CN120683079A - 一种链霉菌dna大片段删除工具及其重组质粒和应用 - Google Patents

一种链霉菌dna大片段删除工具及其重组质粒和应用

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Abstract

本发明公开了一种链霉菌DNA大片段删除工具及其重组质粒和应用，链霉菌DNA大片段删除工具包括TnpB核酸酶、向导RNA以及DNA大片段删除盒。DNA大片段删除盒包括靶向DNA大片段上游同源臂和靶向DNA大片段下游同源臂；靶向DNA大片段上、下游同源序列长度分别为1.5‑10kb。本发明还公开了包括该链霉菌DNA大片段删除工具的重组质粒、链霉菌DNA大片段删除工具或重组质粒在链霉菌DNA大片段敲除中的应用，以及链霉菌DNA大片段的敲除方法。本发明将同源重组系统与高效TnpB迷你基因编辑系统相结合，可实现对链霉菌DNA大片段的精准、高效编辑，具有极大的推广应用价值。

Description

一种链霉菌DNA大片段删除工具及其重组质粒和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种链霉菌DNA大片段删除工具及其重组质粒和应用。
背景技术
微生物基因组DNA大片段编辑是基因组精简、代谢途径优化及基因研究的重要技术手段。链霉菌属(Streptomyces)是放线菌中最大的一个属，因其能产生大量有价值的活性次级代谢产物且其基因组中还含有丰富的沉默生物合成基因簇，被认为是极具开发价值的类群。然而，链霉菌因其基因组较大(8-10Mb)且GC含量较高(普遍GC含量超过70％)，相较于其它微生物，对其进行基因编辑等遗传操作十分困难，遗传操作手段十分有限，特别是在进行基因组大片段编辑时，缺乏有效的工具。
TnpB蛋白是近年来在转座子系统中发现的一种可编程的核酸酶，在进化上可能为Cas12蛋白的祖先，可通过约231nt的长非编码RNA引导去切割靠近TTGAT 5’端的DNA序列，其体积仅约Cas蛋白的1/3(约400个氨基酸)，备受国内外研究者的关注。到目前为止，TnpB核酸酶已成功应用于人类细胞、小鼠胚胎、单双子叶植物等多物种的内源基因编辑。研究者还对生物体中广泛分布的TnpB核酸酶进行了大规模、系统性挖掘和研究，鉴定到多种具有靶向编辑活性的TnpB。但总体来说，同Cas9相比，TnpB同其它紧凑型基因编辑工具均存在编辑效率低的问题，更重要的是，现有的小型编辑器还没有链霉菌体内进行基因编辑的报道。
专利CN113528408B公开了一种基于CRISPR-nCas3系统的高效基因组大片段删除方法及应用，主要应用于运动发酵单胞菌及类似细胞，运动发酵单胞菌及类似菌与链霉菌在生理特性等方面存在显著差异，运动发酵单胞菌及类似菌为革兰氏阴性菌，基因组较小(～2-3Mbp)，而链霉菌为革兰氏阳性菌，基因组较大(～8-12Mbp)，GC含量高达70％以上，且具有多拷贝基因与重复序列。将基于CRISPR-nCas3的大片段删除技术应用于链霉菌基因组编辑存在显著挑战，需克服递送效率、基因组复杂性及遗传工具兼容性等多重障碍，导致其在链霉菌中应用难度较高。
发明内容
本发明针对链霉菌中尚缺乏基因组大片段编辑工具的现状，深度分析小体积、可编程的TnpB核酸酶实现基因编辑的核心元件及其作用机理，利用TnpB系统和同源重组系统，开发适用于链霉菌的高效大片段基因编辑工具，从而实现对链霉菌大片段基因区的高效编辑，为在链霉菌中开展基础研究与应用研究提供一套强大的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展。
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种链霉菌DNA大片段删除工具及其重组质粒和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供了一种基于TnpB系统的链霉菌DNA大片段删除工具，包括：TnpB核酸酶、向导RNA以及DNA大片段删除盒。
作为本发明的一些具体实施方式，所述DNA大片段删除盒按照编辑靶向DNA大片段的方向依次包括以下核心元件：靶向DNA大片段上游同源臂和靶向DNA大片段下游同源臂；靶向DNA大片段上、下游同源序列用于DNA大片段删除时提供同源重组修复模板，其中所述靶向DNA大片段上、下游同源序列长度分别为1.5-10kb。
作为本发明的一些具体实施方式，所述向导RNA包括RNA骨架、靶向区段以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶。
作为本发明的一些具体实施方式，所述RNA骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述靶向区段位于所述RNA骨架的3’端，为靶向基因大片段上的TAM序列(5’TTGAT)之后长度为12-40nt的核酸序列；所述丁型肝炎病毒(HDV)核酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，用于稳定RNA骨架-基因靶向区段结构。
作为本发明的一些具体实施方式，所述TnpB核酸酶是经过密码子优化可在链霉菌中表达的TnpB核酸酶，同其野生型Deinococcus radiodurans ISDra2来源的TnpB的DNA相似性是79.74％；所述TnpB核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
第二方面，本发明提供一种重组质粒，包括上述一项所述的链霉菌DNA大片段删除工具。所述重组质粒为含有安普霉素抗性筛选标记的链霉菌DNA大片段删除质粒。
作为本发明的一些具体实施方式，所述重组质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，分别插入TnpB核酸酶、向导RNA，以及DNA大片段删除盒构建而来的。
作为本发明的一些具体实施方式，所述重组质粒的构建方法包括：
S1、将TnpB核酸酶以及向导RNA分别替换链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pCRISPR-Cas9上的Cas9和sgRNA片段，获得质粒pTnpB-reRNA；
S2、通过SphI核酸内切酶酶切质粒pTnpB-reRNA，获得线性化pTnpB-reRNA；
S3、将DNA大片段删除盒与线性化质粒载体pTnpB-reRNA进行无缝克隆组装，获得质粒pSTAGE-BGC。
第三方面，本发明提供一种如上述任一项所述的链霉菌DNA大片段删除工具或重组质粒在链霉菌DNA大片段敲除中的应用。
第四方面，本发明提供一种链霉菌DNA大片段的敲除方法，包括如下步骤：
A1、在非诱导条件下，将上述任一项所述的重组质粒转化进入目的宿主中，通过DNA大片段删除盒的同源臂序列与靶向DNA大片段上下游同源序列的同源交换，实现DNA大片段删除，通过质粒相关抗性的抗生素筛选，得到携带DNA大片段删除质粒的转化子；
A2、将步骤A1中的转化子划线接种到含有质粒抗性抗生素及启动子诱导剂的培养基平板，恒温培养至可见单克隆；
A3、随机挑选步骤A2中的单克隆，进行菌落PCR验证得到无痕的DNA大片段敲除菌株。
本发明将TnpB核酸酶与同源重组修复系统结合，单次操作可删除10kb以上基因簇。相比Cas9等，其小型化结构(～400aa)更适配链霉菌的转化瓶颈；reRNA依赖的靶向机制可精准识别链霉菌基因组高AT的TAM序列，避免CRISPR系统的脱靶风险。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)将同源重组系统与高效TnpB迷你基因编辑系统相结合，系统开发了新型的、适用于链霉菌DNA的大片段删除工具；
2)本发明的链霉菌DNA大片段删除工具，可实现对链霉菌DNA大片段的精准、高效编辑，具有极大的推广应用价值；
3)本发明的链霉菌DNA大片段删除工具，可实现对链霉菌大片段基因区的高效编辑，为在链霉菌中开展基础研究与应用研究提供一套强大的工具，促进代谢工程、系统生物学及合成生物学的发展；
4)本发明聚焦在首次将TnpB核酸酶与同源重组修复系统结合，单次操作可删除10kb以上基因簇，相比Cas9等，其小型化结构(～400aa)更适配链霉菌的转化瓶颈；reRNA依赖的靶向机制可精准识别链霉菌基因组高AT的TAM序列，避免CRISPR系统的脱靶风险。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1构建的pSTAGE-BGC质粒图谱；
图2为实施例3中随机挑选的含有质粒pSTAGE-BGC-1.0kb、pSTAGE-BGC-1.5kb、pSTAGE-BGC-2.0kb及pSTAGE-BGC-2.5kb的单克隆编辑菌株在培养14天后的色素分泌结果图；
图3为实施例3放线紫红素合成基因簇成功被删除的菌株理论基因组的示意图；
图4为实施例3中采用pSTAGE-BGC-1.0对放线紫红素合成基因簇进行删除的部分单克隆的DNA电泳结果展示图；
图5为实施例3中采用pSTAGE-BGC-1.5kb对放线紫红素合成基因簇进行删除的部分单克隆的DNA电泳结果展示图；
图6为实施例3中采用pSTAGE-BGC-1.5kb成功敲除链霉菌模式菌株S.ceolicolorM145中靶标基因大片段的部分单克隆的Sanger测序结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例以链霉菌模式菌株Streptomyces coelicolorM145为靶标菌株，该菌株基因组序列编号：GeneBank：GCA_008931305.1。本发明实施例以上述菌株中放线紫红素合成的关键基因SCO5087(actI)为内源基因靶点，以删除放线紫红素合成基因簇为目标，测试本发明的编辑效率。
实施例1、链霉菌DNA大片段删除工具的构建
1.1质粒设计与构建
依据链霉菌的密码子偏好性，对Deinococcus radiodurans ISDra2来源的TnpB核酸酶进行密码子优化，优化后的TnpB核酸酶同其Deinococcus radiodurans ISDra2野生型来源的TnpB核酸酶的DNA相似性是79.74％，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
向导RNA命名为reRNA，按照5’到3’端的方向依次包括以下核心元件：RNA骨架(序列如SEQ ID NO.3)，基因靶向区段(以如上所述的SCO5087基因为靶点时序列如SEQIDNO.4)以及丁型肝炎病毒(HDV)核酶(序列如SEQ ID NO.5)。上述基因片段均由金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成。
使用经密码子优化后的TnpB核酸酶和reRNA-ZH分别替换链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pCRISPR-Cas9(https://doi.org/10.1021/acssynbio.5b00038)上的Cas9和sgRNA片段，获得质粒pTnpB-reRNA。
然后通过SphI核酸内切酶酶切质粒pTnpB-reRNA，获得线性化pTnpB-reRNA。之后将靶基因的上、下游同源臂组成的基因敲除盒分别与线性化质粒载体pTnpB-reRNA进行无缝克隆组装(试剂盒购于：Vazyme，ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)，获得质粒pSTAGE-BGC(质粒图谱如图1所示)。
本发明以放线紫红色合成的关键基因SCO5087(actI)为内源基因靶点，设计并构建了上、下游同源臂约为1.0kb、1.5kb、2.0kb、2.5kb的质粒pSTAGE-BGC，分别命名为pSTAGE-BGC-1.0kb、pSTAGE-BGC-1.5kb、pSTAGE-BGC-2.0kb、pSTAGE-BGC-2.5kb，用于敲除放线紫红素合成基因簇(17.4kb)。其中，长度约为1.0kb的上游同源臂序列如SEQ ID NO.6所示，长度约为1.0kb的下游同源臂序列如SEQ ID NO.7所示；长度约为1.5kb的上游同源臂序列如SEQ ID NO.8所示，长度约为1.5kb的下游同源臂序列如SEQ ID NO.9；长度约为2.0kb的上游同源臂序列如SEQ ID NO.10所示，长度约为2.0kb的下游同源臂序列如SEQ IDNO.11所示；长度约为2.5kb的上游同源臂序列如SEQ ID NO.12所示，长度约为2.5kb的下游同源臂序列如SEQ ID NO.13。对所构建的质粒均进行了Sanger测序，以确保完全正确。
实施例2、链霉菌高效超迷你编辑系统的应用
2.1、转化
将实施例1中构建的目的质粒转入大肠杆菌E.coli ET12567/pUZ8002(https://doi.org/10.1016/0378-1119(92)90549-5)感受态细胞中进行质粒扩增，具体方法如下：
取200ng质粒加至100μL已解冻的自制感受态细胞E.coli ET12567/pUZ8002中，轻弹管壁混匀；冰上静置30分钟后，42℃水浴45秒，然后立即置于冰上2-3分钟；随后加入无抗LB液体培养基，200rpm，37℃培养1小时；然后5000rpm离心5分钟，弃掉900μL上清；将菌体重悬于剩余培养基中，加到含有卡那霉素(25μg/mL)、氯霉素(12.5μg/mL)和安普霉素(50μg/mL)的LB固体平板上并用无菌涂布棒轻轻涂匀；37℃过夜培养后，挑取单克隆至20mL含有25μg/mL卡那霉素、12.5μg/mL氯霉素和50μg/mL安普霉素的LB液体培养基培养，培养OD600约0.4时，5000rpm离心5分钟收集菌体；加入20mL无抗的LB液体培养基，5000rpm离心5分钟，弃上清，该步重复两次；最后用2mL LB液体培养基重悬菌。
2.2、结合转移与抗性筛选
在非诱导条件下，将步骤2.1大肠杆菌中的质粒经结合转移进入天蓝色链霉菌M145(即Streptomyces coelicolor M145)中，具体方法如下：
取事先收集的链霉菌孢子，5000rpm离心5分钟，弃上清，用2mL 2×YT液体培养基重悬菌体，将装有孢子的离心管置于50℃水浴锅中热激10分钟，接着在200rpm，30℃摇床中预萌发30分钟；取500μL步骤2.1收集的E.coli菌液于含有200μL链霉菌孢子悬浮液的1.5mL离心管中，斡旋混匀；取200μL混合液，均匀涂布于MS平板上；将MS平板倒置于30℃培养箱中培养，18小时后于培养基表面覆盖1mg/mL安普霉素和1mg/mL萘啶酮酸，待表面干燥后，继续将MS平板倒置于30℃培养至长出结合子(约5天左右)。此时，得到的便是成功编辑的结合子。
实施例3、基因编辑效率评估
随机挑取步骤2.2中得到的单克隆，划线接种到带有质粒抗性抗生素(50μg/mL安普霉素，100μg/mL萘啶酮酸)以及0.5μg/mL硫链丝菌素的ISP2固体培养基上，倒置，30℃恒温培养14天后观察表型变化，评估不同DNA大片段敲除系统的编辑效率。部分结果如图2所示，图2中从左到右分别代表含有pSTAGE-BGC-1.0kb、pSTAGE-BGC-1.5kb、pSTAGE-BGC-2.0kb以及pSTAGE-BGC-2.5kb质粒的E.coli同S.coelicolor M145结合转移后随机挑取的不同的单克隆。若放线紫红素合成基因簇成功敲除，该突变株则无法合成紫红素，从而导致菌落呈现无色或较浅的颜色。培养14天后，随着同源臂长度的延长，抗性固体筛选培养基中长出的随机挑取的菌落呈现无色或较浅颜色的数量增加，说明pSTAGE-BGC可成功敲除链霉菌模式菌株S.ceolicolor M145中的靶标基因大片段，延长同源臂长度可提高对链霉菌大片段敲除的效率。
随体挑取步骤2.2中的pSTAGE-BGC-1.0kb和pSTAGE-BGC-1.5kb编辑的单克隆，划线接种到带有质粒抗性抗生素(50μg/mL安普霉素，100μg/mL萘啶酮酸)以及0.5μg/mL硫链丝菌素的ISP2固体培养基上，倒置，30℃恒温培养至可见菌体；挑取少量菌体至含有20μLDMSO的PCR管后，置于100℃，15分钟后于-20℃冷藏30分钟，该步重复两次以充分裂解细胞，获得细胞裂解液；接着采用NEBHigh-Fidelity 2X Master Mix(货号：M0492)试剂盒PCR扩增靶向位点片段，引物设计如表1所示，PCR反应体系如表2所示，PCR反应程序如表3所示。
表1以SCO5087(actI)为目标靶点的PCR扩增引物
引物 序列(5’-3’) 序列编号
check-actBGC1.5k-F acgagctgagtcgggacatg SEQ ID NO.14
actBGC-check-R ctgcaacggtgtcagccggc SEQ ID NO.15
表2PCR反应体系
体系 15μL
ddH2O 5.25μL
正向引物(10μM，SCO5087-LH-F) 0.75μL
反向引物(10μM，SCO5087-R) 0.75μL
2×PhantaFlashMasterMix 7.50μL
细胞裂解液(含DMSO) 0.25μL
表3PCR反应程序
将上述PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4和图5所示，在抗性固体筛选培养基中长出的随机挑取的菌落经PCR有PCR产物且大小与理论相符，则表明该单克隆成功敲除了靶基因大片段。图4中Lane 1-8以及图5中Lane 1-7分别展示了含有pSTAGE-BGC-1.0kb质粒和pSTAGE-BGC-1.5kb质粒的E.coli同S.coelicolorM145结合转移后随机挑取的部分单克隆。若成功敲除靶标基因大片段，理论PCR条带大小应为1702bp(图3)，若放线紫红素合成基因簇未被敲除，则在1％的琼脂糖凝胶电泳中无法检测到相应PCR产物。
如图4所示，pSTAGE-BGC-1.0kb质粒编辑组中，8个单克隆均未能检测到符合理论大小(1702bp)的PCR产物，表明pSTAGE-BGC-1.0kb未能高效敲除靶标基因大片段(放线紫红素合成基因簇)。如图5所示，pSTAGE-BGC-1.5kb编辑组的7个单克隆中，有5个检测到了符合理论大小(1702bp)的PCR产物，这5个单克隆成功敲除了放线紫红素合成基因簇，因此pSTAGE-BGC-1.5kb可成功敲除链霉菌模式菌株S.ceolicolor M145中的靶标基因大片段。图5仅展示了部分随机挑选的单克隆的PCR检测结果，对随机挑取的pSTAGE-BGC-1.5kb全部结合子单克隆进行分析，结果显示成功敲除放线紫红素合成基因簇的菌株克隆数占50％左右，因此pSTAGE-BGC-1.5kb的敲除效率为50％。
随后利用唯赞质粒纯化试剂盒(货号：DC201)纯化回收上述PCR产物，送于苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger测序分析。如图6所示，为pSTAGE-BGC-1.5kb敲除链霉菌模式菌株S.ceolicolor M145中的靶标基因大片段的部分单克隆的Sanger测序结果图，图6中仅展示了突变株1和突变株5(分别对应图5中的Lane1和Lane5)的测序结果，测序结果表明的确是长度为1702bp放线紫红素合成基因簇大基因片段被成功敲除。
综上，表明同源臂长度是影响靶标基因大片段敲除的关键，上、下游同源臂的长度需要在1.5kb左右或以上。以上结果充分说明，本发明获得的链霉菌基因大片段删除工具可以有效介导链霉菌基因大片段删除。
上述各实施例所用培养基如下所示：
LB培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，溶于1L ddH2O，115℃灭菌30分钟后，室温储藏备用；若配置固体培养基，额外加入2％琼脂粉；
MS培养基：称取10g黄豆饼粉、10g胰蛋白胨、10g琼脂粉，溶于500mL自来水，115℃灭菌30分钟；
ISP2培养基：称取10g麦芽提取物、4g酵母提取物、4g葡萄糖，溶于1L ddH2O，调节pH至7.4，115℃灭菌30分钟，4℃贮藏备用，若配置固体培养基，额外加入2％琼脂粉；
2×YT培养基：称取16g胰蛋白胨、10g麦芽提取物、5g氯化钠，溶于1L ddH2O，调节pH至7.0，115℃灭菌30分钟，4℃贮藏备用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种基于TnpB系统的链霉菌DNA大片段删除工具，其特征在于，包括：TnpB核酸酶、向导RNA以及DNA大片段删除盒。
2.根据权利要求1所述的链霉菌DNA大片段删除工具，其特征在于，所述DNA大片段删除盒按照编辑靶向DNA大片段的方向依次包括以下核心元件：靶向DNA大片段上游同源臂和靶向DNA大片段下游同源臂；所述靶向DNA大片段上游同源臂和靶向DNA大片段下游同源臂长度分别为1.5-10kb。
3.根据权利要求1所述的链霉菌DNA大片段删除工具，其特征在于，所述向导RNA包括RNA骨架、靶向区段以及丁型肝炎病毒核酶。
4.根据权利要求3所述的链霉菌DNA大片段删除工具，其特征在于，所述RNA骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述靶向区段位于所述RNA骨架的3’端，且为靶向基因大片段上的TAM序列之后长度为12-40nt的核酸序列；所述丁型肝炎病毒核酶的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。
5.根据权利要求1所述的链霉菌DNA大片段删除工具，其特征在于，所述TnpB核酸酶为经密码子优化的可在链霉菌中表达的TnpB核酸酶，所述TnpB核酸酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种重组质粒，其特征在于，包括如权利要求1-5中任一项所述的链霉菌DNA大片段删除工具。
7.根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的基础上，分别插入TnpB核酸酶、向导RNA以及DNA大片段删除盒构建而来的。
8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的构建方法具体包括：
S1、将TnpB核酸酶及向导RNA分别替换链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pCRISPR-Cas9上的Cas9和sgRNA片段，获得质粒pTnpB-reRNA；
S2、通过SphI核酸内切酶酶切质粒pTnpB-reRNA，获得线性化pTnpB-reRNA；
S3、将DNA大片段删除盒与线性化质粒载体pTnpB-reRNA进行无缝克隆组装，获得质粒pSTAGE-BGC。
9.一种如权利要求1-5中任一项所述的链霉菌DNA大片段删除工具或如权利要求6-8中任一项所述的重组质粒在链霉菌DNA大片段敲除中的应用。
10.一种链霉菌DNA大片段的敲除方法，其特征在于，包括如下步骤：
A1、在非诱导条件下，将如权利要求6-8中任一项所述的重组质粒转化进入目的宿主中，通过DNA大片段删除盒的同源臂序列与靶向DNA大片段上下游同源序列的同源交换，及质粒相关抗性的抗生素筛选，得到携带DNA大片段删除质粒的转化子；
A2、将步骤A1中的转化子划线接种到含有质粒抗性抗生素及启动子诱导剂的培养基平板，恒温培养至可见单克隆；
A3、随机挑选步骤A2中的单克隆，进行菌落PCR验证得到无痕的DNA大片段敲除菌株。
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