PL152882B1

PL152882B1 - Method of producing a type b hepatitis antigen

Info

Publication number: PL152882B1
Application number: PL1986262598A
Authority: PL
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1991-02-28
Also published as: DD252614A5; ATE92527T1; IL80754A0; DE3688831T2; DK565186A; FI95929B; FI95929C; YU201386A; EP0226846B1; KR920004050B1; US4895800A; NO864704D0; DK565186D0; PT83819B; AU583683B2; FI864791L; IN166428B; JPS62190085A; ZA868601B; IE64519B1

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 152 882 POLSKA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr---Int. Cl.⁵ C12N 15/51

Zgłoszono: 86 11 26 (P. 262598)

Pierwszeństwo: 85 11 26 Stany Zjednoczone ^Ameryki CZTTELBIJI

CC 0 L w A

Zgłoszenie ogłoszono: 87 09 21

Opis patentowy opublikowano: 1991 12 31

Twórcy wynalazku: Juerg F. Tschopp, James M. Cregg, Michael M. Harpold, Richard G. Buckholz

Uprawniony z patentu: Phillips Petroleum Company,

Bartlesville (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie technologii rekombinacji DNA do wytwarzania antygenu płaszczowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg). Wynalazek rozwiązuje zagadnienie wytwarzania antygenu płaszczowego wirusa zapalenia wątroby typu B w organizmach drożdży. Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania nowych konstrukcji DNA kodujących antygen płaszczowy wirusa zapalenia wątroby typu B, jak również nowych mikroorganizmów transformowanych tymi konstrukcjami DNA.

Rozwój technologii rekombinacji DNA jaki nastąpił w ostatnich latach, umożliwił wytwarzanie w sposób kontrolowany wielu różnorodnych użytecznych polipeptydów przez mikroorganizmy. Z użyciem mikroorganizmów produkuje się już wiele polipeptydów pochodzenia eukariotycznego, takich jak ludzki hormon wzrostu, interferony leukocytowe, insulina i proinsulina ludzka. Dalsze stosowanie dostępnych już technik rekombinacji DNA stwarza perspektywy wytwarzania wielu innych użytecznych produktów polipeptydowych przez mikroorganizmy. Jednym z takich użytecznych produktów polipeptydowych jest antygen płaszczowy wirusa zapalenia wątroby typu B.

Wirus B wszczepiennego zapalenia wątroby przenosi się wśród ludzi powodując chroniczne osłabiające infekcje, wywołujące poważne zniszczenie wątroby, nowotwór pierwotny, a nawet śmierć. W większości przypadków można się spodziewać całkowitego wyzdrowienia po zakażeniu tym wirusem. Jednakże, znaczną część populacji, zwłaszcza w krajach afrykańskich i azjatyckich stanowią chroniczni nosiciele, będący groźnym potencjałem przenoszenia tej choroby w sposób pandemiczny.

Skuteczną formą zapobiegania rozwojowi wirusowego zakażenia wątroby typu B jest podanie szczepionki przeciw wirusowi zapalenia wątroby. Szczepionka ta jest zazwyczaj antygenem płaszczowym tego wirusa o wysokim stopniu oczyszczenia. Szczepionka taka jest skuteczna jako środek zapobiegający infekcji. Grupą ludzi o szczególnie wysokim stopniu ryzyka są pacjenci

152 882 wymagający transfuzji krwi lub zabiegu dializowania oraz personel medyczny pracujący wśród tej grupy ludzi. Szczepionka taka jest również skuteczna jako środek zapobiegający powstawaniu nowych nosicieli, a zatem, wylania się możliwość całkowitego wyeliminowania wirusa zapalenia wątroby z powierzchni ziemi.

Wirus zapalenia wątroby typu B nie rozwija się w hodowlach komórkowych, a zatem, może być otrzymywany jedynie z zakażonej surowicy ludzkiej lub wyższych naczelnych. Tak więc, brak jest dostępnych środków pozwalających na otrzymanie i zapewnienie wystarczających dostaw wirusa zapalenia wątroby typu B, potrzebnych do produkcji' antygenu do celów- szczepień ochronnych.

Szczepionkę przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu B zazwyczaj wytwarza się przez izolację i oczyszczenie antygenu płaszczowego z surowicy krwi nosicieli wirusa zapalenia wątroby. Jednakże, takie oczyszczanie należy wykonywać wyjątkowo wydajnie, gdyż w oczyszczonej plazmie znajdują się bardzo niskie stężenia żądanego antygenu. Jest zatem bardzo trudne przygotowanie szczepionki przeciw temu wirusowi na skalę przemysłową.

Sposobem według wynalazku wytwarza się antygen płaszczowy wirusa zapalenia wątroby typu B z dużymi wydajnościami.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób uzyskiwania nowych konstrukcji DNA zdolnych do ekspresji wysokiego poziomu antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B.

Okazało się, że antygen płaszczowy wirus zapalenia wątroby typu B można wytwarzać z wysoką wydajnością przez hodowlę komórek drożdży transformowanych konstrukcjami DNA zawierającymi sekwencje kodujące ten antygen pod kontrolą regionów regulatorowych wrażliwych na metanol, źródła węgla nie wywierające represji katabolicznej i na głód źródła węgla.

Dla lepszego zrozumienia wynalazku przedstawiono rysunki, na których fig. 1 przedstawia mapę restrykcyjną regionu regulatorowego (skrót bp oznacza parę zasad) genu syntetezy dwuhydroksyacetonowej (DAS) z Pichia, fig. 2 - mapę restrykcyjną regionu regulatorowego pierwszego genu oksydazy alkoholowej (Α0Χ1) z Pichia, fig. 3 - mapę restrykcyjną regionu regulatorowego genu p40 z Pichia, fig. 4 - mapę restrykcyjną plazmidu pAOP2, fig. 5 - schemat konstruowania plazmidów pBSAG5 i pBSAG51, fig. 6 - mapę restrykcyjną plazmidu pHBS, fig. 7 - mapę restrykcyjną plazmidu pAOT-1, fig. 8 - mapę restrykcyjną plazmidu pYJ33, fig. 9 - konstruowanie plazmidu pYM39 z plazmidów pSAOH5 i pTHBS3, fig. 10 - konstruowanie plazmidu pYMló z plazmidów pYM39 i pPG3.2, fig. 11 -konstruowanie plazmidu pBSAAG 151 z plazmidów pYM 16 i pBSAG51, fig. 12 - insercję części plazmidu pBSAG151 w locus pierwszego genu oksydazy alkoholowej (ΑΟΧ1) w chromosomie Pichia, fig. 13 - schemat konstruowania plazmidu pTHBS3.

W opisach figur użyte są następujące skróty nazw enzymów restrykcyjnych.

Skrót	Enzym restrykcyjny
As	Asull
B	BamHI
b₂	BgllI
Bc	Bell
C	Ciał
h₂	HincII
Ha	Hindlll
K	KpnII
Ndi	Ndel
Nr	Nrul
Ps	Pstl
Pvi	Pvul
Pv₂	PvuII
Ri	EcoRI
Rs	EcoRV
S	Sali
Sp	SphI
Ss	Sstl
St	Stul
Xb	Xbal
Xh	Xhol

152 882

Na załączonych figurach, miejsca restrykcyjne stosowane do manipulacji fragmentami DNA, które uległy zniszczeniu podczas ligacji są pokazane przez umieszczenie dla zniszczonego miejsca w nawiasach.

Dzięki wynalazkowi otrzymano nowy fragment DNA, zawierający region regulatorowy i region kodujący polipeptyd. W tym fragmncie DNA, region polipeptyd koduje antygen płaszczowy wirusa zapalenia wątroby typu B lub jego część, a region regulatorowy ma zdolność kontrolowania transkrypcji informacyjnego RNA, jeśli usytuowany jest na końcu 5' genu kodującego polipeptyd. Ta kombinacja regionu regulatorowego, . genu antygenu płaszczowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) i fragmentu terminatora transkrypcji nazwana jest w niniejszym opisie kasetą ekspresyjną lub jednostką ekspresyjną.

Region regulotorowy zastosowany w wynalazku jest wrażliwy na co najmniej jeden z następujących warunków:

- obecność metanolu w pożywce, z którą kontaktuje się organizm gospodarza zawierający kasetę ekspresyjną,

- obecność źródła węgla nie wywierającego represji katabolicznej innego niż metanol w pożywce, z którą kontaktuje się organizm gospodarza zawierający kasetę ekspresyjną, oraz,

- głód źródła węgla w pożywce, z którą kontaktuje się organizm gospodarza zawierający kasetę ekspresyjną, po wzroście organizmu gospodarza na wywierającym represję kataboliczną źródle węgla i energii.

Skonstruowano ponadto nowe, liniowe koliste plazmidy zawierające wyżej opisane kasety ekspresyjne.

Otrzymano też zasadniczo czyste hodowle szczepów drożdży transformowanych wyżej opisanymi, liniowymi i kolistymi plazmidami.

Według wynalazku sposób wytwarzania antygenu płaszczowego wirusa zapalenia wątroby typu B, polega na hodowli szczepu drożdży transformowanego wyżej otrzymanymi plazmidami, w warunkach, w których uzyskuje się ekspresję żądanego produktu białkowego.

Zastosowane w praktycznym wykonaniu wynalazku regiony regulatorowe są wrażliwe na podłoża zawierające:

(1) metanol; (2) źródła węgla nie wywierające represji katabolicznej, takie jak glicerol, galaktoza, octan i podobne; (3) źródła węgla wywierające reakcję kataboliczną, takiejak glukoza, etanol, fruktoza, i podobne, po których stosuje się warunki głodu źródła węgla.

Przykłady regionów regulatorowych odpowiadających powyższym kryteriom są przedstawione na mapach restrykcyjnych na figurach 1,2 i 3. Region regulatorowy przedstawiony na fig. 1 pochodzi z genu syntetazy dwuhydroksyacetonowej (DAS) z Pichia pastoris. Region regulatorowy przedstawiony na fig. 2 pochodzi z pierwszego genu oksydazy alkoholowej (Α0Χ1) z Pichia pastoris (w Pichia występują dwa geny oksydazy alkoholowej, oznaczone jako Α0Χ1 i Α0Χ2). Region regulatorowy przedstawiony na fig. 3 pochodzi z genu p40 z Pichia pastoris. Dla specjalistów jest zrozumiałe, że z drożdży metylotrofowych takich jak Pichia pactoris można wyizolować również inne regiony regulatorowe o opisanych powyżej własnościach. Te dodatkowe regiony regulatorowe o własnościach regulacyjnych podobnych do własności regionów regulatorowych opisanych powyżej są również objęte zakresem wynalazku.

Gen antygenu płaszczowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) został wyizolowany przez Valenzuela'ę i wsp. w 1979 r (Naturę, 280, 815). Można go otrzymać przez traktowanie odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi różnych wektorów, takich jak na przykład pHBS-5 (patrz fig. 6 oraz Walenzuela i wsp. 1982) (Naturę, 298,374), pHBV-T-lA (Genentech, opis patentowy europejski nr 73657), pHBS-56 (ATCC 40047; opis patentowy europejski nr 1^0551) i innych.

Gen antygenu płaszczowego wirusa zapalenia wątroby typu B modyfikuje się przez traktowanie egzonukleazą Bal31 w celu usunięcia z końca 5' tego genu wirusowych sekwencji niekodujących. W celu usunięcia wirusowych sekwencji niekodujących z końca 3' genu HBsAg, koniec 3' tego genu modyfikuje się przez trawienie endonukleazą i łączenie z linkerem. Następnie, gen HBsAg modyfikuje się dalej wprowadzając miejsca restrykcyjne dogodne do manipulacji fragmentami DNA. Otrzymany fragment DNA jest insertem EcoRI-StuI i posiada następującą sekwencję nukleotydową:

152 882

5'-GAATTCATGG

TGCTCGTGTT

CCTCACAATA

CTCAATTTTC

ATTCGCAGTC

TCCTCCAATT cgttttatca

TCTTCTTATT

CGTTTGTCCT

GGACCATGCA

CTATGTTTCC

AAATTGCACC

GCAAAATACC

GGCTCAGTTT

GCTTTCCCCC

TGGTATTGGG

TTATACCGCT

CATTTAAGGC

AGAACATCAC

ACAGGCGGGG

CCGCAGAGTC

TAGGGGGATC

CCCAACCTCC

TGTCCTGGTT

TATTCCTCTT

GGTTCTTCTG

CTAATTCCAG

AAACCTGCAC

CTCATGTTGC

TGTATTCCCA

TATGGGAGTG

ACTAGTGCCA actgtttggc

GGCCAAGTCT

GTTACCAATT

CT-3'

ATCAGGATTC

TTTTTCTTGT

TAGACTCGTG

TCCCGTGTGT

AATCACTCAC

ATCGCTGGAT

CATCCTGCTG

GATTATCAAG

GATCAACAAC

GACTCCTGCT

TGTACAAAAC

TCCCATCGTC

GGCCTCAGTC

TTTGTTCAGT

TTTCAGCTAT

GTACAGCATC ττγττττπτγ

CTAGGACCCC

TGACAAGAAT

GTGGACTTCT

CTTGGCCAAA

CAACCTCCTG

GTGTCTGCGG

CTATGCCTCA

GTATGTTGCC

AACCAGTACG

CAAGGCAACT

CTACGGATGG

CTGGGCTTTC

CGTTTCTCTT

GGTTCGTAGG

ATGGATGATG

GTGAGTCCCT

TCTGGGTATA

Konstrukcje: region regulatorowy - gen strukturalny według wynalazku można wprowadzać do mikroorganizmów w celu amplifikacji, reprodukcji i ekspresji różnymi drogami. Dla uzyskania autonomicznej replikacji w drożdżach, użyteczny jest element sekwencji autonomicznej replikacji (ARS). Przykładami takiego elemntu są PARS1 i PARS2, pochodzące z Pichapastoris (Cregg, opis zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr SN 666 577, Phillips Petroleum Co.). W przypadku integracyjnej transformacji gospodarza nie stosuje się elementu ARS. Korzystny sposób uzyskania transformacji integracyjnej opisany jest przez Cragg'a w opisie zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych nr 791013, (Phillips Petroleum Co.). W sposobie tym wymagane jest zastosowanie kierowanego miejscem wektora integracyjnego. Wektor taki zawiera: pierwszy, zdolny do insercji fragment DNA, gen będący markerem selekcji, drugi, zdolny do insercji fragment DNA.

Każdy z tych dwu zdolnych do insercji fragmentów DNA ma długość co najmniej 200 nukleotydów i posiada sekwencje nukleotydowe homologiczne z częściami genomowego DNA gatunków z rodzaju Pichia. Różne komponenty takiego wektora integracyjnego są kolejno uszeregowane, tworząc liniowy fragment DNA, w którym kaseta ekspresji i gen będący markerem selekcji są usytuowane pomiędzy końcem 3' pierwszego zdolnego do insercji fragmentu DNA a końcem 5' drugiego zdolnego do insercji fragmentu DNA. Pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA są zorientowane w stosunku do siebie w liniowym fragmencie tak, jak są one zorientowane w genomie Pichia.

W DNA stosowanym do transformowania szczepu gospodarza, niezbędne jest wprowadzenie co najmniej jednego genu będącego markerem selekcji. Ułatwia to selekcję i izolację tych organizmów, w których nastąpiło włączenie transformującego DNA. Gen markerowy nadaje transformowanemu organizmowi cechę fenotypową, której nie posiada gospodarz wyjściowy, na przykład, przywrócenie zdolności wytwarzania specyficznego aminokwasu w przypadku, gdy szczep gospodarza nietransformowanego posiada defekt szlaku biosyntezy tego specyficznego aminokwasu.

Dla specjalistów jest zrozumiałe, że do wektorów stosowanych w praktycznym wykonaniu wynalazku można wprowadzać dodatkowe sekwencje DNA, takie jak przykładowo bakteryjny DNA plazmidowy. DNA bakteriografa i podobne. Sekwencje te nadają zdolność amplifikacji i utrzymywania się tych wektorów w gospodarzach bakteryjnych.

Ekspresja w transformowanych drożdżach. Opisane powyżej plazmidy mają zastosowanie do transformowania szczepów drożdży. Regulacji ekspresji genu w drożdżach za pomocą nowych fragmentów DNA sposobem według wynalazku można dokonać poddając transformowane organizmy warunkom głodu źródła węgla. Warunki niedoboru źródła węgla po wzroście na różnych źródłach węgla, zarówno wywierających jak i nie wywierających represji katabolicznej indukują ekspresję produktu genu utrzymywanego pod kontrolą regionów regulatorowych według wynalazku. Następną drogą wywołania ekspresji żądanego produktu genu w odpowiednich gatunkach transformowanych drożdży, jest prowadzenie wzrostu transformowanych drożdży na metanolu.

152 882 5

Jeszcze inną drogą indukowania ekspresji żądanego genu jest prowadzenie wzrostu transformowanych drożdży na podłożach zawierających źródła węgla nie wywierające represji katabolicznej.

Regiony regulatorowe według wynalazku są użyteczne do wywoływania ekspresji we wszystkich szczepach drożdży, gdyż okazało się, że regiony te są indukowane w różnych warunkach. Tak więc, można powodować, aby drożdże zdolne do wzrostu na metanolu lub na źródłach węgla nie wywierających represji katabolicznej wytwarzały obce, to jest heterologiczne polipeptydy bezpośrednio, a w przypadku drożdży zdolnych do wzrostu na źródle wywierającym represję kataboliczną można wywoływać wytwarzanie obcych polipeptydów przez poddanie 'tak rosnących komórek drożdży warunkom głodu 'źródła węgla.

Transformowanymi szczepami drożdży korzystnymi w sposobie według wynalazku są drożdże z rodzajów: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopsis, Pichia i Kluyveromyces. Drożdże z tych rodzajów są korzystne, ponieważ warunki bezpiecznej pracy z nimi, warunki wzrostu i podobne czynniki są znane specjalistom i ustalone.

Szczepami drożdży szczególnie korzystnymi wjednym aspekcie sposobu według wynalazku są szczepy zdolne do wzrostu na metanolu jako źródle węgla i energii. Wiadomo, że do drożdży rosnących na metanolu należą drożdże z rodzajów: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopsis i Pichia.

Ponieważ regiony regulatorowe według wynalazku są również indukowane wzrostem na źródłach węgla nie wywierających represji katabolicznej, jak również wzrostem w warunkach głodu źródła węgla, to szczepy drożdży zdolne do wzrostu na takich niemetanolowych substratach jak glukoza, octan, glicerol, etanol, laktoza, galaktoza, fruktoza i sacharoza i podobnych oraz mieszaninach dwu lub więcej tych substratów są również użyteczne w praktycznym wykonaniu wynalazku. Prowadząc wzrost organizmu gospodarza na odpowiednim niemetanolowym źródle węgla nie wywierającym represji katabolicznej, takim jak glicerol lub galaktoza albo prowadzając wzrost organizmu gospodarza na odpowiednim źródle węgla wywierającym represję kataboliczną, takim jak etanol, glukoza i fruktoza i następnie poddając organizm gospodarza warunkom głodu źródłą węgla można osiągnąć ekspresją produktu genu będącego pod kontrolą regionów regulatorowych według wynalazku.

Szczególnie korzystnym szczepem gospodarza drożdżowego jest mutant Pichia pastoris GS 115, który jest mutantem defektywnym pod względem zdolności wytwarzania histydyny. GS 115 oznaczono jako szczep posiadający zmutowany genotyp HIS4 w wyniku defektu w szlaku histydynowym z naruszeniem genu kodującego dehydrogenazę histydynolu. GS 115 pochodzi z Pichia pastoris NRRL Y-11430; jest on zdeponowany w Northern Regional Center Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych Ameryki, w Peoria, Illinois, pod numerem akcesyjnym NRRL Y-15851. Ten konkretny gospodarz jest przydatny, gdyż jest mutantem auksotroficznym z defektem w szlaku histydyny. Transformacja tego gospodarza wektorem zawierającym oprócz innych sekwencji DNA sekwencje zawierające funkcje genu HIS4 umożliwia selekcję transformowanych gospodarzy.

Innym korzystnym szczepem drożdży nadającym się do zastosowania w praktycznym wykonaniu wynalazku jest mutant Pichia pastoris GS 190. Jest to mutant z defektem szlaku argininy z naruszeniem genu kodującego liazę argininobursztynianową. GS 190 pochodzi z Pichia pastoris NRRL Y-11430. Jest on zdeponowany w Northern Regional Research Center Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych w Peoria, Illinois, pod numerem akcesyjnym NRRL Y-18014.

Jeszcze innym korzystnym szczepem gospodarza drożdżowego jest podwójnie auksotroficzny mutant PPF1 z defektem zarówno w szlaku histydyny jak i w szlaku argininy. PPF1 jest defektywny zarówno pod względem szlaku histydyny z naruszeniem genu kodującego dehydrogenazę histydynolu jak i pod względem szlaku argininy z naruszeniem genu kodującego liazę argininobursztynianową. PPF1 jest zdeponowany w Northen Regional Reasearch Center Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych Ameryki w Peoria, Illinois pod numerem akcesyjnym NRRL Y-18017.

Escherichia coli również odpowiednim gospodarzem dla plazmidów według wynalazku. Dla specjalistów jest zrozumiałe, że wiele szczepów E. coli jest tu odpowiednim gospodarzem. Kilka szczepów stosowanych w niniejszej pracy jest podanych poniżej:

Oznaczenie szczepu Numer akcesyjny

MC1061 nie znany

LE392 ATCC 33472

MM294 ATCC 33625

152 882

Procedura transformacji Pichia pastoris. Procedury ekspresyjne stosowane do transformowania Pichia pastoris zostały opisane uprzednio. Są one przedstawione bardziej szczegółowo w przykładzie I.

Pichia pastoris transformuje się przez enzymatyczne trawienie ścian komórkowych z wytworzeniem sferoplastów. Sferoplasty te miesza się z transformującym DNA i inkubuje w obecności jonów wapniowych i glikoli polietylenowego, a następnie regeneruje w podłożu selekcyjnym nie zawierającym histydyny. Transformujący DNA zawiera gen HIS4, którego nie posiada szczep gospodarza, a zatem, w zastosowanym eslekcyjnym środowisku wzrostu przeżywają jedynie komórki transformowane.

Ekstrakcja antygenu płaszczowego wirusa zapalenia wątroby typu B. Specjalistom znanych jest wiele sposobów ekstrakcji heterologicznego białka z jednokomórkowych rekombinantowych gospodarzy. Każda ze znanych technik rozrywania komórek i zatężania białka i/lub ekstrakcji z rozerwanych komórek nadaje się do wyodrębniania HBsAg wytwarzanego sposobem według wynalazku.

Oznaczenie antygenu płaszczowego wirusa zapalenia wątroby. Transformowane komórki poddaje się wzrostowi w odpowiednich warunkach w celu uzyskania ekspresji w sposób opisany powyżej. Następnie, po rozerwaniu komórek analizuje się frakcję rozpuszczalną i nierozpuszczalną na obecność HBsAg. Frakcję rozpuszczalną analizuje się na obecność cząsteczek o średnicy 22 nm w dostępnym w handlu zestawie analitycznym „AUSRIA II (Abbott Lab.). Zarówno frakcję rozpuszczalną jak i nierozpuszczalną analizuje się na obecność monomeru stosując metodę hybrydyzacji Westerna, z użyciem anty-surowicy przeciw monomerycznej formie HBsAg i radioaktywne, znakowane ¹²⁵J - białko A.

Wynalazek opisany jest bardziej szczegółowo w następujących przykładach, nie ograniczających jego zakresu.

Skróty zastosowane w przykładach mają następujące znaczenie: SDS — dodecylosulfonian sodowy; EDTA — kwas etylenodwuaminoczterooctowy; TEMED — Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametylenodwuamina; DTT — ditiotreitol; BSA — albumina surowicy bydlęcej; EtBr — bromek etidium; PMSF — fluorek fenylometylosulfonylowy; Ci — Curie; Zymolyase 60,000 — dostawca: Miles Laboratories.

Bufory i roztwory stosowane w poniższych przykładach mają następujące składy:

Bufor IM Tris: 121,1 g zasady Tris w 800 ml wody doprowadza się do żądanej wartości pH dodając stężony (35%) wodny roztwór kwasu solnego, pozostawia roztwór do schłodzenia do temperatury pokojowej przez końcowym ustaleniem pH i rozcieńcza do objętości 1 litra.

Bufo TE: 1,0 mM EDTA w 0,01 M (pH 7,4) buforze Tris.

PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem): 10 mM fosforan sodowy (pH 7,0), 0,15 M NaCl.

Bufor stosowany w elektroforezie żelowej SDS: 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10%o glicerol, 100 mM ditiotreitol, 1,001 procentowy błękit bromofenolowy.

Podłoże YPD: 1% ekstraktu drożdżowego „Bacto“, 2% Bacto-pectonu, 2% glukozy.

Podłoże SD: 6,75 g podstawy azotowej drożdżowej bez aminokwasów (DIFCO), 2% glukozy w litrze wody.

SED: 1 M sorbit, 25 mM EDTA, 50 mM DTT.

Bufor SCE: 9,1 g sorbitu, 1,47 g cytrynianu sodowego, 0,168 g EDTA, 50 ml wody; doprowadza się pH do wartości 5,8 kwasem solnym.

CaS: 1 M sorbitol, 10 mM CaCk; sterylizuje się przez filtrację.

Roztwór PEG: 20% glikolu polietylenowego - 3350,10 mM CaCk, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4); sterylizuje się przez filtrację.

SOS: 1 M sorbit, 0,3 X podłoże YPD, 10 mM CaCk.

Skład soli podstawionych (stosowany do prowadzenia wzrostu transformowanych szczepów Pichia w fermentorze).

Sole podstawowe H3PO4, 85% CaSO4-2H₂O K2SO4

MgSO4-7H2O

KOH

Ilość w litrze 4,2 ml 0,18g

2,86 g 2,34 g 0,65 g

152 882 7

Pożywka do hodowli Pichia (stosowana do prowadzenia wzrostu szczepu GS115 (pBSAG5 w fermentorze).

H3PO4 (85%)	g/litr wody 3,5 ml
CaSO4-2H₂O	0,15
K2SO4	2,38
MgSO4-7H₂O	1,95
KOH	0,65
FeSO4*7H₂O	0,065
CuSO4-5H₂O	0,006
ZnSO4-7H2O	0,020
MnSO<H2O	0,003
Biotyna	0,000041
Źródło węgla	20-10)g

Roztwór soli śladowych (do prowadzenia wzrostu szczepu GS115/pBSAG151).

	g/litr wody
CuSO4-5H2O	0,06
KJ	0,08
MnSO₄-H2O	0,3
NaMoO₄-2H2O	0,2
H3BO3	0,02
ZnSO₄-7H2O	2,0
FeCl₃-6H2O	4,8
H2SO4	3-5 ml/litr (dla usunięcia zmętnienia)

Bufor do rozcieńczania „Ausria: 4,3 mM Na2HPO4,1,5 mM KH2PO4, 2,7 mM KC1,0,15 M NaCl, 1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,02% azydku sodowego: końcowe pH równe 7,4.

Bufor solubilizacyjny: 10 mM buforu fosforanu sodowego (pH 7,5), 0,5 M NaCl, 0,1% triton Χ-100, 2mM PMSF.

O ile nie podano inaczej, składy powyższych roztworów reprezentują stężenie podstawowe. Tam, gdzie w przykładach stosuje się inne stężenia, zaznaczono to przez podanie wielokrotności stężenia podstawowego (lx).

Przykład I. Transformowanie Pichiapastoris.

A. Prowadzenie wzrostu komórek.

1. Kolonię Pichia pastoris GS 115 (NRRL Y-15851) posiewa się do około 10 ml podłoża YPD i wytrząsa hodowlę w temperaturze 30°C przez 12 do 20 godzin.

2. Po upływie 12 do 20 godzin rozcieńcza się zawiesinę komórek do gęstości optycznej ODeoo około 0,01 - 0,1 i utrzymuje się komórki w logarytmicznej fazie wzrostu na podłożu YPD w temperaturze 30°C przez około 6 do 8 godzin.

3. Po 6 - 8 godzinach, zaszczepia się 100 ml podłoża YPD ilością 0,5 ml hodowli posiewowej o gęstości optycznej ODeoo około 0,1 (lub ilością równoważną) i wytrząsa w temperaturze 30°C przez około 12-20 godzin.

4. Po osiągnięciu wartości ODeoo równej 0,2-0,3 (po upływie około 16-20 godzin) zbiera się komórki przez wirowanie przy 15(X)g przez 5 minut.

B. Przygotowanie sferoplastów.

1. Komórki przemywa się 1 raz ilością 10 ml sterylnej wody (wszystkie operacje wirowania w etapach 1 do 5 prowadzi się przy 1500 g przez 5 minut).

2. Komórki przemywa się 1 raz ilością 10 ml świeżo przygotowanego SED.

3. Komórki przemywa się dwukrotnie ilością 10 ml sterylnego 1M sorbitu.

4. Komórki zawiesza się w 10 ml buforu SCE.

5. Dodaje się 5 -10//1 preparatu Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories) o stężeniu 4mg/ml i inkubuje komórki w temperaturze 30°C przez około 30-60 minut.

152 882

Ponieważ wytwarzanie sferoplastów jest krytycznym etapem w procedurze transformacji, powinno się monitorować powstawanie sferoplastów w sposób następujący: Przed lub bezpośrednio po dodaniu zymolazy oraz w różnych okresach czasu podczas inkubacji dodaje się próbkę 100μ1 komórek do 900//15% SDS i do 900μ1 IM sorbitu. Inkubację zatrzymuje się w punkcie, w którym następuje liza komórek w SDS, ale nie w sorbitolu (zwykle między 30 a 60 minutą inkubacji).

6. 'Sferoplasty przemywa się dwukrotnie ilością 10ml IM sorbitolu przez wirowanie przy 1000 g przez 5-10 minut (czas i szybkość wirowania mogą być różne: wirowanie prowadzi się tak, aby powstały poletka sferoplastów, a nie nastąpiło pękanie komórek w wyniku przeciążenia).

7. Komórki przemywa się raz ilością 10 ml sterylnego roztworu CaS.

8. Komórki zawiesza się w ilości 0,6 ml roztworu CaS.

C. Transformacja.

1. W sterylnych probówkach polipropylenowych o wymiarach 12 X 75 mm umieszcza się próbki DNA w objętości do 20μ1 (DNA powinno być zawieszone w wodzie lub buforze TE; dla uzyskania maksymalnej częstości transformacji małymi ilościami DNA korzystne jest dodanie do każdej próbki około 1μ1 poddanego działaniu ultradźwięków DNA E. coli o stężeniu 5 mg/ml.

2. Do każdej próbki DNA dodaje się 10D/ti1 sferoplastów i prowadzi inkubację w temperaturze pokojowej w czasie około 20 minut.

3. Do każdej próbki dodaje się 1 ml roztworu PEG i prowadzi inkubację w temperaturze pokojowej w czasie około 15 minut.

4. Próbki wiruje się przy 1000 g przez 5-10 minut i dekantuje roztwór PEG.

5. Próbki zawiesza w 150//^1 SOS i inkubuje w czasie 30 minut w temperaturze pokojowej.

6. Dodaje się 850μ1 sterylnego 1M sorbitolu i określone ilości próbek wysiewa się na płytki w sposób opisany poniżej.

D. Regeneracja sferoplastów.

1. Agarowe podłoże regeneracyjne przygotowuje się w sposób następujący:

a) , sterylizuje się w autoklawie Agar-KCl (9g Bactoagaru, 13,4g KC1 i 240 ml wody).

b) . sterylizuje się w autoklawie roztwór -10 X glukoza (20 g glukozy, 100 ml wody).

c) . sterylizuje się w autoklawie roztwór 10 X SC (6,75 g podstawy azotowej drożdżowej „Yeast Nitrogen Base“ bez aminokwasów i 100 ml wody). Przed lub po sterylizacji dodaje się żądany aminokwas lub kwas nukleinowy do stężenia 20^//g/ml.

d) . Do 300 ml stopionego roztworu Agar-KCl dodaje się 30 ml roztworu 10 X glukoza i 30 ml roztworu 10 X SC oraz 0,6 ml biotyny o stężeniu 0,2 mg/ml oraz żądany aminokwas lub kwas nukleinowy do stężenia 20 //g/ml. Tak przygotowany stopiony agar regeneracyjny utrzymuje się w temperaturze 55-60°C.

2. Posiew próbek po transformacji na płytki.

Co najmniej 30 minut przed zakończeniem etapu transformacji płytki pokrywa się dolną warstwą 10 ml agaru regeneracyjnego na płytkę. W czasie, gdy próbki transformacyjne są w roztworze SOS do probówek utrzymywanych w łaźni o temperaturze 45-50°C dodaje się po 10 ml agaru regeneracyjnego. Do tych 10 ml ilości stopionego agaru regeneracyjnego utrzymywanego w temperaturze 45-50°C dodaje się w określoną ilość każdej próbki i wylewa na płytki zawierające zestaloną dolną warstwą 10 ml agaru regeneracyjnego.

3. Oznaczanie jakości preparatu sferoplastów.

Z jednej próbki pobiera się ilość 10/L/1 i wykonuje 100-krotne rozcieńczenie przez dodanie 990^1 IM sorbitu. Z tego 100-krotnego rozcieńczenia pobiera 10μ1 i rozcieńcza HW-krotnie przez dodanie następnej ilości 990μ11 M sorbitu. Na płytki z agarem YPD posiewa się po 100//1 obydwu rozcieńczeń dla oznaczenia stężenia pozostałych w preparacie całych komórek, które nie przeszły w postać sferoplastów. Ilości po 100//1 każdego rozcieńczenia dodaje się do 10 ml agaru regeneracyjnego wzbogaconego 40//ml histydyny dla oznaczenia ogólnej ilości zdolnych do regeneracji sferoplastów. W próbie transformacji, za dobre wyniki uznaje się 1-3 X 10⁷ zdolnych do regeneracji sferoplastów i około 1 X 10³ całych komórek/ml.

4. Płytki poddaje się inkubacji w temperaturze 30°C w czasie 3 do 5 dni.

Przykład II. Konstruowanie rodziny wektorów pAOP2.

1. Plazmid pPG2.5 trawi się enzymem BamHI (Plazmid pPG2.5 jest plazmidem opartym na pBR322, zawierającym fragment EcoRI-Sall o długości około 2,5 kilopar zasad pochodzących z plazmidu pPG4.O, który to plazmid zawiera pierwszy gen oksydazy alkoholowej (ΑΟΧ1) i regiony

152 882 9 regulatorowe; jest on dostępny w Northern Regional Research Center Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, w Peoria, Illinois pod numerem NRRL B-15868).

2. Doprowadzony do postaci liniowej plazmid trawi się enzymem Bal31.

3. Otrzymany DNA taktuje się fragmentem Klenowa dla wytworzenia tępych końców i poddaje się ligacji z linkerami EcoRI.

4. Produkty ligacji transformuje się do E. coli, szczep MM294.

5. Prowadzi się skroning transformantów techniką hybrydyzacji kolonii, stosując syntetyczny oligonukleotyd o następującej sekwencji:

5'TTAIT'CGAAACGGGAATTCC.

Oligonukleotyd ten zawiera sekwencję promotora Α0Χ1 przed kodonem inicjacji ATG (lecz nie zawiera tego kodonu), przyłączoną do sekwencji linkera EcoRI.

6. Prowadzi się analizę sekwencji żądanych (pozytywnych) klonów stosując technikę Maxama - Gilberta. Wszystkie trzy klony pozytywne posiadały następującą sekwencję:

5'...TTATTCGAAACGAGGAATTCC...3'

Wszystkie one zachowały nukleotyd „A“ z kodonu ATG (podkreślony). Uznano, że ten A prawdopodobnie nie będzie szkodził, a zatem wszystkie następne klony są pochodnymi tych pozytywnych klonów. Klony te otrzymały odpowiednie oznaczenia laboratoryjne: pAOPl, pAOP2 i pAOP3.

7. Dwa inne klony zidentyfikowano poprzez skrining ich produktów ligacji z linkerem BA131. Posiadają one następującą sekwencję:

5'... TAATTATTCG GAATTCC ..3' ρΑΟΧΙ EcoRI

Klony te otrzymały oznaczenia pAOP5 i pAOPó.

W wariancie powyższej procedury, plazmid pPG2.5 cięto enzymem AsuII zamiast enzymem BamHI, zlinearyzowany fragment traktowano fragmentem Klenowa (nie wykonano trawienia BA 131) i poddawano ligacji z linkierami EcoRI. Otrzymany plazmid zawiera sekwencje promotora ΑΟΧ1, a nie zawiera kodonu inicjacji ATG. Plazmid ten, oznaczony jako pAOP4 posiada następującą sekwencję:

5'.. TAATTATG GAATTC ..3' ρΑΟΧΙ EcoRI

Promotor Α0Χ1 (ρΑΟΧΙ) reaguje na represję kataboliczną źródła węgla poważnym zahamowaniem syntezy enzymatycznej. Ponadto, promotor AO jest wrażliwy na głód źródła węgla. Wzrost na metanolu prowadzi do dalszego inkubowania promotora Α0Χ1. Poza tym, na podstawie wyczerpujących badań opisanych przez Ellisa, Brusta, Koutza, Watersa, Harpolda i Gingerasa w „Molecular and Cellular Biology May. 1985, str. 1111-1121, stało się jasne, że stosowany w niniejszym wynalazku fragment promotora Α0Χ1 podlega regulacji w podobny sposób, jak promotor Α0Χ1 w chromosomie. Każdy z klonów otrzymanych i wyizolowanych w sposób opisany w tym przykładzie wykazuje wrażliwość na reperesję kataboliczną, głód źródła węgla i indukowanie metanolem, tak jak się to dzieje w przypadku samego promotora Α0Χ1.

