CS245182B1 - Kmeň mikroorganizmu Streptomyces fradiae CCM 3765 - Google Patents

Abstract

Kmeň mikroorganizmu Streptomyces fradiae CCM 3765 produkujdci tylozín. Kmeň podía vynálezu bol získaný pósobením mutagénov a opakovanými pasivnými selekciami. Výhodou kmeňa podlá vynálezu je zvýšená produkcia tylozínu /80 až 120 i/ a odolnost k mechanickému namáhaniu, ktorému je kultura podrobená počas miešania vo fermentore.

Description

Vynález sa týká kmeňa mikroorganizmu Streptomyces fradiae CCM 3765 /interně označenie NMU 2/32/ produkujúceho tylozín.

Zvýšenie priemyselnej výroby tylozínu je možné dosiahnuť zvýšením výrobnej kapacity, alebo zvyšováním produkcie pri jeho biosyntéze. Druhý sposob, t.j. zvyšovanie produkcie pri jeho biosyntéze nevyžaduje na rozdiel od prvého, velké investiční náklady. Je založená na lepšej produkčnej schopnosti kmeňa používaného pre biosyntézu alebo na lepších fermentačných podmienkách, ktoré sa zabezpečuji! dokonalejším riadením fermentácie.

Tento druhý sposob je v siíčasnej době jedinou možnou cestou zvýšenia výťažnosti a jedným z hlavných prínosov je zlepšovanie produkčných vlastností kmeňa. Produkčně kmene sú získávané radom zavedených postupov dlhodobých šlachtitelských programov.

Výsledné kmene vykazuji! potom rad výzmaných odlišných vlastností, z ktorých najdóležitejšie sú tie vlastnosti, ktoré sa prejavujú vo zvýšenej produkcii tylozínu vo fermentoroch vo výrobě.

Kmeň Streptomyces fradiae CCM 3765 bol získaný posobením mutagénov a opakovanými pasivnými selekciaml na východzí kmeň Streptomyces fradiae EMS 98. Sposob šlachtenia kmeňa je znázorněný na nasledujúcej schéme, kde je uvedená genealogická línia vedúca ku kmeňu, na ktorý je uplatňovaný patentový návrh.

Streptomyces fradiae EMS 98 PS

115 - 10

UV - 1 UV 1/31

PS

131 - 7

NMU - 1

NMU - 1/19

NMU - 2

NMU - 2/32

Skratkyi PS - pasívna selekcia - selekcia bez pósobenia mutagénu UV - pósobenie UV světla

MNU - pósobenie nitrozometyl močoviny

Posledně mutagénne pósobenie bolo na kmeň inertného označenia MNU 1/19 nitrozometylmočovinou v koncentrácii 0,15 M po dobu 100 min. fosfátovom pufre s hodnotou pH 6,8 na spórovú suspenziu kmeňa MNU 1/19, získanú zmytím vysporulovanej kultúry vodou. Po dobu pósobenia bola mutačně zmes miešaná na elektromagnetickom miešadle pri 25 °V.

V časových intervaloch po 40, 60, 80 a 100 min. pósobenia nitrozometylmočoviny boli odoberané vzorky a riedené riediacou radou s koeficientom 10 za súčasného zrieďovania nitrozometylmočoviny na neúčinnú koncentráciu. Zriedené vzorky boli naočkované'na Petriho misky so sporulačným agarom tak, aby nedochádzalo ku vzájbmnému kontaktu kolonií a po vyspor ulovaní boli samostatné kolonie preoěkované na šikmé agary.

Spory pre pasívnu selekciu boli suspendované v destilovanéj vodě, riedené riediacou radou s faktorora 10 a očkované na Petriho misky so sporulačnou pódou. Po 14-dennej inkubácii pri teplote 28 °C boli izoláty vysporulované a bolo možné ich preočkovať na šikmé agary.

Inkubácia tohto základného sporulačného materiálu preblehala pri 28 °C 10 až 12 dní. Vyššie uvedeným sposobom aplikáciou mutagénov a pasívnej selekcie bol získaný izolát NMU 2/32. Izoláty boli hodnotené podlá schémy šikmý agar - vegatívne inokulum - vlastná fermentácia.

Kmeň mikroorganizmus Streptomyces fradiae CCM 3765 převyšuje produkciu dosial používaných kmeňov o 80 až 120 %. Kmeň tvoří pri kultivácii na sporulačnej pode s kvasničným extraktom, hovádzím extraktom, hydrolytovaným kaseinom a dextrínom kolonie o priemere 4 až 6 mm vyvýšené nad substrátom so sporulovaným stredom, s bielymi sporami v střede po 10 až 12-dňovej kultivácii pri 28 °C.

Přednostou tohto kmeňa je jeho odolnost k mechanickému namáhaniu, ktorému je kultúra podrobená počas miešania vo fermentore. Hlavnou a najvýznamnéjšou vlastnostou kmeňa Streptomyces fradiae CCM 3765 je zvýšená produkcia tylozínu pri submerznej fermentácii.

Přikladl

Fermentácia v bankách na rotačných třepačkách

Vegetativně inokulum bolo připravené submerzne v 500 ml varných bankách so 60 ml inokulačnej pódy /kukuřičný extrakt, sójová múka, sójový olej a CaCC>₃/. živná póda po vysterilizovaní bola naočkovaná klučkou spor zo šikmého agaru a inkubovaná na rotačnom trepacom stroji 40 až 48 hodin.

Takto připraveným vegetatívnym inokulom boli očkované produkčné varné banky o obsahu 500 ml s objemom fermentačnej pódy 60 ml /zdroj uhlíka repná melasa, sójový olej, zdroj dusíka rybia múka, kukuřičný gluten, anorganické soli a CaCO^/. Fermentácia prebieha 8 až 9 dní kultivácie. Produkcia tylozínu za vyššie uvedených podmienok dosiahla 6 OOO mj./ml.

Příklad 2

Fermentácia v poloprevádzkovom fermentore

Fermentácia v poloprevádzkovom fermentore o objeme 5 000 1 bola dvojstupňová. Očkovacia póda obsahovala kukuřičný extrakt, sójovú múku, krmné droždie, sójový olej a CaCO^, Fermentačná póda obsahovala kukuřičný extrakt, rybiu múku, kukuřičný gluten, repnú melasu, sójový olej a CaCOj.

Fermentor bol plněný 2 800 1 pódy a očkovaný 10 % objemu z očkovacieho fermentoru. Kultivácia prebiehala pri teplote 28 °C, miešanie 180 obr./min., vzdušnenie 2 500 1/min. za 200 hod. kultivácie. Produkčným kmeňom Streptomyces fradiae CCM 3765 bola dosiahnutá produkcia 6 300 mj./ml.

Claims (1)

1. Kmeň mikroorganizmu Streptomyces fradiae CCM 3765 produkujúci tylozín.