CN120683078A - 一种适用于链霉菌的TnpB基因编辑系统及其构建和应用 - Google Patents

一种适用于链霉菌的TnpB基因编辑系统及其构建和应用

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CN120683078A CN202410603449.0A CN202410603449A CN120683078A CN 120683078 A CN120683078 A CN 120683078A CN 202410603449 A CN202410603449 A CN 202410603449A CN 120683078 A CN120683078 A CN 120683078A
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Abstract

本发明公开了一种适用于链霉菌的TnpB基因编辑系统及其构建和应用；该系统包括工程化TnpB核酸酶及reRNA引导盒，工程化TnpB核酸酶相对于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有氨基酸差异。进一步的，所述氨基酸差异位于第188、217、125、179、388、27、25、8、96、240、208、279、254、110、267、286、186、356、162、210、332、385、9、200、111、333、57位中的一位。本发明的工程化TnpB核酸酶及其效应蛋白具有更高的活性，在链霉菌体内的基因编辑效率表现更为卓越；TnpB(如D333V，S57R等)突变体对链霉菌内源基因SCO5087的编辑效率接近100％。

Description

一种适用于链霉菌的TnpB基因编辑系统及其构建和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种适用于链霉菌的TnpB基因编辑系统及其构建和应用；特别是涉及一种适用于链霉菌的工程化TnpB核酸酶、TnpB基因编辑系统及基因编辑的方法。所述工程化TnpB核酸酶，包含一种基于参比TnpB核酸酶的突变。利用本发明工程化TnpB、TnpB基因编辑系统可以实现链霉菌体内的高效精准基因编辑；且相较于未被工程化的TnpB基因编辑系统，利用本发明工程化的TnpB核酸酶、TnpB基因编辑系统能极大提高目标基因的编辑效率。
背景技术
链霉菌是放线菌门中最大的一个属，因能产生结构丰富、活性广泛、极具应用价值的次级代谢产物且具有海量编码新化合物的潜能，在医药卫生、食品、工农业等多领域展现出广泛的应用前景。但由于链霉菌自身特性，如基因组GC含量高、染色体呈线状、在实验条件下其次级代谢产物生物合成基因簇大多沉默不表达等特点，大大限制了通过传统同源双交换的方式进行系统性代谢工程去开发新的有价值的次级代谢物或者提高已知活性次级代谢产物产量的进程。从基因组出发利用合成生物学自下而上高效挖掘是目前次级代谢产物研发的主流思路，而拥有强大的遗传操作系统是从链霉菌中开发和改良已有次级代谢产物的基础。
然而，链霉菌基因组较大(8-10Mb)且GC含量高(普遍GC含量超过70％)，相较于其它微生物，在链霉菌上完成基因编辑等遗传操作十分困难，遗传操作手段十分有限。随着CRISPR-Cas9技术的发展及其在链霉菌中的应用，很大程度上缓解了链霉菌基因编辑费时低效的问题，有效打破链霉菌领域内缺少高效遗传操作的瓶颈，成为目前适用于链霉菌的主要基因编辑工具。尽管CRISPR-Cas9系列基因编辑工具在链霉菌基因编辑中发挥重要作用，但仍有许多问题有待改进。比如CRISPR-Cas9的体积过于庞大，影响质粒构建和递送效率；高GC的PAM序列导致潜在的高脱靶效应(Off-target effects)等问题。
为突破Cas9等蛋白体积大所造成的应用局限性，研究者一方面通过系统优化改CRISPR-Cas系统关键元件以克服不足，如使用Cas9的直系同源酶、改造Cas9、优化引导RNA等一系列措施；另一方面也在不断探索应用新型基因编辑技术，如base editing,primeediting等；另外研究者还不断挖掘和开发紧凑的CRISPR蛋白，以开发新型CRISPR系统。TnpB是近期发现的一种体积仅约Cas9蛋白1/3(约400个氨基酸)的可编程核酸酶，在长非编码RNA引导下可切割靠近TTGAT 5’端DNA序列，备受国内外研究者关注。到目前为止，已成功应用TnpB对多物种的内源基因进行编辑，但总体来说，同Cas9相比，TnpB同已报道的其它紧凑型基因编辑工具均存在编辑效率低的问题，更重要的是，现有的小型基因编辑器还未见在链霉菌体内进行编辑的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于链霉菌的TnpB基因编辑系统及其构建和应用。本发明针对链霉菌中尚缺乏迷你基因编辑工具的现状以及目前迷你基因编辑工具编辑普遍存在效率低的问题，构建了介于TnpB的链霉菌迷你基因编辑系统。在此基础上，通过对TnpB-DNA-RNA三维晶体结构深入分析和理性设计，优化改造TnpB核酸酶，开发出介于TnpB核酸酶的链霉菌高效迷你基因编辑系统，实现对链霉菌体内基因组的精准、高效编辑，从而丰富链霉菌基因操作工具库，促进链霉菌沉默基因簇基因功能研究、为代谢途径精准改造和智能生物制造提供有力的使能工具。
为克服目前迷你基因编辑器编辑效率低的问题，进一步丰富链霉菌基因编辑工具库，本发明以TnpB核酸酶(仅约400个氨基酸)为基础，构建了基于TnpB的链霉菌迷你基因编辑系统，并通过对TnpB-DNA-RNA三维晶体结构分析和理性设计，工程化改造TnpB核酸酶，开发出基于工程化TnpB核酸酶的链霉菌高效基因编辑系统及应用此系统对应的基因编辑方法和流程。本发明的目的是通过下述技术方案予以实现：
第一方面，本发明提供一种工程化TnpB核酸酶，所述工程化TnpB核酸酶相对于未经改造的TnpB核酸酶(如SEQ ID NO.1)所示的氨基酸序列具有氨基酸差异。
作为本发明的一个实施方案，所述氨基酸差异位于第188位、217位、第125位、第179位、第388位、第27位、第25位、第8位、第240位、第208位、第96位、第279位、第254位、第110位、第267位、第286位、第186位、第356位、第162位、第210位、第332位、第385位、第9位、第200位、第111位、第333位、第57位中的一位。
作为本发明的一个实施方案，所述氨基酸差异优选位于第356位、第162位、第210位、第332位、第385位、第9位、第200位、第111位、第333位、第57位中的一位。
在一些优选的实施方案中，所述的工程化TnpB核酸酶为第188位氨基酸残基A替换为V；第217位氨基酸残基S替换为K；第125位氨基酸残基N替换为G；第179位氨基酸残基Y替换为P；第388位氨基酸残基Y替换为A；第27位氨基酸残基S替换为C；第25位氨基酸残基L替换为F；第8位氨基酸残基V替换为K；第240位氨基酸残基G替换为R；第208位氨基酸残基H替换为K；第96位氨基酸残基T替换为R；第279位氨基酸残基H替换为T；第254位氨基酸残基V替换为S；第110位氨基酸残基R替换为K；第267位氨基酸残基S替换为R；第286位氨基酸残基R替换为L；第186位氨基酸残基F替换为K；第356位氨基酸残基E替换为A；第162位氨基酸残基I替换为N；第210位氨基酸残基Q替换为N；第332位氨基酸残基H替换为S；第385位氨基酸残基H替换为C；第9位氨基酸残基V替换为Y或F，优选F；第200位氨基酸残基V替换为L；第111位氨基酸残基K替换为S；第333位氨基酸残基D替换为V；第57位氨基酸残基S替换为R。
在一些优选的实施方案中，所述的工程化TnpB核酸酶为第356位氨基酸残基E替换为A；第162位氨基酸残基I替换为N；第210位氨基酸残基Q替换为N；第332位氨基酸残基H替换为S；第385位氨基酸残基H替换为C；第9位氨基酸残基V替换为Y或F，优选F；第200位氨基酸残基V替换为L；第111位氨基酸残基K替换为S；第333位氨基酸残基D替换为V；第57位氨基酸残基S替换为R。
第二方面，本发明提供一种实现链霉菌体内高效迷你基因编辑系统，其包括上述工程化TnpB核酸酶及其RNA引导盒。
作为本发明的一个实施方案，所述reRNA引导盒按照基因编辑靶基因的方向依次包括以下核心原件：TnpB蛋白的向导RNA碱基序列、基因靶向区段、丁型肝炎病毒(HDV)核酶，用于引导TnpB蛋白向靶序列DNA移动。
作为本发明的一个实施方案，所述TnpB蛋白的向导RNA碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的一个实施方案，所述基因靶向区段，位于所述向导RNA碱基序列的3’端，为靶基因上的TAM序列5’TTGAT之后长度为12-40bp的核酸片段。
第三方面，本发明提供一种重组表达质粒载体，用于表达前述的链霉菌迷你基因编辑系统。
第四方面，本发明提供一种前述链霉菌迷你基因编辑系统的构建方法，所述方法包括构建含有安普霉素抗性筛选标记的基因编辑质粒；所述基因编辑质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，插入所述工程化TnpB核酸酶及其reRNA引导盒。
第五方面，本发明提供一种前述链霉菌迷你基因编辑系统在基于双链断裂及链霉菌自身修复系统下的链霉菌基因组编辑应用。
第六方面，本发明提供一种适用于链霉菌的基因编辑方法，所述基因编辑方法具体如下：在非诱导条件下，通过结合转移将上述基因编辑系统转入目的链霉菌宿主中，使所述宿主的靶位点附近发生基因删除或基因敲入、置换，造成移码突变，进而使得靶标基因失活。
作为本发明的一个实施方案，所述基因编辑方法包括如下步骤：