Opis terminatora AO. Fragment Stul-Hindlll użyty jako terminator AO zawiera sekwencje, które służą jako matryca dla poliadenylacji transkryptu informacyjnego RNA Α0Χ1. Sekwencje te zawierają:

Jeśli fragment Stul-Hindlll jest zlokalizowany w plazmidzie w kierunku 3' do regionu kodującego polipeptyd, to powoduje on zakończanie syntezy RNA. Sekwencje terminatorowe ΑΟΧ1 zostały wyizolowane i mogą być odzyskane z plazmidu pPG3.2, który jest plazmidem opartym na pBR?22, zawierającym sekwencje terminatorowe ΑΟΧ1. Plazmid ten, transformowany do gospodarza E. coli będzie powszechnie dostępny w Northern Regional Reasearch Center Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych w Peoria, Illinois pod numerem akcesyjnym NRRL B-15999 po uzyskaniu patentu na niniejsze zgłoszenie.

Przykład III. Kolejne etapy zastosowane do wytworzenia plazmidów opisywanych w tym przykładzie są przedstawione na fig. 5. Konstruowanie plazmidów pBSAG5 i pBSAG51.

1. Konstruowanie pCFL2. Wektor pAOP2, zawierający na końcu 3' promotor ΑΟΧ1 bez części TG z kodonu ATG trawi się enzymem HincII. Fragment DNA zawierający ten promotor izoluje się i poddaje ligacji z pBR322, uprzednio trawionym enzymem HindUI i połączonym z fragmentem Klenowa. W reakcji tej powstaje wektor pCFL2.

2. Konstruowanie plazmidu pBSAOP2. Plazmid pBR322-BglII, będący plazmidem pBR322, w którym miejsce dla PvuII zastąpiono miejscem dla Bglll, trawi się enzymami EcoRI i Ciał. Ten, doprowadzony do postaci liniowej plazmid łączy się w reakcji ligacji z fragmentem Clal/EcoRI z plazmidu pCFL2, zawierającym 5-ΑΟΧ1. Wytworzony wektor oznaczono symbolami pBSAOP2.

3. Konstruowanie plazmidu pBSAG22. Plazmid pHBS-5 (opisany przez Valenzuela'ę i wsp., Naturę, 298, 357-350 (1982), patrz fig. 6), zawierający insercję genu HBsAg w miejscu EcoRI w plazmidzie pBR322, trawi się enzymem Ciał. Następnie, przez trawienie engonukleazą Bal31 usuwa się w obydwu kierunkach około 60 par zasad. Pozostały fragment DNA trawi się enzymem BamHI i łączy z fragmentem Klenowa. Po ligacji, pulę około 200 transformantów trawi się za pomocą Ncol. Doprowadzone do postaci liniowej plazmidy izoluje się i poddaje powtórnej ligacji. Po transformacji E. coli, około 10% wszystkich plazmidów (oznaczonych jako pBSAGl) posiada nowo utworzone miejsce dla Ncol. Plazmid pBSAG 1 trawi się enzymem Ncol, łączy z fragmentem Klenowa i trawi enzymem BamHI. Otrzymany plazmidowy fragment poddaje się ligacji z pBSAOP2, uprzednio trawionym enzymem EcoRI, uzupełnionym fragmentem Klenowa i trawionym za pomocą BamHI. Otrzymany wektor oznaczono symbolami pBSAG22.

4. Konstruowanie plazmidów pBSAG4, pBSAG5 i pBSAG51.

Plazmid pAOT-1 zawierający fragment zakończenia transkrypcji 3-ΑΟΧ1, trawi się enzymami Xbal i Pstl. (plazmid pAOT-1 jest plazmidem opartym na pBR322, otrzymanym przez ligację fragmentu Sall-Hindlll o długości 1,6 kilopar zasad, z pPG3.2 /dostępnego w gospodarzu E. coli pod numerem NNRL B-l5999/ z trawionym Sa 1 Ι-HindllI plazmidem pBR322 Δ EcoRi ((o jest pBR322 ze zniszczonym miejscem dla EcoRI, patrz fig. 7). Fragment zawierający terminator poddaje się ligacji z uprzednio ciętymi enzymami Xbal i Pstl plazmidem pBSAG22.Otrzymuje się pXP-l. pBSAG22 trawi się enzymem Dral, dodaje się linkery Stul i poddaje się dalszemu trawieniu za pomocą Stul i EcoRI. Izoluje się gen strukturalny HBsAg i poddaje go ligacji z uprzednio ciętymi enzymami Stul i EcoRI plazmidem pXP-l. Otrzymuje się pBSAG4.

Fragment Ciał z pBSAG4, zawierający gen strukturalny HBsAg poddaje się ligacji do miejsca Ciał w pYJ33 (patrz fig. 8), otrzymując plazmidy pBSAG5 i pBSAG51. Mapa restrykcyjna plazmidu pBSAG51 przedstawiona jest na fig. 11. Plazmidy pBSAG5 i pBSAG51 różnią się jedynie orientacją fragmentu Ciał, który zawiera kasetę ekspresji 5'-AOXl (HBsAg)3'-AOXl. W pBSAG5, fragment 5'-AOXl sąsiaduje z genem HIS4 z Pichia, podczas, gdy fragment 3'-AOXl sąsiaduje z elementem autonomicznym PARS2. Plazmid pBSAG5, transformowany do gospodarza E. coli został zdeponowany w Northern Regional Research Center Ministerstwa Rolnictwa Stanów Zjednoczonych dla zapewnienia powszechnej dostępności po uzyskaniu patentu na niniejsze zgłoszenie. Szczep E. coli MC1061-pBSAG5 uzyskał numer akcesyjny NRRL B-18028.

Przykład IV. Konstruowanie gospodarza Pichia pastoris GS 115 (pBSAG 151), w którym zachodzi ekspresja genu HbsAg.

W przykładzie tym opisano preparowanie gospodarza Pichia pastoris, w którym pierwszy gen oksydazy alkoholowej (ΑΟΧ1) w chromosomie Pichia zpstał zastąpiony genem antygenu płaszczowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg).

Dla wytworzenia zmutowanego gospodarza Pichia pastoris -Aoxl”, w którym zachodzi ekspresja genu HBsAg, konstruuje się plazmid pBSAG151 w sposób opisany na figurach 9-11. Pierwszym etapem w tej konstrukcji jest trawienie endonukleazą restrykcyjną HindllI wektora ekspresyjnego pSAOH5 zawierającego promotor ΑΟΧΙ-gen LacZ oraz wektora ekspresyjnego pTHBS3, zawierającego promotor ΑΟΧΙ-gen HBsAg, przygotowanego w sposób opisany poniżej i przedstawiony na fig. 13. W celu wytworzenia pTHBS3, plazmid pAOT-1 (patrz fig. 7) trawi się za pomocą Stul, poddaje się ligacji z linkerami EcoRI i następnie trawi enzymem Pstl. Izoluje się fragment EcoRI-Pstl zawierający fargment 3'-AOXi.

Wektor pAOP3, zawierający sekwencję 5'-AOXl, trawi się enzymami EcoRI i Sstl. Otrzymany fragment 5'-AOXl w reakcji ligacji włącza się do wektora wahadłowego E. coli - S.cerevisiae, pSEYlOl [Douglas i wsp, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81,3983-3987 (1984)], który to wektor trawi

152 882 11 się uprzednio za pomocą EcoRI i Sstl. Wynikiem ligacji tych fragmentów pAOP3 i pSEYlOl jest plazmid pTAO20. Plazmid pTAO20 zawiera geny URA3 i oporności na ampicylinę potrzebne do selekcji odpowiednio w S. cerevisiae i w bakteriach, koło 2μ do replikacji w S. cervisiae oraz sekwencje 5 -ΑΟΧ1.

Plazmid pTAO20 trawi się częściowo za pomocą Pstl. Doprowadzony do postaci liniowej wektor izoluje się i trawi za pomocą EcoRI. Największy fragment (zawierający sekwencję koło 2 μ, gen URA3 i fragment 5'-A0X 1) poddaje się ligacji z fragmentem 3'-A.OXl otrzymanym z pAOT-1. Otrzymuje się ' wektor pTHBSl.

Po trawieniu pHBS-5 za pomocą EcoRI izoluje się fragment EcoRI zawierający HBsAg, fragment ten poddaje się ligacji z uprzednio trawionym EcoRI i poddanym działaniu bakteryjnej fosfatazy alkalicznej plazmidem pTHBS 1. Wytworzony wektor oznaczony jako pTHBS2, posiada insercję genu HBsAg pomiędzy sekwencjami 3'- a 5'-A0Xl.

Plazmid pYJ30 (dostępny w E. coli jako gospodarzu pod numerem NRRL B-15890) poddaje się trawieniu EcoRI, uzupełnia fragmentem Klenowa i tnie enzymem Pstl. Izoluje się fragment zawierający geny P. pastoris HIS4 (Parsl i fragment ten poddaje się ligacji z fragmentem Pstl-Sstl z wektora pTHBS2, (który zawiera gen HBsAg flankowany sekwencjami Α0Χ1). W wyniku ligacji powstaje wektor pTHBS3.

W wyniku trawienia pTHBS3 enzymem Hindlll tworzy się fragment o długości 1,4 kilopar zasad (fragment ten zawiera gen HBsAg, sekwencję terminacji Α0Χ1 i część sekwencji promotora Α0Χ1). Fragment ten wyodrębnia się i dokonuje ' jego insercji do pochodzącego z pSAOH5 fragmentu o długości 7,7 kilopar zasad, zawierającego gen HIS4 z Pichia, większość sekwencji promotora Α0Χ1 i sekwencje z pBR322. Izoluje się rekombinantowy plazmid pYM39 o długości

9.1 kilopar zasad, zawierający przywrócone sekwencje promotora Α0Χ1.

W drugim etapie konstrukcji, plazmid pPG3.2 (dostępny w E. coli jako gospodarzu pod numerem NRRL B-15999) trawi się za pomocą PvuII z wytworzeniem fragmentu o długości 1,5 kilopar zasad zawierającego bezpośrednio sekwencje 3' genu ΑΟΧ1. Dokonuje się insercji tego fragmentu do pojedyńczego miejsca Nrul w pYM39. Izoluje się rekombinantowy plazmid pYM 16 o długości 10,6 kilopar zasad, zawierający fragment PvuII zorientowany tak, że sąsiadujące sekwencje genu 3'-AOXl są zorientowane w kierunku genu HIS4 w tym wektorze. Plazmid pYM16 zawiera wszystkie składniki wymagane dla uzyskania delecji genu ΑΟΧ1 z gospodarza Pichia i ekspresji HBsAg pod kontrolą promotora ΑΟΧ1, ale nie zawiera on wyciętego fragmentu genu HBsAg z pBSAG5.

Ostatnim etapem konstrukcji jest zatem włączenie żądanego genu HBsAg do wektora, w którym nastąpi delecja genu ΑΟΧ1. W tym celu, plazmidy pYM16 i pBSAG51 trawi się enzymami restrykcyjnymi Pstl i SphI (Plazmid pBSAG51 jest identyczny z plazmidem pBSAG5, z tym, że fragment Ciał zawierający kasetę ekspresji HBsAg usytuowany jest w odwrotnej orientacji). Fragment o długości 6,3 kilopar zasad z pBSAG51, zawierający wyciętą kasetę ekspresji genu HBsAg i gen HIS4 z Pichia włącza się przez insercję do fragmentu o długości 4,6 kilopar zasad z pYM16, który zawiera sekwencje 3ΆΟΧ1 i większość sekwencji z pBR322. W wyniku powstaje plazmid pBSAG 151 o długości 10,9 kilopar zasad. Plazmid pBSAG151 w gospodarzu E. coli został zdeponowany w Northern Regional Research Center w Peoria, Illinois pod numerem akcesyjnym NRRL B-18021 dla zapewnienia powszechnej dostępności po uzyskaniu patentu na niniejsze zgłoszenie.

Dla wykonania transformacji szczepu mutantu P. pastoris HIS4, GS 115 (NRRL Y-15851), plazmid pBSAG151 trawi się enzymem restrykcyjnym Bglll uzyskując liniowy wektor o długości

7.2 kilopar zasad, zawierający 0,85 kilopar zasad sekwencji 5' genu ΑΟΧ1 na jednym końcu i 1,1 kilopar zasad sekwencji z części 3' genu ΑΟΧ1 na drugim końcu (fig. 12). Około 2//g ciętego Bglll pBSAG 151 transformuje się do GS 115, wykonując selekcję pod względem prototrofii histydyny. W ^wyn^iku transformacji uz^ys^kuje sⁱę ok:oło 5 X 10³ kolonii His*.

Przypadki transformacji, w których następuje insercja pBSAG151 w postaci liniowej cząsteczki w locus ΑΟΧ1 w chromosomie powodują delecję genu ΑΟΧ1. Transformowane szczepy His+, w których nastąpiła żądana insercja liniowej cząsteczki identyfikuje się zatem na podstawie bardzo powolnego wzrostu na metanolu. (Pichia pastoris ma drugi, „słabszy gen oksydazy alkoholowej, ΑΟΧ2, wytwarzający oksydazę alkoholową w ilości wystarczającej do powolnego wzrostu na metanolu szczepów defektywnych pod względem pierwszego genu oksydazy alkoholowej).

152 882

W procedurze identyfikacji transformantów His*, które nie mogą dobrze rosnąć na metanolu należy w pierwszym etapie wyizolować komórki His* z agaru selekcyjnego. Etap odzysku prowadzi się przez przeniesienie agaru do probówki o pojemności 50 ml, zawierającej 20 ml sterylnej wody i pulweryzację agaru w homogenizatorze Brinkmana przy małej szybkości przez 30 sekund. Pozostałość agarową oddziela się od komórek przez filtrację mieszaniny przez gazę i przemycie agaru . ilością 30 ml sterylnej wody. Komórki drożdży rozcieńcza się następnie do gęstości optycznej Ae(»=0,l, poddaje działaniu ultradźwięków w czasie 10 sekund w sonifikatorze Bransona ustawieniu mocy 4 dla rozbicia bryłek komórek drożdży i rozcieńcza 1(00-krotnie wodą sterylizowaną. Ilości 10 i 100 μΐ posiewa się na płytki agarowe zawierające 0,67% podstawy azotowej drożdżowej bez aminokwasów (Difco) i 0,1 % glukozy. Po inkubacji w temperaturze 30°C przez 3 dni, wykonuje się skrining kolonii, które pojawiły się na płytkach na zdolność wzrostu na metanolu, wykonując posiewy kolonii metodą replik na serię płytek agarowych zawierających 0,67% podstawy azotowej drożdżowej bez aminokwasów i następujące źródła węgla: 1) brak źródła węgla, 2) 0,5% metanol, 3) 2% glukoza. Spośród kolonii, które wyrosły za 2% glukozie, 32% nie wykazywało zdolności dobrego wzrostu na metanolu.

Dla potwierdzenia, że nastąpiła insercjapBSAG151 w sposób opisany na fig. 12. Zjednegoze szczepów P. pastoris defektywnego pod względem utylizacji metanolu wyekstrahowano całkowity DNA, trawiono go endonukleazami restrykcyjnymi i hybrydyzowano metodą Southerna typu biot z sondami znaczonymi ³²P. W jednym zestawie prób Southerna trawiono DNA ze szczepu ΑοΧΓ . GS 115 (pBSAG151) i szczepu AoXl* GS 115 za pomocą Hindlll i hybrydyzowano zeznaczonym pPG4,0, plazmidem złożonym z genu ΑΟΧ1 i sekwencji z pBR322, dostępnym w gospodarzu E. coli w Northern Regional Research Center w Peoria, Illinois pod numerem NRRL B-15868. W pasmach zawierających DNA z GS115 widoczny był fragment o długości 2,3 kilopar zasad kodujący ΑΟΧ1. Jednakże, w pasmach zawierających DNA z GS115 (pBSAG 151), fragment ten był nieobecny i nie pojawiły się nowe fragmenty. Wynik jest dowodem, na to, że w szczepie GS115 (pBSAG 151) uległ delecji gen ΑΟΧ1.

PrzykładV. Prowadzenie wzrostu drożdży Pichia transformowanych wektorami zawierającymi kod dla HBsAg.

1. Prowadzenie hodowli szczepu GS115 (pBsAg5) w fermentorze.

W wytrząsanej kolbie poddaje się wzrostowi 10% inokulum przez dobę, na pożywce stanowiącej podstawę azotową drożdżową (YNB) + 2% glukozy, w temperaturze 30°C. Inokulum to dodaje się do fermentora zawierającego sterylizowane sole podstawowe (doprowadzone do pH 4). Glukozę podaje się w rozcieńczeniu 0,5-0,1/godzinę. Gdy gęstość komórek osiągnie stały poziom, a zawartość glukozy w fermentorze obniży się do poziomu 100 ppm, indukuje się wytwarzanie HBsAg przez zmianę zasilania źródłem węgla na metanol lub mieszaninę 50% glukozy/50% metanolu.

2. Prowadzenie hodowli GS115 (pBSAG151) (ΑοΧΓ) fermentorze.

Optymalną ekspresję aktywności Ausria rozpuszczalnego HBsAg (3-4% rozpuszczalnego białka) osiąga się prowadząc wzrost organizmu ΑοΧΓ metodą wsadową na glicerolu, a następnie na pożywce zawierającej metanol. Wzrost inokulum można prowadzić na pożywce YMB + glicerol.

Sole podstawowe + glicerol (użyto 1 i 4% glicerol) oraz biotynę można autoklawować w fermentorze. Po schłodzeniu, doprowadza się pH mieszaniny do wartości między 3,5 a 6 i przed zaszczepieniem inokulum dodaje się sole śladowe (2,5 ml/litr); 100% metanol można podać przed lub po wyczerpaniu glicerolu. Zawartość metanolu na poziomie 2% nie zakłóca akumulacji HBsAg, która może trwać do 200 godzin. Jednak 5% zawartość metanolu w fermentorze zatrzymuje akumulację cząsteczek HBsAg.

Wzrost do wyższych gęstości komórek osiąga się przez zwiększenie stężenia soli. Przy wzroście na metanolu dla zwiększenia gęstości komórek szczególnie ważne są zwiększone poziomy cynku. Wyższe poziomy dającej się ekstrahować aktywności Ausria osiąga się jeśli się nie limituje się wzrostu cynku, ale wtedy zawartość dającego się ekstrahować białka jest również wyższa, dając w wyniku netto obniżenie aktywności Ausria jako % ilości rozpuszczalnego białka.

3. Prowadzenie hodowli komórek GS115/pBSAG5 i GS115 (pBSAgl51) we wstrząsanych kolbach.

152 882

Transformowaną kolonię zbiera się i posiewa ezo (smugami) na płytkę SD. Zawartość ezy komórek posiewa się do 50 ml pożywki YNB (IX YNB,5//g/ml biotyny) z zawartością 5% glukozy wytrząsanej kolbie o pojemności 250 ml i wytrząsa przez noc w temperaturze 30°C z szybkością 250 wstrząsów/minutę w wytrząsarce z napowietrzaniem. Poranna gęstość optyczna ODeoo ma wartość 2-3. Z kolby pobiera się ilość 100 jednostek ODeoo komórek (około 10’ komórek) i wiruje w wirówce LEC w czasie 7 minut przy 2000 Xg w temperaturze pokojowej. Poletkę komórek zawiesza się w 500 ml podłoża YNB z dodatkiem 2% glicerolu w dwulitrowej kolbie (ODeoo=0,2).

