CS237101B1 - Sposob přípravy vodorozpustných chromolytických polysacharidových enzýmových substrátov - Google Patents

Description

237101 4

Vynález sa týká sposobu přípravy vodo-rozpustných chromolytických polysachari-dových enzýmových substrátov, vhodnýchpre stanovenie příslušných polysacharid--hydrolázových enzýmových aktivit. K velmi efektívnym a preto najviac v po-sledných rokoch rozšířeným spósobom sta-novenia polysacharid-hydrolázových enzý-mových aktivit je sposob fotokolorimetric-ký. Spočívá na tom, že sa enzým nechá re-agovat s nerozpustným polysacharidovýmgélom, na ktorom je kovalentne viazanévhodné farbivo. Počas hydrolýzy účinkempřítomných příslušných polysacharid-hydro-láz prechádza farebný polysacharid postup-né do roztoku, pričom intenzita zafarbeniaroztoku je úměrná aktivitě enzýmu.

Pochopitelné toto platí iba za předpokla-du, že polysacharidový ohromolytický gélje dokonale přístupný molekule enzýmu aže kovalentne viazané farbivo na polysa-charide nemá inhibičný účinok na samotnúenzýmovú reakciu [J. Kennedy: Advancesin carbohydrate chemistry and biochemis-try, 29, (1974) str. 350 až 357],

Reakcia viazania farbiva na polysachari-de musí byť vedená tak, aby distribúcia mo-lekul farbiva bola homogenná na makromo-lekule polysacharidu, čo možno dosiahnuťsprávnou volbou reakčných podmienok privyfarbovaní polysacharidu.

Známe sú postupy, keď reakcia viazaniafarbiva najmá na rozpustný polysacharid sarobí v roztoku a po vyfarbení sa rozpustnýpolysacharid prevedie sieťovaním do neroz-pustné) formy, resp. v nlektorých prípadochsa móže použit aj v rozpustnej formě. V ta-kom případe sa polysacharid oddělí z re-akčného roztoku dialýzou a vyzrážaním sorganickým rozpúšťadlom [MSkinen K. K.,Paunio I. K.: Anal. Biochem. 39, 202, (1971)].Uvádzaný sposob sa použil pri vyfarbovaní„Blue Dextran 2000“, používaný ako fareb-ný standard pre testovanie gélov pri gélo-vej permeačnej chromatografii.

Pre diagnostické účely je známy sposobstanovenia aktivity alfa amylázy v biologic-kých tekutinách pomocou farbeného roz-pustného amylopektínu pod názvom DY-AMYL [Babson S. R., Babson A. L.: ClinicaChimíca Acta 44, 193 (1973)]. Ako farbivosa v tomto chromolytickom substráte pou-žívá farbivo Reacton Rot 2M-Geigy, s maxi-mom absorbancie 546 nm.

Vo váčšine prípadov pre stanovenie enzý-mových aktivit sa doposial používali ne-rozpustné chromolyticlké substráty, sletova-né róznymi sietovacími reagentami a rózne-ho stupňa napúčania vo vodě.

Určitou obecnou nevýhodou takýchto sub-strátov bolo, že pre jednotlivé analýzy bolopotřebné použit značný prebytok substrátu,ktorý sa pohyboval v medziach 50 až 150miligramov na jedno stanovenie. Pochopi-telné, že ak sa použije substrát rozpustnýje možné stanovit enzýmovú aktivitu pří-slušného' enzýmu i s použitím 5 mg rozpust- ného chromolytického substrátu, t. j. smnožstvem substrátu minimálně lOkrát niž-ším. Táto skutečnost je obzvlášť důležitá pristanovení takých enzýmov, ktorých sub-stráty sú poměrně tažko dostupné, cenovonáročné alebo v prípadoch, kde v rutinnejdiagnostickej praxi je potřebné prevádzaťdenne poměrně vysoký počet analýz enzý-movej alktivity.

Pri rozpustných polysacharidoch akýmisú napr. glykogén, α-manan, pululan, pek-tová kyselina a iné, obyčajne nebývá pro-blémom připravit vodorozpustný chromoly-tický substrát, nakolko správnou volboustupňa substitúcie farbiva sa rozpustnost izafarbeného polysacharidu zachová.

Zložitejšie to bývá ako ukázali naše výs-kumné práce u nerozpustných polysachari-dov ako sú celulóza, škrob, lichenan, chi-tín, xylan, /3-manan a iné. Ani opakovanousubstitúciou aplikovaného farbiva sa nepo-daří obyčajne získat chromolytický, dobrérozpustný polysacharid. Naviac pri vyššomstupni prefarbenia polysacharidu možnotalkmer pravidelné pozorovat značný inhi-bičný účinok viazaného farbiva na enzýmo-vú hydrolýzu, ČO' by podstatnou mierou zni-žovalo citlivost enzýmovej reakcie.

Uvedené nedostatky přípravy rozpustnýchchromolytických polysaoharidových substrá-tov vhodných na stanovenie polysacharid--hydrolázových aktivit rieši nová přihláškavynálezu na základe ktorej je možné z ne-rozpustného polysacharidu připravit roz-pustný enzýmový substrát, ktorý splňa všet-ky podmienky pre meranie príslušnej enzý-movej aktivity.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že vprvom stupni sa nerozpustný polysacharidalkyluje v alkalickom prostředí s etylénoxi-dom a/alebo kyselinou monochlóroctovou,a/alebo propylénoxidom, a/alebo alkylhalo-genidom s počtom uhlíkov 1 až 2 a/alebo β--ohloretylsulfonátom sodným na taký stu-peň substitúcie, pri ktorom je už polysacha-rid vo vodě rozpustný, mačo sa v druhomstupni na alkyl-polysacharid naviaže rema-zolové farbivo Remazol briliant blue R(dvojsodná sol kyseliny 8-amino-5[3-(sulfo-etylsulf onyl) anilino ] 6-antrachinonsulf ono-vej) v množstve 3 až 10 % hmotnostných nahmotnost polysacharidu pri teplote 15 až25 °C a koncentrácii hydroxidu sodného 0,7až 1,0 °/o hmotnostných po dobu 30 až 90 mi-nút, a v treťom stupni sa alkylovaný chro-molytický polysacharid vyzráža z roztokualkoholom okyseleným kyselinou octovouna neutralizáciu volných alkálií v reakčnejzmesi a nakoniec sa vyfarbený polysacharidzbaví fyzikálně viazaného' farbiva premýva-ním, alebo extrakciou s metanolom. iPokial sa týká výšky stupňa substitúcie,ktorý podmieňuje dobrú rozpustnost poly-sacharidu vo vodě, tá závisí od typu poly-sacharidu a od alkylačného reagentu. Taknapr. karboxymetylcelulóza sa stává roz- 237101 pustnou ivo vodě při stupni substitúcie 0,4,zatiaí škrob je rozpustný už pri stupni sub-stitúcie 0,2. Pri alkylácii polysacharidov setylénoxidom na dosiahnutie rozpustnostivo vodě je potřebné substituovat polysacha-ridy len na stupeň substitúcie 0,2 až 0,3, apri alkylácii /3-chloretylsulfonátom sodnýmlen na 0.1 až 0,2.

