CN120683099A - 一种用于链霉菌的高效基因编辑系统及其构建方法和应用 - Google Patents

一种用于链霉菌的高效基因编辑系统及其构建方法和应用

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Abstract

本发明公开了一种用于链霉菌的高效基因编辑系统及其构建方法和应用；所述系统包括可在链霉菌中表达的TnpB核酸酶及向导RNA，该向导RNA包含RNA骨架、基因靶向区段以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶的基因序列。其中，基因靶向区段位于所述RNA骨架的3’端，为靶基因上的TAM序列(5’TTGAT)之后长度为12‑40bp的核酸片段；丁型肝炎病毒(HDV)核酶用于稳定RNA骨架‑基因靶向区段结构。本发明提供的链霉菌迷你基因编辑工具，在同源修复模版存在的情况下，在链霉菌中可达到70‑100％的基因编辑效率，其中在理性设计后的向导RNA作用下的基因编辑效率可达100％。

Description

一种用于链霉菌的高效基因编辑系统及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种用于链霉菌的高效基因编辑系统及其构建方法和应用。特别是涉及一种优化的向导RNA、TnpB基因编辑系统及其构建方法和在链霉菌中的应用。本发明通过优化TnpB系统的向导RNA，系统开发了新型的、适用于链霉菌的迷你基因编辑工具。本发明的链霉菌迷你基因编辑工具，可实现对链霉菌体内基因组的精准、高效编辑，具有极大的推广应用价值。
背景技术
链霉菌属(Streptomyces)是放线菌中最大的一个属，因其能产生大量有价值的活性次级代谢产物且其基因组中还含有丰富的沉默生物合成基因簇，被认为是极具开发价值的类群。从基因组信息出发，基于合成生物学理念的“自下而上”的高效高通量开发新型活性次级代谢产物是当前天然产物药物研发的主流思路，而其关键在于拥有高效、精准、便捷的遗传操作体系。然而，链霉菌因其基因组较大(8-10Mb)且GC含量降高(普遍GC含量超过70％)，相较于其它微生物，对其进行基因编辑等遗传操作十分困难，遗传操作手段十分有限。
随着CRISPR-Cas基因编辑系统的发展及其在链霉菌中的应用，很大程度上缓解了链霉菌基因编辑费时低效的问题，有效打破链霉菌领域内缺少高效遗传操作的瓶颈，成为目前适用于链霉菌的主要基因编辑工具，实现对链霉菌基因组的高效精准基因编辑，在探索链霉菌新的次生代谢物、提高次级代谢产量、改造代谢途径等方面得到很好应用。然而，当前基于CRISPR-Cas系统的基因编辑仍存在许多问题有待解决，比如Cas9或Cas12a蛋白的氨基酸数量均超过1000，也就是说编码这种效应蛋白的核苷酸(对)数量均大于3000，把这么多的核苷酸有效包装进一些递送系统显得又些困难，从而影响质粒构建和转化效率。Cas9/Cas12a体积的庞大，也限制了后续编辑系统的改造空间。
为突破Cas9等蛋白体积大所造成的应用局限性，研究者们从不同方向出发进行了研究和探索：通过系统优化改造CRISPR-Cas系统以克服不足，如改造Cas9、优化引导RNA、使用Cas9直系同源酶等一系列措施；探索应用新型基因编辑技术，如开发prime editing等；开发新型CRISPR系统，挖掘和开发紧凑的CRISPR蛋白，包括CasX(约980个氨基酸)、Cas12f(400-700个氨基酸)、Cas12i(约1000个氨基酸)、Cas12Φ(700-800个氨基酸)、Cas12m(604个氨基酸)、Cas12I(约860个氨基酸)、Casλ(约800个氨基酸)等。TnpB蛋白是近年来在转座子系统中发现的一种可编程的核酸酶，在进化上可能为Cas12的祖先，可通过约150nt的长非编码RNA引导去切割靠近TTGAT 5’端的DNA序列，其体积仅约Cas蛋白的1/3(约400个氨基酸)，备受国内外研究者的关注。到目前为止，TnpB核酸酶已成功应用于人类细胞、小鼠胚胎、单双子叶植物等多物种的内源基因编辑。研究者还对生物体中广泛分布的TnpB核酸酶进行了大规模、系统性挖掘和研究，鉴定到多种具有靶向编辑活性的TnpB。但总体来说，同Cas9相比，TnpB同其它紧凑型基因编辑工具均存在编辑效率低，更重要的是，现有的小型编辑器还没有链霉菌体内进行基因编辑的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于链霉菌的高效基因编辑工具及其构建方法和应用。本发明针对链霉菌中尚缺乏迷你基因编辑工具的现状以及目前迷你基因编辑工具编辑普遍存在效率低的问题，深度分析小体积、可编程的TnpB核酸酶实现基因编辑的核心元件及其作用机理，设计引导TnpB核酸酶实现双链切割的RNA序列，系统开发适用于链霉菌的高效迷你基因编辑工具，进而实现基于双链断裂、定向修复的链霉菌基因组高效精准编辑。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现：
第一方面，本发明提供一种用于引导TnpB蛋白向靶序列移动的向导RNA。所述向导RNA(按照5’到3’端的方向依次)包含RNA骨架、基因靶向区段以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶的基因序列。
在一种实施方式中，所述RNA骨架的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
在一种实施方式中，所述RNA骨架的核苷酸序列为本发明通过对TnpB的向导RNA的深入探究分析，理性设计的一段RNA核苷酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
本发明中，该系统可靶向的基因为TAM序列(5’TTGAT)所在或附近基因。在一种实施方式中，所述基因靶向区段，位于所述RNA骨架的3’端，为靶基因上的TAM序列(5’TTGAT)之后长度为12-40bp的核酸片段。所述丁型肝炎病毒(HDV)核酶用于稳定RNA骨架-基因靶向区段结构。
第二方面，本发明提供一种TnpB介导的链霉菌迷你基因编辑系统；所述系统包括：可在链霉菌中表达的TnpB核酸酶及所述向导RNA。
在一种实施方式中，所述TnpB核酸酶是经过密码子优化可在链霉菌中表达的TnpB核酸酶(同其野生型Deinococcus radiodurans ISDra2来源的TnpB的DNA相似性是79.74％)。所述TnpB核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码所述TnpB核酸酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
第三方面，本发明提供一种重组表达质粒载体，用于表达所述链霉菌迷你基因编辑系统。
第四方面，本发明提供了一种所述链霉菌(高效)迷你基因编辑系统的构建方法，包括如下步骤：
构建包括由含有安普霉素抗性筛选标记的基因敲除/敲入质粒；所述基因敲除/敲入质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，分别插入经密码子优化的TnpB蛋白及其向导RNA、基因敲除/入盒。
在一些实施示例中，将经密码子优化的TnpB蛋白及其向导RNA分别替换链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒上的Cas9和sgRNA片段，获得质粒A；酶切所述质粒A获得线性化质粒B；插入所述基因敲除/入盒，即得所述基因敲除/敲入质粒。
在一种实施方式中，所述基因敲除质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，插入适用于链霉菌的TnpB基因编辑系统(TnpB蛋白及其向导RNA)及基因敲除盒。
在一种实施方式中，基因敲除盒按照基因编辑靶基因的方向依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂和靶基因下游同源臂；靶基因上、下游同源序列用于基因编辑发生时提供同源重组模版。
在一种实施方式中，所述基因敲入质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，插入适用于链霉菌的TnpB基因编辑系统(TnpB蛋白及其向导RNA)及基因敲入盒。
在一种实施方式中，所述基因敲入盒按照基因编辑靶基因的方向依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、插入基因、靶基因下游同源臂。
第五方面，本发明提供一种利用上述链霉菌迷你基因编辑系统在基于双链断裂、定向修复的链霉菌基因组精准编辑中的应用。
第六方面，本发明提供一种利用上述链霉菌迷你基因编辑系统对受体菌链霉菌中目的基因进行基因编辑方法，所述方法包括：
①在非诱导条件下，将利用上述方法构建的基因敲除/入质粒转化进入目的宿主中，通过基因敲除/入盒的同源臂序列与靶基因上下游同源序列的同源交换，实现基因的敲除(入)，通过质粒相关抗性的抗生素筛选，得到携带基因敲除/入质粒的转化子；
②将步骤①中的转化子划线接种到含有质粒抗性抗生素及启动子诱导剂的培养基平板，恒温培养至可见单克隆；
③随机挑选步骤②单克隆，菌落PCR验证得到无痕的基因敲除/入菌株。
在本发明的一些实施方案中，所述启动子诱导剂选自硫链丝菌素。
与现有技术相比，本发明提供的链霉菌迷你基因编辑工具，在同源修复模版存在的情况下，在链霉菌中可达到70-100％的基因编辑效率，其中在理性设计后的向导RNA作用下的基因编辑效率可达100％。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其他特征、目的、优点将会变得更明显：
图1为HpTnpB-reRNA-ZH和HpTnpB-reRNA-ZJ质粒图谱；
图2为理论上靶基因(SCO5087)成功被编辑菌株基因组结构示意图；
图3为本发明TnpB系统(HpTnpB-reRNA-ZJ)对链霉菌内源基因编辑结果展示图(DNA电泳图)；
图4为HpTnpB-reRNA-ZH和HpTnpB-reRNA-ZJ对链霉菌内源基因编辑效率比较；
图5为Sanger测序结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例以链霉菌模式菌株Streptomycin coelicolor A3(2)为靶标菌株，该菌株基因组序列编号：GeneBank：GCA_008931305.1。本发明实施例以上述菌株中放线紫红素合成的关键基因SCO5087(actI)为内源基因靶点，以基因敲除为目标，测试本发明的编辑效率。
实施例1、链霉菌高效迷你基因编辑工具的构建
1.1、质粒设计与构建
所用TnpB基因为密码子优化的TnpB蛋白基因，其根据链霉菌密码子偏好性对TnpB蛋白编码基因进行密码子优化，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。一种向导RNA，命名为reRNA-ZH，按照5’到3’端的方向依次包括以下核心元件：RNA骨架(SEQ ID NO.3)，基因靶向区段(以如前所述的SCO5087为靶点时序列如SEQ IDNO.4)以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶的基因序列(SEQ ID NO.5)，该RNA骨架为文献中报道(https://doi.org/10.1038/s41586-021-04058-1)的一段可引导TnpB于靶标基因附近切割双链DNA的RNA核苷酸序列。另一种向导RNA，命名为reRNA-J，按照5’到3’端的方向依次包括以下核心元件：RNA骨架(SEQ ID NO.6)，基因靶向区段(以如前所述的SCO5087为靶点时序列如SEQ ID NO.4)以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶的基因序列(SEQ ID NO.5)，其RNA骨架(SEQ ID NO.6)为本发明经过理性设计的一段RNA核苷酸序列。上述基因片段均由金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成。
经密码子优化后的TnpB基因及reRNA-ZH分别替换链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pCRISPR-Cas9(https://doi.org/10.1021/acssynbio.5b00038)上的Cas9和sgRNA片段，获得质粒pTnpB-reRNA-ZH。
经密码子优化后的TnpB基因及reRNA-J分别替换链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pCRISPR-Cas9(https://doi.org/10.1021/acssynbio.5b00038)上的Cas9和sgRNA片段，获得质粒pTnpB-reRNA-ZJ。
然后通过SphI核酸内切酶酶切质粒pTnpB-reRNA-ZH和pTnpB-reRNA-ZJ，获得线性化pTnpB-reRNA-ZH和线性化pTnpB-reRNA-ZJ。之后将靶基因的上、下游同源臂组成的基因敲除盒分别与线性化质粒载体pTnpB-reRNA-ZH和pTnpB-reRNA-ZJ进行无缝克隆组装(试剂盒购于：Vazyme，ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)，获得质粒HpTnpB-reRNA-ZH(质粒质谱图如图1)以及HpTnpB-reRNA-ZJ(质粒谱图如图1)。以如前所述的SCO5087(actI)为内源基因靶点时，上游同源臂序列如SEQ ID NO.7所示，下游同源臂序列如SEQ ID NO.8。本发明对所构建的质粒均进行了Sanger测序，以确保完全正确。