Hodowlę inkubuje się w tenmperaturze 30°C w wytrząsarce z napowietrzaniem 250 obrotach/minutę, do osiągnięcia ODeoo=2-3. W przypadku gospodarza ΑοχΓ w hodowli pobiera się 500 ODeoo. Zawiesinę komórek wiruje się w wirówce LEC przez 7 minut z szybkością 2000Xg. Paletkę komórek zawiesza się w 500 ml pożywki YNB z dodatkiem 5% metanolu (1,0 ODeoo).

W przypadku gospodarza Aoxl+, z . hodowli pobiera się ilość 170 ODeoo komórek, wiruje je w tych samych warunkach i zawiesza w 500 ml pożywki YNB z dodatkiem 0,5% metanolu (0,3 ODeoo)· ' Obydwie hodowle wytrząsa się w 2-litrowych kolbach w temperaturze 30°C z szybokością 250 obrotów/minutę. Kiedy tylko gęstość komórek osiągnie wartość ODeao>2, wtedy hodowle rozcieńcza się dwukrotnie tymi samymi pożywkami. Periodycznie pobiera się próbki po 100 ODeoo i wiruje je przez 7 minut przy 2000 Xg. Otrzymane peletki komórek można przechowywać w stanie zamrożenia w temperaturze -70°C przez 1-2 tygodni.

Przykład VI. Oznaczanie HBsAg: Cząsteczka 22 nm i monomer HBsAg.

1. Przygotowanie ekstraktów i oznaczanie białka.

Wszystkie niżej opisane operacje prowadzi się w temperaturze 0-4°C. Zamorożoną peletkę komórek rozmraża się i przemywa dwukrotnie ilością 2 ml ziębionego lodem buforu solubilizacyjnego. Komórki (100jednostek ODeoo) przenosi się do szklanej próbówki (13 X 100 nm). Do peletki komórek dodaje się 0,35 ml buforu solubilizacyjnego i 0,5 g przemytych kwasem perełek szklanych o średnicy 0,45 mm. Zawiesinę wstrząsa się na wstrząsarce wirowej przy ustawieniu maksymalnej mocy, cztery razy po minucie za każdym razem, a wjednominutowych okresach między wytrząsaniem utrzymuje się je na lodzie. Całą zawiesinę komórek usuwa się, a perełki szklane przemywa się ilością 0,35 ml buforu solubilizacyjnego· Przemywki łączy się z zawiesiną komórek i przenosi do próbówki Eppendorfa. Ekstrakt wiruje się w wirówce Eppendorfa w czasie 15 minut. Supernatant (frakcje rozpuszczalna; 0,7 ml) oddziela się od peletki. Dla wyekstrahowania białka HBsAg z peletki, do peletki tej dodaje się 0,7 ml roztworu: 2 X stężony SDS - bufor solubilizacyjny miesza się we wstrząsarce wirowej i utrzymuje we wrzeniu przez 15 minut. Mieszaninę tę następnie wiruje się przez 15 minut i usuwa supernatant (frakcję nierozpuszczalną) znad komórkowego debris. Pewne ilości frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej oznacza się na zawartość białka metodą precypitacji TCA i metodą Lowry'ego. Jako standard stężenia białka służy BSA. Zarówno frakcja rozpuszczalna jak i nierozpuszczalna zawierają białko w stężeniu w zakresie 3-15mg/ml.

2. Alternatywny sposób preparowania ekstraktów.

W przykładzie tym opisano warunki ekstrakcji monomerycznego, heterologicznego białka HBsAg lub kompleksu białkowego - cząsteczek 22 nm, z hodowli Pichia pastoris transformowanych wektorami zawierającymi sekwencje kodujące białko HBsAg.

Prowadzi się wzrost hodowli Pichia pastoris do gęstości 10-100 jednostek ODeoo w mililitrze. Ilość 100 jednostek ODeoo przenosi się do borokrzemianowej próbówki o wymiarach 13 X 100 mm i przemywa dwukrotnie 20 objętościami buforu solubilizacyjnego.

Komórki wiruje się otrzymując peletki. Do peletek komórek (w wirówce medycznej IEC) dodaje się 0,5 g przemytych kwasem perełek szklanych o średnicy 0,5 mm, a następnie 0,35 ml buforu solubilizacyjnego. Bufor solubilizacyjny zawiera albo 0,5 M NaCl i 0,1% Triton Χ-100 (wag./obj.) jako kontrolę albo 3 molowe stężenie jodku potasowego lub tiocyjanianu potasowego, z dodatkiem lub bez dodatku 0,1% Tritonu Χ-100. Wszystkie roztwory buforują się do pH 7,5 za pomocą 10 mM fosforanu sodowego. Mieszaninę miesza się cztery razy po minucie przy makymalnej szybkości, stosując wstrząsarkę wirową. W okresach między mieszaniem mieszaninę ziębi się na lodzie w czasie nie krótszym od minuty. Po zakończeniu lizy, roztwór zniszczonych komórek oddziela się, perełki szklane przemywa się ilością 0,35 ml buforu solubilizacyjnego, po czym łączy się te dwa roztwory i poddaje się wirowaniu w czasie 15 minut przy 13.000 xg. Supernanty oddziela się i przeznacza do analizy reaktywnie immunologicznie cząsteczki HBsAg (próba Ausria) i na całkowite białko strącane kwasem trójchlorooctowym. Wyniki 5 prób przedstawiono w tabeli 1.

152 882

Tabela 1

Warunki lizy	A Cząsteczki 22 nm HBsAg (pg/ml)	B Białko ogólne (μ/ml)	c Zawartość cząsteczki 22 nm HBsAg w białku (w % wagowych)
Stężenie soli NaCl (0,5M) + Triton	203-249	8,6 -114	2,1-3,2
KJ (3M) + Triton	5,1-150	0,85- 3,4	0,5- 8,1
KJ (3M) — Triton	71 -136	2,5 - 4,3	2,3- 74
KS CN (3M) + Triton	2,4- 50	0,6 - 1,9	0,8- 9,6
KSCN (3M) — Triton	80 -125	1.6 - 4,3	3,8-16,7

Pomimo, że żaden z warunków, w którym zastosowano jodek lub tiocyjanian potasowy nie daje wyższych wartości dla cząsteczek HBsAg niż warunki stosowania chlorku sodowego (kolumna A), jest, widoczne że jodek lub tiocyjanian potasowy hamuje uwalnianie całkowitego białka (kolumna B), zwiększając przez to aktywność właściwą cząsteczek 2 do 5-krotnie (kolumna C).

3. Oznaczanie cząsteczek 22 nm (zestaw AUSRIA ™II).

Rozpuszczalną frakcję rozcieńcza się 1000 do 1(XXXMk:otnie buforem do rozcieńczania „Ausria“. Ilości 25 i 100 μ\ tych rozcieńczeń oznacza się następująco:

Pierwsza inkubacja.

1. Dla sporządzania krzywych standardowych, seryjne rozcieńczenia zawierające 0,1 ng - 4 ng próbki kontrolnej w całkowitej objętości 200μ1 pipetuje się do osobnych wgłębień na płytce , reakcyjnej (w tym sporządza się 4 próbki kontrolne negatywne).

W celu analizy próbek, 200μ1 każdej rozcieńczonej frakcji rozpuszczalnej umieszcza się pipetą w oddzielnych wgłębieniach płytki reakcyjnej.

2. W każdym wgłębieniu zawierającym próbkę frakcji lub próbkę kontrolną umieszcza się ostrożnie jedną perełkę. Perełki można umieszczać również przed dodaniem roztworu kontrolnych lub próbek.

3. Płytkę reakcyjną przykrywa się szczelną nakrywką, którą się ostrożnie dociska dla przykrycia perełek i usunięcia pęcherzyków powietrza.

4. Następnie inkubuje się mieszaniną reakcyjną na płytce w temperaturze 45°C w czasie 2 godzin.

5. Przykrywkę zdejmuje się i odrzuca, ciecz zasysa się i każdą perełkę przemywa się dwukrotnie ilością 4-6 ml destylowanej lub dejonizowanej wody.

Druga inkubacja.

6. Do każdego wgłębienia zawierającego perełkę pipetuje się 200μ1 znaczonej 125j Anty-Nbs.

7. Płytkę reakcyjną przykrywa się nową szczelną nakrywką, nakywkę ostrożnie dociska się do płytki dla pokrycia perełek i usunięcia pęcherzyków powietrza.

8. Płytkę reakcyjną inkubuje się w temperaturze 45°C w czasie 1 godziny.

9. Nakrywkę zdejmuje się i odrzuca, ciecz zasysa się i każdą perełkę przemywa się 4 razy jak w etapie 5.

10. Następnie perełki szybki przenosi się do odpowiednich probówek scyntylacyjnych. Odczyty z licznika γ - scyntylacyjnego

11. Szybkość zliczeń oznacza się dla 1 minuty.

12. Po ostatnim przemyciu próbki zlicza się w czasie 24 godzin.

Stężenie cząsteczek 22 nm wylicza się na podstawie krzywej standardowej sporządzonej w etapie 1.

