CS267066B1 - Kmeň mikroorganizmu Streptomyces aureofaciens CCM 3948 - Google Patents

Description

2 CS 267 066 Bl

Vynález sa týká kmeňa Streptomyces aureofaciens CCM 3948 (interně označenie kmeňaje NMM 84/16) so zvýšenou produkciou chlórtetracyklínu, odolný voči fágovéj indekcii. Přednostou kmeňa podlá vynálezu je odolnost voči fágovej infekcii, stabilita vlastnostípri pasážovaní a pri dlhodobom uchovávaní v lyofilizovanej formě.

Zvýšenie výroby antibiotika chlórtetracyklínu móže sa realizovat rozšířením výrobnýchfermentačných prevádzok, alebo zvýšením výtažností fermentačného procesu. Druhá alternativa,ktorá nevyžaduje významné investičně náklady, je umožněná bud zlepšením fermentačného proce-su, alebo zvýšením produkčnej schopnosti kmeňov používaných pre biosyntézu.

Používané kmene sa tiež musia vyznačovat odolnostou voči vážnému nebezpečenstvu počasfermentácie, akým je fágová infekcia.

Kmeň NMM 84/16 bol získaný z kmeňa Streptomyces aureofaciens CCM 3820 radom opakovanýchmutagénnych zásahov (metylnitrózomočovina, N-nitrózometylmočovina, DV-svetlo + N-nitrózome-tylmočovina, pósobenie fága Bl) a následných pravidelné zaradovaných pasivných selekci!.

Izoláty boli hodnotené podlá následovněj schémy: izolované kolonie na Petriho miske 1 šikmý agar i vegetativně inokulum i vlastná fermentácia

Produkčně boli izoláty hodnotené vo dvoch pokusoch před lyofilizáciou a v troch pokusochpo lyofilizácii. Lyofilizované konzervy slúžia k dlhodobému uchovávaniu spórového materiálua umožňujú zachovanie vhodných rastových a produkčných vlastností. Stanovenie produkčnejschopnosti izolátov bolo robené fosforečnanovou metodou a merané na přístroji Shimadzu. Týmto hodnotiacim systémom bol získaný kmeň, na ktorý je uplatňovaný patentový nárok.

Kmeň Streptomyces aureofaciens CCM 3948 tvoří pri monospórovom rozseve na sporulačnejpůdě typu sacharóza-peptón kolonie o velkosti 2 až 5 mm v priebehu 12 až 14 dní kultiváciepri 28 °C. Kolonie sú na okraji radiálně zvrásnené, střed kolonií je preliačený. Kultúradobré sporuluje na sporulačnej póde i na prírodnom substráte (proso).

Pri mikroskopickom pozorovaní mycélium je vytvořené z tenkých bohato větvených vlákien. V porovnaní s kmeňom CCM 3820 u kmeňa CCM 3948 je pozorovaná vSčšía rastová rýchlosť.Farba vysporulovanej kultúry je šedá. Porovnanie vlastností kmeňa CCM 3948 s vlastnosťamiprodukčného kmeňa CCM 3820 je uvedené v nasledujúcej tabulke:

Kmeň Produkcia chlórtetracyklínu v banke Dókaz fága v kultuře(% z počtu kultúr) (/ig.ml-1 , (%, CCM 3820 5 400 100 2 CCM 3948 (NMM 84/16, 6 230 115,4 0 CS 267 066 Bl 3 Výhoda používania kmeňa streptomyces aureofaciens CCM 3948 je vo vytvoření podmienokdalšieho rastu výroby chlórtetracyklínu bez jej ohrozenia fágovou infekciou.

Produkcia chlórtetracyklínu kmeňom podlá vynálezu sa zvýšila v priemere o 8 až 10 S.

Nasledujúce příklady prevedenia kmeňa podlá vynálezu presne dokladajú, ale neobmedzujú. Příklad 1

Vegetativně inokulum bolo připravované submerzne v 500 ml varných bankách so 60 mlinokulačnej pódy, ktorá obsahovala základné živiny, t. j. zdroj uhlíka (sacharóza), dusíka(kukuřičný výluh v kombinácii s anorganickým zdrojom dusíka) a uhličitan vápenatý. Vegetativněinokulum bolo očkované klučkou spor zo šikmého agaru a kultivované na rotačnom trepacomstroji 21 hod. Takto připraveným vegetatívnym inokulom boli očkované fermentačné bankyo obsahu 500 ml so 60 ml fermentačnej pódy. Zdrojom uhlíka bola sacharóza, zdrojmi dusíkakukuřičný výluh, sójová múka a amónna sol. Póda dalej obsahovala uhličitan vápenatý, benzylltiokyanát a minerálně soli. Příprava vegetatívneho inokula a fermentácia boli prevádzanéna rotačnom trepacom stroji pri 240 ot./min. 1, výstřednosti 2,5 cm a kultivačnej teploty28 °C. Fermentácia trvala 96 hod., kedy bola dosiahnutá najvyššia produkcia antibiotikaa boli odoberané vzorky na stanovenie.

Produkčně hodnotenie izolátov bolo opakované dvakrát, najlepšie izoláty boli lyofilizo-vané a po vyočkovaní opSť minimálně trikrát produkčně hodnotené.

Vyššie uvedeným fermentačným spósobom sa dosiahli produkcie chlórtetracyklínu 5 900až 6 200 /íg.ml 1 pódy. Příklad 2

Podlá spósobu uvedeného v příklade 1 s tým rozdielom, že příprava vegetatívneho inokulaa fermentácia prebiehali v štvrfprevádzkových objemoch. Vegetativně inokulum bolo připravenév inokulačnom laboratórnom tanku o objeme 20 1, naplneňom 10 1 inokulačnej pódy, ktorýbol naočkovaný 100 ml spórovej suspenzie z prosnej konzervy. Živná póda vo fermentaěných laboratórnych tankoch bola naočkovaná vegetatívnym inokulomv množstve 10 % objemu. Fermentácia prebiehala pri 28 až 29 °C, miešaníe 450 ot./min. podobu 90 až 92 hod.

Vzorky boli odobrané od 44. hod. kultivácie na stanovenie sacharózy anorganickéhodusíka a produkčnej aktivity, ktorá dosahovala'v 92. hod. indexu produkcie 108 až 110 %. Příklad 3

Podlá spósobu uvedeného v příklade 1 s rozdielom, že příprava vegetatívneho inokula a fermentácia sa realizujú vo velkoobjemovej aparatúre. Inokulum bolo připravené v očkova-3 3 com fermentačnom tanku o objeme 5 m , naplnenom 3 m inokulačnej pódy. Vegetatívnym inokulom3 3 bola očkovaná produkčná živná póda vo fermentore o objeme 50 m , ktorý bol plněný 29 m pro-dukčnej živnej pódy, Benzyltiokyanát sa dávkoval v množstve 1,5 až 3 /ag.ml pódy spolus prikrmovacím roztokom, ktorého dávkovaníe začínalo pri spotřebovaní 'zdroja uhlíka nahladinu 26 až 25 mg’.ml pódy. Vyššie uvedeným postupom sa dosahuje produkcia chlórtetracy-klínu zo šarže odpovedajúce indexu 108 až 110 %.

Claims (1)

1. 4 CS 267 066 Bl PREDMET VYNÁLEZU KmeS'mikroorganizmu Streptomyces aureofaciens CCM 3948 so zvýšenou produkciou chlór-tetracyklínu a odolný voči fágovej infekcii, najma voči aktinofágu Bl. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs