CN120683080A - 一种工程化TnpB核酸酶及其编辑系统和应用 - Google Patents

一种工程化TnpB核酸酶及其编辑系统和应用

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Abstract

本发明公开了一种工程化TnpB核酸酶及其编辑系统和应用。本发明的工程化TnpB核酸酶相对于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型TnpB核酸酶进行了氨基酸位点的定点突变，所述工程化TnpB核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还公开了一种向导RNA、包含所述工程化TnpB核酸酶和向导RNA的链霉菌迷你基因编辑系统、表达编辑系统的重组表达质粒、编辑系统的构建方法，以及编辑系统在介导链霉菌迷你基因编辑系统中的应用。本发明经工程化改造后的TnpB核酸酶，结合向导RNA所形成的链霉菌迷你基因编辑系统，能够对链霉菌在5’‑TTGAT序列附近进行高效的基因编辑，极大地提升编辑效率。

Description

一种工程化TnpB核酸酶及其编辑系统和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种工程化的TnpB核酸酶及其编辑系统和应用。
背景技术
链霉菌属(Streptomyces)是放线菌中最大的一个属，因其能产生大量有价值的活性次级代谢产物且其基因组中还含有丰富的沉默生物合成基因簇，被认为是极具开发价值的类群。从基因组信息出发，基于合成生物学理念的“自下而上”的高效高通量开发新型活性次级代谢产物是当前天然产物药物研发的主流思路，而其关键在于拥有高效、精准、便捷的遗传操作体系。然而，链霉菌因其基因组较大(8-10Mb)且GC含量较高(普遍GC含量超过70％)，相较于其它微生物，对其进行基因编辑等遗传操作十分困难，遗传操作手段十分有限。
随着CRISPR-Cas基因编辑系统的发展及其在链霉菌中的应用，很大程度上缓解了链霉菌基因编辑费时低效的问题，有效打破链霉菌领域内缺少高效遗传操作的瓶颈，成为目前适用于链霉菌的主要基因编辑工具，实现对链霉菌基因组的高效精准基因编辑，在探索链霉菌新的次生代谢物、提高次级代谢产量、改造代谢途径等方面得到很好应用。然而，当前基于CRISPR-Cas系统的基因编辑仍存在许多问题有待解决，比如Cas9或Cas12a蛋白的氨基酸数量均超过1000，也就是说编码这种效应蛋白的核苷酸(对)数量均大于3000，把这么多的核苷酸有效包装进一些递送系统显得又些困难，从而影响质粒构建和转化效率。Cas9/Cas12a体积的庞大，也限制了后续编辑系统的改造空间。
为突破Cas9等蛋白体积大所造成的应用局限性，研究者们从不同方向出发进行了研究和探索：通过系统优化改造CRISPR-Cas系统以克服不足，如改造Cas9、优化引导RNA、使用Cas9直系同源酶等一系列措施；探索应用新型基因编辑技术，如开发prime editing等；开发新型CRISPR系统，挖掘和开发紧凑的CRISPR蛋白，包括CasX(约980个氨基酸)、Cas12f(400-700个氨基酸)、Cas12i(约1000个氨基酸)、Cas12Φ(700-800个氨基酸)、Cas12m(604个氨基酸)、Cas12I(约860个氨基酸)、Casλ(约800个氨基酸)等。TnpB蛋白是近年来在转座子系统中发现的一种可编程的核酸酶，在进化上可能为Cas12的祖先，可通过约150nt的长非编码RNA引导去切割靠近TTGAT 5’端的DNA序列，其体积仅约Cas蛋白的1/3(约400个氨基酸)，备受国内外研究者的关注。到目前为止，TnpB核酸酶已成功应用于人类细胞、小鼠胚胎、单双子叶植物等多物种的内源基因编辑。研究者还对生物体中广泛分布的TnpB核酸酶进行了大规模、系统性挖掘和研究，鉴定到多种具有靶向编辑活性的TnpB。
发明内容
本发明针对链霉菌中尚缺乏迷你基因编辑工具的现状，深度分析小体积、可编程的TnpB核酸酶实现基因编辑的核心元件及其作用机理，系统性挖掘潜在的TnpB核酸酶，经工程化改造，实现对目标双链进行切割，系统开发适用于链霉菌的高效迷你基因编辑工具，进而实现链霉菌基因组高效精准编辑。本发明的目的在于提供一种工程化TnpB核酸酶及其编辑系统和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供一种适用于链霉菌的工程化TnpB核酸酶，所述工程化TnpB核酸酶相对于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型TnpB核酸酶具有包括第41位、第42位、第44位、第45位、第46位、第50位、第51位、第53位、第54位、第56位、第57位、第58位、第64位、第65位、第67位、第69位、第72位、第81位、第84位、第85位、第88位、第91位、第97位、第99位的氨基酸位点突变。
