazar等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:4005,2006)，火焰延长人中的半衰期(参见，例如Hinton等,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。示例性置换包括250位的Gln和/或428位的Leu(本段中对于恒定区使用EU编号)以增加抗体的半衰期。位置234、235、236和/或237中的任意或者全部位置处的置换降低对于Fcγ受体(特别是FcγRI受体)的亲和力(参见，例如US 6,624,821)。一些抗体在人IgG1的234、235和237位处具有丙氨酸置换，以降低效应子功能任选地，将人IgG2的234、236和237位置换成丙氨酸，将235位置换成谷氨酰胺(参见，例如US 5,624,821)。

E.重组抗体的表达

抗体可以通过重组表达产生。可以对编码抗体的核酸进行密码子优化以用于在期望细胞类型(例如，CHO或Sp2/0)中表达。重组核酸构建体通常包括与抗体链的编码序列可操作地连接的表达控制序列，包括天然相关的或异源启动子区。表达控制序列可以是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体导入了合适的宿主细胞，将宿主保持在适于高水平表达核苷酸序列的条件下，并且收集和纯化交叉反应抗体。编码抗体的一个或多个载体还可以包含选择基因，例如二氢叶酸还原酶，以允许放大编码抗体链的核酸的拷贝数。

大肠杆菌是对于表达抗体(特别是抗体片段)特别有用的原核宿主。微生物如酵母也可用于表达。酵母属是优选的酵母宿主，合适的载体根据需要具有表达控制序列、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。

哺乳动物细胞可用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸片段。参见，Winnacker,From Genes to Clones,(VCH Publishers,NY,1987)。本领域中已经开发了若干能够分泌完整异源蛋白质的合适的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞和非抗体产生骨髓瘤，包括Sp2/0和NS0。可能有利的是使用非人细胞。用于这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强地(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。合适的表达控制序列是来源于内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见Co等，J.Immunol.148:1149(1992)。

在将编码抗体重链和轻链的载体导入到细胞培养物中后，可以在无血清培养基中筛选细胞群的生长生产率和产物质量。然后对最高生产细胞群进行FACS基单细胞克隆以产生单克隆系。高于50pg/细胞/天或100pg/细胞/天(其相当于大于7.5g/L培养物的滴度)的单位生产率可能是有利的。可以测试单细胞克隆产生的抗体的浊度、过滤特性、PAGE、IEF、UV扫描、HP–SEC、碳水化合物-寡糖作图、质谱和结合测定，例如ELISA或Biacore。可以将选择的克隆保存在多个小瓶中并且冰冻储存用于随后使用。

一旦表达，可以根据本领域的标准方法对抗体纯化，包括蛋白A捕获、柱色谱(例如，疏水作用或离子交换)、用于病毒灭活的低pH等(一般参见，Scopes,ProteinPurification(Springer-Verlag,NY,1982))。

用于商业性生产抗体的方法包括密码子优化，选择启动子、转录元件和终止子，无血清单细胞克隆、细胞保存、使用选择标记用于放大拷贝数、CHO终止子、无血清单细胞克隆、改善蛋白质滴度(参见，例如US 5,786,464、US 6,114,148、US 6,063,598、US 7,569,339、WO2004/050884、WO2008/012142、WO2008/012142、WO2005/019442、WO2008/107388、和WO2009/027471和US 5,888,809)。

V.核酸

本发明还提供了编码任何上文所述的重链和轻链的核酸。通常，核酸还编码与成熟重链和轻链融合的信号肽(例如，具有SEQ ID NO:22或24的氨基酸序列的细胞肽，其可通过SEQ ID NO：23和25编码)。核酸的编码序列可以与调控序列可操作地连接以确保编码序列的表达，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸可以以分离的形式存在或者可以克隆到一个或更多个载体中。核酸可以通过例如重叠核苷酸的固相合成或PCR合成。编码重链和轻链的核酸可以在例如表达载体内连接成一个连续核酸，或者可以分开，例如各自克隆到其自身的表达载体中。

VI.治疗应用

本发明提供了多种治疗或影响预防患有路易体病或者具有患路易体病的风险的患者中的路易体病的方法。适合于治疗的患者包括具有LBD疾病的风险但是未表现出症状的个体，以及目前表现出共核蛋白病的症状或早期警报征象的患者，例如，EEG减慢、神经精神病临床表现(沮丧、痴呆、幻觉、焦虑、冷漠、性感缺乏)、自律变化(直立性低血压、膀胱紊乱、便秘、大便失禁、流涎、吞咽苦难、性功能障碍、脑血流量变化)、感觉变化(嗅觉、疼痛、辨色能力异常感觉)、睡眠障碍(REM睡眠行为障碍(RBD)、多动腿综合征/周期性末端运动(periodic extremity movements)、嗜睡症、失眠)以及各种其他征象和症状(疲劳、复视、视力模糊、皮脂溢出、体重减轻/增加)。因此，本发明可以向具有已知的LBD的遗传风险的个体预防性实施。此类个体包括具有经历改进并的亲戚的那些人以及通过分析基因标记或生物化学标记确定了风险的那些人。PD风险的基因标记包括α-突触核蛋白或Parkin、UCHLI和CYP2D6基因中的突变；特别是α-突触核蛋白基因的位置30和53处的突变。目前患有帕金森氏病的个体可以有其临床表现鉴定，包括静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓和姿势不稳定。

在无症状患者中，治疗可以在任何年龄(例如，10、20、30岁)开始。但是，在患者达到40、50、60或70岁之前通常不需要开始治疗。治疗通常需要一段时间的多个阶段。可以通过分析随着时间的抗体或者对于治疗剂(例如，α-突触核蛋白肽的截短形式)的活化的T细胞或B细胞应答来监测治疗。如果未能应答，则指示更高剂量。

在患者中产生有益治疗响应(例如，减少神经炎和/或轴突α突触核蛋白积累、降低神经炎营养不良、改善认知功能，和/或逆转、治疗或防止认知减退)的条件下，可以通过向患者施用来将该抗体用于治疗或影响预防患者中的路易体病。在一些方法中，与对照群体相比，经治疗患者中新皮质和/或基地神经节的神经纤维网中的神经炎营养不良的面积平均可以降低至少10％、20％、30％或40％。

在患有路易体病或者具有患路易体病的风险的患者中，通常观察到认知障碍、认知功能的进行性减退、脑形态的变化和脑血管功能的变化。施用本发明抗体可以抑制或延迟此类患者中认知功能的减退。

本发明还提供了保留或增加突触密度和/或树突密度的方法。突触或树突密度的变化指数可以通过突触形成(突触泡蛋白)和/或树突(MAP2)的标记测量。在一些方法中，突触密度或树突密度可以恢复到健康对象中的突触密度或树突密度水平。在一些方法中，与未治疗的对照患者群相比，经治疗患者中的突触密度或树突密度的平均水平可以提高5％、10％、15％、20％、25％、30％或更多。

VII.治疗方法

在预防性应用中，以有效降低疾病的风险、减轻疾病的严重程度或者延迟疾病的至少一种征象或症状的发作的方案(施用的剂量、频率和途径)，向易感于疾病或者以其他方式而具有疾病风险的患者施用抗体、诱导抗体的药剂或者包含抗体的制剂。在一些预防性应用中，方案有效抑制或延迟α突触核蛋白和截短片段在脑中的积累，和/或抑制或延迟其毒性效应和/或抑制或延迟行为缺陷的出现。在治疗性应用中，以有效改善疾病的至少一种征象或症状或至少抑制其进一步恶化的方案(施用的剂量、频率和途径)，向被怀疑患有或者已经患有路易体病的患者施用抗体或诱导抗体的药剂。在一些治疗性应用中，方案有效降低α突触核蛋白和截短片段的水平、相关毒性和/或行为缺陷，或者至少抑制其进一步增加。

如果与未用本发明方法治疗的可比较患者的对照群的平均结果相比被治疗患者个体取得了更有利的结果，或者如果在控制的临床试验(例如，阶段II、阶段II/III或阶段III试验)中经治疗患者相比于对照患者表现出了更有利的结果(p<0.05或0.01或甚至0.001水平)，则认为方案是治疗或预防有效的。

有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态(包括路易体疾病的类似)、患者是否是ApoE携带者、或者是人还是动物、施用的其他药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。