Alkylácia sa prevádza v přítomnosti hyd-roxidu sodného o koncentrácii 20 až 40 %hmot. pri teplotách 50 až 60 °C po dobu 2až 4 hodin. Po potrebnej alkylácii sa reakč-ná zmes zriedi vodou tak, aby Ikoncentráciahydroxidu sodného dosahovala hodnotu 0,8až 1,0 % hmot., pri ktorej koncentrácii sapřidává po častiach farbivo tak, aby dávko-vanie farbiva sa ukončilo v priebehu 20 mi-nut a po přidaní celkového množstva farbi-va sa nechá reakčná zmes reagovat ešte 60minut pri teplote 15 až 20 °C. Potom sa vy-farbený polysacharid vyzráža s okyselenýmalkoholom. Množstvo kyseliny sa volí tak,aby postačila len na neutralizáciu volnéhohydroxidu sodného. Vyzrážaný chromolytic-ký polysacharid sa potom vypiera, alebo ex-trahuje najlepšie metanolom, připadne zme-sou metanol-aceton až do kvantitativnéhoodstránenia fyzikálně viazaného farbiva napolysacharid. U polysacharidov, ktoré sú už rozpustnéi bez alikylácie možno farbivo viazať priamov alkalickom prostředí. Třeba však volit ta-ké množstvo farbiva, ktoré ešte neznižujerozpustnost hotového produktu, čo je asi3 až 10'% hmot. na hmotnost suchého poly-sacharidu. Výhodou navrhovaného sposobu je predo-všetkým skutečnost, že umožňuje aj z ne-rozpustných polysacharidov predchádzajú-cou alkyláciou s nasledovným kovalentnýmviazaním farbiva na polysaoharid připravitvodorozpustné chromolytické substráty spí-ňajúce všetky kritériá enzýmových substrá-tov vhodných na meranie příslušných enzý-mových aktivit. Ďalšie výhody sú v tom, žepřipravené substráty sú pre enzýmové re-akcie citlivejšie ako substráty nerozpustnéa preto na analýzu je potřebné lOkrát me-nej substrátu pri rovnalkej citlivosti stano-venia. Podstatnou výhodou je možnost sta-novenia aktivity v podstatné menšom obje-me vzorky, ako v případe nerozpustných Sle-tovaných substrátov.

Dalšie výhody a přesnější popis novéhosposobu sú evidentně v nasledovných prí-kladoch, ktoré nie sú vyčerpávajúce, ale lenilustrativně. Příklad 1 17 g práškovej celulózy o polymeračnomstupni 650 sa suspenduje v 600 ml isopro-panolu, do ktorého sa predom emulgovalo20 .ml roztoku hydroxidu sodného o koncen-trácii 25 % hmot. Reakčná zmes sa miešapri laboratórnej teplote 1 hodinu, načo sa přidá 8 g chloroctanu sodného a reakčnáteplota sa za stálého miešania zvyšuje po-stupné počas 1 hodiny na 60 °C, pri ktorejsa nechá reagovat 3 hodiny. Nerozpustnákarboxymetylcelulóza sa na filtri odsaje apremyje alkoholom. Dobré odsátá karboxy-metylcelulóza sa zaleje v ikadičke 300 až 400mililitrov destilovanej vody, v ktorej sa ce-lulóza rozpustí a po rozpuštění sa přidávápo častiach, celkom 1,3 g farbiva Remazolbriliant blue R a nechá sa za miešania rea-govat celkove 1 hodinu za postupného pri-dávania octanu sodného celkove 8 g. Po u-končení reakcie sa roztok pomaly nalievado 4 litrov alkoholu (za intenzívneho mie-šania) okyseleného takým množstvom kyse-liny octovej, aby právě stačilo na neutrali-záciu volného hydroxidu sodného v reakč-nom roztoku chromolytickej karboxymetyl-celulózy. Vyzrážaný produkt sa odfiltruje apremýva na filtri metanolom, resp. extrahu-je metanolom v Soxlethovom extrafktore.

Hotový chromolytický produkt, vodoroz-pustná hydroxyetylcelulóza obsahuje 5 %viazaného farbiva a stupeň substitúcie smonochlóroctovou kyselinou 0,42. Příklad 2

Postup ako v příklade 1 len namiesto ce-lulózy ako polysacharid použijeme chitín. Výsledný produkt chromolytický karboxy-metylchitín má 5,5 % viazaného farbiva astupeň substitúcie s kyselinou monochlor-octovou 0,48. Příklad 3

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom,že ako polysacharid použijeme lichenan amnožstvo farbiva 1,7 g. Výsledný produkt chromolytický karboxy-metyllichenan má 6,2 % viazaného farbivaa stupeň substitúcie kyselinou monochlor-octovou 0,44. Příklad 4

Postup ako v příklade 1 s tým rozdielom,že ako polysacharid sa použije xylán. Výsledný produkt chromolytický karboxy-metylxylan obsahuje 4 % hmot. viazanéhofarbiva a stupeň substitúcie monochlorocto-vou kyselinou 0,38. Příklad 5

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom,že ako polysacharid sa použije zemiakovýškrob a množstvo chloroctanu sodného len4,5 g a množstvo farbiva 1,7 g. Výsledný produkt chromolytický karboxy- metylškrob obsahuje 7 % hmot. viazaného farbiva a stupeň substitúcie s kyselinou monochloroctovou 0,25. 237101 Příklad 6

Postup pódia příkladu 1 s tým rozdielom,že ako alkylačné reagens sa použije 2,5 getylénoxidu a reakcia sa vedie pri 40 až50 °C po dobu 2 hodin.

Vzniknutý derivát hydroxyetylcelulózy saďalej modifikuje naviazaním farbiva podlápříkladu 1.

Hotový produkt, chromolytický vodoroz-pustný derivát hydroxyetylcelulózy, so stup-ňom substitúcie 0,3 vzhladom na hydroxy-etyl a obsahom viazaného farbiva 4,3 % jevhodný ako rozpustný substrát pre stanove-nie celulózovej aktivity. Příklad 7

Postup podl'a příkladu 6 s tým rozdielom,že ako polysacharid sa použije ,/3-manan.

Rozpustný chromolytický substrát má po-dobné vlastnosti z hlediska stupňa sabsti-túcie a množstva viazaného farbiva ako vpříklade 6 a je vhodný na meranie mansná-zovej aktivity. Příklade

Postup podlá příkladu 6 s tým rozdielom,že ako polysacharid sa použije lichenan. Výsledný produkt hydroxyetyllichenan skovalentne viazaným farbivom je vhodnýmrozpustným substrátem na stanovenie liche-názovej aktivity. Příklad 9

Postup podlá příkladu 6 s tým rozdielom,že ako polysacharid sa použije zemiakovýalebo kukuřičný škrob. Výsledný produkt chromolytický hydro-xyetylškrob je vhodným rozpustným sub-strátom na stanovenie aktivity alfa amylá-zy. Příklad 10 17 g sodnej soli kyseliny pektovej sa sus-penduje v 200 ml izopropanolu a za stálé-ho miešania sa přidá 5 ml hydroxidu sod-ného o koncentrácii 5 % hmot. Po 30 minu-tách sa přidá 0,8 g farbiva Remazol briliantblue R a mieša sa 1 hodinu pri teplote 15až 20 *C. Výsledný produkt, vodorozpustný chro-molytický pektát sodný je dobrý substrátna stanovenie endopolygalakturonázovej ak-tivity. Příklad 11

Postup ako v příklade 10 s tým rozdie-lom, že ako polysacharid sa použije a-ma-nan. Výsledný produkt, chromolytický vodo- rozpustný «-manan je vhodný enzýmový 8 substrát na stanovenie «-mananázovej akti-vity. Příklad 12 20 g metylcelulózy s obsahom metoxylu28 % hmot. sa suspenduje v 100 ml etanolua za miešania sa přidá 5 ml vodného roz-toku hydroxidu sodného o koncentrácii 2 %hmot. a reakčná zmes sa nechá miešať 30minut pri izbovej teplote, potom sa přidá počastiach 1,0 g farbiva Remazol briliant blueR a nechá sa reagovat za miešenia pri tep-lote 15 až 20 °C 1 hodinu. Po 1 hodině sapřítomné alkálle neutralizujú s kyselinouoctovou a nezreagované farbivo sa vymýváalebo extrahuje ako v příklade 1. Výslednýprodukt, vodorozpustná chromolytická me-tylcelulóza je velmi dobrým substrátom premeranie celulázovej enzýmovej aktivity. Příklad 13 17 g zemiakového škrobu sa suspendujedo 100 ml izopropanolu v iktorom sa pre-dom rozpustilo 8 ml vodného roztoku hyd-roxidu sodného o koncentrácii 40 % hmot-nostných. Po zhomogenizovaní reakčnejzmesi sa přidá 3,5 g /3-chloretylsulfonátusodného a reakčná zmes sa vyhřeje na 55 °C,pri ktorej teplota sa nechá reagovat 90 rni-nút. Potom sa reakčná zmes ochladí na 20stupňov Celsia a přidá sa 1,7 g farbiva Re-mazol briliant blue R a nechá sa za mieša-nia reagovat 1 hodinu. Potom sa chromo-génny vodorozpustný sulfoetylškrob odfil-truje a premýva, alebo extrahuje metano-lom od nezreagovaného farbiva.