作为本发明的一些具体实施方式，所述氨基酸位点突变包括：E41A、S42A、R44K、Q45E、D46S、M50L、I51T、A53G、A54Q、D56S、K57S、A58E、R64Q、E65A、G67E、A69S、Q81N、R84K、D85N、R88T、Q91K、A97V，K99Q；所述工程化TnpB核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的一些具体实施方式，所述工程化TnpB核酸酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
作为本发明的一些具体实施方式，所述野生型TnpB核酸酶是经过密码子优化可在链霉菌中表达的TnpB核酸酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供一种工程化TnpB核酸酶介导的链霉菌迷你基因编辑系统，包括上述任一项所述的工程化TnpB核酸酶，以及向导RNA。
作为本发明的一些具体实施方式，所述向导RNA包括RNA骨架、基因靶向区段以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶；用于引导工程化TnpB核酸酶向靶序列移动。
作为本发明的一些具体实施方式，所述RNA骨架为本发明理性设计的一段RNA核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述基因靶向区段位于所述RNA骨架的3’端，为靶基因上的TAM序列(5’-TTGAT)之后长度为12-40bp的核酸片段；所述丁型肝炎病毒(HDV)核酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，用于稳定RNA骨架-基因靶向区段结构。
第三方面，本发明提供一种重组表达质粒载体，用于表达上述所述的链霉菌迷你基因编辑系统。
第四方面，本发明提供一种链霉菌迷你基因编辑系统的构建方法，包括：构建由含有安普霉素抗性筛选标记的基因编辑质粒，所述基因编辑质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，插入所述工程化TnpB核酸酶以及所述向导RNA构建而来。
第五方面，本发明提供一种链霉菌迷你基因编辑系统在介导链霉菌基因编辑中的应用。
作为本发明的一些具体实施方式，采用所述链霉菌迷你基因编辑系统对链霉菌进行基因编辑的方法包括如下步骤：
S1、在非诱导条件下，将基因编辑质粒转化进入目的宿主中，通过链霉菌体内自身的DNA修复机制，实现对目的基因的编辑，通过质粒相关抗性的抗生素筛选，得到携带基因敲除/入质粒的转化子；
S2、将步骤S1中的转化子划线接种到含有质粒抗性抗生素及启动子诱导剂的培养基平板，恒温培养至可见单克隆；
S3、随机挑选步骤S2中的单克隆，进行菌落PCR验证得到被编辑的菌株。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供新型工程化TnpB核酸酶，与对应的野生型TnpB相比，经工程化改造后，可在理性设计的向导RNA的作用下，能够识别5’-TTGAT序列并实现对链霉菌体内该序列附近进行高效编辑，具有极大的推广应用价值；
(2)本发明提供一种新型的链霉菌迷你基因编辑工具及其构建方法和应用；在链霉菌中，野生型TnpB对TTGAT附近进行编辑的可能性极低(约8％)，然而经工程化改造后的TnpB作用下的基因编辑效率显著提高，可达到41％。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1中构建的pSTAGE-TnpB*/ωRNA*与pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*的质粒图谱；其中，左图为pSTAGE-TnpB*/ωRNA*的质粒图谱，右图为pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*的质粒图谱；
图2为采用pSTAGE-TnpB*/ωRNA*对链霉菌进行内源基因编辑后随机挑选的部分单克隆的PCR电泳结果图；
图3为采用pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*对链霉菌进行内源基因编辑后随机挑选的部分单克隆的PCR电泳结果图；
图4为采用pSTAGE-TnpB*/ωRNA*和pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*对链霉菌进行内源基因编辑的编辑效率比较图；
图5为采用pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*对链霉菌进行内源基因编辑后，部分单克隆的Sanger测序结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例以链霉菌模式菌株Streptomyces coelicolorA3(2)为靶标菌株，该菌株基因组序列编号：GeneBank：GCA_008931305.1。本发明实施例以上述菌株中放线紫红素合成的关键基因SCO5087(actI)为内源基因靶点，以编辑SCO5087为目标，测试本发明的编辑效率。
实施例1、链霉菌高效迷你基因编辑工具的构建
1.1质粒设计与构建
依据链霉菌的密码子偏好性，对Deinococcus radiodurans R1来源的TnpB核酸酶进行密码子优化，命名为野生型TnpB*核酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
对野生型TnpB*核酸酶进行如下位点的定点突变：E41A、S42A、R44K、Q45E、D46S、M50L、I51T、A53G、A54Q、D56S、K57S、A58E、R64Q、E65A、G67E、A69S、Q81N、R84K、D85N、R88T、Q91K、A97V，K99Q，得到工程化TnpB*核酸酶(eTnpB*)。工程化TnpB*核酸酶(eTnpB*)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.4所示。
向导RNA命名为ωRNA*，按照5’到3’端的方向依次包括以下核心元件：RNA骨架(序列如SEQ ID NO.5所示)，基因靶向区段(以SCO5087为靶点时序列为SEQ ID NO.6)以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶(序列如SEQ ID NO.7所示)。
上述基因片段均由金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成。
将上述合成的野生型TnpB*及ωRNA*基因片段分别替换链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pCRISPR-Cas9(https://doi.org/10.1021/acssynbio.5b00038)上的Cas9和sgRNA片段，获得质粒pSTAGE-TnpB*/ωRNA*，如图1中左图所示。
将上述合成的工程化eTnpB*及ωRNA*基因片段分别替换链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pCRISPR-Cas9(https://doi.org/10.1021/acssynbio.5b00038)上的Cas9和sgRNA片段，获得质粒pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*，如图1中右图所示。
对所构建的质粒均进行了Sanger测序，以确保完全正确。
实施例2、链霉菌高效超迷你编辑系统的应用
2.1转化
将实施例1中构建的目的质粒pSTAGE-TnpB*/ωRNA*和pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*分别转入大肠杆菌E.coli ET12567/pUZ8002(https://doi.org/10.1016/0378-1119(92)90549-5)，具体方法如下：
分别取200ng质粒pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*和pSTAGE-TnpB*/ωRNA*加入到100μL已解冻的自制感受态细胞E.coli ET12567/pUZ8002中，轻弹管壁混匀；冰上静置30分钟后，42℃水浴45秒，然后立即置于冰上2-3分钟；随后加入无抗LB液体培养基，200rpm，37℃培养1小时；然后5000rpm离心5分钟，弃掉900μL上清；将菌体重悬于剩余培养基中，加到含有卡那霉素(25μg/mL)、氯霉素(12.5μg/mL)和安普霉素(50μg/mL)的LB固体平板上并用无菌涂布棒轻轻涂匀；37℃过夜培养后，挑取单克隆至20mL含有卡那霉素(25μg/mL)、氯霉素(12.5μg/mL)和安普霉素(50μg/mL)的LB液体培养基培养，培养OD600约0.4时，5000rpm离心5分钟收集菌体；加入20mL无抗的LB液体培养基，5000rpm离心5分钟，弃上清，该步重复两次；最后用2mL LB液体培养基重悬菌。
2.2结合转移与抗性筛选
在非诱导条件下，将步骤2.1中的质粒经结合转移进入天蓝色链霉菌A3(2)中，具体方法如下：
取事先收集的链霉菌孢子，5000rpm离心5分钟，弃上清，用2mL 2×YT液体培养基重悬菌体，将装有孢子的离心管置于50℃水浴锅中热激10分钟，接着在200rpm，30℃摇床中预萌发30分钟；取500μL步骤2.1收集的E.coli菌液于含有200μL链霉菌孢子悬浮液的1.5mL离心管中，斡旋混匀；取200μL混合液，均匀涂布于MS平板上；将MS平板倒置于30℃培养箱中培养，18小时后于培养基表面覆盖安普霉素(1mg)和萘啶酮酸(1mg)，待表面干燥后，继续将MS平板倒置于30℃培养至长出结合子(约5天左右)。此时，得到的便是成功编辑的结合子。
实施例3、基因编辑效率评估
随体挑取步骤2.2中的单克隆，划线接种到带有质粒抗性抗生素以及0.5μg/mL硫链丝菌素的ISP2固体培养基上，倒置，30℃恒温培养至可见菌体；挑取少量菌体至含有20μLDMSO的PCR管后，置于100℃，15分钟后于-20℃冷藏30分钟，该步重复两次以充分裂解细胞，获得细胞裂解液；接着采用诺唯赞2×Rapid Taq Master Mix(货号：P222-01)试剂盒PCR扩增靶向位点片段，引物设计如表1所示，PCR反应体系如表2所示，PCR反应程序如表3所示。
表1以SCO5087(actI)为目标靶点的PCR扩增引物
引物 序列(5’-3’) 编号
T-SCO5087-F GTCGCCTGCTTCGACGCGAT SEQ ID NO.8
T-SCO5087-R CCTCCAGCGGAACGTAGTCG SEQ ID NO.9
表2PCR反应体系
体系 15μL
ddH2O 6.0μL
正向引物(10μM，SCO5087-LH-F) 0.6μL
反向引物(10μM，SCO5087-R) 0.6μL
2×RapidTaqMasterMix 7.5μL
细胞裂解液(含DMSO) 0.3μL
表3 PCR反应程序
将pSTAGE-TnpB*/ωRNA*和pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*对Streptomyces coelicolorA3(2)菌株SCO5087基因的编辑结果进行验证，若成功编辑靶标基因SCO5087(actI)，电泳检测时的理论PCR条带大小与野生型Streptomyces coelicolor A3(2)菌株不同或Sanger测序结果不同于野生型。
将随机挑选出的单克隆的PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，其中部分单克隆的检测结果如图2和图3所示。图2中的Lane 1-11和图3中的Lane 1-20分别代表含有pSTAGE-TnpB*/ωRNA*和pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*的E.coli同S.coelicolor A3(2)结合转移后随机挑取的部分单克隆，WT代表未经基因编辑的野生型Streptomyces coelicolor A3(2)菌株。结果显示：随机挑选的抗性菌株中存在与野生型菌株大小不同的PCR条带，并能看出，图3中与野生型菌株条带大小不同的单克隆数量占比明显高于图2。
由于依赖链霉菌自身NHEJ修复系统，编辑后可造成随机片段大小的插入或删除。若随机挑取的单克隆PCR产物的大小不同于野生型，则认为该单克隆是成功被编辑的。如图2中Lane 3和Lane 4，PCR后无产物，则意味着该菌株被成功编辑，可能删除了较大的片段。对PCR后无PCR产物的抗性菌株进行全基因组重测序，测序结果能够证明，PCR后无产物的抗性菌株，其靶标基因SCO5087(actI)的确被成功编辑。
对pSTAGE-TnpB*/ωRNA*和pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*的E.coli同S.coelicolor A3(2)结合转移后随机挑取的全部单克隆的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并对鉴定结果进行统计分析。结果如图4所示，结果表明，pSTAGE-TnpB*/ωRNA*编辑组有8.3％的单克隆，其靶标基因SCO5087被成功编辑，而pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*编辑组，靶标基因SCO5087被成功编辑的单克隆达到了41.0％的占比，相比于pSTAGE-TnpB*/ωRNA*基因编辑效率明显提高，进一步证明pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*质粒可高效编辑链霉菌模式菌株S.ceolicolorA3(2)中的靶标基因SCO5087(actI)。
利用唯赞质粒纯化试剂盒(货号：DC201)纯化回收PCR产物，送于苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger测序分析，抗性菌株#4、#13、#29的Sanger测序结果展示在图5中(抗性菌株#4和#13分别对应图3中的Lane 4和Lane 13)，图5的测序结果进一步表明，相比于野生型菌株，抗性菌株的靶标基因SCO5087被成功编辑。
以上结果充分说明，本发明获得的新型迷你基因编辑器pSTAGE-eTnpB*/ωRNA*可以有效介导链霉菌基因组编辑，经工程化改造后的TnpB*核酸酶及其链霉菌迷你基因编辑系统能够大大提高对TTGAT附近进行基因编辑效率。
上述各实施例所用的培养基如下所示：
LB培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，溶于1L ddH2O，115℃灭菌30分钟后，室温储藏备用。若配置固体培养基，额外加入2％琼脂粉；
MS培养基：称取10g黄豆饼粉、10g胰蛋白胨、10g琼脂粉，溶于500mL自来水，115℃灭菌30分钟；
ISP2培养基：称取10g麦芽提取物、4g酵母提取物、4g葡萄糖，溶于1LddH2O，调节pH至7.4，115℃灭菌30分钟，4℃贮藏备用，若配置固体培养基，额外加入2％琼脂粉；
2×YT培养基：称取16g胰蛋白胨、10g麦芽提取物、5g氯化钠，溶于1L ddH2O，调节pH至7.0，115℃灭菌30分钟，4℃贮藏备用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种适用于链霉菌的工程化TnpB核酸酶，其特征在于，所述工程化TnpB核酸酶相对于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型TnpB核酸酶具有包括第41位、第42位、第44位、第45位、第46位、第50位、第51位、第53位、第54位、第56位、第57位、第58位、第64位、第65位、第67位、第69位、第72位、第81位、第84位、第85位、第88位、第91位、第97位、第99位的氨基酸位点突变。
2.根据权利要求1所述的工程化TnpB核酸酶，其特征在于，所述氨基酸位点突变包括：E41A、S42A、R44K、Q45E、D46S、M50L、I51T、A53G、A54Q、D56S、K57S、A58E、R64Q、E65A、G67E、A69S、Q81N、R84K、D85N、R88T、Q91K、A97V，K99Q；所述工程化TnpB核酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的工程化TnpB核酸酶，其特征在于，所述工程化TnpB核酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种工程化TnpB核酸酶介导的链霉菌迷你基因编辑系统，其特征在于，包括如权利要求1-3中任一项所述的工程化TnpB核酸酶，以及向导RNA。
5.根据权利要求4所述的链霉菌迷你基因编辑系统，其特征在于，所述向导RNA包括RNA骨架、基因靶向区段以及丁型肝炎病毒核酶。
6.根据权利要求5所述的链霉菌迷你基因编辑系统，其特征在于，所述RNA骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述基因靶向区段位于所述RNA骨架的3’端，且为靶基因上的TAM序列之后长度为12-40bp的核酸片段；所述丁型肝炎病毒核酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
7.一种重组表达质粒载体，其特征在于，用于表达如权利要求4所述的链霉菌迷你基因编辑系统。
8.一种如权利要求4所述的链霉菌迷你基因编辑系统的构建方法，其特征在于，包括：构建含有安普霉素抗性筛选标记的基因编辑质粒，所述基因编辑质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，插入所述工程化TnpB核酸酶以及所述向导RNA构建而来。
9.一种如权利要求4所述的链霉菌迷你基因编辑系统在介导链霉菌基因编辑中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述介导链霉菌基因编辑的方法包括如下步骤：
S1、在非诱导条件下，将基因编辑质粒转化进入目的宿主中，通过链霉菌体内自身的DNA修复机制，及质粒相关抗性的抗生素筛选，得到携带基因敲除/入质粒的转化子；
S2、将步骤S1中的转化子划线接种到含有质粒抗性抗生素及启动子诱导剂的培养基平板，恒温培养至可见单克隆；
S3、随机挑选步骤S2中的单克隆，进行菌落PCR验证得到被编辑的菌株。
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