抗体的示例性剂量范围为约0.1至50mg/kg患者体重。抗体可以每天一次、隔天一次、每周一次、隔周一次、每月一次、每季度一次、每年一次或根据经验分析确定的其他方案施用这样的剂量。示例性的治疗需要在长时期(例如，致死后6个月)施用多个剂量。额外的示例性治疗方案需要每两周一次或者每月一次或者每3至6个月一次施用。

抗体可以通过外周途径施用，即，其中施用的抗体穿过血脑屏障到达脑中的预期位点。施用途径包括局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内或肌内。抗体的一些施用途径是静脉内和皮下。这种注射最典型地在手臂或腿肌肉中进行。在一些方法中，药剂直接注射到积累了沉积物的特定组织中，例如颅内注射。

本方案可以与有效治疗或预防被治疗疾病的另外的药剂组合来实施。例如，在帕金森氏病的情况下，对于α突触核蛋白的免疫治疗(WO/2008/103472)、左旋多巴、benzaseride、卡比多巴、多巴胺激动剂、非麦角多巴胺激动剂、儿茶酚-O-甲基(“COMT”)抑制剂如安他可朋(entacopone)或tolcopone、单胺氧化酶(“MAO”)抑制剂如雷沙吉兰(rasagaline)、金刚烷胺或抗胆碱能剂可与本方案组合使用。

可以施用有效剂量的将在下文极详细描述的任何药物制剂，以治疗性或预防性治疗患有共核蛋白病或者具有患共核蛋白病的风险的人患者。下文描述的一些制剂可以添加到适合向患者静脉内施用的输液袋中，例如每四周一次施用。一些患者被诊断患有帕金森氏病。本文所述制剂可以以约0.3mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg或约30mg/kg人源化9E4药物物质的剂量施用。在一些患者中，可以根据耐受性、安全性、药代动力学、效力和其他可以凭经验确定的参数来进一步调节剂量。

VIII.制剂

本发明的制剂(也称为药物组合物)包含抗体(例如，小鼠9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶饰或人源化形式)或其抗原结合片段、缓冲剂、一种或更多种糖和/或多元醇和表面活性剂，并且pH未约5至约7.5。制剂可以配置成以液体形式或冻干形式储存。当以冻干形式储存时，可以将制剂用液体(例如，无菌水)重构到本文所述浓度和性能。当说冻干组合物可以通过添加水重构以产生特定组分浓高度和pH的制剂时，意指冻干制剂可以通常添加水简单重构(即，不提供额外量的组分或添加酸或碱以改变pH)。冻干前(prelyophilized)液体制剂的浓度和特性也可以根据下文描述的那些，如果冻干制剂被重构到与冻干前制剂相同的体积的话。如果体积不同，制剂的浓度应按比例调节。如果重构体积是冻干前体积的一半，则冻干前制剂的组分浓度应该是重构制剂的浓度的一半。

任选地，将从CHO细胞培养物中纯化的9E4抗体再悬浮在下文所述制剂中、临时冰冻用于冻干前储存、冻干并且用水重构到与冻干前相同的浓度。此类制剂应当优选地通过冰冻、冻干、储存和重构来稳定抗体并且适合于胃肠外施用。在示例性的工作流程中，使纯化抗体以约40mg/ml再悬浮在制剂3(表10)中并存在袋中于-40C储存。将袋在室温解冻3小时并且合并内容物。将制剂通过0.2为微米无菌过滤器进行无菌过滤。向小瓶中填充5.4ml制剂并且冻干。冻干小瓶储存在2-8C下。通过添加无菌水(例如，约5.0至5.4ml无菌水，取决于制剂)来对冻干小瓶进行重构。然后将5ml重构产物加入到含有20-100ml生理盐水、乳酸林格氏溶液或5％葡萄糖溶液等的静脉注射袋的端口中用于向患者静脉内注射。

一些制剂包含填充剂，其可以与糖/多元醇组分相同或不同。通常，溶液是无菌的，例如通过使用0.2μm或0.22μm的过滤器无菌过滤来实现。一些制剂的生物负载≤约3CFU/30mL。一些制剂含有≤约0.1EU/mg的细菌内毒素。本发明的制剂一般还是稳定的，如下文进一步限定的，在冻融时低至不可检测水平的片段和/或聚集。另一些制剂在冻干饼重构后在40℃下稳定至少3个月。在一些制剂中，小于约10％的抗体以聚集物存在于制剂中。在一些实施方案中，小于或等于约5％的抗体以聚集物存在于制剂中。

在一些制剂中，抗体以约5mg/mL至约100mg/mL的浓度存在。在一些制剂中，抗体以约5mg/mL至约50mg/mL的浓度存在。抗体以约25mg/mL至50mg/mL的浓度存在。例如，抗体可以以约35-45mg/ml或约40mg/mL的浓度存在。抗体可以以约50mg/小瓶至约500mg/小瓶或更大的无菌液体剂型存在。坑提可以与约40mg/小瓶至约500mg/小瓶的冻干剂型存在。例如，抗体可以以约250-350mg/小瓶或约200mg/小瓶的无菌液体或冻干剂型存在。

所公开制剂中使用的抗体可以与治疗剂部分偶联，例如，细胞毒素剂、放射治疗剂、免疫调节剂、第二抗体(例如，形成抗体异源缀合物)或有利于或增强配制抗体(例如，嵌合、镶饰或人源化9E4)的活性的任何其他生物活性剂。代表性治疗剂部分已知可用于治疗、控制或缓解路易体病或者共核蛋白病的症状的药剂。

配制抗体可以包括上述抗体9E4的嵌合、镶饰或人源化形式中的任意一种。例如，抗体可以包括含SEQ ID NO:4之三个Kabat CDR的轻链可变区和含SEQ ID NO:11之三个Kabat CDR的重链可变区。制剂可以包括抗体，抗体包括轻链可变区和/或重链可变区，轻链可变区具有包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中的任意一个的氨基酸序列，重链可变区具有包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中的任意一个的氨基酸序列。一些制剂包括抗体，抗体包括轻链可变区，轻链可变区具有包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列。一些制剂包括抗体，抗体包括重链可变区，重链可变区具有包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列。例如，配制抗体可以包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

所公开制剂中使用缓冲剂以取得合适的抗体pH，例如，组氨酸、琥珀酸盐和柠檬酸盐缓冲剂。一些制剂的PH在约5.5至约7的范围内，例如pH 5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。一些制剂的pH为约5.5至约6.5。一些制剂的pH为约6.0，另一些制剂的pH为约6.5。在一些制剂中，柠檬酸盐缓冲剂或琥珀酸盐缓冲剂以约10mM至约30mM范围内的浓度存在，例如约15-25mM或约20mM的浓度。一些柠檬酸缓冲剂包含分布为约15mM至约20mM范围内内以及约2mM至约6mM范围内的浓度的脱水柠檬酸钠和柠檬酸钠一水合物。

用于制剂的合适的糖和/或多元醇包括海藻糖、蔗糖、甘露醇或其组合。糖/多元醇充当填充剂、冻干保护剂和/或张力调节剂。例如，一些制剂包含以约220mM至约260mM范围内的浓度存在的海藻糖、以约220mM至约260mM范围内的浓度存在的蔗糖或者浓度为20mM至约40mM的蔗糖和以约200mM至约220mM范围内的浓度存在的甘露醇的混合物。一些制剂包含以约230mM或约240mM的浓度存在的海藻糖。另一些制剂包含以约230mM或约240mM的浓度存在的蔗糖。另一些制剂包含以约50mM的浓度存在的蔗糖和以200mM范围内的浓度存在的甘露醇的混合物。另一个制剂包含衣约28mM的浓度存在的蔗糖和以约212mM的浓度存在的甘露醇的混合物。一些这样的制剂的特征为摩尔渗透压浓度为约250-400、300-400或300-350mOsm/kg，例如，335mOsm/kg。

制剂优选地包含表面活性剂以降低抗体在表面的聚集和吸附。合适的表面活性剂包括按重量计以约0.005％至约0.05％范围内的浓度存在的聚山梨醇酯20(PS20)。PS20保护免于显著增加的聚集或浊度，否则这些现象将在9E4抗体的制剂中发生。聚山梨醇酯20可以以约0.01％至约0.05％的浓度存在。例如，浓度可以为0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％或0.05％。或者，在一些制剂中，聚山梨醇酯20以约0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L或0.5g/L的浓度存在。一些制剂包含浓度为0.2g/L(即，0.163mmol/L)的聚山梨醇酯20。

一种示例性制剂(液体、冻干前或者冻干后重构的)的特征在于从约5.5到约7范围内的pH，并且包括：(a)抗体9E4的嵌合、镶饰或人源化形式或者与9E4竞争和抗原的特异性结合的其片段，浓度在约10mg/ml至约50mg/ml的范围内；(b)以从约10mM至约30mM的范围内的浓度存在的柠檬酸盐或琥珀酸盐；(c)糖和多元醇(“糖/多元醇”)，其选自以约220mM至约260mM的范围内的浓度存在的海藻糖、以约约220mM至约260mM的范围内的浓度存在的蔗糖、以及以约20mM至约40mM的范围内的浓度存在的蔗糖和以约200mM至约220mM的范围内的浓度存在的甘露醇的混合物；以及(d)按重量计以约0.005％至约0.05％的范围内的浓度存在的聚山梨醇制20。例如，制剂包括：(a)抗体，抗体包括轻链和重链，轻链具有SEQ ID NO:29给出的氨基酸序列，重链包含SEQ ID NO:32给出的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，其以约40mg/mL的浓度存在；(b)浓度为约20mM的柠檬酸盐缓冲液；(c)浓度为约230mM的海藻糖；(d)浓度为约0.02％的聚山梨醇酯20；以及约6.0的pH。

一些冻干制剂包含：(a)抗体9E4的人源化形式或者其抗原结合片段；(b)柠檬酸盐；(c)海藻糖；和聚山梨醇酯20。冻干制剂可以包含约200mg的抗体。一些冻干制剂能够用无菌水重构。一些冻干制剂包含100-300或150-250mg 9E4抗体、15-35或20-25mg脱水柠檬酸钠、1.65-2.75或2-2.3mg柠檬酸一水合物、360-500或400-470mg脱水海藻糖、以及0.5至1.5mg或0.75至1.25mg聚山梨醇酯20。示例性冻干制剂包含200mg 9E4抗体(例如，人源化9E4抗体)、25mg脱水柠檬酸钠、2.15mg柠檬酸一水合物、435mg脱水海藻糖和1mg聚山梨醇酯20。另一种示例性冻干制剂包含200mg 9E4抗体(例如，人源化9E4抗体)、25mg脱水柠檬酸钠、3.15mg柠檬酸一水合物、435mg脱水海藻糖和1mg聚山梨醇酯20。此类制剂优选地重构到约5ml的体积。其他冻干制剂包含与本段落任何地方的公开相同比例但是不同的量的相同组分(例如，例如，400mg抗体、50mg脱水柠檬酸钠、4.3mg柠檬酸一水合物、870mg脱水海藻糖和2mg聚山梨醇酯20)。

冻干制剂优选地重构到约30-50或35-45mg/mL、优选地约40mg/mL的抗体浓度；(b)以约10-30或15-25mM、优选地约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂；(c)以约160-330或200-260mM、优选地约230mM的浓度存在的海藻糖；(d)以约0.1-0.3或约0.15至0.25g/L、优选地约0.2g/L存在的聚山梨醇酯20；以及(e)约5.5-6.5、优选地约6.0的pH。

液体制剂或重构冻干制剂优选地为基本上等张的，意味着约250-350mOsm/kg水的张力。一些制剂的张力为约335mOsm/kg。一些制剂的张力为270-300mOsm/kg。液体制剂或重构冻干制剂还可以为>350mOsm/kg水的高张的或低张的(<250mOsm/kg水)。

一些冻干制剂表现为白色至微黄色粉末。一些液体制剂或重构冻干制剂表现为溶液，其几乎不含外来颗粒并且可以包含少量半透明的白色至微黄色的产物典型的颗粒。一些液体制剂或重构冻干制剂具有每小瓶(体积＝5ml)≤约6,000个≥10μm的显微可见(sub-visible)颗粒和/或每小瓶≤约600个≥25μm的显微可见颗粒。一些液体制剂或重构冻干制剂表现为无色至浅黄色(≤参考溶液BY3)。一些液体制剂或重构冻干制剂表现为透明至稍微乳白色(参考悬液III).

除了本文描述为组分的那些外，可以不需要任何药物赋形剂、载体等就能制备本文描述的任何制剂。如果存在不显著量的不影响制剂的性质的其他组分，则此类制剂可以描述为由列举的组分组成，或者基本上有列举的组分组成。优选地在用于向人施用的药物制备的FDA批准或审核的良好生产规范(GMP)下制备该制剂。

所公开制剂中使用的抗体还可以可检测标记偶联，例如用于诊断共核蛋白病、用于检测共核蛋白病的进展，和/或用于评估治疗的效力。如本文所述配制的抗体通常可用于在患有或怀疑患有共核蛋白病(例如，帕金森氏病)的对象中或者在获自此类对象的合适的生物样品中进行这样的测定。可以与人源化9E4抗体偶联或连接的代表性可检测标记包括多种酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者乙酰胆碱酯酶；辅基，例如streptavidinlbiotin和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，例如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如鲁米诺；生物发光材料，例如荧光素酶、荧光素和水母素；放射性物质，例如但不限于碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I,)、碳(¹⁴C)、硫(⁵S)、氘(³H)、铟(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In)、个锝(⁹⁹Tc)、铊(²⁰¹Ti)、镓(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、钯(¹⁰³Pd)、钼(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn和¹¹⁷Tin；使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射材料，非放射性顺磁性金属离子，以及用特定放射性同位素放射性标记或缀合的分子。

可以使用本领域的已知技术将治疗部分和/或可检测物质直接地或者或者通过中间物(例如接头)间接地与小鼠嵌合、镶饰或人源化9E4抗体直接偶联或缀合。参见，例如，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(编辑)，第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)中的Arnon等,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy"；Controlled Drug Delivery(第二版),Robinson等(编辑),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)中的Hellstrom等,"Antibodies For DrugDelivery"；Monoclonal Antibodies 84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编辑),第475-506页(1985)中的Thorpe,"Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy:A Review"；Monoclonal Antibodies For Cancer DetectionAnd Therapy,Baldwin等(编辑)第303-16页(Academic Press 1985)中的"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy"以及Thorpe等,Immunol.Rev.,1982,62:119-58。

所公开制剂中使用的抗体还包括经修饰小鼠、嵌合、镶饰或人源化9E4抗体，其相对于相应地未经修饰抗体在体内具有延长的半衰期。此类经修饰形式可以通过例如通过已知的保护/阻断基的糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接来制备。作为一个例子，用于抗体半衰期延长的代表性方法描述在WO 02/060919中。

本发明包括在38℃-42℃稳定(例如，通过高效尺寸排阻色谱(HPSEC)评估)至少约30天的抗体制剂，在20℃-24℃稳定至少约1年的抗体制剂，以及在2℃-4℃稳定至少约3年的抗体制剂评估冻干制剂在冻干状态储存的稳定性。如果在一个或更多个这些指定的时间和温度组合下孵育之后制剂满足以下对于低至不可检测的片段化和/或低至不可检测的聚集的定义，则认为制剂是稳定的。更具体地，所公开制剂表现出低至不可检测水平的抗体聚集和/或片段化，或者抗体片段化和/或聚集相对于初始水平(例如小于约10％的聚集)低的或不可检测的增加。一些制剂表现出≤约5％的组合的聚集和/或片段化。具有低至不可检测水平的片段化的制剂在例如通过高效尺寸排阻色谱(HPSEC)确定的单峰中或者在通过还原型毛细管凝胶电泳(rCGE)确定的双峰(一个对应于抗体重链和抗体重链中的每一个)(代表未降解抗体)中包含总蛋白质的至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％，并且不包含具有每种总蛋白质的超过5％、超过4％、超过3％、超过2％、超过1％或超过0.5％的其他单峰。具有低至不可检测水平的聚集的制剂包含按蛋白质的重量计不超过约15％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％或不超过约0.5％的聚集，如通过高效尺寸排阻色谱(HPSEC)确定的。例如，在一些制剂中，少于约10％的抗突触核蛋白抗体以聚集物存在。本发明的稳定制剂还表现出很少或不具有嵌合、镶饰或人源化9E4的生物活性(例如通过ELISA和/或其他功能测定可测量的结合亲和力)的损失，即，初始可测量值的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。一些制剂的结合亲和力为参考材料的初始初始可测量值的约60％至约140％。

IX.药物制剂的制备

本发明还提供了制备药物制剂的方法。在本发明的一个方面，此类方法包括：(a)培养哺乳动物细胞，哺乳动物细胞具有稳定整合入其基因组的编码小鼠抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)或者其嵌合、镶饰或人源化形式的核酸，使得细胞分泌抗体到细胞培养基中；(b)从细胞培养基中纯化抗体；以及(c)制备任意上述制剂。

药物制剂的制备可以包括评估制剂中抗体的至少一种性质的额外步骤，性质选自由物理稳定性、化学稳定和生物活性组成的组。

例如，可以培养哺乳动物细胞以产生抗体，其中哺乳动物细胞具有稳定整合如其基因组的编码人源化9E4抗体的轻链和重链的核酸。可用于该目的的哺乳动物细胞包括具有稳定整合入其基因组的编码SEQ ID NO:29给出的抗体轻链和SEQ ID NO:31或32给出的抗体重链的核酸序列。

为了产生抗体，将所公开核酸引入载体。在一些实例中，载体包含与能够导致在宿主细胞中表达DNA的合适控制序列可操作地连接的编码小鼠9E4抗体或者其嵌合、镶饰或人源化形式的核酸。此类控制序列包括导致转录的启动子(例如，本领域中已知的组成型启动子或诱导型启动子)、终止此类转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA结合位点的序列、增强子、多聚腺苷酸化信号以及控制转录和翻译的终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒(例如，病毒载体，如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、慢病毒、痘病毒和巨细胞病毒载体)或者简单的基因插入物。一旦转化到合适的宿主细胞中，抗体核酸可以整合到宿主基因组中，或者载体可以独立于宿主基因组复制和发挥功能。

所公开的核酸单独地或组合地(例如，编码抗体轻链的核酸和编码抗体重链的核酸的组合)引入到载体中。

可用于制备本发明抗体制剂的宿主细胞包括哺乳动物细胞，包括人来源的细胞、人胚肾细胞、猴肾细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠塞尔托利细胞、人宫颈癌(HeLa)细胞、犬肾细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺瘤细胞和NS0细胞。

或者，可以通过化学合成制备嵌合、镶饰或人源化9E4抗体然后用在所公开制剂中。

用于制备所公开制剂的抗体通常是分离的或纯化的，即，基本上不含细胞物质或者来自产生抗体之细胞的其他污染物蛋白质，或者基本上不含或者化学合成时的化学前体或其他化学物质。例如，基本上不含细胞物质的抗体包含具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、8％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％或更少(按干重计)的污染蛋白质的抗体制备物。当重组产生抗体时，其还基本上不含细胞培养基，使得培养基表现为蛋白质制备物体积的约30％、25％、20％、15％、10％、8％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％或更少。当通过化学合成产生抗体时，优选地基本上不含参与蛋白质合成的化学前体或其他化学物质或者与后者分离。因此，此类抗体制备物具有类此抗体制剂具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、8％、5％、2％、1％、0.5％、0.1％或更少(按干重计)的化学前体或者抗体药物物质之外的其他化合物。例如，一些抗体药物物质的制剂具有通过以下测定确定的以下纯度：蛋白质A ELISA(≤约25ng/mg)、CHOP ELISA(≤约100U²/mg)、IGF-1ELISA(≤约1ng/mg)、胰岛素ELISA(≤约1ng/mg)和DNA qPCR(≤约3pg/mg蛋白质)。一些抗体药物物质制剂的生物负载≤约10CFU/mL。一些抗体药物物质制剂含≤约0.5EU/mg的细菌内毒素。重组表达载体的纯化可以使用本领域已知的若干方法中的任意一种，例如，亲和色谱、酸处理、深层过滤、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、纳滤、超滤、透析和渗滤。

可以将纯化的抗体药物物质调节成包含本文所述的任何制剂的溶液，稀释到期望浓度并且储存直到准备使用。任选地，制剂可以以浓缩形式储存直到准备使用。

液体制剂可以根据稳定性特性在冷冻下以冰冻形式储存或者在室温下储存，稳定性特性可以通过经验确定。在一些情况下，使用进一步过滤步骤。一些本文所述的制剂可以冻干并且以粉末形式储存。冻干制剂可以根据稳定性特性在冷冻下以冰冻形式储存或者在室温下储存，稳定性特性可以通过经验确定。例如，冻干制剂可以储存在约2℃至约8℃的温度下。在这种情况下，可以在向患者施用前将制剂重构成具有以本文所述的浓度存在的抗体和赋形剂的液体制剂。在一些情况下，制剂用无菌水重构。在一些情况下，将制剂重构并且添加到输液袋中用于向患者施用。重构制剂在向患者施用前可以在冷冻下或室温下储存符合稳定性特定的一段时间。冻干和重构技术是本领域中已知的并且描述在实施例中。

可以将液体制剂或重构冻干制剂在向患者施用前添加到含有稀释剂(例如生理盐水或林格氏溶液)的输液袋中。输液袋的体积与液体制剂或重构冻干制剂的体积(例如，1-10ml)相比通常相对较大(例如，50ml至1L，或者100-500ml)。多种液体可以用在输液袋中，例如生理盐水、乳酸林格氏溶液或5％葡萄糖溶液，其各自是基本上等张的。在一个示例性方案中，将约5ml液体制剂或冻干制剂通过生理盐水的100-ml袋的端口注射并且通过以约1.75ml/分钟的流速静脉内输注约1小时的一段时间来施用。

因此，本发明还包括包含冻干抗体药物物质和用于重构和使用的说明的药物产品。一些药物产品包括：(a)小瓶，其包含约40至约200mg的粉末形式的抗体；和(b)用于重构抗体的说明。一种示例性药物产品包括：(a)小瓶，其包含粉末形式的约200mg抗体、约25mg脱水柠檬酸钠、约3.15mg柠檬酸一水合物、约435mg脱水海藻糖和约1mg聚山梨醇酯20；(b)用于重构的说明；和(c)用于制备输注用重构制剂的说明，其中(i)抗体包括含SEQ ID NO:29给出的氨基酸序列的轻链和含SEQ ID NO:32给出的氨基酸序列的重链，具有或不具有C-末端赖氨酸；以及(ii)重构说明需要用注射用水重构到5mL的可提取体积。

实施例

引入以下实施例以说明本发明的模式。以下实施例的某些方面是关于本共同发明人发现或预期在本发明的实践中运作良好的技术和方法描述的。根据本公开内容以及本领域的一般技术水平，本领域技术人员将理解以下实施例仅旨在举例说明，并且可以使用多种改变、修改和变更而脱离本发明的范围。

实施例1:表达载体的制备

将人源化9E4的重链和轻链二者可变区的特定序列(分别(SEQ ID NO：32和29)亚克隆到表达载体中，表达载体包含允许富集高生产细胞的元件(例如，转录增强元件(TS)、多聚腺苷酸化信号、新霉素磷酸转移酶突变体)。

使用质粒pCET Hu9E4VLv3.hCK作为模板，通过PCR分离轻链可变区，在片段的5’端引入EcoRV限制位点和3’端KpnI显著位点用于利用相同限制酶的消化亚克隆到载体pBI-60和pBI-90中。这些载体包含人κ链的基因恒定区。此外，载体pBI-60和pBI-90编码减弱的选择标记新霉素磷酸转移酶，用于在选择期间富集高生产细胞。pBI-60编码新霉素磷酸转移酶的F240I突变体，pBI-90编码D227V突变体。

使用质粒pCET Hu9E4VHv3.hlgG1作为模板，通过PCR分离人源化9E4重链的可变区，引入5’端MfeI限制位点和3'端BlpI限制位点用于亚克隆。将可变区克隆到MfeI和BamHI消化的含有G1m(3)同种型的人IgG1的基因恒定区的真核表达载体pBI-61中。载体编码来自仓鼠的可选择标记二氢叶酸还原酶(DHFR)。