4. Oznaczanie monomeru (próba Westerna).

Objętość równoważną 25μg białka (frakcji rozpuszczalnej lub nierozpuszczalnej), zwykle 2 -5μ1, rozcieńcza się wodą do 10μ1. Dodaje się 10μ12 X stężonego buforu do elektroforezy żelowej SDS(10mMDTTw 1 X buforze) i próbki utrzymuje się we wrzeniu w czasie 15 minut. Następnie próbki umieszcza się na 12% żelu akryloamidowym sDs (Leammli). Po elektroforezie żelowej, białka przenosi sią na krążki nitrocelulozowe (Towbin i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979). HBsAg wykrywa się z użyciem antysurowicy HBsAg (uzyskanej z HBsAg

1528821 15 pochodzącego z plazmy) i znaczonego 125j - białka A. Krążki nitrocelulozowe eksponuje się na błonie Kodak XAR-5 przez noc w temperaturze -70°C. Monomer oznacza się ilościowo przez zliczanie radioaktywnych pasm z krążków nitrocelulozowych w liczniku promieniowania y. Jako standard stosuje się rekombinantowy HBsAg wytworzony przez S. cerevisiae (100-500 ng/pasmo).

Przykład VII. Oznaczanie poziomów ekspresji'HBsAg w Pichia pastoris.

Wytwarzanie HBsAg przez szereg transformowanych szczepów Pichia 'pastoris oznaczano stosując metodę podaną w przykładzie 6, z solubilizowaną procedurą według opisanej w części 1 tego przykładu. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Szczep transformowany	GS115/pBSAG151	GS115/pBSAg5/
fenotyp	ΑοχΓ His*	ΑοχΓ His*
postać wektora	zintegrowany	autonomiczny

poziom HBsAg*/w kolbie wstrząsarki

komórek/litr	10”	w”
Zawartość monomeru w%	7	w
Zawartość cząsteczek 22 nm (w%)	2,5	0,2
Zawartość monomeru ' (mg/litr) b	8,4	18
Zawartość cząsteczek 22 nm (mg/litr)	3	0,24

poziom HBsAg (wzrost w fermentorze)

Komórki/litr	3,5 X 10”	8 X 10”
Zawartość monomeru (w%)	7	1
Zawartość cząsteczek 22 nm (w %)	2,9	0,1
Zawartość monomeru (w mg/litr)	294 96
Zawartość cząsteczek 22 nm (w mg/litr)^b	122	10

a - próby na zawartość wykonane metodą Bradforda b - zawartość HBsAg w litrze podłoża hodowli; ODeoo = 5 X 10⁷ komórek/ml = 0,14 mg suchej masy/ml = 0,06 mg białka/ml.

Przedstawione powyżej wyniki są dowodem na to, że w hodowli Pichia pastoris można osiągnąć wysokie poziomy wytwarzania HBsAg pod kontrolą regionu regulatorowego pierwszego genu oksydazy alkoholowej (ΑΟΧ1) z Pichia pastoris.

Przykłady zamieszczono jedynie dla ilustracji praktycznego wykonania wynalazku i nie należy ich uważać jako ograniczenia zakresu wynalazku lub załączonych zastrzeżeń. . Racjonalne odchylenia i modyfikacje nie odbiegające od istoty i ducha wynalazku uważa się za objęte zakresem żądanej ochrony patentowej.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Ssosóó wytwarzania aatygenn wirusa zapalenia wątrolry typu B,znamienny tym,że hoduje się szczep drożdży transformowany plazmidem zawierający fragment DNA, bakteryjny DNA plazmidowy, gen będący markerem selekcji pochodzenia drożdżowego i sekwencję autonomicznej

152 882 replikacji z drożdży, przy czym jako fragment DNA stosuje się fragment zawierający: (a) region regulatorowy zdolny do kontrolowania transkrypcji informacyjnego RNA, jeśli znajduje się na końcu 5' regionu kodującego polipeptyd, który to region regulatorowy jest wrażliwy na co najmniej jeden z następujących warunków: (i) obecność metanolu w podłożu hodowli, z którym kontaktuje się organizm gospodarza zawierający powyższy fragment DNA, (ii) obecność w podłożu, z którym kontaktuje się organizm gospodarza ' zawierający wspomniany fragment DNA źródła , węgla nie wywierającego represji katabolicznej, innego niż metanol, (iii) niedobór źródła węgla w podłożu hodowli, z którym kontaktuje się organizm gospodarza zawierający wspomniany fragment DNA po wzroście tego organizmu gospodarza na źródle węgla i energii wywierającym represję kataboliczną, oraz (b) region kodujący polipeptyd, będący regionem kodującym antygen płaszczowy zapalenia wątroby typu B lub część tego antygenu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się na podłożu zawierającym co najmniej jedno źródło węgla i energii, takie jak metanol bądź inne źródło węgla nie wywierające represji katabolicznej albo co najmniej jedno źródło węgla i energii wywierające represję kataboliczną, przy czym, w przypadku stosowania źródła węgla i energii wywierającego represję kataboliczną otrzymany produkt poddaje się warunkom głodu źródła węgla.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytworzony antygen płaszczowy wirusa zapalenia wątroby typu B poddaje się dalszej izolacji i oczyszczaniu.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że region regulatorowy we fragmencie DNA jest scharakteryzowany mapą restrykcyjną przedstawioną na fig. 2.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do transformowania szczepu drożdży stosuje się plazmid zawierający fragment DNA posiadający ' ponadto 3' - sekwencja DNA za regionem kodującym polipeptyd, przy czym ta 3-sekwencja dNa ma zdolność kontrolowania poliadenylacji i zakończania transkrypcji mRNA kodowanego przez ten region kodujący polipeptyd.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, że szczep drożdży transformuje się plazmidem, w którym fragment DNA , zawiera ponadto jedną lub więcej dodatkowych sekwencji DNA pochodzących z bakteryjnego plazmidowego DNA, DNA bakteriofaga, drożdżowego plazmidowego DNA lub drożdżowego DNA chromosomalnego.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako drożdżowy DNA chromosomalny stosuje się DNA zawierający autonomicznie replikującą się sekwencję DNa i gen markerowy.
8. Sposób według zastrz. 1 albo7, znamienny tym, że do transformowania szczepu drożdży stosuje się plazmid, w którym fragment DNA zawiera ponadto odcinek DNA, w skład którego wchodzą kolejno uszeregowane: pierwszy, zdolny do insercji fragment DNA, gen będący markerem selekcji oraz drugi, zdolny do insercji fragment DNA, przy czym, każdy z dwóch zdolnych, do insercji fragmentów DNA ma długość co najmniej 200 nukleotydów i posiada sekwencje nukleotydowe homologiczne z częściami DNA genomowego gatunków z rodzaju Pichia, a fragment DNA i gen markerowy usytuowane są pomiędzy końcem 3' pierwszego zdolnego do insercji fragmentu DNA a końcem 5' drugiego zdolnego do insercji fragmentu DNA; oraz ten pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA są w stosunku do siebie zorientowane tak, jak są one zorientowane w genomie Pichia.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 8, znamienny tym, że jako region kodujący polipeptyd we fragmencie DNA stosuje się fragment EcoRI-StuI o długości około 700 par zasad o następującej sekwencji nukleotydowej:

5-GAATTGATGG

TGCTCGTGTT

CCTCACAATA

CTCAATTTTC

ATTCGCAGTC

TCCTCCAATT

CGTTTTATCA

TCTTCTTATT

CGTTTGTCCT

AGAACATCAC

ACAGGCGGGG

CCGCAGAGTC

TAGGGGGATC

CCCAACCTCC

TGTCCTGGTT

TATTCCTCTT

GGTTCTTCTG

CTAATTCCAG

ATCAGGATTC

TTTTTCTTGT

TAGACTCGTG

TCCCGTGTGT

AATCACTCAC

ATCGCTGGAT

CATCCTGCTG

GATTATCAAG

GATCAACAAC

CTAGGACCCC

TGACAAGAAT

GTGGACTTCT

CTTGGCCAAA

CAACCTCCTG

GTGTCTGCGG

CTATGCCTCA

GTATGTTGCC

AACCAGTACG

GGACCATGCA

CTATGTTTCC

AAATTGCACC

GCAAAATACC

GGCTCAGTTT

GCTTTCCCCC

TGGTATTGGG

TTATACCGCT

CATTTAAGGC

AAACCTGCAC

CTCATGTTGC

TGTATTCCCA

TATGGGAGTG

ACTAGTGCCA

ACTGTTTGGC

GGCCAAGTCT

GTTACCAATT

CT-3'

GACTCCTGCT

TGTACAAAAC

TCCCATCGTC

GGCCTCAGTC

TTTGTTCAGT

TTTCAGCTAT

GTACAGCATC

CAAGGCAACT

CTACGGATGG

CTGGGCTTTC

CGTTTCTCTT

GGTTCGTAGG

ATGGATGATG

GTGAGTCCCT

TCTGGGTATA
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako plazmid stosuje się pBSAG5.
11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako plazmid stosuje się pBSAG51 przedstawiony na fig. 11.
12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako plazmid stosuje się pBSAG151 przedstawiony na fig. 11.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako szczep drożdży stosuje się szczep z rodzaju Pichia.
14. Sposób według zastrz. 5 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9, znamienny tym, że stosuje się region regulatorowy i 3' - sekwencję DNA pochodzące z plazmidu pAOP2, przedstawionego na fig. 4.

pesMsi

FIG. 7

FIG. 6

FIG. 8

FIG. 10

FIG. 11

Β. O*

Lzi

β. Trawienie (Hr/P«a) Ba

J—I

Ba to Ba

Chromosom__J 1_L

5'-A0XlMBaAe| HX· 4

3'-A0Xl

FIG. 12 =y_.

-H (MrZPva) Ba —>—I—I··

3'-ftOXl

FIG. 13 pTwsa

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł