CS276453B6 - Process for preparing surface antigen hepatitis b - Google Patents
Process for preparing surface antigen hepatitis b Download PDFInfo
- Publication number
- CS276453B6 CS276453B6 CS868641A CS864186A CS276453B6 CS 276453 B6 CS276453 B6 CS 276453B6 CS 868641 A CS868641 A CS 868641A CS 864186 A CS864186 A CS 864186A CS 276453 B6 CS276453 B6 CS 276453B6
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- dna
- dna fragment
- fragment
- yeast
- plasmid
- Prior art date
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 9
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 99
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 72
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 48
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 95
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 58
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 abstract 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 18
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 17
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 15
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Substances [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 11
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 11
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 8
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 7
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 0 CCC(CC)*1=CC1C1C=CC*1 Chemical compound CCC(CC)*1=CC1C1C=CC*1 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 5
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067193 Formaldehyde transketolase Proteins 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 229940116357 potassium thiocyanate Drugs 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710191958 Amino-acid acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000009042 Argininosuccinate Lyase Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 101000695548 Homo sapiens Probable proline-tRNA ligase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102100028531 Probable proline-tRNA ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 2
- BHKKSKOHRFHHIN-MRVPVSSYSA-N 1-[[2-[(1R)-1-aminoethyl]-4-chlorophenyl]methyl]-2-sulfanylidene-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-one Chemical compound N[C@H](C)C1=C(CN2C(NC(C3=C2C=CN3)=O)=S)C=CC(=C1)Cl BHKKSKOHRFHHIN-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 101150065207 P40 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N Putrescine Natural products NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000517713 Tremaster Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- QOTAEASRCGCJDN-UHFFFAOYSA-N [C].CO Chemical compound [C].CO QOTAEASRCGCJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 229940050929 polyethylene glycol 3350 Drugs 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Beans For Foods Or Fodder (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález se týká použití technologie rekombinace ONA pro přípravu povrchového antigenu hepatitis B. Konkrétněji se vynález týká přípravy povrchového antigenu hepatitis B v kvasinkách. V souvislosti s tím se vynález týká též nových konstrukcí DNA kódujících povrchový antigen hepatitis B a nových organismů transformovaných shora popsanými konstrukcemi ONA.
V posledních letech se rozvinula technologie rekombinace DNA, která poskytuje možnost řízené produkce ohromného množství různých použitelných polypeptidů pomocí mikroorganismů. Pomocí různých mikroorganismů již bylo vyrobeno mnoho eukaryotických polypeptidů, například lidský růstový hormon, leukocytové interferony, lidský insulin a lidský proinsulin. Očekává se, že pokračující aplikace metod, které jsou již k dispozici, v budoucnu umožní produkci pomocí mikroorganismů u dalších požadovaných polypeptidických produktů. Jedním z takových užitečných polypeptidických produktů je povrchový antigen hepatitis B.
Virus hepatitis B (sérové hepatitidy) se přenáší mezi lidmi a projevuje se infekcemi, které chronicky zeslabují lidský organismus a mohou mít postupně za následek těžké poškození jater, primární karcinomy a nakonec smrt. Ve většině případů je možno u infekcí způsobených hepatitis B očekávat úplně vyléčení. Velké části populace, zejména v mnoha afrických a asijských zemích jsou však chronickými nosiči a představují tak nebezpečný potenciál pandemického přenosu této choroby.
Účinnou profylaxí proti viru hepatitis B je podávání vakciny proti viru hepatitis B, kterou je Obvykle vysoce přečištěný povrchový antigen hepatitis B. Taková vakcina je účinná po předcházení infekcím způsobeným tímto virem. Jako skupiny obyvatelstva, které jsou zvláště silně ohroženy těmito infekcemi je možno uvést osoby, které vyžadují léčení pomocí transfuzí krve nebo dlalýzou, zdravotnický personál, který přichází s těmito osobami do styku apod. Kromě toho je tato vakcina rovněž účinná pro zabránění vzniku nového nosiče a bylo by možno s její pomocí úplně eliminovat virus hepatitis B na zemi.
Virus hepatitis B z buněčných kultur- není infekční a lze ho tedy získávat pouze z infikovaných lidí nebo vyšších primátů. Neexistuje tedy až dosud prostředek pro získání a udržování dostatečných zásob viru hepatitis B pro použití na přípravu antigenu sloužícího pro imunizaci proti viru hepatitis B.
Vakcina proti viru hepatitis se obvykle připravuje tak, že se z krevní plasmy nosičů viru hepatitis B izoluje a přečistí povrchový antigen hepatitis B. Čištění še však musí provádět s vysokou účinností, protože v čištěné krevní plasmě jsou obsaženy jen velmi níz’ké koncentrace požadovaného antigenu. Z těchto důvodů bylo až dosud velmi obtížné připravovat požadovanou vakcinu proti viru hepatitis B v průmyslovém měřítku.
Úkolem vynálezu je tedy vyřešit způsob výroby povrchového antigenu hepatitis B ve vysokém výtěžku.
Dalším úkolem vynálezu je příprava nových konstrukcí DNA, které by byly schopny exprimovat povrchový an.tigen hepatitis B na vysoké úrovni.
Tyto a další úkoly, které vynález řeší, jsou zřejmé z dalšího popisu a definice předmětu vynálezu.
Podstata vynálezu
Nyní se v souvislosti s vynálezem zjistilo, že povrchový antigen hepatitis B je možno produkovat ve vysokých výtěžcích kultivací kvasinkových buněk transformovaných konstrukcemi DNA obsahujícími sekvence kódující povrchový antigen hepatitis B za řízení regulačními oblastmi, které jsou responsivní vůči methanolu, zdrojům uhlíku nepotlačujÍGÍm katabolit a nedostatku zdroje uhlíku.
Předmětem vynálezu je způsob přípravy povrchového antigenu hepatitis B, vyznačující se tím, že se kultivuje kmen kvasinek rodu Pichia transformovaný plasmidem v živném prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku zvolený ze souboru zahrnujícího
CS 276 453 B6
i) alespoň jeden zdroj uhlíku a energie zvolený ze skupiny zahrnující methanol a zdroj uhlíku nevykazující katabolitovou represi, ii) alespoň jeden zdroj uhlíku a energie vykazující katabolitovou represi s tou podmínkou, že v případě ii) se získaný produkt podrobí podmínkám zahrnujícím nedostatek zdroje uhlíku, přičemž uvedený plasmid obsahuje DNA fragment, DNA bakteriálního plasmidu, selektovatelný kvasinkový markerový gen a kvasinkovou autonomní replikační sekvenci, kde uvedený DNA fragment obsahuje
a) regulační oblast, která je schopna řídit transkripci mediátorové RNA, pokud je umístěn na konci 5’ polypeptidové kódovací oblasti, přičemž tato regulační oblast je responsivní k alespoň jedné z podmínek zahrnujících
i) přítomnost methanolu v kultivačním prostředí se kterým hostitelský organismus, obsahující uvedený DNA fragment, ve styku, ii) přítomnost zdroje uhlíku nevykazujícího katabolitovou represi odlišného od methanolu v kultivačním prostředí, se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku a iii) nedostatek zdroje uhlíku v kultivačním prostředí se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku poté; co byl hostitelský organismus nechán růst na zdroji uhlíku a energie vykazujícím katabolitovou represi a
b) polypeptid kódující oblast, přičemž tato kódující oblast kóduje povrchový antigen hepatitis B nebo jeho části.
Předmětem vynálezu je také fragment DNA, plasmid a transformovaný kmen rodu Pichia, které jsou popsány dále a které slouží k provádění způsobu podle vynálezu.
Přehled obrázků na výkrese
Na obr. 1 je znázorněna restrikční mapa regulační oblasti dihydroxyaceton syntázového genu (DAS) u kvasinek rodu Pichia.
Na obr. 2 je znázorněna restrikční mapa regulační oblasti primárního alkohol oxidázového genu (AOX1) u kvasinek rodu Pichia.
Na obr. 3 je znázorněna restrikční mapa regulační oblasti genu p40 u kvasinek rodu Pichia.
Na obr. 4 je znázorněna restrikční mapa plasmidu pA0P2·
Na obr. 5 je znázorněno schéma, podle kterého se postupuje při konstrukci plasmidu pBSAG5 a pBSAG5I.
| Na | obr. | 6 | je | znázorněna | restrikční | mapa | plasmidu | pHBS-5 |
| Na | obr. | 7 | je | znázorněna | restrikční | mapa | plasmidu | pAOT-1 |
| Na | obr. | B | je | znázorněna | restrikční | mapa | plasmidu | pY333. |
Obr. 9 ilustruje konstrukci plasmidu pYM39 z plasmidů pSA0H5 a pTHBS3.
Obr. 10 ilustruje konstrukci plasmidu pYMI6 z plasmidů pYM39 a pPG3.2.
Obr. 11 ilustruje konstrukci plasmidu pBSAGI5I z plasmidů pYMI6 a pBSAG5I,
Obr. 12 ilustruje inserci části plasmidu pBSAGI5I na lokus primárního alkoholu oxidázového genu (A0X1) chromosomu kvasinek rodu Pichia.
Obr. 13 znázorňuje schéma, podle kterého se postupuje při konstrukci plasmidu pTHBS3. V obrázcích se pro označení restrikčních enzymů používá následujících zkratek:
ϊ
CS 276 453 Β6
Zkratka _Restrikční enzym
| As | AsuII |
| B | BamHI |
| β2 | BglII |
| Bc | BC1I |
| C | Clal |
| H2 | HincII |
| H3 | HindlII |
| K | KpnII |
| Nd1 | Ndel |
| Nr | Nrul |
| Ps | Pstl |
| Pvi | Pvul |
| Pv2 | PvuII |
| *1 | EcoRI |
| R5 | EcoRV |
| S | Sáli |
| Sp | Sphl |
| Ss | Sstl |
| St | Stul |
| Xb | Xbal |
| Xh | Xhol |
Na připojených obrázcích jsou restrikční místa použitá pro manipulaci fragmentů DNA, která však byla zničena při spojování (ligaci), označena tak, že je zkratka zničeného mís ta uvedena v závorkách.
Při způsobu podle vynálezu se používá nového fragmentu DNA, který obsahuje regulační oblast a polypeptid kódující oblast, přičemž polypeptid kódující oblast kóduje povrchový antigen hepatitis B nebo jeho části a regulační oblast je schopna řídit transkripci mediá torové RNA, pokud je umístěna na konci 5' genu kódujícího polypeptid. Kombinace regulační oblasti genu, povrchového antigenu hepatitis B (HBsAg) a transkripčního terminátorového fragmentu je v tomto popisu dále označována termínem exprimačnl kazeta nebo exprimační jednotka. Regulační oblast použitá podle vynálezu je responsivní alespoň k jedné z podmínek zvoleně ze souboru zahrnujícího
a) přítomnost methanolu v kultivačním médiu, se kterým přichází hostitelský organismus obsahující exprimační kazetu do styku,
b) přítomnost zdroje uhlíku nepotlačujícího katabolit, odlišného od methanolu, v kul tivačním médiu, se kterým přichází hostitelský organismus obsahující exprimační kazetu do styku a cj nedostatek zdroje uhlíku v kultivačním prostředí, se kterým přichází hostitelský organismus obsahující exprimační kazetu do styku, poté, co byl hostitelský organismus ponechán růst na zdroji uhlíku a energie potlačujícím katabolit.
Součástí vynálezu jsou dále též nové lineární a cirkulární plasmidy obsahující shora popsané exprimační kazety.
Do rozsahu vynálezu spadají dále v podstatě čisté kultury kmenů kvasinek, které jsou transformovány shora popsanými lineárními nebo cirkulárními plasmidy.
Předmětem vynálezu je způsob přípravy povrchového antigenu hepatitis B, který se vyznačuje tím, že se kultivuje kmen kvasinek transformovaný shora popsanými plasmidy za takových podmínek, za kterých se dosáhne exprese požadovaného bílkovinného produktu.
Regulační oblasti používané při prováděni způsobu podle vynálezu jsou charakterizovány svou schopností odezvy na média obsahující
CS 276 453 B6
1) methanol,
2) zdroje uhlíku nepotlačující katabolit, jako například glycerol^, galaktóza, ethylacetát apod.,
3) zdroje uhlíku potlačující katabolit, jako například glukóza, ethanol, fruktóza apod., provede-li se poté kultivace za podmínek nedostatku zdroje uhlíku.
Jako příklady regulačních oblastí, které vyhovují shora uvedeným kritériím, je možno uvést regulační oblasti, jejichž restrikční mapy jsou znázorněny na obr. 1, 2 a 3. Regulační oblast znázorněná na obr. 1 je odvozena od dihydroxyaceton syntázového genu (DAS) Pichia pastoris. Regulační oblast znázorněná na obr. 2 je odvozena od primárního hlavního alkoholoxidázového genu (A0X1) Pichia pastoris (Pichia má dva alkohol oxidázové geny, které jsou v tomto popisu označovány A0X1 a A0X2). Regulační oblast znázorněná na obr. 3 je odvozena od genu p40 Pichia pastoris. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že z methylotrofních kvasinek, jako jsou například kvasinky Pichia pastoris je možno izolovat jiné regulační oblasti, které mají shora popsané vlastnosti. Použití takových regulačních oblastí, které mají podobné regulační vlastnosti jako konkrétní shora uvedené regulační oblasti, rovněž spadá do rozsahu vynálezu.
Povrchový antigen hepatitis B (HBsAg) byl izolován nedávno (Valenzuela a další (1979) Nátuře 280, 815) a lze ho získat působením vhodného restrikčního enzymu, na vhodné vektory, jako je například pHBS-5 (viz obr. 6, a Valenzuela a další, (1982), Nátuře 298, 347), pHBV-T-lA (Genentech, EPA, 73 657), pHBS-56 (identifikační číslo ATCC 40 047; viz EPA 120 551) atd.
Gen povrchového antigenu hepatitis B byl modifikován působením exonukleázy Bal31, aby se odstranily virální nekódující sekvence na konci 5' genu hepatitis B. Konec 3’ genu HBsAg byl modifikován digeraci endonukleázou a přidáním linkeru, aby se odstranily virální nekódující sekvence na konci 3’ genu hepatitis B. Gen povrchového antigenu hepatitis B byl dále modifikován, aby obsahoval vhodná restrikční místa pro manipulaci fragmentu DNA.
Výsledný fragment DNA je EvoRI-StuI inzert a má tuto sekvenci nukleotidů:
| - GAATTCATGG | AGAACATCAC | ATCAGGATTC | CTAGGACCCC |
| TGCTCGTGTT | ACAGGCGGGG | TTTTTCTTGT | TGACAAGAAT |
| CCTCACAATA | CCGCAGAGTG | TAGACTCGTG | GTGGACTTCT |
| CTCAATTTTČ | TAGGGGGATC | TCCCGTGTGT | CTTGGCCAAA |
| ATTCGCAGTC | CCCAACCTCC | AATCACTCAC | CAACCTCCTG |
| TCCTCCAATT | TGTCCTGGTT | ATCGCTGGAT | GTGTCTGGGG |
| CGTTTTATCA | TATTCCTCTT | CATCCTGCTG | CTATGCCTCA |
| TCTTCTTATT | GGTTCTTCTG | GATTATCAAG | GTATGTTGCC |
| CGTTTGTCCT | CTAATTCCAG | GATCAACAAC | AACCAGTACG |
| GGACCATGCA | AAACCTGCAC | GACTCCTGCT | CAAGGCAACT |
| CTATGTTTCC | CTCATGTTfiC | TGTACAAAAC | CTACGGATGG |
| AAATTGCACC | TGTATTCCCA | TCCCATCGTC | CTGGGCTTTC |
| GCAAAATACC | TATGGGAGTG | GGCCTCAGTC | CGTTTCTCTT |
| GGCTCAGTTT | ACTAGTGCCA | TTTGTTCAGT | GGTTCGTAGG |
| GCTTTCCCCC | ACTGTTTGGC | TTTCAGCTAT | ATGGATGATG |
| TGGTATTGGG | GGCCAAGTCT | GTACAGCATC | GTGAGTCCCT |
| TTATACCGCT | GTTACCAATT | TTCTTTTGTC | TCTGGGTATA |
| CATTTAAGGC | CT-3' | ||
| Strukturální | genové konstrukce | s regulační oblastí podle | vynálezu se mohou amplifiko |
| it, reprodukovat | a experimovat v organismech různými způsoby | . Pro autonomní replikaci | |
| kvasinkách je užitečný prvek autonomní replikační sekvence | (ARS). Jako příklady je mož- | ||
| i uvést PARS1 a | PARS2 odvozené od | Pichia pastoris (viz dosud | nevyřízenou patentovou při- |
CS 276 453 B6 hlášku USA 6. 666 577, autor: Cregg, převedenou na firmu Philips Petroleum Co.). Když je naproti tomu požadována integrativní transformace hostitele, nepoužívá se žádného prvku ARS. Přednostní metoda, jak dosáhnout integrativní transformace je popsána v dosud nevyřízené patentové přihlášce USA č. 791 013, autor: Cregg, převedená na firmu Phillips Petroleum Co., která zahrnuje použití místně směrovaného integračního vektoru, který obsahuje
- první insertovatelný fragment DNA,
- selektovatelný markerový gen a
- druhý insertovatelný fragment DNA.
První a druhý insertovatelný fragment DNA by měl mít délku vždy alespoň asi 200 nukleotidů a měl by obsahovat nukleotidové sekvence, které jsou hormologičké s částmi genomové DNA druhu kvasinek spadajících do rodu Pichia. Různé složky integrativního vektoru , jsou uspořádány do série za vzniku lineárního fragmentu DNA tak, že exprimační kazeta a selektovatelný markerový gen jsou umístěny mezi koncem 3’ prvního insertovatelného fragmentu DNA a koncem 5' druhého insertovatelného fragmentu DNA. Vzájemná orientace prvního a druhého insertovatelného fragmentu DNA v sériově uspořádaném lineárním fragmentu je stejná jako v genomu Pichia.
Do DNA použité pro transformaci hostitelského kmene je nutno zahrnout alespoň jeden selektovatelný markerový gen. To usnadňuje selekci a izolaci těch organismů, do kterých byla zavedena transformační DNA. Markerový gen dodává transformovanému organismu určitý rys fenotypu, který hostitel dříve neměl, například navrácení schopnosti produkovat specifickou aminokyselinu v tom případě, kdy netransformovaný hostitelský kmen vykazoval defekt při postupu biosyntézy specifické aminokyseliny.
Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že do vektorů používaných při provádění tohoto vynálezu je možno rovněž zavést přídavné sekvence DNA, jako například DNA bakteriálního plasmidu, DNA bakteriofágu apod. Tyto sekvence umožňují amplifikaci a udržování těchto vektorů v bakteriálních hostitelích.
Exprese v transformovaných kvasinkách.
Shora popsané plasmidy podle vynálezu jsou použitelné v kmenech kvasinek, které lze transformovat. Regulace exprese genu v kvasinkách za použití nových fragmentů DNA podle vynálezu se může provádět tak, že se transformované organismy vystaví podmínkám zahrnujícím nedostatek zdroje uhlíku. Vystavení těmto podmínkám poté, co byly organismy ponechány růst na různých zdrojích uhlíku jak potlačujících katabolit, tak nepotlačujících katabolit, indukuje expresi genového produktu, který je udržován pod kontrolou regulačních oblastí podle vynálezu. Jiný způsob, jak dosáhnout exprese požadovaného genového produktu ve vhodném kmeni transformovaných kvasinek, spočívá v tom, že se kvasinky nechají růst na methanolu. Ještě dalším způsobem pro vyvolání exprese požadovaného genového produktu je růst transformovaných kvasinek na mediích, které obsahují zdroje uhlíku nepotlačující katabolit.
Regulační oblasti podle vynálezu jsou užitečné pro expresi ve všech kmenech kvasinek, poněvadž se ukázalo, že jsou indukovány za různých podmínek. Kvasinky schopné růstu na methanolu nebo na zdrojích uhlíku nepotlačujících katabolit mohou být přinuceny ke tvorbě cizích, tj. heterologických polypeptidú přímo, zatímco kvasinky schopné růstu na zdrojích uhlíku potlačujících katabolit mohou být přinuceny ke tvorbě cizích polypeptidú tím, že se jejich buňky takto získané vystaví podmínkám zahrnujícím nedostatek zdroje uhlíku.
Při způsobu podle vynálezu se přednostně používá transformovaných kmenů kvasinek, které spadají do následujících rodů.
Candida,
Kloeckera,
Saccharomyces,
Schizosaccharomyces,
CS 276 453 B6
Rhodotorula,
Hansenula,
Torulopsis,
Pichia a Kluyveromyces.
Kvasinkám z těchto rodů se dává přednost s ohledem na bezpečnou manipulaci s nimi, na jejich podmínky růstu a na další faktory, které jsou dobře prozkoumány a odborníkům v tomto oboru známy.
Při jednom provedení způsobu podle vynálezu se obzvláštní přednost dává těm kmenům kvasinek, které jsou schopny růst na methanolu, jakožto zdroji uhlíku a energie. Kvasinky, o nichž je známo, že jsou schopny růstu na methanolu zahrnují tyto rody:
Candida,
Kloeckera,
Saccharomyces,
Rhodotorula,
Hansenula,
Torulopsis a Pichia.
Vzhledem k tomu, že regulační oblasti podle tohoto vynálezu jsou rovněž indukovány růstem na zdrojích uhlíku nepotlačujících katabolit a za podmínek nedostatku zdroje uhlíku, může se při provádění tohoto vynálezu použít kmenů kvasinek, které jsou schopny růstu na takových nemethanolických substrátech, jako je glukóza, ethylacetát, glycerol, ethanol, laktóza, galaktóza,· fruktóza, sacharóza a směsi dvou nebo více těchto látek. Exprese genového produktu pod kontrolou regulačních oblastí podle vynálezu je možno dosáhnout tím, že se hostitelský organismus nechá růst na vhodném nemethanolickém zdroji uhlíku nepotlačujícím katabolit, jako je například glycerol, nebo galaktóza nebo tím, že se hostitelský organismus nechá růst na vhodném zdroji uhlíku potlačujícím katabolit, jako je například ethanol, glukóza a fruktóza, načež se vystaví podmínkám zahrnujícím nedostatek zdroje uhlíku.
Z hostitelských kmenů kvasinek se obzvláštní přednost dává mutantu Pichia pastoris GS115, což je mutant defektní, pokud se týče jeho schopnosti produkovat histidin. V důsled ku defektní dráhy vedoucí ke tvorbě histidinu způsobené vadným genem kódujícím histidinol dehydrogenázu byl mutant GS115 určen jako mutant s genotypem his4. Mutant GS115 je odvozen od Pichia pastoris NRRLY-11430 a je uložen pod registračním číslem NRRLY-15851 ve sbírce kultur Severního oblastního výzkumného centra ministerstva zemědělství USA (Northern Regio nal Research Center of the United States Department of Agriculture) v Peorii ve státě Illinois, USA. Tento konkrétní hostitel je užitečný proto, poněvadž se jedná o auxotrofní mutant s defektní dráhou vedoucí k produkci histidinu. Transformace tohoto hostitele vekto rem, který obsahuje mezi jinými sekvencemi DNA sekvence kódující funkci genu HIS4, umožňuje snadnou selekci transformovaných hostitelů.
Dalším přednostním kmenem kvasinek pro použití při provádění tohoto vynálezu je mutant Pichia pastoris GS190, což je mutant defektní, pokud se týče jeho schopnosti produkovat arginin. Defektnost dráhy vedoucí ke tvorbě argininu je způsobena mutací genu kódujícího argininosukcinát lyázu. Mutant GS190 je odvozen od kmene Pichia pastoris NRRL Y-11430
CS 276 453 B6 a je uložen ve sbírce kultur Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture v Peorii, Illinois (USA) pod identifikačním číslem NRRL Y-18014.
Ještě dalším přednostním hostitelským kmenem kvasinek je dvojnásobně auxotrofní mutant PPF1, což je mutant, který je defektní jak pokud se týče dráhy vedoucí ke tvorbě histidinu, tak dráhy vedoucí ke tvorbě argininu. Je to způsobeno tím, že u mutantu PPF1 došlo jak k mutaci genu kódujícího histidinol dehydrogenázu, tak k mutaci genu kódujícího argininosukcinát lyázu. Mutant PPF1 je uložen ve sbírce kultur Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture v Peorii, Illinois (USA) pod identifikačním číslem NRRL Y-18017.
Rovněž Escherichia coli je vhodným hostitelem pro plasmidy podle vynálezu. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že mnohé kmeny E. coli jsou vhodnými hostiteli. Několik kmenů používaných při práci na tomto vynálezu je uvedeno dále:
Označení kmene Identifikační číslo
MC1061 není známo
LE392 ATCC 33572
MM294 ATCC 33625
Transformační postup Píchla pastoris
Experimentální postupy vedoucí k transformaci Pichia pastoris byly již popsány dříve a jsou podrobněji uvedeny v příkladu I.
Pichia pastoris může být transformován enzymatickou digerací buněčných stěn za vzniku sferoplastů. Sferoplasty se pak smísí s transformační DNA a inkubují v přítomnosti vápenatých iontů a polyethylenglykolu a pak se regenerují v selektivním růstovém médiu deficientním na histidin. Transformační ONA zahrnuje gen HIS4, v němž je hostitelský kmen deficientní. Na použitém selektivním médiu přežívají proto jen transformované buňky.
Extrakce povrchového antigenu hepatitis B
Odborníkům v tomto oboru je zřejmě, že existují četné metody pro extrakci heterologického proteinu z jednobuněčného rekombinantního hostitele. Pro izolaci povrchového antigenu hepatitis B HBsAg připraveného způsobem podle vynálezu je možno použít jakékoliv známé technologie drcení buněk a koncentrace proteinů a/nebo extrakce z rozdrcených buněk. Stanovení povrchového antigenu hepatitis B
Transformované buňky se nechají shora uvedeným způsobem růst za vhodných podmínek exprese. Po rozdrcení buněk se rozpustná a nerozpustná frakce analyzuje na HBsAg. Rozpustná frakce se analyzuje na 22 nm částice za použití komerční analytické soupravy AUSTRIA®II (Abbot Laboratories). Jak rozpustná, tak nerozpustná frakce se analyzuje na monomer za použití postupů Western blotting proceduře, při kterých se používá antisera proti monomerrtí
125 formě HBsAg a proteinu A značeného radioaktivním jodem I.
Vynález je podrobněji popsán v následujících příkladech provedení. Příklady mají pouze ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.
Příklady
V příkladech se používá následujících zkratek, které mají tento význam:
| SDS | natrium dodecylsulfát |
| EOTA | ethylendiamintetraoctová kyselina |
| TEMED | Ν,Ν,Ν',Ν' - tetramethylendiamin |
| DTT | dithiothreitol |
| BSA | albumin z hovězího séra |
| EtBr | ethldiumbromid |
CS 276 453 B6
O
| PMSF | fenylmethylsulfonylfluorid |
| Ci | Curie |
| Zymolyasa | 60 000 zdroj: Miles Laboratories |
Pufry a roztoky používané v následujících příkladech mají dále uvedené složení
| 1 M Tris pufr: | 121,1 g Tris báze v 800 ml ^0, pH upraveno na požadovanou hodnotu přidav kem koncentrované (35 %) vodné HC1, před konečnou úpravou pH roztok ponechán vychladnout na teplotu místnosti, zředěn na konečný objem 1 litr. |
| Pufr TE: | 1,0 mM EDTA v 0,01 M (pH 7,4) Tris pufru |
| PBS (fosforeč- | 10 mM fosforečnanu sodného (pH 7,0) |
| nanem tlumený roztok kuchyňské soli) | 0,15 M NaCl |
| SDS gelový pufr | 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8) 2% SDS 10% glycerol 100 mM dithiothreitol 0,001% bromfenolová modř |
| Médium YPD | 1 % bakto-kvasinkový extrakt 2 % bakto-pepton 2 % dextrosa |
| Médium SD: | 6,75 g kvasinkový dusíkový základ bez aminokyselin (DIFCO) 2 % dextrosa v 1 litru vody. |
| SED: | 1 M sorbitol 25 mM EDTA 50 mM DTT |
| pufr SCE: | 9,1 g sorbitol 1,47 g citrát sodný 0,168 g EDTA 50 ml H20 pH pomocí HC1 na 5,8 |
| CaS: | 1 M sorbitol 10 mM CaCl2 filtrační sterilizace |
| roztok PEG: | 20 % polyethylenglykol-3350 10 mM CaGl2 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) filtrační sterilizace |
| SOS: | 1 M sorbitol 0,3x médium YPD 10 mM CaCl2. |
CS 276 453 B6
Složení základních solí (pro růst transformovaných kvasinek Pichia ve fermentoru)
Základní soli Koncentrace
| H3PO4, 85 % | 4,2 ml/1 |
| CaS04 . 2H20 | 0,18 g/1 |
| K2S04 | 2,86 g/1 |
| MgS04 . 7H20 | 2,34 g/1 |
| KOH | 0,65 g/1 |
| Médium uváděné pro Pichia (pro růst GS115/pBSAG5 ve fermentoru) | ||
| Koncentrace ve | vodě | |
| H3P04 (85 %) | 3,5 ml/1 | |
| CaS04 . 2H20 | 0,15 g/1 | |
| k2so4 | 2,38 g/1 | |
| MgS04 . 7H20 | 1,95 g/1 | |
| KOH | 0,65 g/1 | |
| FeS04 . 7H20 | 0,065 g/1 | |
| CuS04 . 5H20 | 0,006 g/1 | |
| ZnS04 . 7H20 | 0,020 g/1 | |
| MnS04 . H30 | 0,003 g/1 | |
| Biotin | 0,000041 g/1 | |
| zdroj uhlíku | 20 až 100 g/1 | |
| Roztok stopových solí [pro růst | GS115 CpBSAGISl)] | |
| Koncentrace ve | vodě | |
| CuS04 . 5H20 | 0,06 g/1 | |
| KI | 0,08 g/1 | |
| MnS04 . H20 | 0,3 g/1 | |
| Na2Mo04 . 2H20 | 0,2 g/1 | |
| H3B03 | 0,02 g/1 | |
| ZnS04 . 7H20 | 2,0 g/1 | |
| FeCl3 . 6H20 | 4,8 g/1 | |
| h2so4 | 3 až 5 ml/1 (po | Odstranění zákalu) |
| ivací pufr: | 4,3 mM Na2HP04 |
1,5 mM KH2PO4
2,7 mM KC1
0,15 M NaCl % albumin z hovězího séra 0,02 % azidu sodného konečná hodnota pH 7,4
CS 276 453 B6
Solubilizační pufr: 10 mM natrium fosfátový pufr (pH 7,5)
0,5 M NaCl
0,1 % Triton X-100 mM PMSF
Pokud není uvedeno jinak, představují shora uvedené roztoky základní koncentraci (lx). Tam, kde se v příkladech používá různých koncentračních úrovní, je tato skutečnost označena uvedením násobku základní koncentrace (lx) roztoku.
Příklad I
Postup transformace Pichia pastoris
A. Růst buněk
1. Kolonie Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) se inokuluje do asi 10 ml YPD média a kultura se protřepává při 30 °C po dobu 12 až 20 hodin.
2. Po fázi růstu
3. Po notě 0DéQ0 20 hodin.
4. Kultura se izoluje při dosažení θΟ^θθ asi 0,2 až 0,3 (po asi 16 až 20 hodinách) odstředěním při 1 500 g po dobu 5 minut.
asi 12 az 20 hodinách se buňky zředí na asi 0,01 az 0,1 a udržuji se v log v médiu YPD při 30 °C po dobu asi 6 až 8 hodin.
asi 6 až 8 hodinách se 100 ml média YPD inokuluje 0,5 ml násadové kultury o hodasi 0,1 (nebo ekvivalentním množstvím) a třepe se při 30 °C po dobu asi 12 až
8. Příprava sferoplastů
1. Buňky se jednou promyjí 10 ml sterilní vody (všechna odstřelování ve stupních 1 až 5 se provádějí po dobu 5 minut při 1 500 g).
2. Buňky se jednou promyjí 10 ml čerstvě připraveného SED.
3. Buňky se promyjí dvakrát 10 ml sterilního 1 M sorbitolu.
4. Buňky se resuspendují v 10 ml pufru SCE.
5. Přidá se 5 až 10 /Jl 4 mg/ml Zymolyase 60,000 (Miles Laboratories). Buňky se inkubují při 30 °C po dobu asi 30 až 60 minut.
Vzhledem k tomu, že příprava sferoplastů je kritickým stupněm transformačního postupu, měla by se tvorba sferoplastů monitorovat následujícím způsobem: Před nebo těsně po přidání zymolyázy a v různých dobách v průběhu inkubačni periody se 100 /j1 alikvotní díly buněk * přidají k 900 jul 5% SDS a 900 yUl 1 M sorbitolu. Inkubace se zastaví v okamžiku, kdy dochází k lysi v SOS, ale ne v sorbitolu (obvykle mezi 30 a 60 minutami inkubace).
6. Sferoplasty se dvakrát promyjí 10 ml sterilního 1 M sorbitolu při odstřeňování (1 000 g) po dobu 5 až 10 minut. (Doba a rychlost odstřeňování se mohou různit; používá se odstřeňování, které postačuje pro vytvoření pellety, ale které nezpůsobuje praskání).
7. Buňky se jednou promyjí v 10 ml sterilního CaS.
8. Buňky se resuspendují celkem v 0,6 ml CaS.
C. Transformace
1. Vzorky DNA (do objemu nejvýše 20 >ul) se umístí do sterilních polypropylenových zkumavek o rozměrech 12 x 75 mm. (ONA by měla být ve vodě nebo pufru TE; aby se dosáhlo maximálních frekvencí transformace s malými množstvími DNA, je účelné přidat ke každému vzorku asi 1yul 5 mg/ml DNA ze sonikované E. coli.
CS 276 453 B6
2. Ke každému vzorku DNA se přidá 100 pl sferoplastů. Inkubace se provádí po dobu asi 20 minut při teplotě místnosti.
3. Ke každému vzorku se přidá 1 ml roztoku PEG a inkubace se provádí při teplotě místnosti po dobu přibližně 15 minut.
4. Vzorky se 5 až 10 minut odstřeňují při 1 000 g a dekantuje se roztok PEG.
5. Vzorky se resuspendují ve 150 pl SOS a inkubují se 30 minut při teplotě místnosti.
6. Přidá se 850 pl sterilního 1 M sorbitolu a alikvotní díly vzorků se dále popsaným způsobem umístí na misky. ·
0. Regenerace sferoplastů ,
1. Předpis pro regenerační agarové médium:
a. Agar-KCl- 9 g bakto-agar, 13,4 g KC1, 240 ml t-^O, autoklávování.
b. 10X glukóza - 20 g dextróza, 100 ml H20, autoklávování.
c. lOx SC- 6,75 g dusíkové báze kvasinek bez aminokyselin, 100 ml HjO, autoklávování (před nebo po autoklávování se přidá kterákoliv požadovaná aminokyselina nebo nukleová kyselina až do koncentrace 200 Aig/ml).
d. přidá se 30 ml lOx glukózy a 30 ml lOx SC k 300 ml roztaveného agar-KCl roztoku. Přidá se 0,6 ml 0,2 mg/ml biotinu a kterékoli jiné požadované aminokyseliny nebo nukleové kyseliny do koncentrace 20 pg/ml. Roztavený regenerační agar se udržuje při 55 až 60 °C.
2. Umístování transformačních vzorků na misky:
Spodní agarová vrstva 10 ml regeneračního agaru se nalije na každou misku alespoň 30 minut před dohotovením transformačních vzorků. 10 ml alikvotní díly regeneračního agaru se rozdělí do zkumavek v lázni o teplotě 45 až 50 °C během doby, kdy jsou transformační vzorky v SOS. Celé množství vzorku se přidá k 10 ml alikvotnímu dílu roztaveného regeneračního agaru udržovaného při 45 až 50 °C a směsi se nalijí na misky obsahující 10 ml pevnou spodní agarovou vrstvu z regeneračního agaru,
3. Stanovení kvality Sféroplastového preparátu
Oddělí se 10 pl jednoho vzorku a lOOnásobně zředí přídavkem k 990 pl l.M sorbitolu. Oddělí se 10 pl lOOnásobně zředěného roztoku a provede se nově 100 násobné zředění přídavkem k dalšímu 990 pl alikvotnímu dílu 1 M sorbitolu. Na miskách se YPD agarové médium převrství vždy 100 pl obou zředěných roztoků za účelem stanovení koncentrace nesféroplastovaných celých buněk zbylých v preparátu. Přidá se 100 pl každého z obou zředěných roztoků k 10 ml regeneračního agaru, doplněného 40 pg/ml histidinu za účelem stanovení celkového množství regenerovatelných sferoplastů. Příznivé hodnoty pro transformační experiment jsou
3 až 3.10 celkem regenerovatelných sféroplastů/ml a asi 1.10 celých buněk/ml.
Příklad II
Konstrukce rodiny vektorů pA0P2
1. Plasmid pPG2.5 (plasmid na bázi pBR322 obsahující přibližně 2,5 kbp EcoRI-SalI fragment z plasmidu pPG4.0, kterýžto plasmid obsahuje primární alkoholoxidázový gen (A0X1) a regulační oblasti a je dostupný v hostiteli E. coli pod identifikačním číslem NRRL B-15868 ve sbírce kultur Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA) se digeruje BamHI.
2. Linearizovaný plasmid se digeruje BAL31;
3. Na výslednou DNA se působ! Klenowovým fragmentem, aby se aktivovaly tupé konce a provede se ligace k EcoRI linkerům;
4. Produkty ligace se transformují do kmene E. coli MM294;
CS 276 453 B6
5. Transformanty se podrobí skríningu koloniovou hybridizací za použití syntetického oligonukleotidu s následující sekvencí:
TTATTCGAAACGGGAATTCC.
Tento oligonukleotld obsahuje sekvenci promotoru AOXl až po kodon ATG iniciace, nikoliv však včetně něho, připojenou k sekvenci EcoRl linkeru.
6. Pozitivní klony se sekvencují Maxam-Gllbertovou technikou. Všechny tři pozitivní klony mají následující sekvenci:
5'...TTATTCGAAACGAGGAATTCC.. .3'.
Všechny si podržely A z ATG (podtrženo ve shora uvedené sekvenci). Bylo rozhodnuto, že toto A pravděpodobně nebude na závadu; všechny následující klony jsou deriváty těchto pozitivních klonů. Tyto klony obdržely laboratorní označení pAOPl, pA0P2 a pA0P3.
7. Při skríningu produktů ligace BAL31/linker byly identifikovány dva další klony. Mají následující sekvenci:
5'... TAATTATTCGGAATTCC ...3' pAOXl EcoRl
Tyto klony byly označeny pAOP5 a pA0P6. *
Při variaci tohoto postupu se plasmid pPG2.5 rozštěpí AsuII místo BamHI, na linearizovaný fragment se působí Klonowovým fragmentem (neprovádí se zpracování BAL31, jako tomu bylo shora) a provede se ligace k EcoRl linkerům. Výsledný plasmid obsahuje sekvence promotoru AOX1, nikoliv však iniciační kodon ATG. Takto připravený plasmid byl označen pAOP4 a má následující sekvenci:
5'... TAATTATGGAATTC ...3' pAOXl EcoRl
Promotor A0X1 (pAOXl) responduje na katabolickou represi uhlíku prudkým přerušením syntesy enzymu. Kromě toho responduje AO promotor na nedostatek zdroje uhlíku. Růst na methanolu vede k další indukci A0X1 promotoru. Kromě toho je z rozsáhlého studia, které je například publikováno v Ellis, Brust, Koutz, Waters, Harpold a Gingeras, Molecular and Cellular Biology, květen 1985, str. 1111 - 1121, zřejmé,že fragment A0X1 promotoru použitý podle vynálezu je regulován podobným způsobem jako promotor AOX1 v chromosomu. Všechny klony připravené a izolované způsobem popsaným v tomto přikladu responduji na katabolickou represi, nedostatek zdroje uhlíku a indukci methanolem, jako to činí samotný A0X1 promotor
Popis AO terminátoru
Fragment Stuí-HindlII použitý jako AO terminátor obsahuje sekvence poskytující templát pro polyadenylaci transkriptu AOX1 mRNA. Tyto sekvence zahrnují
TATAGTATAGGATTTTTTTTGTC-polyadenylace.
Když je Stuí-HindlII fragment umístěn na plasmidu 3' k polypeptid kódující oblasti, promotuje terminaci RNA. Byly izolovány terminační sekvence AOXl a lze je získat z plasmidu pPG3.2, což je plasmid na bázi pBR322 obsahující terminační sekvence AOXl. Plasmid transformovaný do hostitele E. coli bude veřejnosti k dispozici po udělení patentu na tuto přihlášku ve sbírce Northern Regional Research Center of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois USA pod identifikačním číslem NRRL B-15999.
Příklad III
Sekvence stupňů použité pro přípravu plasmidů v tomto příkladu jsou souhrnně něny na obr. 5.
znázor13
CS 276 453 B6
Konstrukce pBSAG5 a pBSAG5I
1. Konstrukce pCFL2
Vektor pA0P2, který obsahuje A0X1 promotor bez TG z ATG na svém 3'- konci se rozštěpí HincII. DNA fragment obsahující promotor byl izolován a ligován do pBR322, který byl před tím rozštěpen HindlII a vyplněn Klenowovým fragmentem. Touto reakcí vznikl vektor pCFL2.
2. Konstrukce pBSA0P2 pBR322-BglII, což je pBR322, jehož místo PvuII bylo nahrazeno místem BglII, byl digerován EcoRI a Claí. Linearizovaný plasmid byl ligací spojen s 5 AOXl-obsahujícím Clal/EcoRI fragmentem z pCFL2. Výsledný vektor byl označen pBSA0P2.
3. Konstrukce pBSAG22
Plasmid pHBS-5 (který popsal Valenzuela a další V Nátuře 298, 347 - 350 (1982); viz obr. 6), který obsahuje HBsAg gen insertovaný do místa EcoRI v pBR322, byl digerován Claí. Pomocí exonukleázy Bal31 bylo v obou směrech vyjmuto přibližně 60 bázových pásů. Zbývající fragment DNA byl digerován BamHI a vyplněn Klenowovým fragmentem. Po ligaci byla směs přibližně 20Q transformantů rozštěpena Ncol. Linearizované plasmidy byly izolovány a podrobeny nové ligaci. Po transformaci E. coli mělo přibližně 10 % všech plasmidů (označených pBSAGl) nově vytvořené místo Ncol. pBSAGl byl digerován Ncol, vyplněn Klenowovým fragmentem a digerován BamHI. Tento fragment plasmidu byl ligován k pBSA0P2, který byl před tím digerován EcoRI, vyplněn Klenowovým fragmentem a digerován BamHI. Výsledný vektor byl označen pBSAG22.
4. Konstrukce pB5AG4, pBSAG5, pBSAG5I
Plasmid pAOT-1, což je plasmid na bázi pBR322 získaný ligací 1,6 kbp Sall-HindlII fragmentu pPG3.2 (dostupného v hostiteli E. coli pod identifikačním číslem NRRL B-15999) do Sall-HindlII rozštěpeného pBR322 Δ EcoRI (tj. pBR322 se zničeným místem EcoRI; viz obr. 7), který nese 3'-A0X1 transkripční terminační fragment se rozštěpí Xbal a Pstl. Fragment obsahující terminátor se ligací spojí s p8SAG22, který byl před tím štěpen Xbal a Pstl, za vzniku pXP-1. pBSAG22 se digeruje Dral, pak se přidají Srul linkery a nakonec se použije Stul a EcoRI pro další digeraci. HBsAg strukturální gen se isoluje a liguje do pXP-1, který byl před tím štěpen Stul a EcoRI, za vzniku pBSAG4.
HBsAg obsahuje fragment Claí z pBSAG4 se liguje na jedinečné místo Claí pY333 (viz obr. 8) za vzniku pBSAG5 a pBSAG5I. Restrikční mapa plasmidu pBSAG5I je uvedena na obr. 11, Plasmidy pBSAG5 a pBSAG5I se liší pouze v orientaci fragmentu Claí, který obsahuje exprimeční kazetu 5 -AOXl/HBsAg/3 '-A0X1. V pBSAG5 sousedi tedy fragment 5*-A0Xl s genem Pichia HIS4, zatímco k fragmentu 3*-A0Xl přiléhá autonomní element PARS2. Plasmid pBSAG5 transformovaný do hostitele E. coli byl uložen ve sbírce kultur Northern Region Research Center of the United States Department of Agriculture, kde bude po udělení patentu na tuto přihlášku dostupný pro veřejnost. Kmen E. coli MC1061-pBSAG5 obdržel identifikační číslo NRRL B-18028.
Příklad IV
Konstrukce hostitele GS115 Pichia pastoris exprimujícího HBsAg (pBSAGI5I)
V tomto příkladu je popsána příprava hostitele Pichia pastoris, u kterého je v chromosomu primární alkohol oxidázový gen (A0X1) nahrazen genem povrchového antigenu hepatitis B.
Pro přípravu mutantu hostitele P. pastoris Aoxl-, který exprimuje HBsAg se zkonstruuje plasmid pBSAGI5I, jak je to znázorněno na obr. 9 až 11.
Prvním stupněm při konstrukci je digerace A0X1 promotor-LacZ genového exprimačního vektoru pSA0H5 a A0X1 promotor-HBsAg exprimačního vektoru pTHBS3, které jsou připraveny
CS 276 453 B6 způsoby uvedenými dále a znázorněnými na obr. 13, restrikční endonukleázou HindlII. Pro přípravu pTHBS3 se plasmid pAOT-1 (viz obr. 7) rozštěpí Stul, liguje pomocí EcoRI linkerů a pak digeruje Pstl. Izoluje se EcoRI-Pstl fragment obsahující 3'-AOXl fragment. Vektor pAOP3, který obsahuje 5'-A0Xl sekvence, se rozštěpí EcoRI a Sstl; výsledný 5'-A0Xl fragment se liguje do E. coli-S. cerevisiae shuttle vektoru pSEYIOl (Douglas a další, 1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81 3983 - 3987), který byl před tím štěpen EcoRI a Sstl. Výsledkem ligace těchto pA0P3 a pSEYIOl fragmentů je plasmid pTA020. Plasmid pTA020 obsahuje geny URA3 a ampicilinu pro selekci v S. cerevisiae a bakteriích, 2 /j kruh pro replikaci v S. cerevisiae a 5#-A0Xl sekvence.
Plasmid pTAO2O se zčásti štěpí Pstl. Linearizovaný vektor se izoluje a štěpí EcoRI. Největší fragment (který obsahuje 2 /1 kruhové Sekvence, gen URA3 a 5'rAOXl fragment) se liguje k 3'-A0Xl fragmentu získanému z pAOT-1, za vzniku vektoru pTHBSl.
HBsAg-obsahující EcoRI z pHBS-5 se izoluje digerací EcoRI a pak se liguje s pTHBSl, který byl před tím digerován EcoRI a zpracován bakteriální alkalickou fosfatázou. Výsledný vektor označený pTHBS2 obsahuje gen HBsAg vsunutý mezi 3'- a 5'-A0Xl sekvence.
Plasmid pY33O (který je k dispozici v hostiteli E. coli pod identifikačním číslem NRRL 8-15890) se štěpí EcoRI, vyplní Klenowovým fragmentem a pak štěpí Pstl. P. pastoris HIS4/PARS1 obsahující fragment se isoluje a liguje s Pstl-Sstl fragmentem z vektoru pTHBS2 (který obsahuje HBsAg gen lemovaný Á0X1 sekvencemi). Touto ligací se získá vektor pTHBS3.
1,4 kbp fragment získaný z pTHBS3 po digeraci s HindlII (kterýžto fragment obsahuje HBsAg gen, AQX1 terminační sekvenci a část AOX1 promotorové sekvence) se izoluje a insertuje do 7,7 kbp fragmentu z pSA0H5, který obsahuje Pichia HIS4 gen, většinu A0X1 promotoro vě sekvence a sekvence z pBR322. Pak se izoluje 9,1 kbp rekombinantní plasmid, pYM39, který obsahuje restaurované AOX1 promotorové sekvence.
Ve druhém stupni konstrukce se plasmid pPG3,2 (dostupný v hostiteli E. coli pod identifikačním číslem NRRL B-15999) digeruje PvuII a 1,5 kbp fragment, který obsahuje sekvence bezprostředně 3' vzhledem k A0X1 genu se insertuje na jedinečné místo Nrul pYM39. Izoluje sé 10,6 kbp rekombinantní plasmid, pYMI6, který obsahuje PvuII fragment orientovaný tak, že 3'AOXl genové proximálni sekvence jsou orientovány k části vektoru tvořené HIS4 genem. Plasmid pYMI6 obsahuje všechny komponenty požadované pro deleci A0X1 genu z hostitele Pichia a expresi HBsAg pod kontrolou AOX1 promotoru, ale neobsahuje uspořádaný HBsAg genový fragment pBSAG5.
Posledním stupněm konstrukce je proto rekombinace požadovaného HBsAg genu do vektoru s deleci A0X1 genu. Za tím účelem se pYMI6 a pBSAGSI (plasmid identický s pBSAG5, který se liší jen tím, že fragment Clal, který obsahuje exprimační kazetu HBsAg má opačnou orientaci) se digerují restrikčními enzymy Pstl a SphI. 6,3 kbp fragment z pBSAGSI, který obsahuje uspořádanou HBsAg genovou exprimační kazetu a Pichia HIS4 gen, se insertuje do 4,6 kbp fragmentu z pYMI6, který obsahuje ~i‘ A0X1 sekvence á většinu pBR322 za vzniku konečného 10,9 kbp plasmidu pBSAGISI; Plasmid pBSAGI5I, nesený hostitelem E. coli, je uložen ve sbír ce kultur Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois pod identifikačním číslem NRRL B-18021.
Pro transformaci P. pastoris his4 mutantního kmene GS115 (NRRL Y-15851) se pBSAGI5I nejprve digeruje restrikčním enzymem BglII za vzniku 7,2 kbp lineárního vektoru, který obsahuje 0,85 kbp sekvence od konce 5’ AOX1 genu na jednom konci a 1,1 kbp sekvence od konce 3’ AOX1 genu na druhém konci (obr. 12). Asi 2 jug BglII štěpeného pBSAHI5I se transformuje do GS115 selekcí na histidinovou prototrofii. Transformací vznikne asi 5 x 10^ His+ kolonií.
Transformační pochody, při kterých se pBSAGI5I insertuje jako lineární molekula na chromosomální lokus A0X1 má za následek deleci genu A0X1, a bude veřejnosti k dispozici po udělení patentu na tuto přihlášku. His+-transformované kmeny, ve kterých došlo k požadované lineární inserci se proto identifikují podle velmi pomalého růstu na methanolu. (P.
CS 276 453 Βδ pastoris má druhý slabší alkohol oxidázový gen A0X2, který produkuje dostatečné množství alkohol oxidázy pro pomalý růst na methanolu těch kmenů, které jsou defektní, pokud se týče primárního alkohol oxidázového genu).
Postup identifikace His+ transformantů, které nejsou schopny dobře růst na methanolu zahrnuje nejprve izolaci His+ buněk uložených v selektivním agaru. Přitom se postupuje tak, že se agar převede do 50 ml zkumavky obsahující 20 ml sterilní vody a pomocí Brinkmanova homogeniseru se zpracovává na prášek po dobu 30 sekund při nízké rychlosti. Zbytky agaru se oddělí od buněk přefiltrováním směsi přes gázu a promytím agaru 30 ml sterilní vody. Kvasinkové buňky se pak zředí na optickou hustotu Aggg 0,1, sonikují se pomocí Bransonova sonifikátoru nastaveného do polohy 4, aby se shluky kvasinkových buněk rozdělily a zředí se stonásobně sterilní vodou. Alikvotní díly o objemu 10 a 100 /ii se rozprostřou na misky s agarem obsahujícím 0,67 % dusíkaté báze kvasinek bez aminokyselin (Difco) a 0,1 % glu-1 kozy. Po třídenní inkubaci při 30 °C se kolonie, které se vyvinou v miskách, podrobí skríningu, pokud se týče jejich schopnosti růstu na methanolu tak, že se replikují na sérii misek s agarem obsahujícím 0,67 % kvasinkové báze bez aminokyselin a následující zdroje uhlíku: 1) žádný zdroj uhlíku, 2) 0,5 % methanolu a 3) 2 % glukózy. Z kolonií, které rostly na 2 % glukózy nebylo schopno 32 % růst dobře na methanolu.
Aby se potvrdilo, že došlo k inserci pBSAGI5I sekvencí, jak je to znázorněno na obr. 12, podrobí se jeden kmen P. pastoris, který je defektní, pokud se týče utilizace methanolu, celkové extrakci DNA, která se pak digeruje restrikčními endonukleázami a hybridizuje metodou Southern blot pomocí vzorků značených Ρ. V jedné sérii zkoušek Southern blot se DNA z Aoxl” kmene GS115 (pBSAGI5I) a Aox+ kmene GS115 digerují HindlII a hybridizují značeným pG4.0, což je plasmid, skládající se z A0X1 genu a sekvencí z pBR322, který je dostupný v hostiteli E. coli ve sbírce kultur Northern Reglonal Research Center, Peoria, Illinois (USA) pod identifikačním číslem NRRL B-15868. V řadách obsahujících GS115 DNA je obsažen 2,3 kbp fragment, který zakódovává A0X1. Tento 2,3 kbp fragment však chybí a žádné nové fragmenty nejsou obsaženy v řadách,obsahujících GS115 (pBSAGI5I) DNA. Tento výsledek ukazuje, že gen A0X1 byl z kmene GS115 (pBSAGI5I) deletován.
Příklad V
Růst kvasinek Plchia transformovaných vektory kódujícími HBsAg
1. Růst GS115 (pBSAG5) ve fermentoru
V třepaoí baňce se při 30 °C nechá přes noc vyrůst 10 % inokulum na kvasinkové dusíkaté bázi (YNB) + 2 % glukózy. Inokulum se přidá ke sterilizovaným základním solím (jejichž pH bylo nastaveno na 4) ve fermentoru. Glukózová vsázka se přidává ředicí rychlostí 0,05 až 0,1 h-'*·. Když dosáhne hustota buněk ustáleného stavu a koncentrace glukózy ve fermentoru se blíží hodnotě pod 100 ppm, indukuje se produkce HBsAg změnou uhlíkového zdroje ve vsázce na methanol nebo směs 50 % glukózy a 50 % methanolu.
2. Růst GS115 (pBSAGI5I) (Aoxl-) ve fermentoru
Optimální exprese rozpustné HBsAg Ausria aktivity (3 až 4 % rozpustného proteinu) se dosáhne růstem tohoto Aoxl organismu vsázkovým způsobem na mediu obsahujícím glycerol a pak methanol. Inokulum se může nechat vyrůst na YNB + glycerol. Základní soli a glycerol (konkrétně bylo použito 1 % solí a 4 % glycerolu) a biotin se mohou ve fermentoru autoklávovat. Po ochlazení by se mělo pH nastavit na hodnotu od 3,5 do 6 a před inokulací by se měly přidat stopové soli (2,5 ml/1). Před nebo po vyčerpání glycerolu se může začít uvádět 100 % methanol. Koncentrace methanolu dó 2 % neinterferují s akumulací HBsAg, která může pokračovat až 200 hodin. 5 % methanolu ve fermentoru však zastavuje akumulaci HBsAg.
Růstu do vyšších hustot buněk lze dosáhnout zvýšením koncentrace solí. Pro zvýšení hustoty buněk, které rostou na methanolu je obzvláště důležité zvýšení koncentrace Zinku. Když nebyl růst limitován zinkem, dosáhlo se vyšších koncentrací extraktovatelné Ausria
CS 276 453 B6 aktivity, ale byla vyšší i hodnota extrahovatelného proteinu, takže došlo k celkovému poklesu Ausria aktivity, vyjádřené jako percentuální podíl rozpustného proteinu.
3. Růst buněčných kultur GS115 (pBSAG5) a GS115 (pBSAGI5I) v třepacích baňkách
Transformovaná kolonie se soustředí a ňaproužkuje na SD misku. Pruh buněk se inokuluje v 50 ml YNB bujónu (1 χ YNB, 5yug/ml biotinu) s 5 % glukózy ve 250 ml třepací baňce. Tře páni se provádí přes noc při 30 °C a otáčkách 250 min-1 ve vzduchové třepačce. Ranní hodnota hustoty ODggg činí 2 až 3. Z třepací baňky se odstraní 100 OD^gg jednotek buněk (asi 109 buněk) a ty se odstředí v odstředivce IEC během 7 minut při 2000xg a teplotě místnosti. Buněčná peleta se resuspenduje v 500 ml YNB bujónu s 2 % glycerolu ve dvoulitrové třepací baňce (OD^gg - 0,2). Kultura se inkubuje při 30 °C a otáčkách 250 min1 ve vzduchové třepač ce dokud se nedosáhne OD^gg 2 až 3. V případě hostitele Aoxl” se z kultury odstraní 500 jednotek OOggg· Buněčná suspenze se 7 minut odstřeďuje na IEC při 2000xg. Buněčná peleta se resuspenduje v 500 ml YNB bujónu s 0,5 % methanolu (1,0 OD^gg). v případě Aoxl+ hostitele se z kultury oddělí 170 OD^gg, odstředí za stejných podmínek a resuspenduje v 50 ml YNB bujónu za použití 0,5 % methanolu (0,3 Οθ/gg)· Obě kultury se třepou ve dvoulitrových třepacích baňkách při 30 °C a otáčkách 250 min-1. Kdykoliv se dosáhne OD^gg 2, zředí se kultury stejným růstovým mediem. Periodicky se odebírají 100 OD^gg vzorky a odstřeďují se 7 minut při 200xg. Výsledné buněčné pelety se mohou 1 až 2 týdny skladovat ve zmrazeném stavu při -70 °C.
Příklad VI
Stanovení HBsAg: 22 nm částice a HBsAg monomer
1. Příprava extraktů a stanovení proteinu
Všechny následující operace se provádějí při teplotě 0 až 4 °C. Zmrazená buněčná peleta se nechá roztát, pak se promyje dvakrát 2 ml ledového solubilizačního pufru. Buňky (100 jednotek ODggg) se převedou do připravené skleněné zkumavky (13 x 100 mm). K buněčné peletě se přidá 0,35. ml solubilizačního pufru a 0,5 g skleněných kuliček opraných kyselinou (o průměru 0,45 mm). Suspenze se třepe v mixeru vytvářejícím vír, nastaveném na maximální hodnotu 4x vždy 1 minutu a v jednominutových intervalech mezi třepáním se udržuje na ledu. Pak se buněčná suspenze vyjme a skleněné kuličky se promyji 0,35 ml solubilizačního pufru. Promývací pufr se smísí s buněčnou suspenzí a převede do Eppendorfovy trubice. Extrakt se odstřeďuje v Eppendorfově odstředivce po dobu 15 minut. Oddělí se supernatant (rozpustná frakce; 0,7 ml). Pro extrakci HBsAg proteinu ze zbývající pelety se k peletě přidá 0,7 ml 2x koncentrovaného SDS-solubilizačního pufru a směs se míchá ve vírovém mixeru a vaří po dobu 15 minut. Pak se směs 15 minut odstřeďuje a supernatant (nerozpustná frakce) se oddělí od rozdrcených buněk. Alikvotní díly rozpustné a nerozpustné frakce se analyzují na obsah proteinu za použití TCA precipitace a Lowryho metody. Jako standard >
koncentrace proteinu slouží BSA. Jak nerozpustná, tak rozpustná frakce mívá obvykle koncentraci proteinu v rozmezí od 3 do 15 mg/ml.
2. Alternativní postup přípravy extraktů
Tento postup popisuje podmínky extrakce monomerního heterologického proteinu HBsAg nebo proteinového komplexu, 22 nm částice, z kultur Pichia Pastoris transformovaných vektory obsahujícími sekvence kódující protein HBsAg.
Kultury P. pastoris se nechají růst do dosažení hustoty buněk 10 až 100 ODggg jednotek na mililitr. Alikvotní díl 100 DDggg jednotek se převede do kultivační zkumavky z borosilikátového skla o rozměrech 13 x 100 mm a promyje se dvakrát 20 objemy solubilizačního pufru.
Buňky se peletizují (IEC klinickou centrifugou) a k peletě se přidá 0,5 g kyselinou opraných skleněných kuliček (o průměru 0,5 mm) a pak 0,35 ml solubilizačního pufr. Solubilizační pufr obsahuje buď 0,5 M chloridu sodného a 0,1 % Triton-u X-100 (hmotnost/objem),
CS 276 453 B6 jako kontrolní vzorek nebo 3 M koncentraci jodidu draselného nebo thiokyanátanu draselného, popřípadě v přítomnosti 0,1 % Triton-u X-100. Všechny roztoky jsou tlumeny na pH 7,5 10 mM fosforečnanu sodného. Směs se míchá čtyřikrát vždy po dobu jedné minuty maximální rychios- . tí ve vírovém mixeru, V přestávkách se směs chladí na ledu po dobu alespoň jedné minuty, Po skončení lyse se roztok rozdrcených buněk vyjme, skleněné kuličky se promyjí 0,35 ml solubilizačního pufru a oba roztoky se spojí a 15 minut odstřelují při 13000xg. Supernatanty se oddělí a analyzují na imunoreaktivní HBsAg částici (stanovení Ausria) a na celkový obsah proteinu, který lze srazit kyselinou trichloroctovou(Lowry). Výsledky, ve formě přehledu 5 pokusů, jsou uvedeny v tabulce I.
Tabulka I
| Podmínky lyse | A | B | C |
| HBsAg 22 nm | veškerý | HBsAg 22 nm | |
| částice | Protein | částice/protein | |
| (/ig/ml) | (/jl/ml) | (% hmot.) | |
| sůl (koncentrace) | |||
| NaCl (0,5 M) + Triton | 203 až 249 | 8,6 až 11,2 | 2,1 až 3,2 |
| KI (3 M) + Triton | 5,1 až 150 | 0,85 až 3,4 | 0,5 až 8,1 |
| KI (3 M) - Triton | 71 až 136 | 2,5 až 4,3 | 2,3 až 7,2 |
| KSCN (3 M) + Triton | 2,4 až 50 | 0,6 až 1,9 | 0,8 až 9,6 |
| KSCN (3 M) - Triton | 80 až 125 | 1,6 až 4,3 | 3,B až 16,7 |
Protože v žádném z případů s obsahem jodidu draselného nebo thiokyanatanu draselného se nedosáhlo vyšších hodnot HBsAg částice než v případě použití chloridu sodného (sloupec
A), je zřejmé, že jodid draselný nebo thiokyanátan draselný inhibují uvolňování veškerého proteinu (sloupec B), čímž se zvyšuje specifická aktivita částice dva až pětkrát (sloupec C).
TM
3. Stanovení 22 nm částice (souprava AUSRIA II)
Rozpustná frakce se zředí na 1000 až lOOOOnásobek zřeňovacím pufrem Ausria a alikvotni vzorky 25 a 100 jul se analyzují takto:
První inkubace
1. Pro konstrukci standardní křivky ředění se na dna jednotlivých jímek na reakční desce odpipetuje 0,1 až 4 ng kontrolní látky při celkovém objemu 200 /j1 (4 negativní kontrolní vzorky).
V případě analyzovaných vzorku se rovněž na dna oddělených jímek odpipetuje 200 jul zředěné rozpustné frakce.
2. Do každé jímky obsahující analyzovaný nebo kontrolní vzorek se opatrně vloží jeden kroužek. Alternativně se mohou kroužky rozdělit do důlků před uvedením analyzovaných nebo kontrolních vzorků.
3. Reakční deska se pak zakryje a kryt se uhladí, aby byly kroužky zakryty a aby se odstranily zachycené vzduchové bubliny.
4. Reakce se pak 2 hodiny inkubuje při 45 °C.
5. Krycí uzávěr se odstraní a zahodí. Kapalina se odsaje a každý kroužek se dvakrát opláchne 4 až 6 ml destilované nebo deionizované vody.
Druhá inkubace
95
6. Do každé jímky obsahující kroužek se odpipetuje 200 pl I-Anti-HBs.
CS 276 453 B6
7. Reakční deska se zakryje novým krytem a kryt se uhladí, aby byly kroužky zakryty a aby se odstranily zachycené vzduchové bubliny.
8. Reakční deska se pak 1 hodinu inkubuje při 45 °C.
9. Krycí uzávěr se sejme a zahodí. Kapalina se odsaje a každý kroužek se promyje 4x tak, jako ve stupni 5.
10. Kroužky se ihned převedou do řádně označených počítacích trubic.
Měření pomocí gamma-scintilačniho počítače:
11. Počet impulzů se měří po dobu 1 minuty.
12. Vzorky se měří do 24 hodin od posledního promytí.
Koncentrace 22 nm částic se vypočítá za použití standardní křivky sestrojené způsobem uvedeným ve stupni 1.
4. Stanovení monomeru (stanovení Western)
Ekvivalentní objem 2 /ig proteinu (rozpustné nebo nerozpustné frakce) obvykle 2 až 5 jul se zředí vodou na 10 pl. Přidá se 10 pl 2x koncentrovaného SOS gelového pufru (10 mM
DTT v lx pufru) a vzorek se vaří po dobu 15 minut. Povařené vzorky se nanesou na 12 % SOS akrylamidový gel (Laemmli). Po elektroforéze gelu se proteiny přenesou na nitrocelulózový papír (Towbin a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 76, 4350 - 4354 (1979)). HBsAg se dete125 guje pomocí HBsAg antisera (vzneseného proti HBsAg z plasmy) a I-značeného proteinu A. Nitrocelulózový papír se exponuje na film Kodak XAR-5 přes noc při -70 °C. Kvantifikace mo nomeru se provede spočítáním radioaktivních pásů z nitrocelulózového papíru v gamma počítači. Rekombinantní HBsAg produkované S. cerevisiae (100 až 500 jug/pruh) se používá jako standardů.
Příklad VII
Úroveň exprese HBsAg v Pichia pastoris
Zkušebním postupem Uvedeným v příkladu VI za použití solubilizačního postupu uvedeného v části 1 příkladu VI se určí produkce HBsAg několika transformovanými kmeny P. pastoři Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce Π.
CS 276 453 B6
Tabulka II
| transformovaný kmen | GS115 (pBSAGI5I) | GS115 | (pBSAG5) |
| fenotyp | Aoxl His+ | Aoxl+ | His+ |
| stav vektoru | integrovaný | autonomní | |
| hladina HBsAg3 * * * * * * * (třepací baňka) | |||
| počet buněk na 1 litr | 1011 | IQ11 | |
| monomer (%) | 7 | 1,5 | |
| částice 22 nm (¾) | 2,5 | 0,2 | |
| monomer (mg/1)13 | 8,4 | 1,8 | * |
| částice 22 nm (mg/1)13 | 3 | 0,24 |
hladina HbSAg3 (růst ve fermentoru)
| počet buněk na 1 litr | 3.5xlO12 | BxlQ12 |
| monomer (¾) | 7 | 1 |
| částice 22 nm (¾) | 2,9 | 0,1 |
| monomer (mg/1)13 | 294 | 96 |
| částice 22 nm (mg/1)13 | 122 | 10 |
a stanovení proteinu; měření prováděno Bradfordovou metodou.
b HBsAg na litr kultivačního média; ODggg = 5 x 10? buněk/ml = 0,14 mg sušiny/ml = 0,06 mg proteinu/ml.
Shora uvedené výsledky ukazují, že v Pichia pastoris se může produkovat vysoká hladina HBsAg, pokud je tento proces řízen regulační oblastí Pichia pastoris pro primární alkohol oxidázový gen (A0X1).
Shora uvedené příklady slouží pouze pro ilustrací vynálezu a nelze je považovat za omezující materiál pro následující definici předmětu vynálezu. Oo rozsahů nárokované ochrany spadají i určité variace a modifikace, které se nevzdalují od podstaty a ducha vynálezu .
Claims (5)
1. Způsob přípravy povrchového antigenu hepatitis B, vyznačující se tím, že se kultivuje kmen kvasinek rodu Pichia transformovaný plasmidem v živném prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku zvolený ze souboru zahrnujícího
i) alespoň jeden zdroj uhlíku a energie zvolený ze skupiny zahrnující methanol a zdroj uhlíku nevykazující katabolitovou represi, ii) alespoň jeden zdroj uhlíku a energie vykazující katabolitovou represi s tou podmínkou, že v případě ii) se získaný produkt podrobí podmínkám zahrnujícím nedostatek zdroje uhlíku, přičemž uvedený plasmid obsahuje DNA fragment, DNA bakteriálního plasmidu, selektovatelný kvasinkový markerový gen a kvasinkovou autonomní replikační sekvenci, kde uvedený DNA fragment obsahuje
CS 276 453 B6
a) regulační oblast, která je schopna řídit transkripci mediátorové RNA, pokud je umístěn na konci 5’ polypeptidové kódovací oblasti, přičemž tato regulační oblast je respon sivní k alespoň jedné z podmínek zahrnujících
i) přítomnost methanolu v kultivačním prostředí se kterým hostitelský organismus, obsahující uvedený DNA fragment, ve styku, ii) přítomnost zdroje uhlíku nevykazujícího katabolitovou represi odlišného od methanolu v kultivačním prostředí, se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku a iii) nedostatek zdroje uhlíku v kultivačním prostředí se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku poté, co byl hostitelský organismus nechán růst na zdroji uhlíku a energie vykazujícím katabolitovou represi a
b) polypeptid kódující oblast, přičemž tato kódující oblast kóduje povrchový antigen hepatitis B nebo jeho části.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se povrchový antigen hepatitis B izoluje a čistí.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že regulační oblast v DNA fragmentu je charakterizována restrikční mapou znázorněnou na obr. 2.
4 až 8, vyznačující pA0P2, znázorněného se tím, na obr.
že regulační ob4.
13. Fragment DNA obsahující
a) regulační oblast, která je schopna řídit transkripci mediátorové RNA, pokud je umístěn na konci 5’ polypeptidové kódovací oblasti, přičemž tato regulační oblast je responsivní k alespoň jedné z podmínek zahrnujících
i) přítomnost methanolu v kultivačním prostředí se kterým hostitelský organismus, obsahující uvedený DNA fragment, ve styku, ii) přítomnost zdroje uhlíku nevykazujícího katabolitovou represi odlišného od methanolu v kultivačním prostředí, se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku a iii) nedostatek zdroje uhlíku v kultivačním prostředí se kterým je hostitelský organismus obsahující uvedený DNA fragment ve styku poté, co byl hostitelský organismus nechán růst na zdroji uhlíku a energie Vykazujícím katabolitovou represi a
b) polypeptid kódující oblast, přičemž tato kódující oblast kóduje povrchový antigen hepatitis B nebo jeho části.
14. Fragment DNA podle nároku 13, v němž je regulační oblast charakterizována restrikční mapou znázorněnou na obr. 2.
15. DNA fragment podle nároku 13 obsahující 3’ sekvenci DNA za polypeptid kódující oblastí, přičemž tato 3' sekvence DNA je schopna řídit polyadenylaci a terminaci transkripce mediátorové RNA, kódované touto polypeptid kódující oblastí.
16. DNA fragment podle nároku 13, který dále obsahuje alespoň jednu přídavnou sekvenci DNA odvozenou ze skupiny zahrnující
DNA bakteriálního plasmidu,
CS 276 453 B6
DNA bakteriofágu,
DNA kvasinkového plasmidu a
DNA kvasinkového chromosomu.
17. DNA fragment podle nároku 16, v němž DNA kvasinkového chromosomu obsahuje autonomně se replikující sekvenci DNA a markerový gen.
18. DNA fragment, podle kteréhokoliv z nároků 13 až 17, který dále obsahuje do série uspořádanou DNA zahrnující
- první insertovatelný fragment DNA,
- selektovatelný markerový gen a
- druhý insertovatelný fragment DNA, přičemž první a druhý insertovatelný fragment DNA má vždy délku alespoň 200 nukleotidů a obsahuje nukleotidově sekvence, které jsou homologické a částmi genomové DNA druhu kvasinek spadajících do rodu Pichia, přičemž DNA fragment a markerový gen jsou umístěny mezi koncem 3’ prvního insertovatelného fragmentu DNA a koncem 5' druhého insertovatelného fragmentu DNA a vzájemná orientace prvního a druhého insertovatelného fragmentu DNA je stejná jako v genomu Pichia.
19. DNA fragment podle nároku 13, v němž polypeptid kódující oblast v DNA fragmentu se skládá v podstatě z EcoRI-StuI fragmentu o asi 700 bázových párech s touto strukturou
4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že DNA fragment obsahuje 3' sekvenci DNA za polypeptid kódujíc! oblastí, přičemž tato 3' sekvence ONA je schopna řídit polyadenylaci a termlnaci transkripce mediátorové RNA, kódované touto polypeptid kódující oblastí.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že DNA fragment dále obsahuje alespoň jednu přídavnou sekvenci ONA odvezenou ze skupiny zahrnující
DNA bakteriálního plasmidu,
DNA bakteriofágu,
DNA kvasinkového plasmidu a
DNA kvasinkového chromosomu.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že DNA kvasinkového chromosomu obsahuje autonomně se replikující sekvenci DNA a markerový gen.
7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že DNA fragment dále obsahuje do série uspořádanou DNA zahrnující
- první insertovatelný fragment DNA,
- selektovatelný markerový gen a
- druhý insertovatelný fragment DNA, 'přičemž první a druhý insertovatelný fragment DNA má vždy délku alespoň 200 neukleotidů a obsahuje nukleotidové sekvence, které jsou hcmologické s částmi genomové DNA druhu kvasinek spadajících do rodu Pichia, přičemž DNA fragment a markerový gen jsou umístěny mezi koncem 3’ prvního insertovatelného fragmentu DNA a koncem 5’ druhého insertovatelného fragmentu DNA a vzájemná orientace prvního a druhého insertovatelného fragmentu DNA je stejná jako v genomu Pichia.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že polypeptid kódující oblast v DNA fragmentu Se skládá v podstatě z EcoRI-StuI fragmentu a asi 700 bázových párech s touto strukturou
CS 276 453 B6
9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, dem je pBSAG5.
že uvedeným plasmi
10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, midem je BSAG5I, znázorněný na obr.
11.
vyznačující se tím, že uvedeným plašil. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, midem je pBSAGI5I, znázorněný na obr. 11.
vyznačující se tím, že uvedeným plas
12.
last a 3
Způsob podle kteréhokoliv z nároků sekvence jsou odvozeny z plasmidu
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/801,713 US4895800A (en) | 1985-11-26 | 1985-11-26 | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS864186A3 CS864186A3 (en) | 1992-01-15 |
| CS276453B6 true CS276453B6 (en) | 1992-06-17 |
Family
ID=25181867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS868641A CS276453B6 (en) | 1985-11-26 | 1986-11-26 | Process for preparing surface antigen hepatitis b |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4895800A (cs) |
| EP (1) | EP0226846B1 (cs) |
| JP (1) | JPH0763372B2 (cs) |
| KR (1) | KR920004050B1 (cs) |
| CN (1) | CN86107885A (cs) |
| AT (1) | ATE92527T1 (cs) |
| AU (1) | AU583683B2 (cs) |
| CA (1) | CA1285895C (cs) |
| CS (1) | CS276453B6 (cs) |
| DD (1) | DD252614A5 (cs) |
| DE (1) | DE3688831T2 (cs) |
| DK (1) | DK565186A (cs) |
| EG (1) | EG17949A (cs) |
| ES (1) | ES2058055T3 (cs) |
| FI (1) | FI95929C (cs) |
| HU (1) | HUT43112A (cs) |
| IE (1) | IE64519B1 (cs) |
| IL (1) | IL80754A (cs) |
| IN (1) | IN166428B (cs) |
| MX (1) | MX4334A (cs) |
| NO (1) | NO176025C (cs) |
| NZ (1) | NZ218286A (cs) |
| PH (2) | PH25941A (cs) |
| PL (1) | PL152882B1 (cs) |
| PT (1) | PT83819B (cs) |
| TW (1) | TW215457B (cs) |
| YU (1) | YU46031B (cs) |
| ZA (1) | ZA868601B (cs) |
Families Citing this family (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4777240A (en) * | 1984-03-08 | 1988-10-11 | Scripps Clinic And Research Foundation | SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker |
| GB8521496D0 (en) * | 1985-08-29 | 1985-10-02 | Ciba Geigy Ag | Repressible yeast promoters |
| US5135868A (en) * | 1985-10-25 | 1992-08-04 | Phillips Petroleum Company | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification |
| US5032516A (en) * | 1985-10-25 | 1991-07-16 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
| US4683293A (en) * | 1986-10-20 | 1987-07-28 | Phillips Petroleum Company | Purification of pichia produced lipophilic proteins |
| ATE91304T1 (de) * | 1987-02-27 | 1993-07-15 | Merck & Co Inc | Verfahren zur herstellung des pres 1/s2/shepatitis-b-antigens aus hefe. |
| US5026828A (en) * | 1987-02-27 | 1991-06-25 | Merck & Co., Inc. | Method of purifying recombinant pres-1/S-2/S/S hepatitis B antigen from yeast |
| ATE93891T1 (de) * | 1987-03-09 | 1993-09-15 | Merck & Co Inc | Reinigung von rekombiniertem hepatitis-boberfl|chen-antigen. |
| EP0300213A1 (en) * | 1987-06-22 | 1989-01-25 | Hexal-Pharma Gentechnik GmbH & Co. KG | Hepatitis a viral peptide particle immunogens |
| US5011915A (en) * | 1987-10-26 | 1991-04-30 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| EP0314240A3 (en) * | 1987-10-26 | 1990-03-28 | Merck & Co. Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| US5004688A (en) * | 1988-04-15 | 1991-04-02 | Phillips Petroleum Company | Purification of hepatitis proteins |
| IL89989A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts |
| IL90021A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Process for the production of interferon |
| NZ228774A (en) * | 1988-04-25 | 1991-05-28 | Phillips Petroleum Co | Hbv particles containing pres 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells |
| IL89992A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
| IL89993A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts |
| IL90161A0 (en) * | 1988-05-13 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of hepatitis b s and pres2 proteins in methylotrophic yeasts |
| IL91765A0 (en) * | 1988-09-26 | 1990-06-10 | Salk Inst Biotech Ind | Mixed feed recombinant yeast fermentation |
| AU5196290A (en) * | 1989-02-13 | 1990-09-05 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc., The | Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells |
| US6197548B1 (en) | 1990-04-02 | 2001-03-06 | Medeva Pharma Limited | Transformed Pichia expressing the pertactin antigen |
| US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| EP0548267A4 (en) * | 1990-09-04 | 1994-11-23 | Salk Inst Biotech Ind | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
| CU22290A1 (es) * | 1990-10-08 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la obtencion de antigeno de superficie del virus de la hepatitis b de superior capacidad inmunoganica y su uso en un preparado vacunal |
| US5268273A (en) * | 1990-12-14 | 1993-12-07 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
| ATE220105T1 (de) * | 1991-04-01 | 2002-07-15 | Merck & Co Inc | Gene, die die proteolytische aktivitaet von pichia beeinflussen und deren verwendung |
| CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
| US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
| US5850025A (en) * | 1991-09-19 | 1998-12-15 | Sibia Neurosciences, Inc. | Protection of plants against plant pathogens |
| SG48365A1 (en) | 1992-05-23 | 1998-04-17 | Smithkline Beecham Biolog | Combined vaccines comprising hepatitis b surface antigen and other antigens |
| CA2138997C (en) | 1992-06-25 | 2003-06-03 | Jean-Paul Prieels | Vaccine composition containing adjuvants |
| JPH06209763A (ja) * | 1993-01-13 | 1994-08-02 | Green Cross Corp:The | 変異株 |
| US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| EP0788546B9 (en) * | 1994-10-18 | 2007-06-13 | Dendreon Corporation | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5955349A (en) * | 1996-08-26 | 1999-09-21 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
| US5716808A (en) * | 1995-11-09 | 1998-02-10 | Zymogenetics, Inc. | Genetic engineering of pichia methanolica |
| GB9623233D0 (en) | 1996-11-07 | 1997-01-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
| KR100629028B1 (ko) | 1998-10-16 | 2006-09-26 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 애쥬번트 시스템 및 백신 |
| UA79735C2 (uk) * | 2000-08-10 | 2007-07-25 | Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. | Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах |
| RU2201452C2 (ru) * | 2000-12-28 | 2003-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Биотех" | Рекомбинантная плазмидная днк рнвs, обеспечивающая биосинтез поверхностного антигена вируса гепатита в, способ конструирования плазмиды, штамм дрожжей pichia pastoris ps103 (phbs) - продуцент указанного антигена |
| DE60335602D1 (de) * | 2002-12-18 | 2011-02-17 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Desoxyribonuclease I aus Rinder-Pankreas mit hoher spezifischer Aktivität |
| ATE387494T1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-03-15 | Hoffmann La Roche | Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten |
| EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
| ES2337684T3 (es) * | 2003-12-05 | 2010-04-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Carboxipeptidasa b recombinante y su purificacion. |
| AU2006291780B2 (en) * | 2005-09-14 | 2011-12-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin |
| EP2441469A1 (en) | 2006-03-14 | 2012-04-18 | Oregon Health and Science University | Methods for producing an immune response to tuberculosis |
| JP5814507B2 (ja) | 2006-09-07 | 2015-11-17 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン |
| JP4216875B2 (ja) * | 2006-09-29 | 2009-01-28 | 株式会社東芝 | メタノール応答性プロモーター、プロモーターと外来遺伝子を発現可能な様式で連結した融合遺伝子、ベクター、形質転換体、およびタンパク質の生産方法 |
| WO2008106551A2 (en) | 2007-02-28 | 2008-09-04 | The Govt. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. | Brachyury polypeptides and methods for use |
| JP2010525035A (ja) | 2007-05-02 | 2010-07-22 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン |
| WO2009143524A2 (en) | 2008-05-23 | 2009-11-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Nanoemulsion vaccines |
| WO2010017209A2 (en) | 2008-08-04 | 2010-02-11 | The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Membrane proximal region of hiv gp41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine |
| WO2010099472A2 (en) | 2009-02-27 | 2010-09-02 | The U.S.A. Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Spanx-b polypeptides and their use |
| WO2011047340A1 (en) | 2009-10-16 | 2011-04-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Insertion of foreign genes in rubella virus and their stable expression in a live, attenuated viral vaccine |
| GB201105981D0 (en) | 2011-04-08 | 2011-05-18 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
| US9566329B2 (en) | 2012-04-06 | 2017-02-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Live, attenuated rubella vector to express vaccine antigens |
| WO2014043518A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Brachyury protein, non-poxvirus non-yeast vectors encoding brachyury protein, and their use |
| WO2014135651A1 (en) | 2013-03-08 | 2014-09-12 | Crucell Holland B.V. | Acellular pertussis vaccine |
| EP4137150A1 (en) | 2015-08-03 | 2023-02-22 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Brachyury deletion mutants, non-yeast vectors encoding brachyury deletion mutants, and their use |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
| GB2055847A (en) * | 1979-07-30 | 1981-03-11 | Bull F G | Process for the production of carrier particles |
| US4769238A (en) * | 1981-08-04 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Synthesis of human virus antigens by yeast |
| US4803164A (en) * | 1981-08-31 | 1989-02-07 | Genentech, Inc. | Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast |
| NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
| DE3381566D1 (de) * | 1982-08-16 | 1990-06-21 | Agency Science & Tech | Hepatitis-b-virus-gen enthaltendes rekombinantes plasmid, mit diesem rekombinanten plasmid transformierte hefe und herstellung von hepatitis-b-virus-oberflaechenantigen. |
| IL69202A (en) * | 1982-09-08 | 1991-08-16 | Smith Kline Rit | Surface antigen polypeptides of hbv virus produced in yeast and the preparation thereof |
| US4510245A (en) * | 1982-11-18 | 1985-04-09 | Chiron Corporation | Adenovirus promoter system |
| CA1341302C (en) * | 1983-02-22 | 2001-10-09 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein |
| US4515714A (en) * | 1983-03-09 | 1985-05-07 | Juridicial Foundation, The Chemo-Semo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for purification of hepatitis B virus surface antigen |
| EP0135435A3 (en) * | 1983-08-22 | 1987-03-25 | Merck & Co. Inc. | Immunogenic hbsag derived from transformed yeast |
| US4614793A (en) * | 1983-10-14 | 1986-09-30 | Merck & Co., Inc. | Hepatitis A--subunit antigen |
| JPS60196185A (ja) * | 1984-03-19 | 1985-10-04 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 形質転換酵母の培養方法 |
| US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
| US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
-
1985
- 1985-11-26 US US06/801,713 patent/US4895800A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-10 CA CA000513467A patent/CA1285895C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-12 IN IN819/CAL/86A patent/IN166428B/en unknown
- 1986-11-12 ZA ZA868601A patent/ZA868601B/xx unknown
- 1986-11-12 MX MX433486A patent/MX4334A/es unknown
- 1986-11-13 NZ NZ218286A patent/NZ218286A/en unknown
- 1986-11-14 IE IE302186A patent/IE64519B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-11-19 AU AU65384/86A patent/AU583683B2/en not_active Expired
- 1986-11-24 PH PH34520A patent/PH25941A/en unknown
- 1986-11-24 EG EG733/86A patent/EG17949A/xx active
- 1986-11-24 CN CN198686107885A patent/CN86107885A/zh active Pending
- 1986-11-25 HU HU864873A patent/HUT43112A/hu unknown
- 1986-11-25 DK DK565186A patent/DK565186A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-11-25 AT AT86116302T patent/ATE92527T1/de active
- 1986-11-25 IL IL80754A patent/IL80754A/xx unknown
- 1986-11-25 DD DD29662586A patent/DD252614A5/de unknown
- 1986-11-25 DE DE86116302T patent/DE3688831T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-25 ES ES86116302T patent/ES2058055T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-25 NO NO864704A patent/NO176025C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-11-25 FI FI864791A patent/FI95929C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-11-25 EP EP86116302A patent/EP0226846B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-25 YU YU201386A patent/YU46031B/sh unknown
- 1986-11-25 KR KR1019860010018A patent/KR920004050B1/ko not_active Expired
- 1986-11-25 JP JP61280567A patent/JPH0763372B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-11-26 CS CS868641A patent/CS276453B6/cs unknown
- 1986-11-26 PL PL1986262598A patent/PL152882B1/pl unknown
- 1986-11-26 PT PT83819A patent/PT83819B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-12-01 TW TW075105699A patent/TW215457B/zh active
-
1987
- 1987-11-06 PH PH36040A patent/PH25539A/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CS276453B6 (en) | Process for preparing surface antigen hepatitis b | |
| US4855231A (en) | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast | |
| Hitzeman et al. | Expression of hepatitis B virus surface antigen in yeast | |
| EP0226752B1 (en) | Method for high-level expression of polypeptides in yeast of the genus Pichia | |
| EP0414374B1 (en) | Novel antigens and methods for their preparation | |
| JP2614314B2 (ja) | メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびｐｒｅＳ▲下２▼タンパク質の発現 | |
| US5166329A (en) | DNA encoding the alcohol oxidase 2 gene of yeast of the genus Pichia | |
| HK1003032B (en) | Novel antigens and methods for their preparation | |
| AU605036B2 (en) | Expression of hepatitis B2 pres protein in methylothrophic yeasts | |
| EP0389377A1 (en) | Excretion of proteins from yeast cells | |
| KR900005534B1 (ko) | 복합 프로모터를 이용한 효모 발현 벡터에 의한 b형 간염 바이러스 표면항원들의 제조방법 | |
| Sugden | Molecular and Physiological Studies on Yeast and Fungal Protease Genes and Their Mutants | |
| IE83234B1 (en) | DNA fragment encoding an AOX |