CS87192A3 - Novel polyethylene glycol (peg)conjugates of proteins - Google Patents

Novel polyethylene glycol (peg)conjugates of proteins Download PDF

Info

Publication number
CS87192A3
CS87192A3 CS92871A CS87192A CS87192A3 CS 87192 A3 CS87192 A3 CS 87192A3 CS 92871 A CS92871 A CS 92871A CS 87192 A CS87192 A CS 87192A CS 87192 A3 CS87192 A3 CS 87192A3
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
protein
alpha
ethanediyl
omega
peg
Prior art date
Application number
CS92871A
Other languages
English (en)
Inventor
John Hakimi
Patricia Kilian
Perry Rosen
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27101069&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CS87192(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of CS87192A3 publication Critical patent/CS87192A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/3332—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing carboxamide group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33344—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing carbamate group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33396—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen having oxygen in addition to nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/334—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur
    • C08G65/3344—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur containing oxygen in addition to sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/334—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur
    • C08G65/3348—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur containing nitrogen in addition to sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/964—Chemistry: molecular biology and microbiology including enzyme-ligand conjugate production, e.g. reducing rate of nonproductive linkage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Vending Machines For Individual Products (AREA)

Description

'3 to cn
3C rc X» ETové polyethylenglykolové /PEG/ konjugáty proteinů
Oblast vynálezu 1 Předložený vynález se týká nových polyethylenglykolo-vých konjugátů proteinů· Různé přírodní, a cekombinantní. proteiny mají použitív medicíně a farmacii. Mohou být po čištěni, separaci aformulaci do přípravků podávány paren.terálně. při různýchterapeutických, indikacích. Parenterální podání proteinůvšak může být imunogenní, mohou být relativně nerozpustné vevodě a mohou mít krátký farmakologický poločas života. NÚsled-kesE toho může být obtížné dosáhnou terapeuticky účinnýchhladin v krvi u pacientů.
Dosavadní stav techniky
Tyto problémy mohou být překonány konjugací proteinů kpolymerům jako je polyethylenglykol. ^avis a spol., US patentč. 4179337 popisuje konjugaci polyethylenglykolu./PEG/ kproteinům jako jsou enzymy a inzulín za účelem získání kon-jugátů, ve kterých, by protein, byl méně imunogenní a měl bysi udržet podstatný podál své fyziologické aktivity. Nákaga-wa a spol., US patent č., 4791192 popisuje konjugaci PEG kproteinu, aktivujícímu ostrůvky pro snížení, jeho vedlejšíchúčinků a munogenicity. Veronesé a spol., ěpplieď. Biochem. anďBúotecg;., 11:141-152 /1985/ popisuje aktivaci polýethylengly-kolů fenylchlořformiáty pro modifikaci ribohukleázy a super-oxid dismutázy. Katre a spol., US patent č. 4766106 a 4917888také popisují solubilizaci proteinů polymerovou konjugací* PEG a jiné polymery jsou konjugovány k rekombinantním pro- teinům pro snížení imunogenicity a zvýšení poločasu životnosti*
Viz Nitecki a spol., US patent č. 4902502, Enzon, lne., mezi- -2- nórodní přihláška δ*. PCT/US9G/02133, Nishimura a spol., ev-ropská patentová přihláška í54316 a Tomáši, mezinárodni při-hláška č. PCT/SS85/02572. King a spol., Int.Azchs.ALlergy appl.Imoiun. 66,. 439-446 '/1.981/ popisuje způsob připojení proteinůk PEG za použití 0-/RO-PEG/-S-karboxamidomethyl-dithiokarbo-nátových meziproduktů. Předcházející metody tvorby konjugátů PEG-protein akonjugáty jimi připravené, představují4obtížné problémy. £nim patří skutečnost, že určité metody tvorby těchto konju-gátů protein-PEG mohou protein inaktivovat takže vzniklékonjugáty mají malou biologickou aktivitu. Dále;. určité lin-kery používané při tvorbě těchto konjugátů PEG-protein mohoubýt náchylné k hydrolytickému štěpení in vivo. Jestliže toto·štěpení probíhá po podání, ztrácejí tyto konjugáty zlepšenévlastnosti poskytnuté pomocí PEG.
Podstata vynálezu Předložený vynález poskytuje nové konjugáty PEG-proteiapoužití^ jedinečných linkerů, které spojují různé aminosku-piny v proteinu k. PEG, které tak překonávají problémy spojené's tvorbou konjugátů proteinu s PEG.
Zejména předložený .vynálesE poskytuje? fyziologicky aktiv?·ní konjugát proteinu obecného vzorce I
c protein.
/V
II -3-
Η R Μ. kde E1 je nižší alkyl., R2'je -O- nebo -NH-, R3 je =R-R4 , =Snebo =0, R4 je nižší alkyl nebo cykloalkyl, m a n, jsou vybrá-ny z celých čísel í tak, že konjugát; má alespoň část biolo- gické aktivity nekonjugováného proteinu, 2 3 a tou podmínkou, že když R jé -0-, RJ má jiný význam než=N-R4, když R2 je -θ- a R^ je =0, protein je interferon -alfa, inter 2.3 leukin-1 nebo interleukin-lra a že když R je -O- a R je; =S, není protein antigen E z pylu ambrosie nebo hovězí plas-mový albumin»
Specifičtěji, předložený vynález poskytuje proteinovékonjugáty obecných vzorců 1-4, X-B, I-C, I-D a I-E protein /1-4/ protein ...../I-B/______ protein XI-C/ 1 zR1 -O-/Cff2GH2O/a-C^CH2 . γ
R R^O-./C^CHgO/^CI^CEg fl E1-0-/eR2CE20/n-CH2CH^
0 -4- ΕΓ-Ο-ΖΟ^Ο^Ο/η- Ní K Nff- / \ /
C ti s protein. /1-3/ /\ z® H1-0-/CH2CS20/a-CH2CH2 ζ
Λ J protein. kde R.\ S4, m,n: a protein mají výše uvedený význams. V souladu s předloženým vynálezem je také ponejprv poskyt-nut receptorový antagonista proteinu interleukinu-1 /IL-lra/ a interleukin-1 /IL-1/ konjugovaný k PEG. V souladu s tímto vynálezem, se konjugót proteinu vzor-·ce-I získá kondenzací aktivovaného PEG, tj. PEG, kde jednahydroxylová skupina byla nahrazena aktivovaným linkerem,, sjednou nebo více volnými aminoskupinami v proteinu., áktivu-vané PEG sloučeniny použité pro výrobu konjugótu mají násle-dující obecné vzorce II-A, Il-B,} II-C, II-D, II-E, II-P aII-G: R10/Ca^CH2O/m-CH2CH2-BĚ=C=^R4
^O/CHjCHgO/^-CHjCH^-O - C - NS /11-4/
r -5- h'O/CK,CLO/ -Cff CH -NB - C - Oá d. n R10/CHoCff„0/ -CHO-CRO-E&=C=Sd d EU d d /II-G/ /II-D/
R 0/CB2CHi0/n-CVH2.^C.G—^b5
/11-5/
O ^O/C^CHgO^-CH^CHg-G-C-O-'^ JJ /11*6/ t 4 kde R je nižší alkyl, R je nižší alkyl nebo cykloalkyl aje nižší alkyl nebo H a ni je celé číslo od 1 do 1000· V souladu s tímto vynálezem, při použití aktivovanýchPEG sloučenin vzorců H-A, II-B, II-C, II-D, II-E, II-E neboII-G pro přípravu konjňgátů, spojovací vazba mezi volnými ami-nóskupinami v proteinu a PEG je vytvořena tak, Že si výslednýkonjugát udržuje alespoň část biologické aktivity proteinupři snížení jeho imunogénicity. Dále spojovací skupiny vytvo-řené v konjugátu podle tohoto vynálezu při použití jakéhokolivz aktivovaných polyethylenglykolů vzorce II-A až II-G se získáproteinový konjugát, který není snadno náchylný k hydrolytic- -6- kému štěpení in vivo a nemá žádné nevýhody konjugátů PEG-protein podle předchozího stavu techniky. 1 5 V souladu s tímto vynálezem, R a R. mohou být jakýkolivnižší alkyl, výhodně methyl. Výraz nižší alkyl označuje nižšíalkylovou skupinu, obsahující 1 až 6 atomů uhlíku jako jemethyl, ethyl, n-propyl, isopropyl atd.. Obecně je výhodnoualkylovou skupinou nižší alkylová skupiny, obsahující od i do 4 atomů uhlíku, a nejvýhodnější z nich je methyl. V souladu s tímto vynálezem m a n mohou být zvoleny zjakýchkoliv celých čísel Γ- takovým způsobem, že výslednýkonjugát proteinu má alespoň část biologické aktivity pro-*teinu, který tvoří konjugát. Je zjevné., že součet n a m je/-nepřímo úměrný množství biologické aktivity proteinu, který'jer v konjugátu zadržen. Číselná hodnota n se vztahuje k počtuethylenglykolových jednotek v polyethylenglykolu, který tvo-ří konjugát a je mezi 1 a 1000. Výraz m. se vztahuje k počtuvolných aminoskupin. obsažených v proteinu, který reaguje saktivovaným PEG. Výhodně je hodnota m v rozsahu 1 až 5, hodno-ta 1 je nejvýhodnější. čím je hodnota m + n vyšší, tím jevyšší molekulové hmotnost konjugátu. Molekulová hmotnostpolymerů polyethylenglykolu vzorců II-A až Il-G a konjugátůproteinu vzorců I a 0—A až I-E může být snadno stanovena od-borníky. Z molekulových hmotností,které byly stanoveny jemožno odvodit, hodnoty man. Výraz protein znamená jednakpolypeptidy a jednak fyziologicky přijatelné adiční soli.
Jestliže sloučenina jakéhokoliv ze vzorců II-A až II-Greaguje s proteinem a protein obsahuje více než jednu volnouaminoskupinu, může být získán konjugát jako směs různýchkonjugátů protein-PEG. V případě, kdy protein obsahuje dvěvolné aminoskupiny,, může aktivovaný PEG reagovat buň s jednouz volných aminoskupin nebo s oběma volnými aminoskupinami. -7- V takovém případě směs obsahuje jeden konjugát, ve kterém dvě volné aminoskupiny reagovaly s PEG a druhý konjugát vytvo-řený tak, že jen jedna volná aminoskupina reagovala s PEG.
Protože různé konjugáty v této směsi mají rozdílné molekulové ' hmotnosti, mohou tyto konjugáty. být odděleny běžnými í jako je chromatografife. Pro stanovené, jestli man bylyzvoleny správně, mohou být separované konjugáty screenoványna biologickou aktivitu stejnými, způsoby, použitými proscreen rodičovského proteinu pro stanovení, zda konjugátještě obsahuje část biologické aktivity proteinu použitéhopro tvorbu konjugátu. Tímto způsobem, mohou být čísla manupravena jakýmkoliv požadovaným způsobem pro získání žádoucíaktivity. Η V souladu, s výhodným provedením tohoto vynálezu jsou - .m a n’jakékoli v celé číslo:, takže molekulová hmotnost konju-gátu, mimo hmotnosti proteinu, je mezi asi 300 až asi 30000daltony. 7 souladu s výhodným provedením je m. t. Jestliže jem 1, může :být tento konjugát získán i když jsou přítomny dvěnebo více volných aminoskupin. Aktivovaná PEG sloučenina budenejprve-reagovat s jednou z volných aminoskupin, obsaženýchv proteinové skupině. Eegulací koncentrace,činidel jako jeprotein a reakčních podmínek, v souladu se standardními metoda- v mi aminové kondenzace je možno řídit stupen pegylace volných z minoskupin obsažených v proteinu. V proteinech, obsahujícíchjednu nebo více volných aminoskupin, kde jedna z volnýchaminoskupin je reaktivnější než ostatní aminoskupiny, mohoubýt podmínky zvoleny tak, že protein reaguje s aktivovanouPEG sloučeninou za vzniku sloučeniny vzorce I, kde m je 1. "alší volné aminoskupiny, obsažené v aminokyselinách, kterétvoří protein, mohou následně reagovat s PBG následující kon-denzační reakcí za použití delších nebo využitím: jiných sil-nějších podmínek. V souladu s výhodným provedeními, kde m je 1, -8- n je jakékoliv celé číslo takové, že polyethylenglykol, kterýtvoří konjugát. má molekulovou hmotnost od 300 do 30000 dal-tonů, což odpovídá tomu, že n je přibližně 0 až 680. Výhod-něji je n asi 28, 112 a 225, což odpovídá molekulové hmot-nosti 1325, 5000 a 10000, kde ·η je jako nejvýhodnější v ob-lasti 112. Charakteristika pólyethylenglykolového polymerumolekulovou hmotností je výhodnější než označení samotnýchOpakujících se jednotek v PEG polymeru číslem n, vzhledemk možné nehomogenitě výchozích PÉG sloučenin, které jsouběžně definovány jejich průměrnou molekulovou hmotností a neopakujícími se jednotkami. Výchozí PEG sloučeniny různé moleku-lové hmotnosti, mohou být připraveny v oboru známými metodaminebo mohou být získány od obchodních dodavatelů. V případě, že hodnoty man. získané stanovením moleku-lových hmotností nejsou celá čísla /což je obecný případ/,za-okrouhlují se tyto hodnoty směrem dolů nebo háhoru obvyklýmzpůsobem*
Jestliže je nižší alkyl, 2^ může být jakákoliv nižší alkylová skupina, obsahující 1 až 6 atomů uhlíku; jak je. 5 5 definována výše. Jestliže 2' je cykloalkyl, je 2 výhodněcykloalkylová skupina, obsahující od 3 do 7 atomů uhlíku jakoje cyklopropyl., cyklopentyl, cyklobutýl a cyklohexyl. Výhod-nou cykloalkylovou akupinou je cyklohexyl.
Titulní sloučeniny v každém z následujících příkladůjsou pojmenovány v souladu s nomenklaturou 1UPA3. Nicméně mohoutyto sloučeniny být také pojmenovány následovně1 Příklady 1,2,3 a 4: JD.f a-/2-//cyklohexylkarbonimidoyl/-amino/ethyl/-omega-methoxypóly/oxy-1,2-ethandiyl/ je alternativně nazván alfa-/2-///cyklofeexylamino/methylen/ amino/ethyl/omega-methoxypoly-/pxý-1,2-ethandiyl/· -9- Příklady 1A, 1a a Id:
Alf a-/2-chlorethyl/-omega-methoxypoly/oxy-l,2-ethandiyl/ je:alternativně nazván alfa-methoxy-omegaV2-chlorethyl/poly/oxy- 1,2-ethandiyl/. Příklady 1B, 1b a 1e.:
Alfa7£-azidoethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ jealternativně nazván alfa-methoxy-omega-/2-azidoethyl/poly-/oxy-1,2-ethandiyl/. Příklady 1C,1e a ífi
Al£a-/2-aminoéthyl/-omeg;a-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl·/ ,jealternativně nazván alfa-methoxy-omegá-/2-aminoethyl/poly-/oxy-1,2-ethandiyl/. Příklady 11, 1í.a, 11b, 12, 124, a 13-17:
Alfa-aiethyl-omega-/2-///pyridinyloxy/karbonyl/amino/ethoxy/-poly/oxy-1,2-ethandiyl/ je alternativně nazván alf a-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/ amin©/ethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/. Přikladl 18, 18a, 19. 19A, 20, 20A, 21 a 22:
Alf a-//2-pyridinyloxy/karbonyl/omega-methoxypoly/oxy-l, 2-eťh and iy1/ je al t e řn ať i vně’ aaz ván 'alf á-methy1-omega-/2-///2-pyridinyldxy/karbonyl/oxy/-ethoxy/poly-/0xy-1,2-ethandiyl/. Příklady 23-27:
Alf a-/2-/Ísothiokyanáto/ethyl/-omega-methoxypoly/oxy-í ,2-ethandiyl/ je alternativně nazván alfá-/methoxy-omega-/2-/isothiokyanáto/ethyl/poly/oxy-1,2-ethandiyl/. Příklad 28: ALf a-//2-pyridinyloxy/thiokarbonyl/-omega-methoxypoly/ oxy- 1,2-ethandiyl/ je alternativně nazván alfa-methyl-omega-2-///2-pyridinyloxy/thiokarbonyl/oxy/ethoxy/-poly/oxy-l,2-ethandiyl/. -10-
Předložený vynález také zahrnuje způsob přípravykonjugátů PEG-protein obecného vzorce I nebo vzorců I-A ažI-E, který zahrnuje reakci jedné z aktivovaných sloučenin obec-ného vzorce II-A, II-B, II-C, II-D, II-E, II-P, H-G.J /II-A/ R10/CH2CH20/n-CH2CH2-N = C = N - R4
/II-B/ R 0/CH2CH20/tt-CH2CH2- θ - C /II-C/ R^/CHgCHgO/^ e
.ΝΉ - C 0
J5T
- G
/11-35/ R1O/CH2Cff2Q/n-CH2-eH2-&=C=S /II-E/ R1O/CH2eH20/n-CH2GH2- W - C - O 5 - . s /II-E/ R 0/CHoCHoQ/ -CH CH -O - C2 t n h
/n-G/ r’ O/CH2CH2O/n-CH2CH2-O-5-O. -11- 1 5 kde a , R a n mají výše definovaný význam, s volnou amino-skupinou proteinu nebo jeho solí a izolaci proteinu 2 reakčnísměsi.
Syntéza individuálních PEG derivátů, které jsou připojo-vány k proteinu jakož i jejich reakce s proteinem mohou býtprovedeny jak je popsáno dále jak v popise tak v příkladech. o
Pro získání proteinového konjugátu, kde R je -říH- a R^ jé ·=N-R^, /sloučenina vzorce 1-V může být použito následujícíhoreakčního schématu: -12- R1O(CH2CH2O)dCH2CH2OH S0X2
R1O(CH2CH2O)dCH2CH2X
NaN3, DMF R1O(CH2CH2O)aCH2CH2NH2 R1OÍCH2CH2O)nCH2CH2N3 r4-n=c=s H S h R1O(CH2CH2O)nCH2CH2N-Š-N-fť H. S h R^CHjCH^CHjC^N-fi-N-Fř (c,hs)3p, ca
rJ R O(CH2CH2O)nCH2CH2N^C:N-Fř ΙΠ
Η H N N-J-protein π O(CH2CH2O)n-CH2CH2 NR4
I-A kde I? , R^, n, m a protein mají dříve uvedený význam. V reakčním schématu se hydroxylová skupina na konciPEG molekuly převede na halogenovou skupinu běžnými způ-soby jako je zpracování s thionylhalogenidem, Výsledný PEGhalogenid se převede na azid běžnými způsoby jako je zpracování -13- s azidem sodným;. PEG: azid může pak být převeden na amin ob-vyklými způsoby jako je hydrogenace. PEG-amin pak reaguje salkyl nebo cykloalkyliso.thiokyanátem jako je cyklohexyliso-thiokyanát za vzniku thiomočoviny vzorce III, která se pakdesulfuruje obvyklými způsoby ze vzniku sloučeniny vzorce II—A,který obsahuje karbodiimidovou funkční skupinu, ^ři převá-dění. thiomoSoviny vzorce III na PEG-karbodiimid vzorce II A,je výhodným desulfuračním Činidlem trifenylfosfin. PEG karbodiimidl· obecného vzorce II-A může pak kondenzo-vat s,proteinem za jakýchkoliv běžných podmínek; pro kondenza-ci karbodiimidů s aminy. Obecně se tato reakce provádí vestandardním vodném rozteku pufru, majícím pH mezi 7 a 9 zavzniku konjugátu vzorce I-A. Výsledné kondenzační reakce můžeprodukovat směs konjugátů PEG-protein; o různých molekulovýchhmotnostech v závislosti na počtu volných aminoskupin v protei-nu a době reakce. PEG konjugáty pák mohou být rozděleny na svéindivmduální složky běžnými metodami jako je vysoce účinná ka-palinová ehr.omatografie nebo gelová elektroforéza.
Pro příprava konjugátu proteinu, kde B je -O- a B je=S /sloňffienina vzorce IB/, lze využít následující reakčnischéma. - : ?-
Alternativně, orote:nový konjugét oodle oředloženého_o „'· vynálezu, kde rt · je -u1- a je =b /sloučenina vzorce j--3/může oýt ořipraven oodle následujícího reakčního schéma*·
RlO(CH2ČH2O)2CH2CH2OH
i\ o u IV
VI
S zk R^CHjCI^OkCHjCHjO O' ^N'
II-F NH2-protein
R'-O(CH2CH2O)n’CH2CH2-O N
protein
I-B kde fí', mfr. a protein mají výše definovaný význam. souladu s tímto schématem, reaguje ?SC- s thiokarboná-tem obecného vzorce VΣ v organickém rozpouštědle za vznikuFEG thiokarbonátu vzorce iI-E. ?ři provedení teto reakce můžebýt použita jakákoliv běžná metoda kondenzace thiokarbonátus hydroxvskupinou..
Sloučenina vzorce II-F se převede na konjugát vzorce l-bkondenzací sloučeniny vzorce II-F s alespoň jednou volnou·ami>noskuoínou proteinu. t'ato reakce se provádí způsobem Dopsaným -14-
NH2-protein R1’O(CH2CH2O^CH2CH2-O, protein
I-B m f n a rrot· V této reakci se ‘-karbonothiovlbi s- .<</? HZ“ PÍZ Γ i. d i no nes ve y v? okr v r o u <; i s _ uh I o v o d í kov é s_ _ro z_ p ouótěd1 eza vzniku sloučeniny vzorce -r~-3. Sloučenina vzorce ΙΪ-3 můžekondenzovat s jednou nebo více volnými aminoskupin asi protei-nu za vzniku konjugátu vzorce 1-3 stejným způsobem jak jepopsáno ve spojení s kondenzací sloučeniny vzorce II-A s pro-teinem pro přípravu konjugátu směsi vzorce I-A. Separacetéto směsi může být orovede.na podle molekulárních hmotnostíproduktů vytvořených jak je oonsáno výše. -16- prc- konverzi sloučeniny vzorce ií-Ana konjugát vzorce Ι-Λ.Produkt získaný touto reakcí múze být směs konjugátů různýchinlekulových hmotností v závisiosti na množství volných a.mino-skupin v použitém proteinu. -Avto konjugát.y mohou být separová-ny podle molekulové hmotnosti v souladu s výše popsaným nestupám.
Pro přípravu oreteinovéno konjugátu, kde 3“ je -MH- a Pje -O /sloučenina vzorce 1-C/, muže být užito následujícíreakčr.í schéma:
IV R10(CH2CH20)nCH2CH2NH2
RO(CH2CH2O)n-CH2CH2-rr -Μ-Η
II-C j- -17- I NHg-protein i a / R1-O/CH^CH^O/n-CH^CH2 NE- protein mi /I-C/ 1 5 kde R , R , m, n a protein mají výše uvedený význam.
Sloučenina vzorce IV se získá kondenzací fosgenu s2-hydroxypyridinem /substituovaný^ jestliže R^ ~ nižší alkyl/ža použití jakékoliv běžné metody pro kondenzaci halogenidukyseliny s alkoholem.
Kondenzace PEG-aminu se sloučeninou vzorce IV se prová-dí refluxováním v halogenovaném uhlovodíkovém rozpouštědleza vzniku sloučeniny vzorce II-C. Sloučenina vzorce II-C sekondenzuje s proteinem přes jednu nebo více volných, aminosku-pin proteinu za vzniku sloučeniny vzorce I-C. Aato reakce se.provádí způsobem popsaným pro kondenzaci sloučeniny vzorceII-A za vzniku koajugátu vzorce I-A. V závislosti na počtuvolných aminoskupin, obsažených v proteinu, který reaguje sesloučeninou vzorce Π-C, může být konjugát vzorce I-C vytvo-řen jako směs konjugátů, majících rozdílné molekulové hmot-nosti. 'L'ato konjugátová směs může být rozdělena výše popsanýmzpůsobem.
Pro přípravu proteinového konjugátu podle předloženéhovynálezu, kde R^ je -WH- a R^ je =S /sloučenina vzorce I-D/,může být použito následující reakční schemaí -18- E10/CH2CH2O/aCH2GH2NH2 + di-2-pyridylthiokarbonát
V
R1O/CH2CH2O/aCH Cff K=C=S /II-D/ NEg-proteie
K E NK= , / \ / H^OVC^CH^Q/ CH2CH2 e protein 4 fflk /I-D/ kde m, n a protein mají výše uvedený význam. V tomto reakčním schématu reaguje PEG-amin se di-2-py-ridylthionokarbonátem za vzniku sloučeniny obecného vzorce II-DV tomto postupu může být použita jakákoliv běžná metoda kon-denzace aminu s thiokarbonátem. za vzniku isothiokyanátu. Slou-čenina vzorce II-D reaguje s proteinem za vzniku konjugátuvzorce i-D způsobem popsaným pro konverzi sloučeniny vzorceH. A na sloučeninu vzorce I-A. V souvislosti a v závislostiná počtu volných aminoskupin obsažených v proteinu, kondenza-ce sloučeniny vzorce II-D s proteinem poskytuje směs konju-gátů, která může být rozdělena na své jednotlivé komponentyzpůsobem výše popsaným pro separaci konjugátu vzorce I.
Alternativně, sloučenina vzorce I-D může být získánapoužitím následujícího reakčního schéma»
RlO(CH2CH2O)2CH2CH2NH2
I-D
Sloučenina vzorce v se získá kondenzací thiofosgenus 2-hydroxypyridinem /substituovaným jestliže H je nižšíalkal/, použití, jakékoliv běžné metody oro kondenzaci nalo-genidu kyseliny s alkoholem.· V pak reaguje s PEG--aminem způ-sobem popsaným pro přípravu sloučeniny vzorce lí-C. Výslednousloučeninou je ΙΙ-Ϊ. Sloučenino vzorce il-E kondenzuje sjednou nebo více volnými aminoskupinami proteinu za vznikukonjugátu vzorce I-D. l'ato reakce se orovádí způsobem popsa-ným výše pro přípravu konjugátu I-A. -2Q- -ro p rip rsvu proteinovévynálezu, kde je -3- 3 λ3 kompozice podle předloženéhoje C /sloučenina vzorce Ι-Ξ/, í ze použít následující reak schéma:
RlO(CH2CH2O)2CH2CH2OH +
R1O-(CH2CH2O)n-CH2CH2/
II o
NI protein
r-E kde i?!, ni, π a protein mají výáe uvedený význam.
Ve výše uvedeném reakčním schématu reaguje di-2-pyri-dylkarbonát s ?SG za vzniku sloučeniny vzorce II-G. 'lato reak-ce se provádí za podmínek, běžných při kondenzaci alkoholua karbonátu. Sloučenina vzorce II«G se převede» na sloučeninuvzorce I-H kondenzací sloučeniny vzorce ΓΙ-G s jednou nebovíce volnými aminoskupinami v proteinu, lato reakce se pro-vádí stejným způsobem,který je popsán pro konverzi sloučeniny -21- vzorce II-A na sloučeninu vzorce I-A. Reakční směs takto získa-ná může obsahovat směs konjugovaných sloučenin vzorce I-E v zá-vislosti na volných aminoskupinách obsažených v proteinu.x'ato směs obsahuje smě různých konjugátů různých molekulo-vých hmotností. Různé konjugáty. mohou být separovány ze směsipostupy uvedenými dříve. V souladu s výhodným provedením vynálezu může být při-praven konjugát interferonu-alfa s PEG podle následujícíhore akčního; schématu.
/11-0/
.. ' .. E ý
H R^O/CH^H^-CE^H^ ..... ' ..... ...i -.0 HHg-interferon-alfa NH-interferon-alfa kde R^’ je methyl, n je asi. 112. ^ato reakce je zejména zají-mavá pro interferon-alfa subtýpu interferon-alfa A /nazýva-ný také interferon-alfa 2/.
Syntéza aktivované PEG sloučeniny H-C je popsána výše2 v. souvislosti se syntézou proteinového konjugátu, kde R je-NE- a R^ je? =0. Konečný konjugát interferonu-alf a můžebýt získán analogickým způsobem jak je zde popsáno výše nebov příkladech syntézy proteinového konjugátu I-C. -22-
Pro. přípravu konjugátu s PEG může být použit jakýkolivprotein s fyziologickou aktivitou nebo jeho sůl 3 tou pod-mínkou, Že; protein obsahuje alespoň jednu aminoskupinu prokondenzaci. Výhodnými proteiny, které mohou být použity v předlo-ženém vynálezu jsou interleukin-I /IL-1/, interleukin-1receptorový antagonista-/IL-1ra/, ínterleukin-2 /IL-2/ ainterferony, např. IEN-alfa /leúkocytové interferony/, ΙΡΓΓ-beta /fibroblastový interferon/ a IPN-gamma /imunní Interfe-ron/,. jejich přírodní formy jakož i jejich analogy, homolo-gy nebo jejich zkrácené formy.
Neceptorový antagonista interleukinu-1 /IL-1ra/ můžebýt získán z tkáňových kultur nebo rekombinaritními technika-mi* Jednou z metod získání Il-1ra je zpracování G937 lidskýchmyelomonocytických buněk;/J5TCC CRL 1594/ s diferenciačnímčinidlem phorbol myristátt acetátem /PlSíV a pak jejich sti-mulace fjdctorem stimulujícím kolonie granulocytárních makro-fágů /Granulocyte ^acrophage-Colony Stimulating Pactor -GM-CSPJ dostupný od Angen./ a izolací a čištěním IL-ira z kapa-liny supernatantu kultury jak popisuje ^arter a spol., Nátuře:344, 633-637 /1990/.
Rekombinantní IL-1ra označuje IL-1ra, mající biologic-kou aktivitu srovnatelnou s nativním IL-Ira, ale připrave-ný rekombinantními technikami jak popisuje Parter a spol.,supra nebo Eisenberg a spol., Nátuře 343, 341-346 /1990/.
Interferon zahrnuje všechny typy interferonů jako jsounebo interferony a všechny sub typy všdch typů.
Interferony mohou být získány z tkání nebo tkáňových kulturnebo mohou být připraveny použitím rekombinantních technik -23- popsaných v literatuře, např. popsaných v evropské patentové přihlášce č. publ* 43980. V oboru jsou rovněž známy jiné metody přípravy a izolace přírodních nebo rekombinantních. in- terferonů. V souladu s tímto vynálezem bylo zjištěno, že proteinovýkonjugát podle vynálezu mé stejné použití jako protein.,který tvoří konjugát. Xyto konjugáty jsou terapeuticky ak-tivní stejným způsobem jako protein, ze kterého byly vytvo-řeny a mohou být použity stejným způsobem jako samotný pro-tein bez vyvolávání nežádoucích imunitních odpovědí, kterémohou být spojeny s: podáním samotných proteinů subjektu.
Proto se předložený vynález také týká farmaceutických pro-středků na bázi sloučenin vzorce X nebo jejich solí a způso-bů jejich přípravy.
Farmaceutické prostředky podle předloženého vynálezuse používají při kontrole nebo prevenci nemocí, obsahujíproteinový konjugát obecného vzorce X a terapeuticky inert-ní, netoxický a terapeuticky přijatelný nosičový materiál.Farmaceutické prostředky, které se používají, budou dávkoványv souladu s medicinální praxí tak, že se zvažují podmínky,které jsou léčeny,, stav jednotlivého pacienta, místo aplikace ’ proteinového konjugátu, způsob podání a další faktory známéodborníkům. Následující příklady představují ilustrativní provedenípředloženého vynálezu, aniž by jej jakkoliv omezovaly. 4 -24- Příkladý provedeni vynálezu Příklad 1 Příprava alfa-/22///cyklohexylkarbonimidoyl/amino/ethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7Z. Příprava alf a-/2-chlorethyl/-omeg,a-methoxypoly/oxy-1,2- ethandiyl·/ SRU; 111,7 / SRU jak je zde užito, znamenápočet opakujících se jednotek přítomných-v PEG polymeru/. 2 kaše 50 g MPEG /methoxypolyethylenglykolu, molekulováhmotnost 5000/ v 700 ml toluenu se oddestiluje 200 ml roz-pouštědla. Krefl ukují čímu roztoku se přikape 0,3 ml suchéhopyridinu a 2,2 ml thionylchloridu. Po čtyřhodinovém refluxo-vání se reakční směs míché přes noc. Rozpouštědlo se odstraníza sníženého tlaku a přidá se 500 ml CHgCl^ ke zbatku. Výsled-ný roztok se pak suší bezvodým uhličitanem draselným: a necháprojít přes 50 g bázické aluminy /Wolem Super 1/. VětšinaCHgClg se pak za sníženého tlaku odstraní a k výslednému siru-pu se přidá jeden litr diethyletheru. Ether se odstraní desti-lací a přidá se další diethylether pro vyvolání srážená.
Směs se míchá dvě hodiny a pak se odfiltruje, získá se 45 g .alf a-/2-chlorethyl/-omega-aethoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU111,7.
Znalýza pro Ο^ΞγΟΙΟ/ο^ΟΒ^Ο^ 1 vypočteno 53,97 % C, 9,12 % K, , 71 % Cl nalezeno 54,21 % C, 8,70 % ff, 0,71 95 Cl. 3. Příprava alfa-/2-azidoethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7
Směs 20 g azidu sodného a 50 g alfa-/2-chlorethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 se zahřívá na 120až 125 ve 375 ml suchého BUF. Po 7 hodinách se rozpouštědloodstraní za vysokého vakua. 2pytek se rozpustí v 500 ml CHgClg -25- a zfiltruje přes diatomickou hlinku. většina CH2C12 se pakvyvaří a přidá se diethylether pro vyvolání srážení, Směsse míchá přes noc a pak se «filtruje, “bytek se rozpustí vminimu glymu při 50 °C, roztok se ochladí a vysrážený pro-dukt se odfiltruje. Získá se alfa-/2-azidoethyl/-omega-methoxy-poly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7.
Aaalýza pro C^NýJ/Cí^CH^ 1 ] γ
vypočteno 53,77 % C, 9,09 % H, Ó,84 % H nalezeno 53,$1 % C, 9,08% H, 0,89% H. C. Příprava alfa-/2-aminoethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyí/ SRU 111,7
Ke směsi 25 g alfa-/2~azidoethyl/-omega-methóxypoly /oxy- 1,2-ethyndiyl/ SRU 111,7 ve 250 ml suchého glymu se přidá 3,5 g 10% Pd/C. Směs se pák umísti do atmosféry vodíku podtlakem 3,5 MPa a třepe se při 50 °C 18 hodin. Směs se pákodfiltrujé, pevný podíl se promyje CHgClg a spojené organickéroztoky se zbaví pod sníženým tlakem rozpouštědla, úbytek sepak rozpustí ve 100 ml teplého glymu a produkt se vysrážíz vychladlého roztoku. Sraženina se zfiltruje a suší sezahříváním za sníženého tlaku, získá se 23 g alfa-/2-amino-ethyl^-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7. . - ... énalýza pro C^H^NO/CHgCHgO^ vypočteno 54,43 % C,'9,20 % H,*0,28 % N / nalezeno 54,43 % C, 9,18 % H, 0,36 % N. -Alternativně se roztok 40 g alf a-/2-azidoethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 a 0,7 g /25,0 mmol/trifenylfosfinu rozpuštž?4So200 ml suchého CHgC^ eícbá přesnoc pod atmosférou argonu. Přidá se voda /2 ml/ a směs se míchádalších 12 hodin. Většina methylenchloridu se odstraní ve va-kuu a přidá se 400 ml diethyletheru. Sraženina se odfiltruje?,promyje se etherem a rozpustí ve 300 ml teplého /50 °C/ glymu. 26-
Roztok se nechá stát při teplotě místnosti pres noc a výsled-ná sraženina se odfiltruje, promyje se 2 x 100 ml glymu, 2x100ml diethyletheru a suší se vakuové sušárně v produ dusíku,získá se 35 g alfa-/2-aminoethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7- D·. Příprava alfa-/2-///cyklohexylamino/thiokarbonyl/amino/ethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1.,2-ethyndiyl/ SRU 111,7 X roztoku 4 g alfa-/2-aminoethyl/-omega-methoxypoly /oxy- 1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 v 60 ml suchého glymu při 40 °Cše přidá 0,1 ml cyklohexylisothiokyanátu. Roztok se necháxtátxp míchat při 40 °C 18 hodin. Směs se pak odfiltruje arozpouštědlo se odstraní za vysokého vakua, úbytek se pak roz-pustí ve 100 ml teplého glymu, roztok se ochladí a výslednásraženina sé odfiltruje a suší za vysokého vakua, získá se 3,5 g alf a-2-///cyklohexylamino/thiokarbonyl/-amino/ethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7·
Aialýza pro C^H^OS/CH^O/j ]?
vypočteno 54,25 9,13 % H, 0,54 % !ř, 0,62 % S nalezeno 54,39 % C, 8,87,# H, 0,55 % »,.0,59 % S. E* Příprava alfa-/2-///cyklohexylkarbonimidoyl/amino/—ethyl/-omega-methoxypoly/óxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7
Roztok 1 g alfa-/2-///cyklohexylamino/-thiokarbonyl/-amino/ethyl/-omega-rnethoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7*t2S m&amp; trifenylfosfinu, 90 /ul CCl^ a 84 ^ul triethylaminu,v. 5 ml suchého CH2C12 se refluxuje 72 hodin. Rozpouštědlose odstraní za sníženého tlaku a zbytek se rozpustí v mini-mu suchého glymu. po ochlazení se produkt vysráží a suší zavakua, získá se alfa-/2-///cyklohexylkarbonimidoyl/smino/-ethyl/-omega-methoxypoly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7·
Aialýza pro C10H18N20/CH2CH20/1i1^^í -27’
Sypočteno 54, °1 % C, 9,15 % H, 0,55 % N nalezeno 54,95 % C, 9,27 % U, 0,50 % N. Příklad 1a Příprava alfa-/2-chlorethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethan-diyl/ SRU 225
Postupem popsaným v příkladu 1 A se převede MPEG molekulo-vé hmotnosti 10000 na alf a-/2-chlorethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandíyl/ SRU 225*
Axalýzápro^H^lO/CHgGHgG/^j vypočteno 54,37 % C, 9,14 % H, 0,35 % Cl nalezeno 54,30 % C, 9,15 % H, 0,41 % Cl. Příklad 1b. ' Příprava alfa-/2-szidoethyl/-omega~methoxypoly/oxy-1,2-ethan-diyl/ SRU 225
Postupem popsaným v příkladu 1B se alfa-/2-chlorethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 převede na alfa-/2-azidoethyl/-omega-měthoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225*JSnalýza pro 6^11^:^/^^2^^2^225 vypočteno 54,34 % C, 9,13 96 H, 0,42 % N ---------------------- nalezeno 54,32 % Qt 9,28 % H, 0,50 96 Příklad 1e Příprava alfa-/2-aminoethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethan-diyl/ SRU 225
Postupem popsaným v příkladu tC se alfa-/2-azidoethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 převede na alfa-/2-aminoethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225· -28- -ánalýza pro C^HgNO/CH^CHgO/^^
vypočteno 54,48 # C, 9,17 O, Ú,14U nalezeno 54,80 % C, 9,21' # Η, «,12 % ΚΓ. Příklad Id Příprava alf a-/2-chlorethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 28,3
K roztoku čerstvě destilovaného oxalylchloridu /0,5 ml/ve 40' ml suchého CH^Clg při 0 °C se přikape 0,5 ml suchéhoDMF "v 10 ml CHgClg· Výsledný roztok se nechá ohřát na teplotumístnosti, míchá se 15 minut a pak se opět ochladí na 0 °C.Potom se přidá HPEG molekulové hmotnosti 1325 /5,6 g/ a výsled-ný roztok se refluxuje 5 hodin. Směs se pak nalije do vody aextrahuje se CHgCIz· CH^Clg roztok se suší síranem hořečnatýma odstraněním rozpouštědla za'sníženého tlaku se získá 1,7 galfa-/2-chlorethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 28,3 vé formě bílého prášku.
Aialýza pro C^H^ClO/CHgCHgO/gg^ vypočteno 53»38 % C, 9,03 % H, 2,64 % Cl nalezeno 53,48 % C, 9,10 % 0, 2,41 % Cl. Příklad 1e Příprava alfa-/2-azidpethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethan-diyl/ SRU 28,3
Postupem popsaným v příkladu 1S se převede alfa-/2-chlorethyl/-omega-methoxypoly/oxy-l,2-ethandiyl/ SRU 28,3 naalfav£-azidoethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyi/ SRU 28,3.
Aialýza pro C^H^N^O/CH^CHzCV^g, 3
vypočteno 53,12# C, 8,99 % S, 3,11 % N -29- nale2eno 53,21 % C, 9,07 % B, 2,98 % Příklad 1f Příprava alf a-/2-aminoethyl/-omega-methoxypGly/oxy-1,2-ethan-diyl/ SfiU. 28,3
Postupem popsaným v příkladu 1C se převede? alfa-/2-azi-doethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 28,3 naalfa-/2-aminoethyl/-omega-aethoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 28,3.
Aialýza pro C^NO/CH^O/gg 3 vypočteno 54,47 % C, 9,17 % E, 0,14 % » nalezeno 54,44 % C, 9,19 % H, 0,15 % M. Příklad 2
Příprava rekombinantního interferonu-alfa /IFN-alfa/ konju-govaného k PEG pomocí činidlá alfa-/2-///cyklohexylkarbonimi-doyl/amino/-ethyl/-Gmega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 ALf’a-/2-///CyklohexylkarbonimidGyl/ aod.no/ethyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 připravený podle pří-kladu 1 se přidá k 1 mg homogenního IFN-alfa ve 200 yul puf-....... ru /0,1 KE boritan sodný, pH 9,0/ v molárním poměru 10 ml Či-nidla na jeden mol IFIř-alfa. Roztoky se pečlivě proraísí a pe-gylační reakce se nechá proběhnout při teplotě místnosti po6ϋ minut,
Množství derivatizace /nebo pegylace/ IFN-alfa bylo hod-noceno SES-polyakrylamidovou gelovou elektroforé2ou /SDS-PAjE//tabulka 1/· Proteiny byly vizualizovány vybarvením pomocí Coo-masie Blue. Aaalýza produktů po 60 min reakce ukazuje nové -30- druhy proteinů o vyšší molekulové hmotnosti, odpovídajícíIFN-alfa konjugovanému s PEG. IFN-alfa má zjevnou moleku-lovou hmotnost 15 kD podle? SDS-PAGE. Nemodifikovaný IFN-alfa,jehož zjevná molekulová hmotnost zůstává nezměněna je protonekonjugovaný s PEG. PEG-modifikovaný IFN-alfa produkt mělzjevnou molekulovou hmotnost 28 kD.
Tabulka 1
Modifikace IFN-alfa činidlem popsaným v příkladu 1.
Zjevná molekulová hmotnost % celkového proteinu IFN protein AD/ z reakce 15 /nemodifikovaný/ 80 28. 20 Příklad 3
Příprava rekombinantního interleukinu-2 /rIL-2/ konjugova-ného; k PEG pomocí činidla alfa-/2-///cyklohexylkarbonimi-doyl/amino/ethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRtT 111,7 ALf a-/2-///cyklohexylkarbonimldoyl// amino/ethyl/-omega-methoxypolý/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 připravený podlepříkladu 1 se přidá ke 2 mg rIL-2 ve 200 /ul pufru /0,1 Mboritan sodný, pH 9,0 /v tnolárním poměru 10 mol činidla najeden mol iIL-2. Roztoky se pečlivě smísí a pegylační reakce-:se nechá probíhat 60 minut při teplotě míústnosti.
Množství derivatizace /nebo pegylace/ proteinu se hod-notí pomocí SDS-PAGE /tabulka II/. Proteiny se vizualizujívybarvením pomocí Coomassie Blue. Analýza produktu z 60 minu-tové reakce ukazuje nové druhy proteinů o vyšší molekulové -31- hmotnosti, odpovídající PEG-konjugováným rILr2. rIL-2 mázjevnou molekulovou hmotnost 15 kD podle SDS-PěGE. Nemodi-fikovaný rIL-2 je protein oddělený z reakční směsi, jehožmolekulová hmotnost zůstává nezměněná a není tedy konjugováns PEG. Hlavní PED-modifikovaný řIL-2 produkt má zjevnou mole-kulovou hmotnost 28 kD.
tabulka II
Modifikace rIL-2 Činidlem popsaným v příkladu l
Zdánlivá molekulová hmotnostrIL-2 proteinu AD/ % celkového proteinu z reakce 15 /nemodifikovaný/ 20 28 50 33 20 43 10
Pegylovaný rIL-2 se Čistí, z reakční směsi, jak je popsánoKatreem a spol., /Proc.Nat.-Acad.Sci., USA, 84:1483-1491/ 1987//ža použití hydrofóbní výměnné chromatografie /Sio-fíad, Bio-gelphenyl 5-PW/· Pro oddělení PEG-modiflkávaného a nemodifiko-vaného rIL-2 byl použit lineární gradient klesajícího obsahusoli od 1,53 do 0,0 M /NH^/gSQ^ v 50 míí fosforečnanu sodnémpH 7,0 po 30 minut» Podíly frakcí byly hodnoceny SDS-PA1E aspojené frakce byly hodnoceny na jejich specifickou aktivituve zkoušce proliferace CTLL buněk metodou popsanou Gillisema spol. /J.Immunology 120:2027-2032, 1978//. Koncentrace pro-teinu byly stanoveny spektrofotometricky při 280 nm za použitíexktinkčního koeficientu 0,668 pro rIL-2. Specifická aktivitarIL-2 izolovaných proteinů je vyjádřena jako jednotky/mgproteinu a výsledky jsou shrnuty v tabulce III* Je zřejmé, žespecifická aktivita rIL-2 není konjugací s PEG výrazně změněna. -32-
Tabulka III
Bioaktivita rIL-2 konjugovaného k PEG s Činidlem popsanýmv příkladu 1 ^dánlivá molekulová hmotnost ’ specifická aktivita rIL-2 proteinu AD/ 15 /nemodifikovaný IL-2/28 /jednotky/mg/ 2,0 2 TO7 2,4 x 107 Příklad 4 Příprava rekombinantního interleukinu 1-alfa /rIL-1 alfa/konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-/2-///cyklohexylkarbon-imidoyl/amino/ethyl/omega- methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SSV11:1,7 Činidlo popsané v příkladu 1 se přidá k 2,0 mg: homogenníhorIL-1 alfa v 1,0 ml boritanu sodného, pH 9,0 v molárním poměru 20 ml činidla na jeden mol rllr-1 alfa, fioztok se peč>livě prómísí a pegylační reakce se nechá probíhat při tep-lotě místnosti 60 minut.
Množství derivatizovaného /nebo pegylovaného/ proteinubylo hodnoceno SDS-PáGE /tabulka IV/, ^roteiny byly vizuali*zovány vybarvením pomocí Coomassie Blue. -ónalýza produktůpo 60 minutové reakci ukazuje na nové druhy proteinů o vyššímolekulové hmotnosti, odpovídající PEG konjugovaného rIL-1alfa proteinu. rIL-1 alfa má zdánlivou molekulovou hmotnost17 kD podle SDS-P-áfiE. Nemodifikovaný rIL-1 alfa je proteinz reakční směsi, jehož zdánlivá molekulová hmotnost zůstávánezměněna a není tedy konjugováns PEG- PEG-modifikovaný rIL-1alfa produkt má zdánlivou molekulovou hmotnost 30 kD. -33-
Tabulka IV
Modifikace rIL-1. alfa činidlem popsaným v příkladu 1
Zdánlivá molekulové hmotnost % celkového proteinu rIL-1 alfa proteinu AD/ 2 reakce 1 7 /nemodifikováno/ 85 30 15 Příklad 5 Příprava alf á-//1,2-dihýdro-2-oxo-í-pyridinyl/-thiokarbonyl/-omega-methoxypoly/bxy-t,2-ethandiyl/ SRU 111,7 Z roztoku 1 g /0,2 mmol/ MPEG /methoxypolyethylenglykol/molekulové hmotnosti. 5000 v 15 ml suchého toluenu se oddesti-luje 5 ml roztpouštědla. Výsledný roztok se ochladí a přidáse 46,5 mg /0,2 mmol/ 1,1-karbonothioylbis-2/1H/-pyridinonu*Směs se pak refluxuje pod atmosférou argonu 4 hodiny« Rozpouštědlo se pak odstraní za vakua a zbytek se rozpustí v 5 mlsuchého glymu a nevhá se stát přes noc. Výsledná sraženinase pak odfiltruje a promyje se 2x5 ml suchého glymu a 5 mldiethyletheru. Produkt se pak suší ve vakuové sušárně podmírným proudem dusíku, získá se 0,96 g alfa-//l,2-dihydro-2-oxo-1 -pyridinyl/thiokarbonyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ěthandiyl/ SRU 111,7. ’ ~ Žhalýza pro Cgííj ^ΝΟ^/ΟΞ^Ι^Ο/^ ,μ
vypočteno 54,37 # C, 8,99 # », 0,27 % N, 0,62 % S nalezeno 54,03 % C, 8,98 % S, 0,18 % M, 0,59 % S. Příklad 5a Příprava alfa-//1,2-dihydro-2-oxo-1-pyridinyl/thiokarbonyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225
Postupem popsaným v příkladu 5 se MPEG /methoxypoly-ethylenglykol/ molekulové hmotnosti 10000 převede na alfa- -34- //1,2-dihydro-2-oxo-1 -pyridinyl/ thiokarbonyl/-omega-methoxy-poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225.
Aialýza pro IfO 3S/CE2CH2O/225:
vypočteno 54,54 % C, 9,08 % H, 0,14 % K, 0,32 % S nalezeno 54,38 % C, 9,16 % H, 0,15 % », 0,31 % 3* Příklad 6 Příprava antagoňisty receptoru interleukinu 1 /IL-1ra/konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa//l,2-dihydro-2-oxo-1-pyridinyl/thiokarbonyl/omega-methoxy-poly-/oxy-1,2-ethan-diyl/ SRU1Í1, 7 JJlf a-//1,2- dihydro-2-oxo-1 -pyridinyl/thi ok arbonyl/-omeg a-methoxy-polý/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 připravený podle. příkladu 5 se přidá k 10 mg homogenního IL-lra v 1,0 ml pufru/0,1M boritan sodný, pE 9,0/ v molárním poměru 5 mol činidlana mol IL-1ra. Roztok se pečlivě promíeí a pegylační reakcese nechá probíhat 60 minutipři teplotě místnosti*.
Množství derivatizace /nebo pegylace/ proteinu se hodno->tf pomocí SDS-P-áGE /tabulka V/· Proteiny se vizualizují vybar-vením Coomassie HLué. Jnalýza produktů z 60 minutové reakceukazuje na nové druhy proteinů o vyááí molekulové hmotnosti,odpovídající PEG-konjugovanému IL-lra proteinu* IL-1ra má zdánlivou molekulovou hmotnost 19 kD podle SDS-PA3E. Nemodifiko-vaný IL-lra geprotein z reakční směsi, jehož zdánlivá mo-lekulová hmotnost zůstává nezměněna a je tedy nekonjugováns PEG.
Hlavní PEG-modifikované IL-lra proteiny mají zdánlivoumolekulovou hmotnost 26 a 33 kD*' -35-
T.abulka V kodifikace Ih-ira činidlem popsaným v příkladu 5 ^dánlivá molekulová hmotnostIL-lrs proteinu /kh/ 1 9 /nemodifikovaný/2633>33 % celkového proteinuz reakce 36 33 21 10
Pegylovaný i£-tra se čistí z reakční směsi za použití,hydrofobní výměnné chromatografie /Bio-Had, HRLC MP7 HIC/, Prooddělení pegylovaného li»-1ra a nemodifikovaného IL-Ira bylpoužit lineární klesající gradienz od 0,43 do 0,0 M síranuamonného v 50 mS£ fosforečnanu sodném pH 7,0 během 20 minut.
Podíly frakcí byly hodnoceny pomocí SDS-PJ5GE a spojené frakcebyly studovány pomocí IL-T radioreceptorové kompetičnízkoušky navázání/Kilián a spol., J.Immunol., 136, 4509-4514/1986//. Stručně, IL-1ra a PEG-IL-1ra se inkubují při různýchkoncentracích s EL-4 membránami při 37 °C po 30 minut.alfa se pak přidá a v inkubaci se pokračuje 30 minut. Zkouškase ukončí vakuovou filtrací a oddělením buněk s navázaným/ ^I/IL-1 na filtračních plotnách. Koncentrace IL-1ra neboPEG-IL~1ra, která inhibuje vazbu /^^/IL-1 z 50 % /IC^q/ sestanoví graficky. Výsledky jsou uvedeny v tabulce VI· ΙΟ^θ IL-Irav tomto pokuse je 1-2,0 ng/ml. Pegylovaná IL-Ira směs siudržuje svoji schopnost navázání IL-1 receptoru na EL-4membrány s faktorem 2 až 3krát vitíc^xv^nemodifikovar^/iuo/ IL-1ra. -36-
Tabulka VI 125
Inhibice / 7I/IL-1 vazby pomocí IL-1ra konjugovaným s činid- lem: popsaným v příkladu 5
Zdánlivá molekulová hmotnost · IL-,ra proteinu AD/ ΙΟ^θ /ng/ml/ 19K /nemodifikovaný/ 2,0 26K, 33K/směs/ 5,0
Earmakodynamické vlastnosti iD-ira proteinu se hodnotíin vivo schopnosti IL-1ra inhibovat rlL-lalfa indukci inter-leukinu-6. Sérum myší ošetřených: rII-1 alfa obsahuje vyáěkéhladiny IL-6 /Mclntosh a spol., Immunol. 143: 162-167, /1989//·^odání nemodifikovaného IL-lra spolu s IL-1aIfa /0 h dobapodání/ inhibujé indukci IL-6· Tento systém testu byl použitpro porovnání farmakodynamických vlastností nemodifikovanéhoa PEG IL-íra. Skupiny tří samic C5731/6 myší byly injekčněsubkutánně ošetřeny 200 /U&amp; nemodifikovaného IL-1ra neboPEC—IL-1ra 48 h, 24 h. nebo 6 h před nebo současná /0 h/ s0,2 /Ug rlL-íalfa. O tři hodiny později bylo odebráno sérum·Hladiny IL-6· /jednotky/ byly stanoveny použitím modifikaceIL-6 zkouš^r jak byla popsána již dříve /Van Snick a spol.,Proc.NatloJkadoSci. USA 83:9679-9683, /1986//. V IL-6 zkouš-ce byly buňky hybridomu B9 ošetřeny dvojnásobnou seriá ředěnítestovaného séra v 96-jamkových mikrotitračních plotnách. Po3 dnech inkubace při 37 °C ve vlhké atmosféře, obsahující 5 % CO2 a 95 % vzduchu, byly jamky zpracovány s 0,5 ^uCi tritio-vaného thymidinu a inkubovány dalších 18 hodin. Buňky pakbyly shromážděny na filtrech ze skleněných vláken á scinti-lačním čítačem byla hodnocena hladina inkorporace tritiované-ho thymidinu. IL-6 aktivita je vyjádřena jako U/ml. IL-6jednotky jsou definovány jako převrácená hodnota ředění séra,která působí polovinu maximální inkorporace tritiovaného thymi- -37- dinu ve srovnání s referenčním standardem. *armakodynamické údaje jsou shrnuty v tabulce D1. My-ši ošetřené pouze IL-1 vykazují 28852 U/ml IL-6. Nemodifi-kovaný i modifikovaný IL-Ira inhibuje H-6 indukci v 0 h. Nic-méhě pegylovaný IL-1ra demonstruje: prolongovaný lL-6-inhi-biční účinek ve srovnání s nemodifikovaným IL-1ra 8 a 24 hodinpo podání.
Tabulka Dí
Farmakodynamický profil IL-Ira konjugovaného s činidlempopsaným v příkladu 5
Doba /h/ před podáním IL-6 /jednotky/ml/ IL-1 19 kD 26 kD 0 772 705 6 8361 1587 24 22525 9844 48 1:8485 . 21119 72 13220 21470
Příklad 6A Příprava antagonisty receptoru interleukinu 1 /IL-1ra/konjugovaného k PEG. pomocí "činidla alfa-//1,2-dihydro-2-oxo-l-pyridinyl/thiokarbonyl/-omega-methoxypoly-/pxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 IL-lřa se konjuguje a čistí podle postupu uvedeného vpříkladu 6 za použití činidla popsaného v příkladu 5a.
Hlavni PEG-modifikované IL-lra proteiny mají zdánlivoumolekulovou hmotnost 33 kD a 48 kD. 33^D a 48 ŽD protein činí46 a 27 % z celkových proteinů v reakční směsi.
Schopnost těchto proteinů inhibovat IL-1 vazbu jak je? -38- popsáno v příkladu 6, je shrnuta v tabulce VII. 33^D PEG modi-fikovaný protein.si udržuje schopnost inhibovat IL-1 vazbušestkrát vyšší ve srovnání s IR1-ra a intenzivnější modifika-ce proteinu PEG jak byla pozorována se 48 kD proteinem, vedev podstatě ke ztrátě jeho vazby k IL-1 receptoru.
Tabulka VII125
Inhibice / ^1/ IL-1 vazby k IL-Ira proteinům konjugováným,s. činidlem popsaným v příkladu 5a ·
Zdánlivá molekulová hmotnost.IL-Ira proteinu AD/ 19 /nemodifikovaný 33 48 IG5G /ng/ml/ 1,6 9,0 50,0
Pro stanovení' farmakokinetického profilu druhů ?EG-IL-1rabyla C57BP/6 myším podáno 100 yUg modifikovaného nebo pegýlova-ného druhu I"-1ra. Vzorky séra byly odebrány po 1,2,3,4 a 6hodináchi myším, které dostaly nemodifikovaný IL-Ira a po2,4,8,10 a 24 hodinách od myší, které dostaly PEG*IL-Ira.
Hladiny v séru byly stanoveny zkouškou, vazby k EL-4 membránámpopsanou v příkladu 6. Hodnoty jsou shrnuty v tabulce D2. PEG-IL-1 ra byl detegovatelný vejvzorcích séra při vyšších kon-centracích a po delší dobu ve srovnání s IL-Ira, což demonstrujedelší časové působení v séru. -39-
Tabulka D2
Farmakokinetický profil IL-lra pegylatovaného jako v přikla-du 6a koncentrace lL-1ra v séru čas /h/ po podání
19 kD 33 kD 1 400 2 130 40 2500 4 15 800 6: 16 8 300 10 250 24
Příklad T Příprava rIL-1 alfa konjugováného k PEG pomocí činidla,alfa-/ /1,2-dihydro-2-oxo-1 -pyridinyl/-thiokarbonyl/omega·methoxy-póly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7
Rekombinantní IL-1 alf a byl pegylován s činidlempopsaným v příkladu 5 metodou popsanou v příkladu 4. PomocíSDS-PAiE byly identifikovány tři hlavní druhy molekulovýchhmotností s molekulovými zdánlivými hmotnostmi odpovídajícími17 /nemodifikovaný/, 26 a 33 kD. Poslední dva pegylovanéproteiny činí 25 a 55 % celkového proteinu.
Pegylovaný rIL-1 alfa byl čištěn z. reakční směsi po 60 minutách za použití hydrofobní výměnné chromatografie /Bio- ^ad, HRLC MP7 HIC/. Pro separaci pegylovaného rIL-1 alfa a ne- modifikovaného rIL-1 alfa byl použit lineární gradient klesa-
jící koncentrace soli od 0,43 do 0,0 íí síranu amonného v 5.0 mM -40- fosforečnanu sodném pH. 7,0 během 20 minut. Podíly frakcí sehodnotí pomocí SDS-PAJE a spojené frakce se zkoušejí na spe-cifickou aktivitu ve zkoušce proliferace Dl0 buněk metodou,kterou popsal Kaye a spol. /J.Exp.Med. 158:836-854 /1983//«,Koncentrace proteinů byly stanoveny spektrofotomětricky při 280 nM za použití exktinkčního koeficientu 1,0 pro rIL-1 alfa. 8
Specifická aktivita rIL-1 alfa je přibližně 1,0 x 10 jed-notek/mg. Výsledky specifické aktivity jsou shrnuty v tabul-ce VIX1. 26 kD pegylovaný 1-0-1 alfa konjugát si udržuje bio-aktivitu 2-3 vzhledem k. IM alfa. Další modifikace * vedoucí k 33 kD proteinu vedou k podstatné ztrátě aktivity. specifická aktivita/jednotky/mg/ 4,6 x 1071,9 x- 1074,5 x 106
tabulka VIII
Zdánlivá molekulová hmotnostrIL-1 alfa proteinu /kD/ 17 /nemodifikovaný/ 26 ' 33 Přikladl 8 Příprava IFN-alf a konjugovaného k. PEG pomocí alfa-//l,2-dihydro-2-óxo-1 -pyridinyl/ thiokarbonyl/-omega-methóxypóly-/0x0-1,2-ethandiyl/ SRU 11,7 ALfa-//1,2-dihydro-2-oxo-1-pyridinyl/thiokarbonyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 připravený podlepříkladu 5 se přidá k 1 mg čištěného IFN-alfa ve 100 /ulpufru /0, ÍM boritan sodný, pH 9,0 / v molárním poměru 8 molPEG činidla k jednomu mol IFN-alfa. Roztoky se pečlivě pro-mísí a pegylační reakce se nechá probíhat 60 minut při teplo-tě místnosti.
Druhy převládající molekulové hmotnosti z reakční směsise identifikují pomocí SDS-P75GE jako druhy, mající zdánlivou -41- molekulovou hmotnost 15 /nemodifikovaný/ a 28 kD. 28 kD pe-gylovaný protein činí 40 % celkového proteinu, PegylovanýIFN-alfa se čistí z 60 minutové reakční směsi a charakteri-zuje použitím hydrofobní výměnné ehromatografie /3io-kad, Biogel-phenly-S-PW/. *ro rozdělení pegylovaného IFN-alfa a nemodi-fikovaného IFN-alfa byl použit lineární gradient se stoupajíklesající koncentrací síranu amonného z 0,42 M na 0,0 U ve50 αΰΰ fosforečnanu sodném pH 7,0 po 20 minut. Podíly frakcíbyly hodnoceny SDS-PJGE a spojené frakce byly zkoušeny naatvivirovou účinnost /specifická aktivita/ zkouškou.MDĚK podlemetody popsané Famillettim a spol., /Hethóds Enzym. 78, 387-394/1987//.
Koncentrace proteinů byly stanoveny spektrofotometricky-při 280 nM za použití extinkčního.. koeficientu J ,0 pro 1 mg/ml.IFN.alfa pufrováného roztoku. Specifická aktivita izolova-ných proteinů je vyjádřena jako jednotky na mg proteinu a výs-ledky jsou shrnuty v tabulce IX.. Výsledky ukazují, že specifická aktivita 28 kD pegylo-vaného IFN-alfa není vzhledem k IFN-alfa výrazně změněna.
Tabulka IX
Bio aktivita IFB-alfa konjugovaného s činidlem z příkladu 5 ^dánlivá molekulová hmotnost specifická aktivita IFN-alfa proteinu AD/ /jednotky/mg/ 15 /nemodifikovaný/ 1,1 x 10θ 28 1,4 x 109 -42-
Příklaď. 3A Příprava IFN-alfa konjugovaného k PSG pomocí Činidla alfa-//1,2-dihydro- 2-oxo-1 -pyridinyl/-thiok arbonyl/omega-methoxy-póly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 IEN-alfa byl pegylován jako v příkladu 8 s činidlempopsaným v příkladu 5a. "ruhy převládající molekulové hmot-nosti z 60 minutové reakční směsi byly identifikovány pomocíSDS-PJGE, jako odpovídající zdánlivé molekulové hmotnosti. 15/nemodifikovaný/, 35 a 43 kD. Posledně uvedené dva proteinyčiní 35 a 33 procent velkových proteinů v reakční směsi·
Specifické aktivita stanovené postupy popsanými v pří-kladu 8 pegylováných druhů IFN-alfa jsou shrnuty v tabulce X/Výsledky ukazují, že 35 kD pegylovaný IFN-alfa produkt má bio-logickou aktivitu 2-2yócCJb,'·. ve srovnání s IFN-alfa, 43 kDkonjugát v podstatě aktivitu ztratil.
^'abulka X
Bioaktivita IFN-alfa konjugátu s činidlem podle příkladu 5a .....-·
Zdánlivá molekulová hmotnost specifická aktivita IFN-alfa proteinu /kD/ /jednotky/mg/ 15 /nemodifikovaný/ 3,3 x 10θ 35 1,2 x IQ8 γ 43 1,5x10’ Příklad 8B. Příprava řII-2 konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-//1,2-dihydro-2-oxo-1-pyridinyl·/-thiokarbonyl/omega-methoxypoly/oxy- 1,2-ethandiyl/ SRB 111,7 -43- rIL-2 se pegyluje činidlem popsaným v příkladu 5 a čistípoužitím postupu popsaného v příkladu 3· Převládající molekulové hmotností druhů z reakční směsipo 60 minutách byly identifikovány SDS-PA1E jako majícízdánlivou molekulovou hmotnost 15 /nemodifikovaný/ a 25 kD. 25kD pegylovaný protein činií 60 % všeho proteinu v reakčnísměsi.
Specifická aktivita rID-2 izolovaných proteinů byláměřena jak je popsáno v příkladu 3 a jo vyjádřena jako;jednotky/mg proteinu a výsledky jsou uvedeny v tabulce XI.
Jak je z tabulky XI,zřejmé, biologická aktivita IL-2 ne-byla po konjugaci s PEG .změněna.
Tabulka XI
Bioaktivi.ta,rIL-2 konjugovaného k PEG činidlem popsaným vpříkladu;5
Zdánlivá molekulová hmotnost specifická aktivita řIL-2 proteinu /kD/ /jednotky/mg/ 7 1 5 /nemodifikovaný/ 2,0 x 10 25 2,0 x 107
Příklad 8C Příprava rIL-2 konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-//1,2-dihydro-2-oxo-1-pyridinyl/-thiokarbonyl/omega-methoxypoly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU. 225 -44- ríL-2 byl pegylován za použití postupu popsaného v pří-kladu 3 s činidlem popsaným v příkladu 5a. Převládající druhy molekulové hmotnosti z reakční směsipo 60 minutách byly identifikovány pomocí SDS-P4GE jako ma-jící zdánlivou molekulovou hmotnost 15 kB /nemodifikovaný/, 33 kD a 43 kJD. 33 a 43 kD pegylovené proteiny činí 60 a 20procent všech proteinů v reakční směsi. Příklad 9 Příprava IFN-alfa konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-//1,2-dihydro-2-oxo-1-pyridinyl/-thiokarbony l/-omega-methoxy-poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRV 111,7 -Alternativní metoda pro konjugaci IFN-alfa k PEG jenásledující; IFN-alfa /5 mg/l/ se dialyzuje proti pufru, obdahujícímu5 mM acetátu sodného, pH 5,0, 120 mM NaCl. K dialyzovanémuroztoku proteinu se přidá pevný thiokyanát draselný do koneč-né koncentrace 0,5 M soli a pH se upraví přídavkem jednédesetiny objemu. 1 M tricim-hydroxidu1 sodného, pH.11,9 , získáse roztok o konečné hodnotě pH: 10,0. Ke vzorku se přidáalf a-//l ,2-dihydro-2-oxo-1-pyridínyl/thiokarbonyl/-omega-methoxýpoly/oxy-1,2-ethandiyl/ v molářním poměru 3 mol činidlak. 1 mol proteinu. Modifikace reakce byla taková, že se přiteplotě místnosti pracovalo 30 minut a byla reakce ukončenapřídavkem 1 M glycinu, pH 6,3 na konečnou koncentraci 20 mM.PEG-modifikovaný protein byl z roztoku vysrážen přídavkem puf-ru, obsahujícího 3,5 M síranu amonného, 50 mM. fosforečnanusodného, pH 7,0 na konečnou koncentraci 1,1 M síranu amonnéhoa sraženina se oddělí odstředěním /10000 x g po 12 min/. Ponamočení pelety do pufru, obsahujícího 1,1 M síranu amonného,kterým se opláchne /pufr obsahuje 1,1 Msíranu sodného, 50 mMfosforečnanu sodného, pH 7,0/ se peleta znovu rozpustí v pufru,obsahujícím 25 mM octanu amonného, pK 5,0. PEG-modifikovaný -45- protein: se čistí a charakterizuje jak je popsáno v příkladu 2.Byl získán jedem druh pegylovaného: IFN se zdánlivou moleku-lovou hmotností 28 kD. Aitivirová aktivita /specifická aktivita/modifikovaného proteinu byla stanovena postupem popsaným vpříkladu 8. Specifická aktivita výchozího IFN-alf a byla 2,6x10^U/mg a specifická aktivita iFN-alfa konjugovaného- k PEG byla
O 1,0x10 U/mg což dokazuje, že PEG konjugovaný IFN-alfa máve srovnání s IFN-alfa T/Ae/^zicPíztítit/biologickou aktivitu. Příklad 10 Příprava IFN-alfa konjugovaného k PEG pomocí řinidla alfar.//1,2-dihydro-2-oxo-1-?pyridinyl/-thiokarbonyl/“Omega-methoxypoly/oxy- 1,2-ethandiyl/ SRU 225 IFN-alfa byl konjugován k PEG postupem popsaným v pří-kladu 9* Proteiny byly čištěny a charakterizovány jak je po-psáno v příkladech 2 a 9. Výchozí IFN-alfa měl specifickouaktivitu 2,6 χ 10® U/mg při použití IFN-alfa konjugovanéhok: PEG-bylá zdánlivá molekulová hmotnost 31 kD a·· specifická .
Q aktivita 1,0 χ 10° U/mg jak je popsáno v příkladu 8. Bioak-tivita konjugovaného IFN-alfa byla ¢/53/-7’«<?^<a/vporovnánís IFN-alf a* Příklad 11 Příprava alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/ami-no/ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 2 roztoku 1 g /0,2 mmol/ alfa-/2-aminoethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 /připravenéhov příkladu 1C/ ve 40 ml suchého CH^Clg se oddestiluje 15 mlrozpouštědla. £ výslednému roztoku se při 0 °C pak přidá 65mg /0,3 mmol/ di-2-pyridylkarbonátu a směs se míchá další 4hodiny. Rozpouštědlo se pak odstraní za sníženého tlaku azbytek se trituruje s diethyletherem. Sraženina se pak odfil-truje a promyje 50 ml etheru a dále 50 ml hexanu. Produktse pak suší ve vakuové sušárně pod slabým prodem dusíku, -46- získá se tak 1 g alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxyAar-bonyl/amino/ethoxy/póly/oxy-1 ,2-ethandiyl/ SRU 111,7 ve forměbílého prášku.
Aialýza pro 11 ? vypočteno 54,56 % C, 9,04 % H, 0,55 % Ninalezeno 54,26 % C, 9,00 % B, 0,53 % w?. ^říklad 11 a . Příprava alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/ami-no/ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225
Postupem popsaným v příkladu 1Í se alfa-/2-aminoethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 /připravený vpříkladu 1c/ se převede na alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyl- % . oxy/karbonyl/amino/ethoxy/póly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225«" , , ·* · ,·. w -Aialýz a pro; 21¾^¾0¾°7^: " ' ’ vypočteno 54,54'% C, 9,10 % H, 0,28 £ li nalezeno 54,49 % C, 9,27 % B, 0,31 % N, í •-xfc. Příklad 11b .. Příprava alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxyy'karbonyl/-amino/ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 28,3
Postupem popsaným v příkladu 11 se alfa-/2-aminoethyl/-pmega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 28,3 /připravený vpříkladu 1f/ převede na alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridiny1-..oxy/karbonyl/-amino/ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 28,3. .Analýza pro vypočteno 54,6l % C, 8,75 % í£, 1,94 % Knalezeno 54,67 % C, 8,96 % B, 1,63 % Tf. Příklad 12 Příprava lL-1ra konjugo váného k PEG pomocí činidla alfa-methyl- omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/amino/ethoxy/ poly/oxy- 1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 alfa-Íethyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/amino/- ethoxy/póly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 se přidá ke 25 mg -47- čištěného IL-lra ve 2,5 ml pufru /0,1 M boritan sodný, pH 9,0/v molárním poměru 1 mol činidla na jeden mol IL-1ra. Roztokyse pečlivě promísí a pegylační reakce se nechá probíhat přiteplotě místnosti po 60 minut. PEG modifikovaný ILra se pakčistí postupem popsaným v příkladu 6. Převládající pegylované produkty z 60minutové reakcemají zdánlivou molekulovou hmotnost 28 kD a 3θ W a činípřibližně 42 a 29 % celkového proteinu z reakční směsi·
Schopnost čištěnýbh IL-1ra proteinů z reakční směsi inhi-bovat vazbu IL-1 byla stanovena jak je popsáno v příkladu 6a je shrnuta w tabulce XII·.Vazné.vlastnosti 28 kD produktunebyly významně změněny a vaznost 38 kD proteinu má aktivitu5násobnou proti IL-1ra.
Tabulka XII
Inhibice./^1/-IL-1 vazby* IL-1ra proteinem pegylovaným s Či-nidlem. pops aným v příkladu-1
Zdánlivá molekulová hmotnostIL-lra proteinu AD/ 19 /nemodifikovaný/ 28 38 •ťarmakodynamický profil PEG-H-lra byl stanoven jak jepopsáno v příkladu 6. Odaje jsou shrnuty v tabulce D3· Samot-ný IL-1 indukuje 27283 u/ml IL-6. íJemidifikovaný IL-lra inhi-buje méně než 50 % IL-1 odezvy během 6 hodin po podání. NaopakPEG IL-1ra i když je méně aktivní v kratší době, je mnohemvíce aktivní 24 a 48 hodin po injekci. Proto PEG IL-1ra vykazuje
-48- prolongovzaný farmakodynamický profil. labulka D3 * armakodynamický profilným v příkladu 11 IL-1ra konjugovaného s činidlem Doba /h/ před. IL-6 jednotky/ml podáním IL-i . 19 kD 26 kD 0 4789 23806 6. . 15324 10833 24 24841 5727 48 16348 9364 72 12067 12054 Příklad 12A - -«·- Příprava’IL-1 ra konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/amino/e.thoxy/poly/oxy- - 1,2-ethandiýl/ SRU 225 - alf a-J4ethyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/amino/- «· etho^y/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 /připravený předem postu-pem popsaným v příkladu 11a/ se přidá ke 25 mg čištěného IL-1rave 2,5 ml pufru /0,151 boritan sodný, pH 9,0 / v molárním po-měru 4 moh. Činidla na jeden mol IL-1ra. Roztoky se pečlivě pro-míchají a pegylační reakce se nechá probíhat při teplotě míst-nosti 60 minut. PEG modifikovaný IL-1ra se pak čistí podlepostupu popsaného v příkladu 6. Převládající pegylované produkty z 60minutové reakcemají zdánlivou molekulovou hmotnost 33 kD a 48 kD a Činíasi 76 á 15 % celkového proteinu v reakční směsi· SchopnostiČištěných’Ii«-1ra proteinů z reakční směsi inhibovat vazbu IL-1jsou shrnuty v tabulce XIII* 33 kD PEG modifikovaný proteinmá schopnost inhibovat vazbu IL-1 8krát r*t*/£/fnež IL-lra. 48 kD produkt v podstatě ztratil vazebnou kapacitu· -49-
Tabulka XIII1
Inhibice / ?I/IL-1 vazby IL-lra proteiny pegylovanými s činidlem popsaným v příkladu 11a ^dánlivá molekulová hmotnost IL-lra proteinu AD/ IC^Q/ng/ml/ 19 /nemodifikovaný/ 0,8 33 6,0 48 18,0
Farmakokinetický profil PEG-IL-lra byl stanoven jak jepopsáno v příkladu 6A. ^daje jsoushrnuty v tabulce D4*PEG-IL-1ra byl detegovatelný ve vzorcích séra při vyšších:koncentracích a po delší dobu ve srovnání s nemodifikovanýmXL-1ra. 'labulka D4.
Farmakokinetický'profil I-^-Ira konjugovaného s činidlem popsa-ným v příkladu 1 1 a
Doba /B/ po podání hladina v 19 kD séru IL-lra /ng/ml33 kD 1 220 2 33 700 3 Π 4 5,3 500 6 1,5 8 150 10 83 24 5 -50- Příklad 13 Příprava rIL-2 konjugovaného k PEG pomocí Činidla alfa-methyl—omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/amino/ethoxy/poly/oxy- 1.2- ethandiyl/ SRU 111,7 rIL-2 byl pegylován s alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyl-oxy/karbonyl/amino/ethoxy/poly/oxý-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7,:postupem podle příkladů 3 a 8b. Specifická aktivita IE-2proteinu byla stanovena jak je popsáno v příkladu 8. Spe- 7 cifická aktivita 15 kD nemodifikovaného rIL-2 byla 2 x 10jednotek/mg a 29 kD pegylovaného IL-2 byla 2,4 x 10? jednotek/mg IL-2, což dokládá, že v podstatě nedošlo k podstatné ztrátěbiologické aktivity v důsledku pegylace· Příklad 14 Příprava PEG-modifikováného rIL-1 alfa konjugovaného k PEGpomocí činidla alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbo-nyl/amino/ethoxy/poly/oxy-1,2»ethandiyl/, SRU 111,7 rlL-í alfa se pegyluje s činidlem popsaným v příkladnou, f. alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/ amino/ethoxy/-poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7, podle postupu v příkladech4 a 7* Dva pegylované rIL-1 alfa proteiny se zdánlivou mole-kulovou hmotností 28 kD a 38 kD byly Čištěny a Činí 50 a 25procent všech proteinů v reakční směsi po 60 minutách. Příklad 15 Příprava IEN-alfa konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/amino/ethoxy/póly/ oxy- 1.2- ethandiyl/, SRU 111,7' IFN-alfa byl pegylován s činidlem popsaným v příkladu11, kterým je alf a-methyl-omega-/2-///2-pyridinylaxy/karbonyl/-amino/ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7, postupem podlepříkladu 8· Čtyřicet pročet proteinu bylo po 60 minutách de-rivatizováno a produkt měl zdánlivou molekulovou hmotnost26 kD. •51=· Příklad 16 Příprava IFN-alfa konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/ amino/ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7 ALternativní metoda pegylace IFN-alfa.
Použitím postupu ilustrovaného v příkladu 9 byl IFN-alfakonjugován k PEG pomocí alfa-methyl-omega-/2-///2-pyridinyl-oxyAarbonyl/amino/ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7.Specifická aktivita IFN-alfa byla stanovena jak je popsáno vpříkladu 8. 8pecificlcá aktivita výchozího IPN-alfa byla 1,7z 10 U/mg a specifická aktivita IFN-alfa konjugovaného k PEGpomocí alfs-methyl-omega-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/amin.o/-ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ byla 0,8 χ i;08 U/mg a je 2-Jkráttm&amp;ís ve srovnání s IPN-alfa Příklad 1? Příprava'IFN-alfa konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-methyI-oméga-/2-///2-pyridinyloxy/karbony l/amino/ethoxy/poly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SSIT225.
Použitím postupu ilustrovaného v příkladu 9 byl IFN-alfa pegylován pomocí činidla popsaného v příkladu 11a. Specifická aktivita byla stanovena metodou poosanou v Dříkladu 3 a čini-8 la u IFN-alfa konjugovaného k PEG υ,4 x 10 U/mg;, což dokládánepodstatnou ztrátu biologické aktivity. Příklad 18 Příprava alfa-//2-pyridinyloxy/karbonyl/omega-methoxypoly /oxy- l,2-ethandiyl/ SRU 111,7 Z roztoku 1 g MPEG molekulové hmotnosti 5000 rozpuš-těného ve 30 ml suchého CHgClg se oddestiluje 10 ml rozpouštěd-la. Roztok se ochladí na teplotu místnosti, a přidá se 132 mg/0,6' mM/ di-2-pyridylkarbonátu a 4 mg BM/P. Výsledný roztok sepak míchá 14 hodin a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Zby-tek se trituruje s diethyletherem a výsledná sraženina seodfiltruje. Produkt se pak rozpustí v 7 ml suchého glymu, ohře- -52- pro rozpuštění a výsledný roztok se nechá vychladnout a státpři teplotě místnosti několik hodin. Výsledná sraženina sepak odfiltruje a promyje se 2x5 ml suchého glymu. Pevná lát-ka se pak suší ve vakuové sušárně v proudu dusíku, získá se0,7 g: alfa-//2-pyridinyloxy/karbonyl/omega-methoxypoly /oxy- 1,2-ethandiyl/ SRU 111,7.
Aialýza pro ^O^/CH^CHgQ/^ 11 vypočteno 54,57 % C, 9,02 % H, 0^28 % ří nalezeno 54,51 % C, 9,19 % ff, 0,28 % ». Příklad 18a Příprava alf a-//2-pyridinyloxy/karbonyl/omega-methoxypoly-/oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 225
Postupem popsaným v příkladu 18 se MPEG /methoxypoly-ethylenglykol/ molekulové hmotnosti 10000, převede na alfa-//2-pyridinyloxy/karbonyl/omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 225. .Analýza pro CgHTj ^NO^/CBjCH^O/ggj , vypočteno 54,54 % C, 9,08 % H, 0,14 % $ nalezeno 54,54 % C, 9,12% H, 0,11% Ní. Příklad 19 Příprava lL-1ra konjugovaného k PEG pomocí Činidla alfá-//2-pyridin.yloxy/karbonyl/omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7 IL-1 ra se pegyluje s alfa-//2-pyridinyloxy/karbonyl/-omega-methoxypoly /oxy-12-ethandiyl/, SRU 111,7 postupempopsaným v příkladech 6 a 12. Převládající pegylováné produk-ty mají zdánlivou molekulovou hmotnost 26 kD a 33 kl> a činípřibližně 31 a 57 procent všech proteinů v reakční směsi po. 60 minutách. Schopnost Čištěných IL-ira proteinů z reakčnísměsi inhibovat IL-1 vazbu byla stanovena jak je popsáno vpříkladu 6 a je shrnuta v tabulce XIV. 26 kD pegylovaný XL-1ra -53- 'konjugát má vazebnou kapacitu 4násobnou vzhledem k IL-1ra. 33kD konjugát výrazně ztrácí vazebnou aktivitu jak je in-dikováno 15násobným snížením kompetitivní vazebné aktivity.
Tabulka XIV 1 05
Inhibice / 7I/IL-1 vazby IL-lra proteiny pegylovanými s či- nidlem popsaným v příkladu 18 ^dánlivá molekulová hmotnost lL-1ra proteinu /kD/ IC^q /ng/ml/ 19 /nemodifikovaný/ 2,026 ' 8,033 30,0
Přiklaď "19 A Příprava IL-lra konjugovaného k PEG. pomocí činidla alfa-//2-pyridinyloxy/karbonyl/omega-me.thoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/, SRU225 ILr-ra byl pegylován s alfa-//2-pyridin.yloxy/-karbonyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/,SRU 225, postupempodle příkladu 19. Převládající pegylované produkty ze 60minutové reakce mají zdánlivé molekulové hmotnosti 33 kD a48 kD a činí přibližně 47 a 25 procent všech proteinů z reakčnísměsi.
Schopnost čištěných lL-1ra proteinů z reakční směsi inhi-bovat IL-1 vazbu byla stanovena jak je popsáno v příkladechb a 12 a shrnuto v tabulce XT. 33 kD protein si udržuje ak-tivitu IL-lra. ^onjugát o vyšší molekulové hmotnos- ti výrazně ztratil aktivitu -54-
^dánlivá molekulová hmotnostIL-lra proteinu /kD/ IC50 /ng/ml/ 19 /nemodifikovaný/ 33 48 1,5 9,0 40,0 ^armakokinetický profil PEG-IL-1ra byl stanoveni jak jepopsáno v příkladu 6 A. ^daje jsou shrnuty v tabulce D5·PEG-IL-1ra byl detegovatelný ve vzorcích séra po prolongo-vanou dobu ve srovnání' s nemodifikovaným IL-lra což demon-struje prolongovaný poločas v séru* Farmakodynamický profilPEG-IL-Ira byl. stanoven jak je popsáno v příkladu 6. s tím roz-dílem, že 0,05 /Ug rIL-1 alfa bylo podáno. .?ďaj® jisou shrnutyv tabulce É6. Odezva na IL-1 samotný byla 9203 jednotek/mlIL-6. Prolongovaný inhibiční účinek v porovnání s nemodifi- kovaným. IL-lra, byl zřetelný až do 72 hodin po podání PEG-IL-ira, což demonstruje: zlepšené f armakodynamické. vlast-nosti. Souhrnně tato data dokládají, Že i když pegylovanýprotein má sníženou aktivitu in vivo, mohl by mít zlepšenéfarmakodynamické vlastnosti in vivo.
Tabulka D5
Farmakókinetický profil IL-lra konjugovaného s činidlem popsanýmv příkladu. 18a cas /h/ po podáníí2 sérum IL-1 ra /mg/Sil/19 kD 33 kD580 75 100 -55-
Pokračování tabulky B5 3 30 4 30 60 6 8 8 12 10 17 24 10 Tabulka D6 1‘armakodynamický profil 1^-1ra konjugovaného s činidlem popsaným v příkladu 18 Boba /h/ před. podáním IL-6 /jednotky/ml/ IL-1 19 kB 26 kB 0 521; 454 6 2334 41S 24 13486 2552 48 16577 4667 72 12800 5148 Příklad. 20 Příprava IFN-alfa konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-//2-pyrÍdinyloxyAarbonyl/omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7 Činidlo alfa-//2-pyridinyloxy/karbonyl/omega-methoxypoly-/oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7, se přidá; k 1 mg čištěnéhoIFN-alfa ve 200 ^ul pufru /0,1 boritan sodný/ pH: 9,0/ v molárnímpoměru 10 mol činidla *na mol IFN-alfa. Roztoky se pečlivě pro-míchají a pegylační reakce probíhá při teplotě místnosti 60minut. Čištěný PEG-modifikovaný IFN-alfa se pak získá postupemuvedeným v příkladu 8. Třicetšest procent proteinu bylo deri-vát izováno a produkt měl zdánlivou molekulovou hmotnost 28 kD, -56-
Specifická aktivita čištěných IFN proteinů z reakční směsibyla stanovena jak je popsáno v příkladu 8 a hodnoty jsou shr-nuty v tabulce XVI. kodifikovaný IFN měl 5-6krát sníženou ak-tivitu in vitro.
'iabulka XVI 8ioaktivita IFN-alfa konjugovaného s činidlem popsaným v pří-kladu 18
Zdánlivá molekulová hmotnostΪΡΝ-alfa proteinu AD/ 15 /nemodifikovaný/ 28 specifická aktivitajednotky/mg1,88x1088,Qx107 ·’·»' Příklad 20Á Příprava rIL-2 konjugovaného k PEG pomocí Činidla alfa-//2-py-ridinyloxyAarbonyl/omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 11 1,7 Činidlo alfa-//2-pyridinyloxyz karbonyl/omega-methoxypoly-/oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7, popsané v příkladu 18, sepřidá k i mg rIL-2 ve 200 ^ul pufru /0,1 boritan sodný, pH 9,0/v molárním poměru 5 mol činidla na jeden mol rIL-2. Roztokyse pečlivě promísí a pegylační reakce se nechá probíhat přiteplotě místnosti 60 minut. Převládající druhy molekulové hmotnosti z ó^minutovéreakční směsi byly identifikovány SDS-PJGE jako mající zdán-livou molekulovou hmotnost. 15 kD /nemodifikovaný/ a 25 kD· 25 kD pegylovaný protein činil 60 % celkového proteinu. Příklad 21 Příprava IFN-alfa konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-//2^·paridinyloxy/karbonyl/omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 -5Ί- .IFN-alfa byl pegylován s činidlem, popsaným v příkladu18 postupem popsaným v příkladu 9·
Specifická aktivita stanovená metodami popsanýmiv příkladu 8 byla u výchozího nemodifikovaného IFN-alfa 1,0 x10 U/mg a specifická aktivita IFN-alfa konjugovaného k PEGbyla 0,4 x 10 U/mg což dokládá nevýraznou ztrátu bio aktivity. Příklad 22 Příprava IFN-alfa konjugovaného k PEG pomocí činidla alf a-//2-pyridin,yloxy/karbonyl/omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 PEG byl konjugovám k IFN-alfa za použití’ činidla, po-psaného v příkladu 18a postupem popsaným v příkladu 9» Speci-fická aktivita stanovená metodami popsanými, v příkladu 8 proIFN-alfa konjugovaný k PEG byla 0,3 x 108 U/mg. Příklad 23 Příprava alfa-/2-/isothiokyanáto/ethyl/-omega-methoxypoly-/oxy- 1,2-ethandiyl/ SRU 111,7
Ke 2 g alf a-/2-amihoethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 111,7 ve 100 ml CHgClg se přidá 94,2 mg di-2-py-ridylthiohokarbonátu. Roztok se nechá míchat 18 hodin a pak seextrahuje malým množstvím studené vody. ES^Clg se odstraní zasníženého tlaku a pro vyvolání srážení se přidá ether. Pro-dukt se odfiltruje a suší se za vysokého vakua, získá se alfa-/2-/isothiokyanát®íethyl/-omeg.a-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/SRU 111,7* ' ánalýza pro C^H^NOS /CH^CHgO/^ γ.
vypočteno 53,88 * C, 9,07 * H, 0,28 * N, 0,64 * S
nalezeno 54,45 * θ, θ,^3 * H, 0s28 % N, 0,53 % S -58- Příklad 24 Příprava IFN-alfa konjugovaného k PEG pomocí činidla alfa-/2-/isothiokyanáto/ethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/,SRU 111 ,7 Činidlo alfa-/2-/isothiokyanátu/ethyl/-omega-methoxy-poly /oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7, dříve popsaného v pří-kladu 23 se přidá k 1 mg čištěného IFN-alfa ve 200 ^ulpufru /0,1 M boritan sodný, pH 9,0/ v molárním poměru10 mol činidla na jeden mol IFM-alfa. Roztoky se pečlivě pro-mísí a pegylační reakce se nechá probíhat při teplotě míst-nosti 60 minut. Třicet procent produktu bylo derivatizovánoa má zdánlivou molekulovou hmotnost 26 kD.
Příklad 25 T Příprava řIL-2 konjugovaného k PEG pomoci činidla alfa-/2-/;iso-thiokyanáti/ethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/, ' SRU 111,7 ' Činidlo alfa-/2-isothiokyanáto/ethyl/-omega-methoxypoly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU. 111,7, popsaného v příkladu 23» se a·.přidá, k 1,0 mg rekombinantního IL-2 /rlL-2/ ve 100 ^ul pufru/0,1. M boritan sodný, pH 9,0/ v molárním poměru 10 mol činid-la PEG na mol rIL-2. Roztoky se pečlivě promísí a pegylačníreakce se nechá probíhat při teplotě místnosti po 60 minut.Čištěný PEG-modifikovaný rIL-2 se pak získá postupem podlepříkladu 3*Výsledky derivatizace jsou shrnuty v tabulce XVU· -59-
'1'a bulka XVII
Modifikace; rIL-2 činidlem popsaným v příkladu 23
Zdánlivá molekulová hmotnostrrIL-2 protein: /kD/ 15 /nemodifikovaný/2630 % celkového proteinuz reakce 70 20 10 Příklad 26 Příprava IL-1ra konjugovaného k PEG pomocí Činidla alfa-/2-/isothiokyanáto/ethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/,SRU 111,7 li*-Ira se pegylujes s alfa-/2Tlsothiokyanáta/ethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7 podle postupupopsaného v příkladu 6. Převládající pegylované produkty majímolekulové hmotnosti 26, 31·, 38 a 48 kD a činí přibližně . 17, 44,15 a 10 procent.celkového proteinu*
Schopnost čištěného proteinu 26 kD I^-Ira z 60minutovéreakční směsi, inhibovat. 1^-1 dražbu byla stanovena metodamipopsanými v příkladu 6 a výsledky jsou shrnuty v tabulce XVIII·Pegylovaný protein si udržuje svoji vazbovou kapacitu 2-3ná-sobku IL-1ra*
Tabulka XVIII
Tnhibice /12^I/IL-1 va by lL-1ra proteinem- pegy 1 ovánýms činidlem popsaným v příkladu 23 ^dónlivé molekulová hmotnost IL-Ira proteinu /kD/ IG^q 19 26
-60- Příklad 27 Příprava rIL-1 alfa konjugovaného k PECf pomocí činidlaalť'a-/2-/isothiokyanáto/ethyl/-omeg.a-methoxypoly /oxy-1,2vethandiyl/, SRU 111:,7 ^ekombinantní IL-1 alfa byl pegylován s alJřa-/2-/iso-thiokyanáto/ethyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 111,7, jak. je popsáno v příkladu 4. Dva pegylované druhypřevládající molekulové hmotnosti z 60minutové reakčnísměsi byly identifikovány pomocí SDS-PáGE jako majícízdánlivé molekulové hmotnosti 26 a 38 kD. ^yto uvedené'dva pegylované proteiny čircí 46. a 48 procent celkového pro-teinu?* Pegylovaný rIL-1 alfa byl Čištěn z. reakční směsi acharakterizován jak je popsáno v příkladu 4.
Bioaktivita spojených čištěných: frakcí byla hodnocena’ stu-dií proliferaee? D10 buněk jak je popsáno v příkladu 7 a výsled-ky jsou shrnuty v tabulce XIX· Vzorky uvedené jako směsi vtabulce obsahují více než jeden druh proteinu, nebyly dále·-’čištěny. 26 kD pegylovaný protein měl specifickou aktivituv podstatě nerozeznatelnou od IL-T,
Tabulka XIX
Bioaktivita rIL-1 alfa konjugovaného k PES s činidlem po-psaným vr příkladu 23
Zdánlivá molekulová hmotnost specifická aktivita rIL-1 alfa proteinu /kD/ jednotky/mg 17 26 26,38 /směs/> 38 /směs/
6,0 Jt IQ^ -61- Příklad 28 Příprava alfa-//2-pyridinylaxy/thikarbonyl/-omega-methoxy-poly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 Z-roztoku 1 g /0,1 mmol/ MPEG /methoxypolyethylenglykolmolekulové hmotnosti 10 000/ ve 30 ml CH^Clg se^festiluje10 ml rozpouštědla. Výsledný roztok se ochladí a přidá se 69,7 mg /0,3 mmol/ di-2-pyridinylthionokarbonátu a 2 mgDMáP. Směs se pak míchá' pod atmosférou argonu 18 hodin. Roz-pouštědlo se odstraní za vakua a zbytek se znovu rozpustí vminimu CH^Cl^* Potom se přidá ether a výsledná sraženina deodfiltruje a promyje etherem. Produkt se pak rozpustí v 5 mlteplého glymu a výsledný roztok se nechá stát přes noc. Výsled-ná sraženina se pak odfiltruje a promyje se 2x5 ml. glymu a 5ml di ethyl etheru?.. Produkt se. pák·, suší ve vrakuové sušárně, pod .mírným proudem dusíku, získá se 0,9 g. alf‘a-//2-pyridinyl-.oxy/thio-karbonyl/-omega-methoxypoly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225.
Aialýza pro ^0^3/0^01^0/225 y vypočteno 54,46% C, 9,04 % &amp; nalezeno· 54,6?% C, 9,30 % H. Přiklaď 29 Příprava IL-1ra konjugovaného k PEG pomocí činidla alf.a-//2-pyridinyloxy/thiokarbonyl/-omega-methoxypolý /oxy- 1,2-ethandiyl/, SRU 225
alfa-//2-Pyridinyloxy/thiokarbonyl/-omega-methoxypoly/oxy-1,2-ethandiyl/, SRU 225, připravený jak je popsáno vpříkladu 28 se přidá ke 2,0 mg. IL-Ira v 1,0 ml pufru /0, 1 M boritan sodný, pH 9,0/ v molárním poměru 2 mol Činidla na jedenmol IL-1ra. Roztoky sé pečlivě promísi a pegylační reakce senechá probíhat při teplotě místnosti 60 minut. PEG-modifikovanýIL-1ra se pak čistí postupem podle příkladu 6. -62- Převládající pegylovaný produkt má zdánlivou molekulovouhmotnost. 33 kD a činí přibližně 17 % celkového proteinu z60minutové reakční směsi. Schopnost, čištěného proteinu z reakč-ní směsi, inhibovat 1^-1 vazbu byla stanovena jak je popsánov příkladu. 6· a výsledky jsou shrnuty v tabulce XX·. ^azebnákapacita 33 kD proteinu byla 3-4nésobek IL-lra.
Tabulka XX
Inhibice / 7I/IL-1 vazby IL-lra proteiny pegylovanými s činidlem·, popsaným v příkladu 28Molekulová hmotnost IL-lra proteinu /kD/ ΙΟ^θ /ng/ml/ 19 /nemodifikovaný/ 1,4 33 Příklad 30 tyj:-di-/6-methyl.-2-pyridinyl/esteir kyseliny karbonothiové K roztoku 10 g /0,09 mol/ 6-methyl-2-hydroxypyridinu ve 250 ml suchého CH^lg se přidá 12,7 ml tri ethyl aminu. Roztok:se ochladí na 0 °C a pod atmosférou argonu se přikape 4,1 ml/0,046 mol/ roztoku thiofosgenu v CCl^ /8%/. Směs „se pakmíchá při teplotě místnosti 5 hodin·, zfiltrujje a CH^Clgroztok se promyje dvakrát 100 ml nasyceného hydrogenuhlič.ita-nového roztoku. Organická vrstva se suší a rozpouštědlo se od-straní za sníženého tlaku. -Ke zbytku se přidá hexan /100 ml/a výsledná směs se nechá rozdělit přes noc. 7ýsledná sraženinase odfiltruje, promyje se hexanem a suší ve vakuové sušárně pod:slabým proudem, dusíku, získá se 5,7 g o,o-di-/6-methyl-2-pyridinyl/esteru kyseliny karbonothiové, t.t. 155 až 156 °C.finalýza pro
vypočteno 5^,98 % C, 4,65 % H, 10,76 % ff, 12,32 % S nalezeno 59,65 % C, 4,59 % H, 10,75% řf, 12,06 % S. -63- Příklad 31 alf a-Methyl-omega-/2-///6-methyl-2-p.yridinyloxy/thio-:karbonyl/amino/ethoxy/poly/oxy-1 ,2-ethandiyl/ SRU 225
Roztok 1 g al£'a-methoxy-omega-/2-aminoethyl/-poly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 /připraven v příkladu 1c/ a 52,7mg o,o-di/6-methyl-2-pyridinyl/esteru kyseliny karbonothiové/příklad 30/ rozpuštěného v 15 ml suchého CHgCl^ se míchápřes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstraní zasníženého tlaku a zbytek se trituruje s diethyletherem. Sraženina se odfiltruje a promyje? se etherem, grodukt. se pak rozpustív 5 ml teplého glymu a zfiltruje přes 0,75 mikrometrovýfiltr Milipore?. Roztok se pak nechá stát při teplotě místnosti48 hodin a výsledná sraženina se odfiltruje. Produkt se paksuší ve vakuové sušárně pod: atmosférou dusíku po 18 li, získáse 0,9 g alfa-methyl-omega-/2-///6-methyl-2-pyridinyloxy/thio-karbonyl/amino/ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225*
Aialýza pro C^H.j^OgS/CHgCHgO/ggj
vypočteno; 54,50 % C, 9,09% E, 0,27 % K, 0,32 % S nalezeno· 54,38 % C, 9,20 % H, 0,21 % Ν', 0,37 % S. Příklad 32 Příprava rH<-lra konjugovaného; k PEG pomocí činidla alfa-methyl-omega-/2-///6-methyl-2-pyridinyloxy/thiokarbonyl/-amino/ethoxy/polý/óxy-1,2-ethandiyl/ SRU 325 Činidlo připravené jak je popsáno v příkladu 31 se přidák: 5 mg čištěného rlL-Ira v 1,0 ml 0»1M boritanu sodného, pH9,.Q v molárním poměru 2,0 mol Činidla na mol rlL-Ira. Roztokse pečlivě míchá a reakční směs se ponechá reagovat při teplo-tě místnosti 60 minut. rIL-1ra produkty se hodnotí za použití postupu popsa-ného v přikladu 6. tabulka XXI ukazuje procenta modifikaceprimární molekulové hmotnosti z reakční směsi. -64-
Tabulka XXI
Modifikace rIL.-1ra činidlem popsaným v příkladu 31.Zdánlivá molekulová hmotnost % celkového proteinu rlL-Ira proteinu z reakce 19 /nemodifikovaný/ 30,035 65,048 5,0 cIL—Ira produkty z reakčnímetody popsané v příkladu 6. směsi byly čištěny za použití Čištěné frakce z reakční směsi byly studovány ve zkoušcekompétiční vazby/ radioreceptoru rlL-í: jak je popsána v pří- kladu. 6. Výsledky jsou uvedeny v tabulce XXII. Tyto výsledky \ukazují, že 35 kD protein byl Žkrát měně aktivní; než nemodifi-kovaný IL-1ra pro inhibici IL—1 vazby, zatímco 48 kD protein byl 20 krát méně aktivní.
Tabulka XXII1 oc
Inhibice / £?I/ IL-1 va by rIL-1ra konjugovaným s činidlem,popsaným v příkladu 31Zdánlivá molekulová hmotnost rlL-Ira proteinu AD/ IC^q /ng/ml/ 19 /nemodifikovaný/ 1,535 9,048 30,0 Příklad 33 alf a-/2-///2-Py ridinyloxy/k ar bonyl/amino/e thy 1/-omeg a-/2-///2-pyridihyloxy/karbonyl/amino/-ethoxy/poly' /oxy-1 ,2-ethan-diyl/ SRU 180 -65- 4· Příprava alfa-/2-chlorethyl/-omega-/2-chlorethoxy/póly /oxy-1,2-diyl/ SRU 180' Z kaše 80 g MPEG /polyethylenglykol molekulové hmotnosti8000/ v 750 ml toluenu se oddestiluje 200 ml rozpouštědla*Krefluxujícímu. roztoku se.· přikape 1,7 ml suchého pyridinu a 4,7 ml thionylchloridu. Po refluxování dvanáct, hodin se reakč-ní směs nechá míchat přes noc. Pak se přidá methylenchlorid/50 ml/ a výsledný roztok se zfiltruje přes 60 g bázickéáluminy /Wolem Super 1/. Sloupec se pak eluuje 500 ml CH2C12organické vrstvy se spojí a rozpouštědlo sě odstraní za sní-ženého tlaku. Zbytek se pak rozpustí ve 300 ml CHgClg a po-malu se přidá ether při odstraňování rozpouštědel na parní Λ lázni. V tomto postupu se opakuje až; do vzniku kalné suspenze.Výsledná směs.se pak míchá při teplotě místnosti.několik ho-..din. a odfiltrováním produktu se získá, 73 g alfa-/2T-chlorethyl/-omega-/2-chlor-ethoxy/-poly/oxy/l ,2-ethandiyl/ SRU 180.
Aialýza pro C^Clg/CI^C^O/^Q vypočteno 54,16 % C, 9,09 % H, 0,88 &amp; Cl nalezeno 53,40 % C, 8,81 % H, 0,93 % Cl. B. Příprava alfa-/2-azidoethyl/-omega-/2-azidoethoxy/-poly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 180
Směs 72galf’a-/2-chlorethyl/-omega-/2-chlorethoxy/poly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 180, 25 g azidu sodného a 700 mlsuchého DMF se míchá a zahřívá na 125 °C 12 hodin. Rozpouš-tědlo se pak odstraní za vysokého vakua a zbytek se rozpustív jednom litru CHgClg a zfiltruje přes Celíte. CHgClg se pakodstraní na parní lázni přičemž se přidává diethylether provyvolání srážení. Směs se přes noc míchá a pak se zfiltruje?.Sraženina se pak rozpustí, v minimu glymu při 50 °C, porayluochladí a zfiltruje. Produkt se pak suší ve vakuové sušárněpod proudem dusíku, získá se tak 69 g alfa-/2-azidoethyl/-omega-/2-azidoethoxy/-poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 180. -66-
4nalýza pro C^ř^/C^C^O/jgQ vypočteno 54,07"% C, 9,08 % H, 1,044 % Hnalezeno. 53,76 % C, 9,28% H, 0,96% K. . C. Příprava alf.a-/2-aminóethyl/-omega-/2-aminoethoxy/ póly /oxy-1,2-ethandiyl/ SRU Γ80
Roztok 69 g..' alf a-/2-azidoethyl/-omega-/2-azidoethoxy/póly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 180 a 6,7 g /25,6'.mmol/ trifenylfos-finu rozpuštěnéhofve 200 ml CHgClg se míchá pres noc pod atmosfé-rou argonu. Přidá se voda /2 ml/ a směs se dalších. 12 hodinmíchá. Většina se odstraní ve vakuu, /methylenchloridu/ apřidáse 400 ml diethyletheru. Sraženina se odfiltruješ, promyje seetherem; a rozpustí ve 300 ml teplého /50 °C/glymu. Roztok "se nechá stát při teplotě místnosti přes noc a výsledná sraže-nina se odfiltruje, promyje 2x100 ml glymu, 2x100 ml diethýl-etheru a suší ve vakuové sušárně pod proudem dusíku, získá se66 g alfa-/2-aminoethyl/-omega-/2-aminoethoxy/poly/oyy-1,2-ethandiyl/ SRU 180. · · ^
Analýza pro; 80 ; vypočteno 54,42 % C, 9,18% H, 0,35% Nnalezeno; 53,85 % C, 9,20 % H, 0,43 % R. D. alf a-/2-///2-PyridinyloxyAarbonyl/amino/eth.yl/-omega- /2-///2-pýridinyloxy/karbonyl/amino/-ethoxy/poly/ oxy-T,2-eťhandiyl/ SRU 180 2- roztoku t; g alf’a-/2-aminoethyl/-omega-/2-aminoethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 180 rozpuštěného ve 40 ml suchého , CHgClg se oddestiluje 15 ml rozpouštědla. Roztok se ochladí na 0 a přidá se 85 mg /6,39 mmol/ di-2-pyridylkarbonátu. « Směs se pak míchá 4 h při 0 °C a rozpouštědlo se odstraní za vakua» Zbytek se triturujé s diethyletherem. a produkt se odfil-truje a promyje se etherem. /2x75 ml/. Produkt se pak suší za va- Λ kua a rozpustí v 8 ml suchého glymu /50 C/. Roztok se pak --67-- nechá vychladnout a stát při teplotě místnosti 12 hodin.Vysrážený produkt se odfiltruje, promyje 2 x 5 ml glymu a sušíve vakuové sušárně v proudu dusíku. Získá se 1 g alfa-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/ amino/ethyl/-omeg:a-/2-///2-pyri-dinyloxyAarbonyl/amino/ethoxy/‘poly-/oxy-l ,2-ethandiyl/ SRU 180.
Analýza pro C ^O^/CHgCHgO/^ θθ
vypočteno 54,57 % C, 8,99 % R, 0,68 % K nalezeno 54,32.% C, 8,79 % H, 0,77 % Ní. Příklad 34 alfa-/2-///2-eyridinyloxyAarbonyl/amino/ethyl/-omega-/2-///2-pyridihyloxy/karbonyl/aniino/-ethoxy/poly/oxy-1 ,2-ethyn>.'diyl/ SRU 452 A. Příprava alfa-/2-ehlorethyl/-omega-/2-chlorethoxy/-pol/oxy-. 1,2-ethandiyl/ SRU 452
Postupem popsaným v příkladu 33A se polyethylenglykol mo-lekulové hmotnosti 20000 převede na alfa-/2-chloreth.yl/-omega-,/2-chlorethoxy/-polý/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 452.
Analýza pro CgH^Clg/C^CITgO/^^g vypočteno* 54,38 % C, 9,13 % H, 0,35 # C1 nalezeno 54,36 % C, 9,23 % K, 0,40 % Cl. B. Příprava alfar-/2-azidoethyl/-omega-/2-azidoethoxy/-poly/oxy- 1,2-ethandiyl/ SRU 452
Postupem popsaným v příkladu 33B se alfa-/2-chlorethyl/-omega-/2-chlorethoxy/-poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 452 převede?na alfa-/2-azidoethyl/-omega-/2-azidoethoxy/-poly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 452.
Analýza pro CgH^Ifg/CH^CE^0/^^
vypočteno 54,35 % C, 9,12 % H} 0,42 % M nalezeno 54,38 % C, 9,30 % U, 0,47 % N. -68- C. Příprava alfa-/2-aminoethyl/-omega-/2-aminoethoxy/poly-/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 452
Postupem popsaným v příkladu 33C se alfa-/2-azidoethyl/-omega-/2-azidoethoxy/-poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 452 převedena alfa-/2-aminoethyI/-omega-/2-aminoethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 452·
Aialýza pro; CgBgflig/CHgCI^O/^ vypočteno 54,49 % C, 9,1 7 % R, 0,14%^ nalezen© 54,44 % C, 9,19 % H, 0,15 % D. alf‘a-/2-///2-Pyridinyloxy/karbonyl/amino/ethyl/-omega-jí2-///2-pýřidinyloxyAarbónyl/amino/ ethoxy/poly/oxy- T,2-eťhandiyl/ SRU 452
Postupem popsaným v příkladu 33C se alfa-/2-aminoethyl/-omega-/2-aminoethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 452 převedena alfa-/2-///2-pyridinylóxy/karbonyl/amino/ethyl/-úmega-/2-///2-pyrÍdihyloxyAarbonyl/adino/ethoxy/poly/oxy- T ,2-etharidiyl/ SRU 452. '
Aialýža pro /452
vypočteno 54,56 # C, 9,08 % H, 0,28 % B nalezeno 54,33 % C, 9,13 % H, 0,33 % Příklad 36; Příprava rlL-Ira konjugováného k PEG pomocí činidla alf'a-/2-///2-pyridinyloxy/karbonyl/amino/ethyl/-omega-/2-///2-pyridinyl-oxy/karbonyl/amino/ethoxy/poihy/oxy-l, 2-ethandiyl/ SRU 452 činidlo připravené podle příkladu 34 se přidá k. 5,0 mhČištěného rlL-Ira v 1,0 ml 0,1 Bff boritanu sodného, pH 9,0 v molárnímpoměru Γ,Ο mol Činidla na 4,0 mol rIL-1ra. Roztok se pečlivě mí-chá při teplotě místnosti 60 minut. rlL-Ira produkty se hodnotí za použití metody popsané v příkladu 6. Tabulka XXIII ukazuje procenta modifikace při- -69- mární molekulové hmotnosti z reakční směsi.
Tabulka XXIII kodifikace rlL-Ira činidlem popsaným v příkladu 33
Zdánlivá molekulová hmotnost. % celkového proteinu rIL-1ra proteinu AD/ " z reakce 19 /nemodifikovaná/ 50,0 55 35,0 75 . 15,0 Příklad 36
Bis-/3-methyl- 2-pyridyl/karbonét v .
Roztok 4,6 g /42 mmol/ 3-methyl-2-hydroxypyridinu a 6 mltriethylaminu rozpuštěného ve. 20 ml se? přikape při 0 °C k roztoku 50 ml CHgClg a 1 í. ml fosgenu v toluenu /1,93 molární/·Směs se míchá, při 0. °C 2 ha pak při teplotě místnosti 2 h. •Keakční směs se pak promyje nasyceným roztokem hydrogenuhli- ,čitanu sodného, potom.nasyceným roztokem,chloridu sodnéhoa..pak se suší nad síranem sodným, Rozpouštědlo se odstraní zasníženého tlaku a zbytek se krystaluje ze směsi EtOAr/hexan·Získá se 3 g bis-/3-methyl-2-pyridyl/karbonátu, t.t. 110 až112 °C.
Aialýza pro C vypočteno 63,93 % C, 4,95 % H, 11,47 % » nalezeno 63,78 % C, 4,86 % H, 11,23 % K·
Příklad 3T alfa-Methyl“omega-/2-///3-taethyl-2-pyriáinyloxyAarbonyl/amino/-ethoxy/poly/oxy-1,2-ethandiyl/ SRU 225 Z roztoku 1 galfa-methoxy-omega-/2-aminoethyl/poly/oxy- 1,2-ethandi.yl/ SRU 225 rozpuštěného ve 25 ml C^Clg se· oddes-tiluje 10 ml rozpouštědla. &amp; roztoku se pak přidá 49,2 mg /0,2 -70- mol/ bis-/3-methyl-2-pyridyl/karbonátu a výsledná směs· sepřes noc míchá při. teplotě místnosti pod atmosférou argonu. Roz-pouštědlo se pak odstraní za sníženého tlaku a ke zbytku sepřidá 80 ml diethyletheru. ?evná látka se odfiltruje, promyjeetherem: a pak se rozpustí v 10 ml CHgCl^Pomalu se přidáváether a rozpouštědlo se odvařuje dokud roztok je kalný.
Směs se pak nechá stát 18 h při teplotě místnosti a výslednásraženina se odfiltruje. Pevná látka se pak rozpustí v 8 mlteplého glymu a nechá stát při teplotě místnosti dalších 18hodin. Produkt se pak odfiltruje, a suší ve vakuové sušárně podatmosférou argonu, získá se 0,6 g alfa-methyl-omega-/2-///3-methyl-2-pyridinyloxy/karbonyl/amino/ethoxy/poly/oxy-1,2-ethan-diyl/ SRU 225. ánalýza pro C1QH14lí2O3/CH2CH2O/225 ·> vypočtena 54,59 % G, 9,09 % K, 0,28 % 8 nalezena 55,64 % C, 9,14 % H, 0,22 % 8. Příklad 38 . Příprava rIL-1ra konjugovaného k: PEG pomocí činidla alfa- • >· methyl-omega-/2-///3-methyl-2-pyridinyloxy/karbonyl/amino/- wethoxy/poly/oxy-T,2-ethandiyl/ SRU 225 Činidlo připravené jak je popsáno v příkladu. 37 se přidák. 5,0 ag čištěného rlL-Ira v 1,0 ml 0,1M boritanu sodného,pH 9,0 v molárním poměru 2,0 mol činidla na mol rlL-Ira. Roztokse pečlivě promíchá a reakce se nechá probíhat při teplotěmístnosti 60 minut. rlL-Ira produkty se hodnotí postupem popsaným v příkladu 6. ‘iabulka XXIV ukazuje procenta modifikace primární molekulo-vé hmotnosti z reakční směsi. -7t-
Tabulka XXIV
Modifikace rlL-lra činidlem popsaným., v příkladu 37 ^dánlivá molekulová hmotnostrlL-lra proteinu AD/ % celkového proteinuz reakce 19 /nemodifikovaný/ 35 45 45,0 43,0 12,0 rlL-lra produkty z reakční směsi se čistí jak je popsá-no v príkladuÓ. Čištěné frakce z reakční směsi se sledují kompetiční vaznou zkouškou rIL-1 radioreceptoru jak je popsáno vpříkladu 6. Výsledky jsou uvedeny v tabulce XXV» 35 kD. protein,byl 4krát méně aktivní než nemodifikovaný I"-1ra pro inhibici. H-l vazby* 45 kD protein -byl 30krát méně aktivní'.
tabulka XXV ínhibic.e /12^I/lD-1 vazba rlLrlfca konjugovaným ,s činidlempopsaným v příkladu 35 "dánlivá molekulová hmotnost rIL-1 fra proteinu AD/ IC^q /ng/ml/ 19 /nemodifikovaný/ 1,0 35 45 4,0 30,0

Claims (9)

  1. *72- PATSNTQVÉ N A*R O K Y Z)í 3C U Fyziologicky aktivní konjugát proteinu obecného vzor-ce I B1-O-/CH2CH2O/a-CH2Cíí2-R: NH--protein C I» B- »Λ. /1/ kde íd je nižší alkyl, R^ je -O- nebo -NH-, R? je =N-b\ . nebo> =0, R^ je nižší alkyl nebo cykloalkyl, man jsou zvolenyz celých čísel 1 tak, žekonjngát. má alespoň část biologic-ké aktivity nekonjugovaného proteinu,^ tou podmínkou, že když R^ je -0-, R^ je jiný než =ffi-R^, 2 1 že když R je -0- a S je =0, je protein interferon-alfý, in-terleukin-1 nebo interleukin_1ra a Že když R^ je -0- a R^ je =S, protein není antigen E z pylu?ambrosie nebo hovězí plasmový albumin. Z ΙΐΟί, . "f -Ur
  2. 2. Proteinový konjugát podle nároku 1, kde nt a n jsouvybrány tak, že molekulová hmotnost pegylačního zbytku/ů/na molekulu proteinu je od 300 do 30000 daltonů. 3· Proteinový konjugát podle nároku 1 nebo nároku í, kdem je 1 nebo 2* Proteinový konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1-3 obec-ného vzorce I-A 4. -73- r /R -O/CH^CH^O/^-CHgCfig Η H Η ΪΕ protein HR /i-V kde s\ α a protein mají význam, uvedený v nároku 1 5· Proteinový konjugát podle kteréhokoliv z nároků t-3obecného vzorce I-B R1 -0/C5 CH 0/ -CH' CH -0. protein /i-s/ kde R?‘, tm, n. a protein, mají význam uvedený v nároku !♦
  3. 6. Proteinový konjugát: podle kteréhokoliv z.nároků 1-3obecného vzorce I-C H SF . / NH r z / c Rl-U/Cff2CH2O/ct-CH2CH2 ΪO protein /I-C/ kde H.‘, m,n a protein, mají význam uvedený v nároku 1*
  4. 7. Proteinový konjugát. podle kteréhokoliv z nároků 1-3Obecného vzorce I-D protein N NH 1 / \ /S^-O-ZCE^C^O/^-CfigC^ Cz flfc /1-0/ -74- kde r\. e, n a protein mají význam uvedený v nároku 1» 8. I-E Proteinový konjugát podle nároků 1-3 obecného vzorce X NH--protein 1 z ' X X R -0-/0^0^0/^-0^0¾ C at /I-E/ kde a1·, m, n a protein mají význam definovaný v nároku t. 9* Proteinový konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1-8kde R1 je Cí^. *
  5. 10. Proteinový konjugát podle kteréhokoliv z nároků. 1-9,kde proteinem je interleukin-í. 1U Proteinový konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1-9,kde proteinemi je interleukin-1ra.