实施例2、链霉菌高效迷你编辑系统的应用
2.1、转化
将目的质粒转入E.coli ET12567/pUZ8002(https://doi.org/10.1016/0378-1119(92)90549-5)，具体方法如下：取200ng质粒HpTnpB-reRNA-ZH或HpTnpB-reRNA-ZJ分别加入到100μL已解冻的自制感受态细胞E.coli ET12567/pUZ8002中，轻弹管壁混匀；冰上静置30分钟后，42℃水浴45秒，然后立即置于冰上2-3分钟；随后加入无抗LB液体培养基，200rpm，37℃培养1小时；然后5000rpm离心5分钟，弃掉900μL上清；将菌体重悬于剩余培养基中，加到含有25μg/mL卡那霉素、12.5μg/mL氯霉素和50μg/mL安普霉素的LB固体平板上并用无菌涂布棒轻轻涂匀；37℃过夜培养后，挑取单克隆至20mL卡那霉素(25μg/mL)、氯霉素(12.5μg/mL)和安普霉素(50μg/mL)的LB培养基培养，培养OD600约0.4时，5000rpm离心5分钟收集菌体；加入20mL无抗的LB液体培养基，5000rpm离心5分钟，弃上清，该步重复两次；最后用2mL LB液体培养基重悬菌。
2.2、结合转移与抗性筛选
在非诱导条件下，将步骤2.1中的质粒经结合转移进入Streptomyces coelicolorA3(2)中，具体方法如下：取事先收集的链霉菌孢子，5000rpm离心5分钟，弃上清，用2mL2×YT液体培养基重悬菌体，将装有孢子的离心管置于50℃水浴锅中热激10分钟，接着在200rpm，30℃摇床中预萌发30分钟；取500μL步骤2.1收集的E.coli菌液于含有200μL链霉菌孢子悬浮液的1.5mL离心管中，斡旋混匀；取200μL混合液，均匀涂布于MS平板上；将MS平板倒置于30℃培养箱中培养，18小时后加入1mL抗生素预混液(1mg/mL安普霉素和1mg/mL萘啶酮酸浓度)，待表面干燥后，继续将MS平板倒置于30℃培养至长出结合子(约5天左右)。此时，得到的便是成功编辑的结合子。
实施例3、基因编辑效率评估
随体挑取步骤2.2中的单克隆，划线接种到带有25μg/mL安普霉素及0.5μg/mL硫链丝菌素的ISP2固体培养基上，倒置，30℃恒温培养至可见菌体；挑取少量菌体至含有20μLDMSO的PCR管后，置于100℃，15分钟后于-20℃冷藏30分钟，该步重复两次以充分裂解细胞，获得细胞裂解液；接着采用诺唯赞2×Phanta Flash Master Mix(货号：P510-01)试剂盒PCR扩增靶向位点片段，引物设计如表1所示，PCR反应体系如表2所示，PCR反应程序如表3所示。
表1以SCO5087(actI)为目标靶点的PCR扩增引物
编号 引物 序列(5’-3’)
SEQ ID NO.9 SCO5087-LH-F atgattccggaactccggt
SEQ ID NO.10 SCO5087-R accacagcttgcggaact
表2PCR反应体系
体系 15μL
ddH2O 5.25μL
正向引物(10μM，SCO5087-LH-F) 0.75μL
反向引物(10μM，SCO5087-R) 0.75μL
2×Phanta Flash Master Mix 7.50μL
细胞裂解液(含DMSO) 0.75μL
表3 PCR反应程序
将上述PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，部分结果如图3所示，图3中1-21分别代表含有HpTnpB-reRNA-ZJ质粒的E.coli同S.coelicolor A3(2)结合转移后随机挑取的不同的单克隆。含有同源重组修复模版的质粒HpTnpB-reRNA-ZH或HpTnpB-reRNA-ZJ若成功敲除靶标基因SCO5087(actI)，理论PCR条带大小应为1329 bp(图2)。在抗性固体筛选培养基中长出的随机挑取的菌落经PCR均有PCR产物且大小与理论相符，说明HpTnpB-reRNA-ZH和HpTnpB-reRNA-ZJ质粒均可成功敲除链霉菌模式菌株S.ceolicolor A3(2)中的靶标基因SCO5087(actI)；在未经优化的向导RNA的作用下，该质粒系统(HpTnpB-reRNA-ZH)对靶标基因的敲除效率为69.5％，而优化向导RNA的作用下，质粒系统(HpTnpB-reRNA-ZJ)基因敲除效率高达100％(图4)，说明优化向导RNA序列后，显著提高质粒系统的敲除效率。同源重组是实现基因敲除和基因敲入的主要方法之一，均通过外源DNA片段(即靶基因上、下游同源臂)与目标基因组上的同源序列，在体内发生重组反应，从而实现对目标基因的敲除或替换(即将外源基因插入到目的基因的位置，从而实现基因敲入)。介于基因敲入同基因敲除均基于同源重组的机理，证实本发明的超迷你基因编辑器也适用于敲除/入其它靶标基因。
随后利用唯赞质粒纯化试剂盒(货号：DC201)纯化回收上述PCR产物，送于苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger测序分析。测序结果进一步证实凝胶电泳检测结果(图5)。以上结果充分说明，本发明获得的新型超迷你基因编辑器HpTnpB-reRNA-ZJ可以有效介导链霉菌基因组编辑。
实施例4、各实施涉及的各类培养基
LB培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，溶于1L ddH2O，115℃灭菌30分钟后，室温储藏备用。若配置固体培养基，额外加入2％琼脂粉；
MS培养基：称取10g黄豆饼粉、10g胰蛋白胨、10g琼脂粉，溶于500mL自来水，115℃灭菌30分钟；
ISP2培养基：称取10g麦芽提取物、4g酵母提取物、4g葡萄糖，溶于1L ddH2O，调节pH至7.4,115℃灭菌30分钟，4℃贮藏备用，若配置固体培养基，额外加入2％琼脂粉；
2×YT培养基：称取16g胰蛋白胨、10g麦芽提取物、5g氯化钠，溶于1L ddH2O，调节pH至7.0，115℃灭菌30分钟，4℃贮藏备用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种用于引导TnpB蛋白向靶序列移动的向导RNA，其特征在于，所述向导RNA包含RNA骨架、基因靶向区段以及丁型肝炎病毒核酶的基因序列；所述RNA骨架的核苷酸序列为SEQID NO.3或SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的向导RNA，其特征在于，所述基因靶向区段，位于所述RNA骨架的3’端，为靶基因上的TAM序列5’TTGAT之后长度为12-40bp的核酸片段。
3.一种TnpB介导的链霉菌迷你基因编辑系统，其特征在于，所述系统包括可在链霉菌中表达的TnpB核酸酶及如权利要求1或2所述的向导RNA。
4.如权利要求3所述的链霉菌迷你基因编辑系统，其特征在于，所述TnpB核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.一种重组表达质粒载体，其特征在于，用于表达如权利要求3或4所述的链霉菌迷你基因编辑系统。
6.一种如权利要求3或4所述的链霉菌迷你基因编辑系统的构建方法，其特征在于，所述方法包括构建含有安普霉素抗性筛选标记的基因敲除/敲入质粒；所述基因敲除/敲入质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，插入所述可在链霉菌中表达的TnpB核酸酶及其向导RNA、基因敲除/入盒。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，基因敲除盒按照基因编辑靶基因的方向依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂和靶基因下游同源臂；靶基因上、下游同源序列用于基因编辑发生时提供同源重组模版。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，基因敲入盒按照基因编辑靶基因的方向依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、插入基因、靶基因下游同源臂。
9.一种如权利要求3或4所述的链霉菌迷你基因编辑系统在基于双链断裂、定向修复的链霉菌基因组精准编辑中的应用。
10.一种利用如权利要求3或4所述的链霉菌迷你基因编辑系统对受体菌链霉菌中目的基因进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、在非诱导条件下，将利用如权利要求6所述方法构建得到的基因敲除/入质粒转化进入目的宿主中，通过基因敲除/入盒的同源臂序列与靶基因上下游同源序列的同源交换，实现基因的敲除/入，通过质粒相关抗性的抗生素筛选，得到携带基因敲除/入质粒的转化子；
S2、将所述转化子划线接种到含有质粒抗性抗生素及启动子诱导剂的培养基，恒温培养至可见单克隆；
S3、随机挑选步骤S2中单克隆，菌落PCR验证得到无痕的基因敲除/入菌株。
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