CS267066B1 - Kmeň mikroorganizmu Streptomyces aureofaciens CCM 3948 - Google Patents

Abstract

Šlachtenie produkčných kmeňov Streptomyces aureofaciens produkujúcich chlórtetracyklín je zamerané na trvalé zvyšovanie ich produkčnej schopnosti a odolnosti voči fágovej infekcii. Podlá popísáného postupu bol získaný kmeň Streptomyces aureofaciens CCM 3948 z produkčného kmeňa CCM 3820, ktorý produkuje vo zvýšenej miere ohlórtetracyklín bez príznakov citlivosti na aktinofág Bl. Produkčně schopnosti kmeňa sa prejavujú pri nezmenenom doterajšom režime kultivácie.

Description

KVETKOVÁ MÁRIA RNDr., VIDO VLADIMÍR ing., ŽIGOVÁ EVELÍNA ing., BANSKÁ BYSTRICA, ŠEBEŠOVÁ VIERA, BRUSNO, BERTAN MILAN ing., BANSKÁ BYSTRICA

Kmen mikroorganizmu Streptomyces aureofaciens CCM 3948 (57) Šlachtenie produkčných kmeňov Streptomyces aureofaciens produkujúcich chlórtetracyklín je zamerané na trvalé zvyšovanie ich produkčnej schopnosti a odolnosti voči fágovej infekcii. Podlá popísáného postupu bol získaný kmeň Streptomyces aureofaciens CCM 3948 z produkčného kmeňa CCM 3820, ktorý produkuje vo zvýŠenej miere chlórtetracyklín bez príznakov citlivosti na aktinofág Bl. Produkčně schopnosti kmeňa sa prejavujú pri nezmenenom doterajšom režime kultivácie.

CS 267 066 Bl

Vynález sa týká kmeňa Streptomyces aureofaciens CCM 3948 (interně označenie kmeňa je NMM 84/16) so zvýšenou produkciou chlórtetracyklínu, odolný voči fágovéj indekcii.

Přednostou kmeňa podlá vynálezu je odolnost voči fágovej infekci!, stabilita vlastností pri pasážovaní a pri dlhodobom uchovávaní v lyofilizovanej forme.

Zvýšenie výroby antibiotika chlórtetracyklínu může sa realizovat rozšířením výrobných fermentačných prevádzok, alebo zvýšením výtažností fermentačného procesu. Druhá alternativa, ktorá nevyžaduje významné investičně náklady, je umožněná bud zlepšením fermentačného procesu, alebo zvýšením produkčnej schopnosti kmeňov používaných pre biosyntézu.

Používané kmene sa tiež musia vyznačovat odolnostou voči vážnému nebezpečenstvu počas fermentácie, akým je fágová infekcia.

Kmeň NMM 84/16 bol získaný z kmeňa Streptomyces aureofaciens CCM 3820 radom opakovaných mutagénnych zásahov (metylnitrózomočovina, N-nitrózometylmočovina, DV-svetlo + N-nitrózometylmočovina, pósobenie fága Bl) a následných pravidelné zaradovaných pasivných selekcií.

Izoláty boli hodnotené podlá následovněj schémy:

izolované kolonie na Petriho miske šikmý agar i

vegetativně inokulum vlastná fermentácia

Produkčně boli izoláty hodnotené vo dvoch pokusoch před lyofilizáciou a v troch pokusoch po lyofilizácii. Lyofilizované konzervy slúžia k dlhodobému uchovávaniu spórového materiálu a umožňujú zachovanie vhodných rastových a produkčných vlastností. Stanovenie produkčnej schopnosti izolátov bolo robené fosforečnanovou metodou a merané na přístroji Shimadzu. Týmto hodnotiacim systémom bol získaný kmeň, na ktorý je uplatňovaný patentový nárok.

Kmeň Streptomyces aureofaciens CCM 3948 tvoří pri monospórovom rozseve na sporulačnej půdě typu sacharóza-peptón kolonie o velkosti 2 až 5 mm v priebehu 12 až 14 dní kultivácie pri 28 °C. Kolonie sú na okraji radiálně zvrásnené, střed kolonií je preliačený. Kultúra dobré sporuluje na sporulačnej póde i na prírodnom substráte (proso).

Pri mikroskopickom pozorovaní mycélium je vytvořené z tenkých bohato větvených vlákien.

V porovnaní s kmeňom CCM 3820 u kmeňa CCM 3948 je pozorovaná vačšia rastová rýchlosť. Farba vysporulovanej kultúry je šedá. Porovnanie vlastností kmeňa CCM 3948 s vlastnosťami produkčného kmeňa CCM 3820 je uvedené v nasledujúcej tabulke:

Kmeň	Produkcia chlórtetracyklínu v banke	Dókaz fága v kultuře (% z počtu kultúr)
/ 7 I Qig.ml	) (%)
CCM 3820	5 400	100	2
CCM 3948
(NMM 84/16)	6 230	115,4	0

CS 267 066 Bl 3

Výhoda používania kmeňa streptomyces aureofaciens CCM 3948 je vo vytvoření podmienok 3alšieho rastu výroby chlórtetracyklínu bez jej ohrozenia fágovou infekciou.

Produkcia chlórtetracyklínu kmeňom podlá vynálezu sa zvýšila v priemere o 8 až 10 %.

Nasledujúce příklady prevedenia kmeňa podlá vynálezu presne dokladajú, ale neobmedzujú.

Příklad 1

Vegetativně inokulum bolo připravované submerzne v 500 ml varných bankách so 60 ml inokulačnej pódy, ktorá obsahovala základné živiny, t. j. zdroj uhlíka (sacharóza), dusíka (kukuřičný výluh v kombinácii s anorganickým zdrojom dusíka) a uhličitan vápenatý. Vegetativně inokulum bolo očkované klučkou spor zo šikmého agaru a kultivované na rotačnom trepacom stroji 21 hod. Takto připraveným vegetatívnym inokulom boli očkované fermentačné banky o obsahu 500 ml so 60 ml fermentačnej pódy. Zdrojom uhlíka bola sacharóza, zdrojmi dusíka kukuřičný výluh, sójová múka a amónna sol. Póda dalej obsahovala uhličitan vápenatý, benzyll tiokyanát a minerálně soli. Příprava vegetatívneho inokula a fermentácia boli prevádzané na rotačnom trepacom stroji pri 240 ot./min. výstřednosti 2,5 cm a kultivačnej teploty 28 °C. Fermentácia trvala 96 hod., kedy bola dosiahnutá najvyššia produkcia antibiotika a boli odoberané vzorky na stanovenie.

Produkčně hodnotenie izolátov bolo opakované dvakrát, najlepšie izoláty boli lyofilizované a po vyočkovaní opSť minimálně trikrát produkčně hodnotené.

Vyššie uvedeným fermentačným spósobom sa dosiahli produkcie chlórtetracyklínu 5 900 až 6 200 ,ug.ml ¹ pódy.

Příklad 2

Podlá spósobu uvedeného v příklade 1 s tým rozdielom, že příprava vegetatívneho inokula a fermentácia prebiehali v štvrfprevádzkových objemoch. Vegetativně inokulum bolo připravené v inokulačnom laboratórnom tanku o objeme 20 1, naplneňom 10 1 inokulačnej pódy, ktorý bol naočkovaný 100 ml spórovej suspenzie z prosnej konzervy.

Živná póda vo fermentačných laboratórnych tankoch bola naočkovaná vegetatívnym inokulom v množstve 10 % objemu. Fermentácia prebiehala pri 28 až 29 °C, miešanie 450 ot./min. po dobu 90 až 92 hod.

Vzorky boli odobrané od 44. hod. kultivácie na stanovenie sacharózy anorganického dusíka a produkčnej aktivity, ktorá dosahovala’v 92. hod. indexu produkcie 108 až 110 %.

Příklad 3

Podlá spósobu uvedeného v příklade 1 s rozdielom, že příprava vegetatívneho inokula a fermentácia sa realizujú vo velkoobjemovej aparatúre. Inokulum bolo připravené v očkova3 3 com fermentačnom tanku o objeme 5 m , naplnenom 3 m inokulačnej pódy. Vegetatívnym inokulom 3 3 bola očkovaná produkčná živná póda vo fermentore o objeme 50 m , ktorý bol plněný 29 m produkčnej živnej pódy, Benzyltiokyanát sa dávkoval v množstve 1,5 až 3 /ig.ml pódy spolu s prikrmovacím roztokom, ktorého dávkovanie začínalo pri spotřebovaní ’zdroja uhlíka na hladinu 26 až 25 mg’.ml pódy. Vyššie uvedeným postupom sa dosahuje produkcia chlóxtetracyklínu zo šarže odpovedajúce indexu 108 až 110 %.

CS 267 066 Bl

Kmeň'mikroorganizmu Streptomyces aureofaciens CCM 3948 so zvýšenou produkciou chlór-

Claims (1)

1. PREDMET VYNÁLEZU tetracyklinu a odolný voči fágovej infekcii, najmS voči aktinofágu Bl.