Hotový substrát je velmi dobrý na sta-novenie alfa amylázovej enzýmovej aktivi-ty. P r í k 1 a d 14

Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom,že ako alkylačné reagens sa použije 3,0 gpropylénoxidu a reakčná zmes sa nechá re-agovat pri teplote 55 °C po dobu 2 hodin.

Vzniknutý derivát hydroxypropylcelulózysa ďalej modifikuje naviazaním farbiva po-dlá příkladu 1.

Hotový produkt, chromolytický vodoroz-pustný derivát hydroxypropylcelulózy, sostuipňom substitúcie 0,35 a obsahom viaza-ného farbiva 5,2 % hmotnostných je vhod-ný ako rozpustný substrát pre stanoveniecelulózovej aktivity. Příklad 15 20 g vodorozpustnej etylcelulózy so stup-ňom substitúcie 0,58 sa suspenduje v 100 mlmetanolu, v ktorom sa predom rozpustilo5 ml vodného roztoku hydroxidu sodného okoncentrácii 2·% hmotnostných.

Reakčná zmes sa nechá miešať 30 minút

Claims (1)

1. 237101 při laboratorně] teplote, potom sa přidá počastiach 1,0 g farbiva Remazol briliant blueR a nechá sa reagovat za miešania pri tep-lotě 15 až 20 °C po dobu 1 hodiny. Po 1 ho-dině sa přítomné alkálie neutralizujú s kyse-linou octovou a nezreagované farbiivo sa vy-mývá, alebo extrahuje ako v příklade 1. Výsledný produkt, vodorozpustná chro-molytická etylcelulóza je velmi dobrých 10 substrátom pře meranie celulózovej enzý-movej aktivity. Vynález má široké využitie všade, kde jepotřebné stanovit enzýmové polysacharid--hydrolázové aktivity, či už v medzioperač-nej kontrole pri výrobě jednotlivých enzý-mov, alebo pri diagnostickom stanovení en-zýmových aktivit v biologických tekutinách. P R E D Μ E T Spósob přípravy vodorozpustných chro-molytických polysacharidových enzymovýchsubstrátov vyznačený tým, že v prvom stup-ni sa nerozpustný polysacharid alkyluje valkalickom prostředí s etylénoxidom a/ale-bo kyselinou monochlóroctovou, a/alebopropylénoxidom, a/alebo alkylhalogenidoms počtom uhlíkov 1 až 2, a/alebo ,/5-chlór-etylsulfonátom sodným na taký stupeň sub-stitúcie, pri ktorom je už polysacharid vovodě rozpustný, načo sa v druhom stupnina alkyl-polysacharid naviaže remazolovéfarbivo Remazol briliant blue R (dvojsodná VYNALEZU sol' kyselina 8-amino-5-[3-(sulfoetylsulfo-nyljanilino] 6-antrachinonsulfonovej) vmnožstve 3 až 10 % hmotnostných na hmot-nost polysacharidu pri teplote 15 až 25 °Ca koncentrácie hydroxidu sodného 0,7 až1,0 % hmotnostných po dobu 30 až 90 mi-nut, a v trefom stupni sa alkylovaný chro-molytický polysacharid vyzráža z roztokualkoholom okyseleným kyselinou octovouna neutralizáeiu volných alkálií v reakčnejzmesi a nakoniec sa vyfarbený polysacha-rid zbaví fyzikálně viazaného farbiva pre-mývaním, alebo extrahováním s metanolom.