实施例2:人源化9E4抗体的产生

将质粒pBI-61/9E4HC和pBI-60/9E4LC共转化到在无血清培养基中预适应的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。使细胞生长在不具有任何牛来源的组分的化学物确定的培养基中。用于建立细胞系的培养基如下：

预接种培养基

接种前(Preinocculation)培养基的制备：

1)WFI初始体积为总体积80％，初始温度28℃至35℃。

2)在每一种之前的组分完全溶解之后，立即按照列表(上文)依次加入组分。

3)剩余体积的WFI，0.176L/L培养基。

4)过滤前，将pH调解到7.00至7.20。

5)过滤前，摩尔渗透压浓度为280至320mOsmol/kg。

接种后加入：

营养物补料培养基

3％谷氨酰胺溶液

葡萄糖溶液(500g/L)

1M碳酸钠溶液

2％消泡剂。

营养物补料培养基

营养物补料培养基的制备：

1)WFI初始体积为总体积的70％，初始温度30℃至40℃。

3)剩余体积的WFI，0.179L/L培养基。

4)过滤前，将pH调解到6.90至7.10。

5)过滤前，摩尔渗透压浓度为1185至1585mOsmol/kg。

培养基过滤：

初过滤器-0.2μm过滤器

终过滤器-0.1μm过滤器

从稳定转染的细胞合并抗体，由细胞得到最终生产细胞系。通过蛋白质A亲和色谱和下文所述其他纯化技术纯化合并得到的物质。

实施例3：抗体纯化

蛋白质A是用于人源化、镶饰或嵌合9E4抗体的亲和纯化的细菌蛋白质。蛋白质A色谱通常涉及在抗体结合并且不需要组分(例如，宿主细胞蛋白质、细胞培养基组分和推测的病毒)流过柱的条件下，在pH 6–8下使澄清化细胞培上清液通过柱。可以进行任选的中间洗涤步骤以从柱中除去非特异性结合的杂质，然后在pH 2.5–4下洗脱产物。根据其树脂骨架组合物分类的蛋白质A树脂的类型包括：玻璃或二氧化硅基，例如Prosep vA、Prosep vAUltra(Millipore)；琼脂糖基，例如蛋白质A琼脂糖快速流动,MabSelect(GE Healthcare)；以及有机聚合物基，例如聚苯乙烯二乙烯基苯Poros A和MabCapture(AppliedBiosystems)。可以使用多种洗脱缓冲剂组分，例如乙酸、柠檬酸、磷酸、精氨酸HCl和谷氨酸HCl。

可以通过在低pH下处理或者过滤以及其他方法除去病毒。当前的病毒截留过滤器是具有非常小的孔的超过滤器或微过滤器。病毒滤膜由亲水聚醚砜(PES)、亲水聚偏二乙烯(PVDF)和再生纤维素制备。

深层过滤器用于细胞培养肉汤的澄清化，以保持膜过滤器的能力或者保护色谱柱或病毒过滤器。深层过滤器通常由纤维素、多孔助滤剂(例如硅藻土)和离子电荷树脂粘合剂制备。深层过滤器可以使用尺寸排阻和吸附结合二者来有效分离。

离子交换色谱使用带正电荷或带负电荷的树脂与蛋白质(基于其在跟定缓冲剂系统中的静电荷)结合。可以确定以高度特异性结合和释放靶抗体的条件条件(例如，pH和离子强度)。反过来，可以发现几乎与除抗体外的所有样品组分结合的条件。阴离子交换色谱使用带正电荷的基团(弱碱性，例如二乙基氨基乙基DEAE或二甲基氨基乙基DMAE；或者强碱性，例如季铵乙基Q或三甲基铵乙基TMAE或季铵乙基QAE)。

阳离子交换色谱使用带负电荷的官能团修饰的树脂。其可以是强酸配体，例如磺基丙基、磺基乙基和磺基丁基，或者弱酸性配体，例如羧基。阳离子交换色谱已经用于许多pI值在中性至碱性范围的mAb的纯化过程。抗体在加样步骤中结合在树脂上，并且通过洗脱缓冲剂中增加的导电性或增加的pH而被洗脱。从加样级分和洗涤级分中除去电负电荷的过程相关杂质例如DNA、一些宿主细胞蛋白质、浸提的蛋白质A和内毒素。阳离子交换色谱还可以从期望抗体中分离脱酰胺基产物、氧化物质和N末端截短的形式以及高分子量物质。抗体与阳离子交换树脂的结合取决于pH和导电性以及树脂类型。SP琼脂糖FF和SP琼脂糖XL是两种常见的市售树脂。

超滤是用于抗体浓缩和缓冲剂交换的一种压力驱动的膜过程。超滤是基于尺寸的分离，其中比膜孔大的物质被截留，而较小物质自由通过。超滤的通过在给定压力驱动力下不同组分穿过膜的过滤速度的差异实现分离。缓冲剂交换使用渗滤模式实现，其中最终期望组合物的缓冲剂以与滤液移除相同的速度加入到渗余物系统中，因此保持恒定的渗余物体积。孔范围为1至20nm的超滤可以提供分子量为500道尔顿至1,000千道尔顿范围的物质的分离。

可以使用来自GE Healthcare的MabSelect树脂通过重组蛋白质A(rProtein-A)亲和色谱从收获的滤液中捕获9E4抗体产物。产物在中性pH下与蛋白质A树脂结合并且在等度模式下利用pH 3.0的100mM醋酸钠洗脱。通过该步骤大部分宿主细胞杂质和细胞培养基组分减少。用一半PAIN缓冲剂(500mM NaCl、1.34mM KCl、4mM Na₂HPO₄x 2H₂O、0.735mMKH₂PO4x 2H₂O、0.125％PVP＝科利当17、7.5％异丙醇、4.3mM NaOH、250mM L-精氨酸-HCL，pH7.4，导电率45mS/cm)进行独立的分离步骤以除去依然保留在柱上的组分并且使中性AT合并产物的浊度尽可能小。通过以类似加样量将收获的合并物分开来进行蛋白质A步骤最多三个循环。用1.47mM KH2PO4x 2H2O、8.03mM Na2HPO4x 2H2O 137mM NaCl、2.68mM KCl将将柱平衡到pH 7.4±0.2并且导电率16±3mS/cm移除去储存的溶液并且将柱为加样做好准备。然后以最大30g/L收获滤液对柱加样、洗涤(3份缓冲剂，各自为3个柱体积)并且洗脱。洗脱后，将柱用0.1M磷酸对剥离并且平衡用于下一循环，或者如果次日进行随后的循环，则完全再生并且储存。在最后一次循环后利用0.1M磷酸(剥离)、6M脲和1M乙酸进行完全再生。

将合并的并且0.2μm过滤的MabSelect合并产物用1M乙酸(搅拌)调节到pH 3.5并且在室温下孵育60-70分钟用于病毒灭活(不搅拌)。在搅拌下通过添加1M tris碱中和到pH5.50±0.20。

立即使酸处理产物通过以下深层过滤步骤。通过Cuno Zeta Plus60ZA的深层过滤步骤是用于除去浑浊的步骤。将病毒灭活的合并产物通过由无菌的上述深层过滤器材料和0.2μm PES膜过滤器组成的二阶段过滤过程过滤。

将深层过滤的合并产物使用来自GE Healthcare的Q-琼脂糖快速流动树脂通过阴离子交换色谱(AEX)以流通方式(flow-through mode)进一步纯化。AEX步骤减少了残余的宿主细胞DNA并且除去病毒。将柱用Q平衡缓冲剂(42.8mM氨基丁三醇-HCl、7.2mM tris碱、39mM NaCl)平衡到pH 7.50±0.20和导电率8.0±1.0mS/cm以除去储存的溶液并且将柱为加样做好准备。在加样期间，产物流过柱而杂质与柱结合。在加样/洗脱后，将柱用Q平衡缓冲剂洗涤以除去保留在柱的流动相中的产物。在产物回收后，将柱再生并且最终储存。

将调节的Q-琼脂糖合并产物使用来自Applied Biosystems的Poros HS50通过阳离子交换色谱(CEX)进一步纯化。产物在低盐调节(36.2mM CH₃COONa x 3H₂O，13.8mMCH₃COOH，58.5mM NaCl，pH 5.1，导电率8mS/cm)下与柱结合，然后在高盐条件(38mMCH₃COONa x 3H₂O，12mM CH₃COOH，228mM NaCl，pH 5.1，导电率25.5mS/cm)下以等度模式洗脱。利用中等盐量(37.2mM CH₃COONa x 3H₂O，12.8mM CH₃COOH，102.5mM NaCl，pH 5.1，导电率13.5mS/cm)进行额外的洗涤步骤以除去污染物，例如宿主细胞蛋白质、高分子量产物变体和浸提的蛋白质A。CEX步骤进行最大2个循环。在这种情况下，将调解的AEX合并物分成2个相等体积并且单独在CEX柱上处理。

病毒过滤(VF)提供了特异性用于除去病毒颗粒的第二种正交方法，并且被设计成除去大于20nm的颗粒(例如，细小病毒)。病毒过滤通过在1.0bar的跨纳米过滤器压降下使Poros HS50合并产物在压力下转移通过串联的0.1μm初过滤器和病毒过滤器(Planova20N,Asahi Kasei)来实现。在使用前(泄漏测试)和使用后(泄漏测试和金颗粒测试)进行病毒过滤器的完整性测试。

将纳米过滤的合并产物浓缩到约20g/L(UF1)，然后用≥6倍体积的渗滤缓冲剂(17mM C₆H₅Na₃O₇x 2H₂O，3mMC₆H₈O₇x H₂O，pH 6，导电率4mS/cm)的恒定体积进行渗滤。渗滤后，将合并物浓缩到约75g/L(UF2)。最后，通过用渗滤缓冲剂冲洗来从UF/DF系统中除去渗余物至约52g/L的浓度(＝”30kD合并产物”)。

将30kD合并产物与4+1的比率与5倍海藻糖/Tween20(聚山梨醇酯20)spike缓冲剂((17mM C₆H₅Na₃O₇x 2H₂O，3mMC₆H₈O₇x H₂O，1150mM海藻糖x 2H₂O，1g/L聚山梨醇酯20，pH5.9，导电率1.0mS/cm)混合并且用制剂缓冲剂(17mM C₆H₅Na₃O₇x 2H₂O，3mM C₆H₈O₇x H₂O，230mM海藻糖x 2H₂O，0.2g/L聚山梨醇酯20，pH 6.0，导电率3.30mS/cm)稀释以得到40.0±2.0g/L的蛋白质浓度。

将本体材料(bulk material)通过串联的0.2μm合并过滤器(pool filter)和0.2μm袋过滤器(bag filter)过滤。可以进行额外的初过滤器至0.2μm过滤器以除去颗粒。测试0.2μm合并过滤器的完整性。如果位测试合并过滤器，则单独测试每个袋过滤器。

实施例4:制剂开发

贯穿本实施例，使用具有SEQ ID NO:29的轻链序列和SEQ ID NO:32的重链序列的人源化9E4抗体。

物理化学特征。为了有助于选择潜在的制剂组分，确定人源化9E4抗体的热特性。测定中使用差示扫描量热法(“DSC”)、直角光散射(“RALS”)和固有荧光(“IF”)技术。首先将纯化抗体从10℃加热到71℃，然后从71℃冷却到10℃，然后再次从10℃加热到83℃，然后再次从83℃冷却到10℃，最后再次从10℃加热到95℃。DSC热谱图揭示了两个转变，71℃处的第一个和83℃处的第二个。参见图1。在实验条件下71℃的转变是可逆的。RALS和IF热谱图揭示了中间温度处的单转变。

pH优化。接下来在pH值范围为3.5至8.0的混合缓冲系统中分析人源化9E4的稳定性。再次，在测定中使用DSC、RALS和IF技术。如前，在DSC热谱图中检测了两个转变(除了在pH 3.5检测到第三个转变以外)以及在RALS和IF热谱图中检测到单个中间转变。当在约71℃下趋平时DSC分析中的第一热转变在pH 6.5之前随着pH的增加而增加(表4，下文以及图2)。在pH 5.0和6.5之间，DSC分析中的第二热转变在83℃附近出现峰值。在4.5-8.0的pH范围下，RALS分析中的热转变保持在约77℃，在相同pH范围下IF热转变在75℃至77℃之间变化(图2)。基于该结果，确定5.5至7.0的pH范围提供为人源化9E4抗体提供最大稳定性。

表4：人源化9E4的作为pH函数的DSC热转变峰

pH	Tm1(℃)	Tm＊(℃)	Tm2(℃)
				3.5	43.6	59.0	75.1
4.0	54.9	--	79.8
				4.5	59.2	--	81.4
5.0	65.9	--	82.7
				5.5	68.8	--	83.1
6.0	70.6	--	83.0
				6.5	71.3	--	82.8
7.0	71.3	--	82.3
				7.5	71.3	--	82.2
8.0	71.0	--	82.0

缓冲剂选择。基于人源化9E4抗体的pH依赖性稳定性结果，鉴定对于胃肠外使用来说药学上可接受的并且可以在5.5至7.0之间的pH范围内提供足够的缓冲能力的缓冲系统。缓冲剂体系包括20mM柠檬酸盐缓冲剂(pH 5.5；6.0)、20mM组氨酸缓冲剂(pH 6.0；6.5；7.0)和20mM琥珀酸盐缓冲剂(pH 6.5)。通过DSC、RALS和IF测定20mM琥珀酸盐和20mM组氨酸缓冲剂中人源化9E4抗体的热稳定性。如通过DSC确定的，pH 5.5至6.0的柠檬酸盐缓冲剂中的人源化9E4抗体表现出比组氨酸缓冲剂中的人源化9E4抗体显著更高的第二热转变(Tm2)(下表5)。相反地，pH 6.5至7.0的组氨酸缓冲剂中的人源化9E4抗体表现出比柠檬酸盐缓冲剂中的人源化9E4抗体更高的第一热转变(Tm1)(表5)。使用RALS技术未检测到组氨酸缓冲的抗体的转变。但是柠檬酸盐缓冲的抗体在pH 5.5和6.0表现出78℃的热转变。

还通过DSC和RALS分析了琥珀酸盐缓冲的人源化9E4抗体(pH 6.5)并且将结果与柠檬酸盐缓冲的(pH 6.5)和组氨酸缓冲的(pH 6.5)抗体进行了比较。对于DSC分析，柠檬酸盐缓冲剂和琥珀酸盐缓冲剂中的第二热转变(Tm2)比组氨酸缓冲剂中的高约1℃，表明在测试条件下蛋白质稍高的稳定性。通过RALS检测到了pH 6.5的琥珀酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂的可比较的转变温度。

基于这些发现，选择20mM柠檬酸盐(pH 6.0)和20mM琥珀酸盐(pH 6.5)缓冲剂来用于产生冻干产品并且测试其长期稳定性。

表5：人源化9E4的作为缓冲剂的函数的DSC热转变峰

缓冲剂	Tm1(℃)	Tm2(℃)
			柠檬酸盐(pH 5.5)	68.8	83.4
柠檬酸盐(pH 6.0)	70.2	83.2
			组氨酸(pH 6.0)	68.9	81.9
组氨酸(pH 6.5)	71.3	81.9
			组氨酸(pH 7.0)	71.4	82.5
琥珀酸盐(pH 6.5)	71.8	82.8

糖/多元醇选择。为了提高冻干制剂中人源化9E4抗体的稳定性，分析了糖好多元醇对抗体热稳定性的影响。评估的糖/多元醇包括海藻糖、蔗糖或者蔗糖和甘露醇的混合物。将240mM海藻糖、240mM蔗糖以及50mM蔗糖/200mM甘露醇分别加入到20mM琥珀酸盐(pH6.5)、20mM组氨酸(pH 6.5)和20mM柠檬酸盐(pH 6.5)缓冲剂中。然后通过DSC评估每一种制剂的人源化9E4抗体的稳定性。DSC结果表明，多种糖/多元醇使第一和第二热转变向更高稳定转移，指示了稳定效果(下表6)。但是，海藻糖制剂始终具有最高的热转变(表6)。此外，组氨酸制剂中的第二转变温度(Tm2)低于柠檬酸盐和琥珀酸盐制剂中的(表6)。

表6：作为缓冲剂和糖/多元醇的函数的人源化9E4的DSC热转变温峰

还在琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲剂(pH 6.50中对具有多种糖/多元醇的人源化9E4抗体进行了RALS测量。对于琥珀酸盐缓冲剂，240mM海藻糖制剂具有最高转变温度(77℃)，240mM蔗糖制剂具有中等转变温度(76℃)，50mM蔗糖/200mM甘露醇制剂具有最低转变温度(75℃)。对于柠檬酸盐缓冲剂，240mM海藻糖制剂和50mM蔗糖/200mM甘露醇制剂具有相同的转变温度(78℃)，240mM蔗糖制剂就有较低转变温度(77℃)。柠檬酸盐制剂中转变温度仅1℃的差异在测试可变性之内。

表面活性剂。使用DSC测试聚山梨醇酯20(“PS20”)对热稳定性的影响，并且确定为对人源化9E4抗体的转变温度没有影响。但是，关于震荡应力，观察到了PS20的积极效果。测试了两种制剂对于震荡应力的反应：(A)20mM pH 6.0柠檬酸盐，230mM海藻糖，0.02％(w/w)PS20；(B)25mM pH 6.0柠檬酸盐，230mM海藻糖。即使震荡24小时，具有PS20的制剂(制剂A)提供了较低的泡沫形成程度和恒定的浊度。震荡3小时后，制剂B具有强泡沫形成增加的浊度。没有制剂在震荡研究中导致产生可见颗粒。

接下来，评估了PS20对于震荡诱导的浊度的影响。即使震荡24小时后，制剂A的浊度未增加。相比之下，制剂B的浊度几乎加倍，从震荡前的17FNU(Formazin NephelometricUnit)增加到了震荡24小时后的32FNU(表7)。

表7：震荡前和震荡后人源化9E4抗体制剂的浊度((FNU)

	初始体积	3小时	6小时	24小时
					制剂A	18	18	18	18
制剂B	17	20	25	32

震荡前和后抗体聚集的测量同样地证明了PS20的稳定效应。在震荡前和震荡3、6和24小时后通过高效尺寸排阻色谱(HPSEC)评估制剂A和制剂B中单体抗体和聚集抗体的量。制剂A中PS20的存在与聚集抗体量的稍微增加(0.2％)(表8)和单体抗体量的相应降低(0.2％)(表9)相关联。相比之下，制剂B(无PS20)表现出聚集抗体4倍增加(表8)和单体抗体的量相应高降低(0.9％)(表9)。

表8：震荡前和后人源化9E4抗体聚集(％)

	初始值	3小时	6小时	24小时
					制剂A	2.6	2.6	2.6	2.8
制剂B	2.5	2.7	3.0	3.3

表9：震荡前和后人源化9E4抗体单体水平(％)

	初始值	3小时	6小时	24小时
					制剂A	97.2	97.1	97.1	97.0
制剂B	97.2	97.0	96.7	96.3

因此，震荡研究的结果表明，PS20组织人源化9E4抗体制剂中不期望的浊度和抗体聚集的增加。

冻干可行性研究。基于之前分析，选择制剂1-4(下表10)来评估以冻干形式储存人源化9E4抗体的可行性。

表10：人源化9E4抗体测试制剂

作为开始冻干循环的初始步骤，研究冰冻F1-F4制剂的热特性。使用MettlerToledo DSC 821仪器来确定每一种制剂的玻璃化转变(Tg’)温度。在以下冰冻/解冻循环下进行测量：

冰冻:以5K/分钟从5℃到70℃。

保持：-70℃下3分钟。

加热:以5K/分钟从-70℃到25℃。

表11列出了以该方式确认的玻璃化转变温度。制剂2和4(其包含琥珀酸盐和甘露醇)表现出与海藻糖制剂相比较低的Tg’，而使用不同缓冲剂并不显著影响Tg’。尤其其更高的Tg’，海藻糖制剂(制剂1和3)在初始干燥期间可以禁受更高产物温度，这对于冻干过程有利。

表11：制剂F1至F4的玻璃化转变温度

制剂	Tg’(开始)	Tg’(中点)
			F1	-27℃	-26℃
F2	-35℃	-34℃
			F3	-36℃	-25℃
F4	-34℃	-33℃

基于确定的玻璃化转变温度，开发并且测试了两种不同的冻干循环。第一种循环包括在-10℃(搁板温度)下进行的初级干燥步骤(表12)。第二种循环中的初级干燥步骤在-20℃下进行(表13)。

表12：用于冻干可行性研究的冻干循环1

表13：用于冻干可行性研究的冻干循环2

使用Epsilon 2-12D,GT-12-B冻干器(Christ)进行小规模的冻干可行研究。在0.2μm过滤后，将制剂抗体的5.4ml±0.2ml等分试样加入到20ml小瓶(I型透明玻璃小瓶，20/25mL，Blow Back，来自Schott)。所得小瓶具有5.0ml的标称填充体积和200mg/小瓶的标称剂量。冻干后的预期重构体积为5.0ml水。将小瓶手动输入到冻干器中并且根据循环1或循环2冻干。使用放置在小瓶中的PT100传感器监测产物温度。没有任何偏差的情况下进行循环。在水结晶之前将制剂过冷到-6.5℃的最小温度，之后将制剂冰冻到-50℃。对于初级干燥阶段，在-10℃(循环1)或-20℃(循环2)的搁板温度下应用0.10mbar(电容真空计)的真空。对于循环1，这些参数导致升华期间-28℃至-25℃的平均产物温度。对于循环2，这些参数导致升华期间低于-30℃的平均产物温度。对于两个循环，初级干燥的实际持续时间为40个小时。在初级干燥后，将搁板温度升高到30C(第二干燥)以允许吸收解冻的水。次级干燥设置为8小时的周期，目的是冻干制剂的最终水分含量为约1％。在冻干后，将小瓶塞上塞子(Stelmi C1404 6720GC 6TP3,20mm)并且密封(铝flip-off密封,20mm)。

含海藻糖的制剂在冻干后为完全的无定形并且表现出一些收缩。相比之下，含甘露醇的制剂部分结晶并且不表现出收缩。所有制剂的饼高为约11mm。饼质量为约685mg(F1)、516mg(F2)、700mg(F3)和520mg(F4)。对于所有制剂，饼具有浅黄色颜色。

分析并且比较通过循环1和循环2产生的冻干制剂的特征，包括水分含量、重构时间、显微可见颗粒的数目。见表14(下文)。此外，将冻干制剂的质量与冻干前的产品治疗相比较。额外的特性测试包括澄清度、pH、摩尔渗透压浓度、单体相对于聚集物的量、密度、HIC图案和活性(数据未示出)。总的来说，在冻干和重构后未发现对产品质量造成的不利影响：冻干过程未显著改变产物外观、颜色、可见颗粒水平、澄清度、pH、摩尔渗透压浓度、蛋白质含量、单体含量、HIC图案和活性。此外，通过循环1冻干的制剂的重构时间(100-140秒)和通过循环2冻干的制剂的重构时间(100-170秒)可接受，测量的显微可见颗粒水平低于药典规格。

表14：冻干可行研究的结果，冻干后产品测试

由于冻干循环2导致含甘露醇和蔗糖的制剂更长的重构时间和稍微升高的显微可见颗粒水平(2-10μm)的趋势，选择基于修改的循环1的冻干循环用于加速稳定性研究。该修改的冻干循环包括更短的40个小时而非60个小时的初级干燥阶段(步骤8)和12个小时而非8个小时的延长的次级干燥阶段(阶段10)。包括更长的次级干燥阶段以进一步减少冻干制剂中的水分含量。

冻干制剂的加快的稳定研究。将制剂F1-F4(如上表10所述)如上所述冻干，只是使用表15(下)中示出的冻干循环。对于加速稳定性研究，将冻干制剂储存在40℃、75％相对湿度(RH)下1、2或3个月的一段时间。储存后，将制剂用水(5.0ml)重构，检查重构制剂的特性并且与冻干后立即重构的制剂的特性(“初始值”)相比较。

表15：加速稳定性研究的冻干循环

冻干制剂的饼颜色为浅黄色，与冻干可行性研究中观察的一致。所有情况下饼外观均可接受，海藻糖制剂(F1和F3)由于冻干产物的无定形特性(通过X射线粉末衍射确认)而倾向于收缩。含甘露醇的冻干制剂(F2和F4)部分结晶并且基本上未表现出收缩。在40℃下储存三个月的过程后，制剂的饼外观和颜色未改变。

在40℃下3个月后，冻干制剂在重构前的水分含量未显著改变。紧接冻干的制剂的水分含量为0.90％至1.36％，3个月后，为0.84％至1.47％。参见表16(下文)。同一制剂的不同样品观察的水分含量的差异是由于测试方法的变化。但是，含蔗糖和甘露醇的制剂始终比含海藻糖的制剂包含更高的水分含量。

表16：冻干制剂在40℃下储存后的水分含量

所有冻干制剂的重构时间均可接受，在49秒和97秒之间变化。所有冻干制剂的外观均可接受，即使在40℃下3个月后也未观察到可见颗粒。此外，与冻干前制剂相比，制剂的颜色在经过相同时间段后保持未改变(<BY5)。

在40℃下3个月后，对于任何制剂均未观察到蛋白质浓度、摩尔渗透压浓度和pH中的相关变化(数据未示出)。但是，观察到了浊度的不同的增加。如表17(下文)中所示，含甘露醇的制剂(F2和F4)的浊度表现的较大增加(三个月后6-7FNU)，而含海藻糖的制剂(F1和F3)表现出较少增加(仅2FNU)。

表17：冻干后制剂在40℃下储存后的浊度

通过微流成像(MFI)法测量重构制剂中的显微可见颗粒。每个制剂每个时间点测量两个单独样品。对于冻干后立即重构的制剂(即，未在40℃下储存)，显微可见颗粒的水平示出在表18(下文)中，相应柱状图示出在图3中。在40℃下储存1个月、2个月和3个月的制剂检测的显微可见颗粒的水平分别示出在表19-21中(参见下文)，相应柱状图分别示出在图4-6中。

表18：MFI数据，冻干后的初始值

粒径(μm)	F1-1	F1-2	F2-1	F2-2	F3-1	F3-2	F4-1	F4-2
									≥2.00	2340	2730	11470	11545	10375	11285	2820	2280
≥10.00	110	70	55	50	70	135	25	0
									≥25.00	10	30	0	10	10	20	10	0

表19：MFI数据，在40℃下储存1个月后的值

粒径(μm)	F1-1	F1-2	F2-1	F2-2	F3-1	F3-2	F4-1	F4-2
									≥2.00	12370	12680	232490	218280	7245	7715	184365	176815
≥10.00	50	10	28990	33455	130	105	3885	3925
									≥25.00	0	0	0	2955	0	20	0	0

表20：MFI数据，在40℃下储存2个月后的值

粒径(μm)	F1-1	F1-2	F2-1	F2-2	F3-1	F3-2	F4-1	F4-2
									≥2.00	32995	38225	0	395570	16615	32445	172010	163020
≥10.00	410	1050	0	51030	45	525	9775	8160
									≥25.00	35	115	0	125	0	75	0	75

表21：MFI数据，在40℃下储存3个月后的值

粒径(μm)	F1-1	F1-2	F2-1	F2-2	F3-1	F3-2	F4-1	F4-2
									≥2.00	41895	81355	520555	551750	30740	29275	340450	353695
≥10.00	285	330	60565	74430	65	55	25150	24760
									≥25.00	10	0	645	820	0	0	35	55

MFI分析表明，受试制剂中的显微可见颗粒水平与刚冻干之后类似，但是含甘露醇和蔗糖的制剂(F2和F4)中的水平在一个月后急剧增加，并且之后持续增加。结果，制剂2超过药典对于大于或等于10微米(≥10.00μm)的显微可见颗粒和正好一个月后的大于或等于25微米(≥25.00μm)的显微可见颗粒的极限，制剂4超过了药典对于在40℃下储存2个月后的显微可见颗粒的极限。相比之下，含海藻糖的制剂(F1和F3)未表现出显著增加的颗粒形成，并且低于药典对于40℃下至少3个月的显微可见颗粒的极限。

还在40℃下储存2个月后通过不透光度测量了四种制剂中的显微可见颗粒。不透光度是一种已知技术，其得到与MFI测量不同的结果，通常倾向于更低。如表22(下文)中所示，通过不透光度检测，制剂2具有最高的显微可见颗粒水平，而其他制剂具有较低更加类似的显微可见颗粒水平。

表22：不透光度数据，在40℃下储存2个月后的值

还通过高效尺寸排阻色谱(HP-SEC)分析制剂以确定以冻干状态在40℃下储存后聚集和单体形式的抗体的百分比。如表23(下文)所示，含甘露醇和蔗糖的制剂中聚集抗体的百分比从2.5％增加到4.4％，而含海藻糖的制剂中仅从1.0％增加到1.1％。随着制剂中聚集抗体水平的增加，单体抗体的百分比相应减少。参见表24。图7中示出了作为制剂和在40℃下储存时间的函数的单体抗体的量的图示。

表23：在40℃下储存后的抗体聚集(百分比)

表24：在40℃下储存后的单体抗体(百分比)

经过40℃的储存历程后通过疏水相互作用色谱(HIC)表征制剂。对于每一种制剂，可以通过HIC检测前峰(相对亲水性)、主峰和后峰(相对疏水)。可以通过出现的每个峰的面积的变化来监测蛋白质结构随时间的变化。HIC分析的结果示出在表25-27(下文)中。每一种制剂的前锋面积的变化类似。主峰和后峰面积的变化更显著，含海藻糖的制剂和含甘露醇/蔗糖的制剂不同。具体地，在经过3个月的储存期后，含甘露醇/蔗糖的制剂(F2和F4)的主峰面积分别表现出8.4％和5.4％的降低。相比之下，经过相同的时期后，含海藻糖的制剂(F1和F3)的主峰面积分别表现出4.7％和4.5％的降低。含甘露醇/蔗糖制剂的主峰中大部分之前的蛋白质转移到疏水后峰，制剂F2和F4的后峰面积分别增加6.4％和4.6％。

表25：HIC数据，在40℃储存后的前峰面积(百分比)

表26：HIC数据，在40℃储存后的主峰面积(百分比)

表27：HIC数据，在40℃储存后的后峰面积(百分比)

还通过等电点聚焦和毛细管成像(iCE)表征制剂。每一种制剂表现出三峰图形，包括酸性峰、主峰和碱性峰。如表28中所示，制剂1在40℃储存的三个月期间表现出最小的峰图形变化，而制剂2-4表现出碱性峰面积随时间的大的增加。

表28：在40℃储存后的iCE数据

还检查了每一种制剂中抗体的抗原结合活性。无论哪种制剂，抗体在40℃三个月储存期间表现出高抗原结合活性。

还测试了制剂在超滤/渗滤(UF/DF处理)期间的聚集制剂。试剂3表现出最少量的聚集制剂，而制剂2表现出最多；制剂1和4表现出中等的聚集量(数据未示出)。

考虑所有的加速稳定性数据，与制剂F2和F4相比，制剂F1和F3在三个月储存后表现出最佳稳定。这反映了以下事实：如通过浊度、HP-SEC、显微可见颗粒、HIC和iCE检测的，制剂F2和F4(含甘露醇/蔗糖的制剂)表现出相对差的稳定性。制剂F1与F3相比，一个显著差异在于F1倾向于在超滤/渗滤处理期间产生比F3稍多的聚集物。因此，选择制剂F3作为最优选制剂。

关于冻融的制剂稳定性。接下来测试制剂F3使人源化9E4抗体关于冻融稳定的能力。为此，将人源化9E4抗体纯化并且再悬浮在制剂F3中。然后将20ml含人源化9E4的F3以40mg/ml填充到Sartorius Stedim Flexboy 30ml袋中，并且将袋在-40℃冰冻。每个袋进行最多5次冻/融循环。在冰冻前和1、3和5次冻/融循环后对制剂F3中的人源化9E4抗体进行分析检验。在至多三次冻-融循环后，未检测到显著变化。在五次冻-融循环后，检测到聚集抗体的水平显著增加(0.2％)并且观察到HIC和iCE图像的小的变化。虽有其他分析结果，包括对颜色和可见颗粒的视觉检查、澄清度、UV扫描、HP-SEC、摩尔渗透压浓度、pH、显微可见颗粒数目和抗体活性，在五次冻-融循环后没有变化。

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