S1、在非诱导条件下，将前述方法构建得到的基因编辑质粒转化进入目的宿主中，通过链霉菌自身的同源末端连接，在靶位点附近发生基因删除、插入或置换，造成移码突变，进而使的靶标基因失活；通过质粒相关抗性的抗生素筛选，得到携带靶标基因突变的转化子；
S2、将所述转化子划线接种到含有质粒抗性抗生素及启动子诱导剂(如，硫链丝菌素)的培养基，恒温培养至可见单克隆；
S3、随机挑选步骤S2中单克隆，菌落PCR验证得到靶标基因突变菌株。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明工程化TnpB核酸酶及其效应蛋白具有更高的活性，相较于现有常规TnpB基因编辑工具，本发明的工程化TnpB核酸酶在链霉菌体内的基因编辑效率表现更为卓越；例如本发明实施例多个TnpB(如D333V，S57R等)突变体对链霉菌内源基因SCO5087的编辑效率接近100％。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其他特征、目的、优点将会变得更明显：
图1为工程化TnpB核酸酶编辑效率；注：WT为未经工程化的TnpB核酸酶；点状柱状图表示编辑效率为未经工程化TnpB核酸酶的2倍及以上；
图2为电泳结果展示图(TnpB(S57V))；
图3为测序结果展示图(TnpB(S57V))；
图4为工程化TnpB核酸酶(TnpB(S57V))失活靶标基因结果展示图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：工程化TnpB核酸酶
1.1质粒设计与构建
依据链霉菌的密码子偏好性，对Deinococcus radiodurans ISDra2来源TnpB核酸酶进行密码子优化，由金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成，TnpB的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示，在本发明中命名为野生型TnpB，同Deinococcus radiodurans ISDra2来源TnpB核酸酶的DNA相似性是79.74％。
引导野生型TnpB核酸酶于链霉菌内源靶位点附近发挥切割双链功能的reRNA引导盒，按照5’到3’端的方向依次包括以下核心元件：TnpB蛋白的导向RNA碱基序列(SEQ IDNO.3)，基因靶向区段，丁型肝炎病毒(HDV)核酶(SEQ ID NO.4)。所述基因靶向区段，位于所述RNA骨架的3’端，为靶基因上的TAM序列(5’TTGAT)之后长度为12-40bp的核酸片段。本发明实施例选择链霉菌模式菌株Streptomycin coelicolor A3(2)(基因组序列编号：GeneBank：GCA_008931305.1)放线紫红素合成的关键基因SCO5087(actI)为细胞内源基因靶点，该靶点对应的reRNA引导盒中的基因靶向区段的碱基序列为5’-gtagtcgatgtccgtcgcgt。实施例所用reRNA引导盒由金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成。
将所合成的野生型TnpB及其reRNA引导盒分别替换链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pCRISPR-Cas9(https://doi.org/10.1021/acssynbio.5b00038)上的Cas9和sgRNA片段，获得质粒pTnpB-ZH。
根据Deinococcus radiodurans ISDra2来源TnpB核酸酶与其引导RNA、底物DNA结合的晶体结构，设计了80个TnpB的单点突变(如表1)；以pTnpB-ZH为模版，通过反向PCR(如表2)引入突变，实现对TnpB进行定点突变，引物如表3所示，所述2×MegaPfu Premix(withdye)购自吐露港生物(货号：21809)；之后对反向PCR产物进行纯化(试剂盒购于：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Gel DNA Extraction Mini Kit，DC301)；随后，将纯化后的PCR产物转入感受态细胞E.coli DH5α中，利用其自身DNA重组修复系统，实现线性DNA的体内环化，从而获得TnpB优化质粒系统。
本发明实施例对所构建的质粒均进行了Sanger测序，以确保完全正确。
表1TnpB核酸酶单点突变序列
表2反向PCR反应体系
表3反向PCR引物及退火温度
实施例2：优化后链霉菌迷你编辑系统的应用
2.1转化
将TnpB优化后的目的质粒分别转入自制感受态细胞E.coli ET12567/pUZ8002(https://doi.org/10.1016/0378-1119(92)90549-5)，具体操作方法如下：取200ng TnpB优化后的质粒分别加入到100μL已解冻E.coli ET12567/pUZ8002感受态细胞中，轻轻混匀；待冰上静置30分钟后，42℃水浴45秒，然后立即置于冰上2分钟；随后，将其加入400μL无抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养1小时；然后取100μL涂布于含有卡那霉素(25μg/mL)、氯霉素(12.5μg/mL)和安普霉素(50μg/mL)的LB固体平板上；37℃过夜培养后，挑取单克隆至20mL含有卡那霉素(25μg/mL)、氯霉素(12.5μg/mL)和安普霉素(50μg/mL)的LB液体培养基培养，至OD600约0.4时，离心(5000rpm，5分钟)收集菌体；加入等体积无抗的LB液体培养基洗菌两次，最后用2mL LB液体培养基重悬菌。
2.2结合转移与抗性筛选
在非诱导条件下，将步骤2.1中的质粒通过结合转移方式转入S.coelicolor A3(2)中，具体操作方法如下：取事先收集的链霉菌孢子，离心(5000rpm，5分钟)弃上清，然后重悬于2mL 2×YT液体培养基；50℃热激10分钟，随后于30℃摇床中200rpm，预萌发30分钟；取500μL步骤2.1收集的E.coli菌液与200μL链霉菌孢子悬浮液于1.5mL离心管中，混匀；取100μL混合液，涂布于MS平板上；将MS平板倒置于30℃培养箱中培养，18小时后于培养基表面覆盖安普霉素(1mg/mL)和萘啶酮酸(1mg/mL)，待表面干燥后，继续将MS平板倒置于30℃培养至长出结合子(约5天左右)。此时，便可得到成功编辑的结合子。
实施例3：工程化TnpB系统基因编辑效率的评估
随机挑取步骤2.2中的具有抗性的结合子，划线接种到带有质粒抗性抗生素(50ng/mL安普霉素)以及硫链丝菌素(0.5μg/mL)的ISP2固体培养基上，倒置，30℃培养至可见菌体；挑取少量菌体至含有20μL DMSO的PCR管，于金属浴(100℃，15分钟)裂解细胞，获得细胞裂解液；采用菌落PCR的方式系统评估优化后TnpB系统编辑效率，具体操作如下：采用2×Rapid Taq Master Mix(购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：P222-01)试剂盒PCR扩增靶向位点片段，引物设计如表4所示，PCR反应体系如表5所示，PCR反应程序如表6所示。
表4以SCO5087(actI)为目标靶点的PCR扩增引物
编号 引物 序列(5’-3’)
SEQ ID NO.5 SCO5087-LH-F atgattccggaactccggt
SEQ ID NO.6 SCO5087-R accacagcttgcggaact
表5PCR反应体系
体系 15μL
ddH2O 5.25μL
正向引物(10μM，T-SCO5087-F) 0.75μL
反向引物(10μM，T-SCO5087-R) 0.75μL
2×Rapid Taq Master Mix 7.50μL
细胞裂解液(含DMSO) 0.75μL
表6PCR反应程序
本实施例采用2％的琼脂糖凝胶电泳检测及Sanger测序或全基因组重测序相结合的方式判断随机挑选的结合子是否被编辑。TnpB系统配合链霉菌自身有缺陷的非同源末端连接，实现对靶基因的编辑，如可发生基因敲除、插入、替换等。若成功被编辑，上述PCR扩增产物于2％的琼脂糖凝胶电泳后，其条带大小不同于野生型；对于无法通过凝胶电泳判断的样本，利用唯赞质粒纯化试剂盒(货号：DC201)纯化回收无法通过凝胶电泳判断是否被编辑样本送于苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger测序分析；对于PCR后无扩增产物的样本，收集菌体送于生工生物(上海)股份有限公司进行全基因组重测序，进一步评估基因编辑情况。结果表明(图1-3)，以模式菌株S.ceolicolor A3(2)中的靶标基因SCO5087(actI)为靶点，相对于野生型TnpB系统，单点突变TnpB位点后(A188V、S217K，N125G，Y179P，Y388A，S27C，L25F，V8K，G240R，H208K，T96R，H279T，V254S，R110K，S267R，R286L，F186K，E356A，I162N，Q210N，H332S，H385C，V9Y，V200L，K111S，V9F，D333V，S57R)展现出高效的基因编辑效率，具有提升至少2倍基因编辑能力，其中TnpB核酸酶包含第356位、第162位、第210位、第332位、第385位、第200位、第111位、第9位、第333位和第57位氨基酸中一个位点突变后，编辑效率提高3.0-4.3倍。
实施例4：使用工程化TnpB酶失活靶标基因
在非诱导条件下，将TnpB优化质粒系统(S57R)通过结合转移方式转入S.coelicolor A3(2)中，如步骤2.2。约5天后，随机挑取具有抗性的结合子，划线接种到带有质粒抗性抗生素(50ng/mL安普霉素)以及硫链丝菌素(0.5μg/mL)的ISP2固体培养基上，倒置，30℃培养，观察色素分泌。本发明实施例以放线紫红素合成的关键基因SCO5087(actI)为细胞内源基因靶点，当该靶基因突变后，S.coelicolor A3(2)无法分泌蓝色素。采用菌落PCR或全基因组重测序相结合的方式对靶标基因检测，判断随机挑选的结合子是否被编辑，详见实施例3。工程化TnpB核酸酶(TnpB(S57V))失活靶标基因结果展示见图4；靶标基因突变的菌株于上述抗性平板中培养2周，均未见蓝色素分泌，进一步说明工程化TnpB系统结合链霉菌自身非同源末端连接(NHEJ)的修复方式于靶位点附近发生基因删除或基因敲入、置换，造成靶标基因移码突变，从而使得靶标基因失活。
实施例5：各实施涉及的各类培养基
LB培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，溶于1L ddH2O，115℃灭菌30分钟后，室温储藏备用。若配置固体培养基，额外加入2％琼脂粉；
MS培养基：称取10g黄豆饼粉、10g胰蛋白胨、10g琼脂粉，溶于500mL自来水，115℃灭菌30分钟；
ISP2培养基：称取10g麦芽提取物、4g酵母提取物、4g葡萄糖，溶于1L ddH2O，调节pH至7.4,115℃灭菌30分钟，4℃贮藏备用，若配置固体培养基，额外加入2％琼脂粉；
2×YT培养基：称取16g胰蛋白胨、10g麦芽提取物、5g氯化钠，溶于1L ddH2O，调节pH至7.0，115℃灭菌30分钟，4℃贮藏备用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种用于链霉菌迷你基因编辑系统的工程化TnpB核酸酶，其特征在于，所述工程化TnpB核酸酶相对于具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的TnpB核酸酶具有氨基酸差异。
2.如权利要求1所述的工程化TnpB核酸酶，其特征在于，所述氨基酸差异位于如SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的第188位、217位、第125位、第179位、第388位、第27位、第25位、第8位、第240位、第208位、第96位、第279位、第254位、第110位、第267位、第286位、第186位、第356位、第162位、第210位、第332位、第385位、第9位、第200位、第111位、第333位、第57位中的一位。
3.如权利要求1或2所述的工程化TnpB核酸酶，其特征在于，所述工程化TnpB核酸酶在如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列上具有以下突变中一种：A188V、S217K、N125G、Y179P、Y388A、S27C、L25F、V8K、G240R、H208K、T96R、H279T、V254S、R110K、S267R、R286L、F186K、E356A、I162N、Q210N、H332S、H385C、V9Y或V9F、V200L、K111S、D333V、S57R。
4.一种链霉菌迷你基因编辑系统，其特征在于，所述系统包括如权利要求1-3中任一项所述的工程化TnpB核酸酶及reRNA引导盒。
5.如权利要求4所述的链霉菌迷你基因编辑系统，其特征在于，所述reRNA引导盒包含TnpB蛋白的向导RNA碱基序列、基因靶向区段以及丁型肝炎病毒核酶的基因序列。
6.如权利要求5所述的链霉菌迷你基因编辑系统，其特征在于，所述基因靶向区段，位于所述向导RNA碱基序列的3’端，为靶基因上的TAM序列5’TTGAT之后长度为12-40bp的核酸片段。
7.一种如权利要求4-6中任一项所述的链霉菌迷你基因编辑系统的构建方法，其特征在于，所述方法包括构建含有安普霉素抗性筛选标记的基因编辑质粒；所述基因编辑质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，插入所述工程化TnpB核酸酶及其reRNA引导盒。
8.一种重组表达质粒载体，用于表达如权利要求4-6中任一项所述的链霉菌迷你基因编辑系统。
9.一种如权利要求4-6中任一项所述的链霉菌迷你基因编辑系统在基于双链断裂及链霉菌自身修复系统下的链霉菌基因组编辑中的应用。
10.一种适用于链霉菌的基因编辑方法，其特征在于，在非诱导条件下，通过结合转移将如权利要求6-8中任一项所述的链霉菌迷你基因编辑系统转入目的链霉菌宿主中，使所述宿主的靶位点附近发生基因删除或基因敲入、置换，造成移码突变，进而使得靶标基因失活。
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