  6. 12. Proteinový konjugát podlez kteréhokoliv z nároků 1-9, kdeproteinem je interferon-alf a. 13· Proteinový konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1-9,kde proteinem je interleukin-2»
  7. 14. Proteinový konjugát podle, nároku 1; vzorceH z __NH——interferon-alf a H3C-0/Cff2CE20/n-CH2CH2 C 0 kde n je asi 112< -75- 15* Proteinový konjugát podle nároku j vzorce?
    0 . NH-interferon-alfa / \ / o kde n je asi 112« 16« Proteinový konjugát podle nároku 12 nebo nároku 13, kdeiriterferonenb-alfa je interferon-alfa A« 17« Sloučenina vybraná ze skupiny, zahrnující H- A R10/C^CHgO/^-CffgCHg-BsGs fř-R4 ΙΓ-Β; S10/CH^CE20/n-C^CH2-0 - ΐ II-C R10/Cffg^O/a-CBgCB^-HH
    II-D R10/CHgCH^O/^C^- CÍ^-N^OS IX—B R1O/CE Cff 0/ -CECH -NE - C - 0 2 2 n 2 2 h
    II-F R10/C^C^O/nrCH2C^-0-C-0 s
    &amp; i a1 II-G O tl R^/C^Cí^O^-CE^CHj-O - C -
    kde R1 je nižší alkyl, R4 je nižší alkyl'nebo cykloalkylR5je nižší alkyl nebo &amp; a n. je jekékoliv celé Číslo od í do 1000» 1;8. Sloučenina podle nároku 17, kde R4 je cyklohexyl. 5 . 19» Sloučenina podle nároku 17, kde R Qe H. 20· Sloučenina podle nároku 17, kde R^ je CHy 21» Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 17-20, kde R1 je CK-j·
  8. 22, Sloučenina vzorce · AlrilstaiBallNlMiMMMliVMMÍMnHtaBJheiiÉTtaMnmr: najWfftaalF R^/C^CHgO/fcCl^CH^-NH - C
    kůe R je CH^a n. je asi 112, 23» Proteinový konjugátypodle kteréhokoliv z nároků 1 až 16pro použití jako terapeuticky aktivní sloučeniny při léčbě neboprofylaxi chorob. -77- 24» Způsob přípravy proteinového konjugátu podle kterého- koliv z nároků 1-16, v y z n a č u j í c í se t í o, že zahr-nuje reakci sloučeniny podle nároku 17 s volnou aminoskupinouproteinu nebo jeho soli a izolaci, proteinového konjugátu zre akční směsi. 25· Farmaceutický přípravek, vyznačující setím, že; zahrnuje proteinový konjugát podle kteréhokolivz nároků 1 — 16* a terapeuticky inertní nosič.
  9. 26. Farmaceutické přípravky pro léčení nebo profylaxi imunomodulačnícfo poruch jako jsou neoplastické choroby nebo infekč-ní choroby, vyznačující se t í m, že;; obsahují protei-nový konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1-16 a terapeutickyinertní nosič- -STrw—;-Použití proteinových konjugátů. podle kteréhokoliv -a . nároků 1-16-proJléčbu nobo profylaxi chorob jiných nes lidských. 27· Použití .proteinových konjugátů podle kteréhokoliv znároků 1-16; pro výrobu léčiv pro použití při léčbě nebo profylaxi chorob*
CS92871A 1991-03-25 1992-03-23 Novel polyethylene glycol (peg)conjugates of proteins CS87192A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67400191A 1991-03-25 1991-03-25
US07/767,000 US5595732A (en) 1991-03-25 1991-09-27 Polyethylene-protein conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS87192A3 true CS87192A3 (en) 1992-10-14

Family

ID=27101069

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS92871A CS87192A3 (en) 1991-03-25 1992-03-23 Novel polyethylene glycol (peg)conjugates of proteins

Country Status (32)

Country Link
US (7) US5595732A (cs)
EP (1) EP0510356B1 (cs)
JP (1) JP2637010B2 (cs)
KR (1) KR920018079A (cs)
CN (2) CN1038035C (cs)
AT (1) ATE176159T1 (cs)
AU (2) AU657311B2 (cs)
BG (1) BG60800B2 (cs)
BR (1) BR9201015A (cs)
CA (1) CA2063886C (cs)
CS (1) CS87192A3 (cs)
CY (1) CY2169B1 (cs)
DE (1) DE69228269T2 (cs)
DK (1) DK0510356T3 (cs)
EE (1) EE9400356A (cs)
ES (1) ES2128329T3 (cs)
FI (2) FI107927B (cs)
GR (1) GR3030049T3 (cs)
HU (2) HUT60512A (cs)
IE (1) IE920936A1 (cs)
IL (1) IL101348A0 (cs)
IS (1) IS3824A (cs)
MW (1) MW1892A1 (cs)
MX (1) MX9201298A (cs)
MY (1) MY131095A (cs)
NO (1) NO921142L (cs)
NZ (2) NZ248022A (cs)
OA (1) OA09760A (cs)
RO (1) RO109543B1 (cs)
SI (1) SI9210294A (cs)
ZA (1) ZA922110B (cs)
ZW (1) ZW4392A1 (cs)

Families Citing this family (255)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
WO1994004193A1 (en) * 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5478860A (en) * 1993-06-04 1995-12-26 Inex Pharmaceuticals Corp. Stable microemulsions for hydrophobic compound delivery
KR100361933B1 (ko) 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
AU8052194A (en) * 1993-10-20 1995-05-08 Enzon, Inc. 2'- and/or 7- substituted taxoids
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
HUT75533A (en) * 1993-11-10 1997-05-28 Schering Corp Improved interferon polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US7008624B1 (en) * 1995-02-22 2006-03-07 Immunex Corporation Antagonists of interleukin-15
DE19512484A1 (de) * 1995-04-04 1996-10-17 Bayer Ag Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika
DE19514087A1 (de) * 1995-04-13 1996-10-17 Deutsches Krebsforsch Konjugat aus einem Wirkstoff, einem Polyether und ggfs. einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein
ZA963530B (en) * 1995-05-05 1996-11-05 Hoffmann La Roche Recombinant obese (ob) proteins
ES2093593T1 (es) * 1995-05-05 1997-01-01 Hoffmann La Roche Proteinas obesas (ob) recombinantes.
CA2236591C (en) 1995-11-02 2012-01-03 Schering Corporation Continuous low-dose cytokine infusion therapy
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
AU5773798A (en) * 1997-01-29 1998-08-18 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
EP0973384A4 (en) 1997-02-13 2004-10-13 Sky High Llc ORGAN PRESERVATION SOLUTION
IL131406A0 (en) 1997-02-21 2001-01-28 Genentech Inc Antibody fragment-polymer conjugates and humanized anti-il-8 monoclonal antibodies
US7122636B1 (en) * 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US6458355B1 (en) 1998-01-22 2002-10-01 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
US6468532B1 (en) 1998-01-22 2002-10-22 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory diseases with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
US7005504B2 (en) * 1998-01-22 2006-02-28 Genentech, Inc. Antibody fragment-peg conjugates
FR2774687B1 (fr) * 1998-02-06 2002-03-22 Inst Nat Sante Rech Med Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon gamma, et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques
US6180096B1 (en) 1998-03-26 2001-01-30 Schering Corporation Formulations for protection of peg-interferon alpha conjugates
BR9910023A (pt) * 1998-04-28 2000-12-26 Applied Research Systems Conjugados de poliol-ifn-beta
KR100694345B1 (ko) 1998-05-15 2007-03-12 쉐링 코포레이션 리바비린 및 인터페론 알파를 포함하는, 만성 ｃ형 간염에 걸린 항-바이러스 치료에 대한 나이브 환자의 치료용 약제학적 조성물
TR200003635T2 (tr) * 1998-06-08 2001-04-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Peg-IFN-ALFA ve ribavirinin kronik hepatit C tedavisinde kullanılması.
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
HU229888B1 (en) 1998-10-16 2014-11-28 Biogen Idec Ma Inc Cambridge Polymer conjugates of interferon betha-1a and uses
EE05111B1 (et) * 1998-10-16 2008-12-15 Biogen, Incorporated Interferoon-beetaga sulandatud valgud ja nende kasutamine
DK2319928T3 (da) 1998-10-23 2013-06-24 Kirin Amgen Inc Dimere trombopoietiske peptidomimetika, der binder til MPL-receptor og har trombopoietisk aktivitet
US6362162B1 (en) 1999-04-08 2002-03-26 Schering Corporation CML Therapy
US6605273B2 (en) 1999-04-08 2003-08-12 Schering Corporation Renal cell carcinoma treatment
US6923966B2 (en) 1999-04-08 2005-08-02 Schering Corporation Melanoma therapy
CA2303992A1 (en) 1999-04-08 2000-10-08 Schering Corporation Melanoma therapy
US7169889B1 (en) 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
WO2001005819A1 (en) * 1999-07-15 2001-01-25 Kuhnil Pharm. Co., Ltd. Novel water soluble-cyclosporine conjugated compounds
YU32402A (sh) 1999-11-12 2005-03-15 Maxygen Holdings Ltd. Konjugati gama interferona
IL149267A0 (en) * 1999-11-12 2002-11-10 Maxygen Holdings Ltd Interferon gamma conjugates
SK11672002A3 (sk) 2000-01-10 2002-12-03 Maxygen Holdings Ltd. Polypeptidový konjugát, spôsob jeho výroby, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie
PL204285B1 (pl) 2000-02-11 2009-12-31 Bayer Healthcare Llc Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego
US7109303B2 (en) * 2000-02-15 2006-09-19 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
IT1317835B1 (it) * 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
US7309694B2 (en) * 2000-02-15 2007-12-18 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
SG98393A1 (en) 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
CN1434726A (zh) 2000-06-08 2003-08-06 拉卓拉药物公司 包含高分子量聚环氧乙烷的多价平台分子
US7208167B2 (en) * 2000-08-07 2007-04-24 Sciclone Pharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis C with thymosin and peptide combination therapy
US7118737B2 (en) 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
AU2001273385B2 (en) * 2000-09-08 2005-04-07 Gryphon Therapeutics, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
US20020065397A1 (en) * 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
US6867183B2 (en) 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7060675B2 (en) 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
JP2004534523A (ja) 2001-02-27 2004-11-18 マキシゲン・エイピーエス 新規なインターフェロンβ様分子
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) * 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) * 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828305B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
EP1419191B1 (en) 2001-08-22 2007-10-17 Bioartificial Gel Technologies Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US7166571B2 (en) 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7196059B2 (en) 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
UA78726C2 (en) * 2001-11-01 2007-04-25 Sciclone Pharmaceuticals Inc Pharmaceutical composition of thymosin alpha 1 conjugated with polyethylene glycol, method for production, and method for treatment
US20040058865A1 (en) * 2001-11-26 2004-03-25 Danishefsky Samuel J Homing peptide multimers, their preparation and uses
US7041855B2 (en) * 2001-12-11 2006-05-09 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100488351B1 (ko) * 2001-12-11 2005-05-11 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체
US6916962B2 (en) * 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6956135B2 (en) * 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100888371B1 (ko) 2002-01-17 2009-03-13 동아제약주식회사 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제
DK1476181T3 (en) 2002-01-18 2016-05-23 Biogen Ma Inc POLYALKYLENE POLYMER COMPOUNDS AND USE THEREOF
US20030191056A1 (en) * 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
GB0209893D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
GB0209896D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
US7601688B2 (en) 2002-06-13 2009-10-13 Biocon Limited Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
US20040002451A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
ATE503498T1 (de) 2002-06-21 2011-04-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
TW200500375A (en) 2002-06-28 2005-01-01 Idenix Cayman Ltd Modified 2' and 3'-nucleoside prodrugs for treating flaviviridae
AU2003239774A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-23 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
EP1382352A1 (de) 2002-07-19 2004-01-21 GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH Bisacyloxypropylcystein-Konjugate und deren Verwendung
JP4723244B2 (ja) 2002-07-19 2011-07-13 オメロス コーポレイション 生分解性トリブロックコポリマー、その合成方法、ならびにそれから作製されるヒドロゲルおよび生体材料
WO2004012773A1 (en) * 2002-07-24 2004-02-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyalkylene glycol acid additives
US7563507B2 (en) * 2002-08-16 2009-07-21 University Of Massachusetts Pyridine and related ligand compounds, functionalized nanoparticulate composites and methods of preparation
US7314613B2 (en) 2002-11-18 2008-01-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
US7217845B2 (en) * 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
RS20050502A (sr) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polimerni konjugati interferona- beta sa povećanom biološkom aktivnošću
PL396711A1 (pl) * 2002-12-26 2011-12-19 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Koniugaty polimerów z cytokinami, chemokinami, czynnikami wzrostu, hormonami polipeptydowymi i ich antagonistami, kompozycja farmaceutyczna i sposób zapobiegania, diagnozowania lub leczenia
US20040176655A1 (en) * 2003-02-05 2004-09-09 Ayoub Paul Marie Methods of preparing branched alkyl aromatic hydrocarbons
US20050079155A1 (en) * 2003-03-20 2005-04-14 Xencor, Inc. Generating protein pro-drugs using reversible PPG linkages
CA2458085A1 (en) 2003-03-21 2004-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Transcriptional activity assay
CN100503628C (zh) 2003-05-30 2009-06-24 法莫赛特股份有限公司 修饰的氟化核苷类似物
GB0320638D0 (en) 2003-09-03 2003-10-01 Novartis Ag Organic compounds
ES2737837T3 (es) * 2003-10-09 2020-01-16 Ambrx Inc Derivados poliméricos
EP1673387B1 (en) 2003-10-10 2010-09-15 Novo Nordisk A/S Il-21 derivatives
ES2428358T3 (es) 2003-10-17 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Terapia de combinación
US8778880B2 (en) 2004-02-02 2014-07-15 Ambrx, Inc. Human growth hormone modified at position 35
CN101001866A (zh) * 2004-02-02 2007-07-18 Ambrx公司 经修饰的人类干扰素多肽和其用途
US7351787B2 (en) * 2004-03-05 2008-04-01 Bioartificial Gel Technologies, Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
US7318918B2 (en) 2004-05-19 2008-01-15 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
US20060194726A1 (en) * 2004-05-25 2006-08-31 Rueger David C Methods of treating cartilage defects
WO2005123113A2 (en) * 2004-06-14 2005-12-29 Intermune, Inc. Interferon compositions and methods of use thereof
KR101699142B1 (ko) * 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2006005058A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor ix moiety conjugates
CA2572765C (en) * 2004-07-08 2013-05-21 Amgen Inc. Compound having improved bioefficiency when administered in a multidose regimen
MX2007000883A (es) 2004-07-19 2007-04-02 Biocon Ltd Conjugados de insulina-oligomero, formulaciones y usos de los mismos.
CN101023094B (zh) * 2004-07-21 2011-05-18 法莫赛特股份有限公司 烷基取代的2-脱氧-2-氟代-d-呋喃核糖基嘧啶和嘌呤及其衍生物的制备
US7638299B2 (en) 2004-07-21 2009-12-29 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
CA2576549C (en) * 2004-08-12 2011-01-18 Schering Corporation Stable pegylated interferon formulation
BRPI0515279A (pt) 2004-09-14 2008-07-15 Pharmasset Inc preparação de ribofuranosil pirimidinas e purinas 2'fluoro-2'-alquil- substituìdas ou outras opcionalmente substituìdas e seus derivados
WO2006071840A2 (en) * 2004-12-22 2006-07-06 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
EP2284191A3 (en) 2004-12-22 2011-07-20 Ambrx, Inc. Process for the preparation of hGH
WO2006068802A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
US8080391B2 (en) 2004-12-22 2011-12-20 Ambrx, Inc. Process of producing non-naturally encoded amino acid containing high conjugated to a water soluble polymer
DK1835938T3 (da) 2004-12-27 2013-11-04 Baxter Int Polymer-von Willebrand-faktor-konjugater
JPWO2006080171A1 (ja) 2005-01-31 2008-06-19 株式会社 エフェクター細胞研究所 免疫増強剤
BRPI0609809A2 (pt) 2005-05-18 2011-10-11 Maxygen Inc polipeptìdeo isolado ou recombinante, conjugado, composição, polinucleotìdeo isolado ou recombinante, célula hospedeira, vetor, métodos para preparar o polipeptìdeo, para preparar um conjugado, para inibir replicação de um vìrus em células infectadas com o vìrus para reduzir o numero de cópias de um vìrus em células infectadas com o vìrus, para reduzir o nìvel de rna de hcv no soro de um paciente infectado com hcv, para reduzir o nìvel de dna de hbv em soro de um paciente infectado com hbv e para reduzir o nìvel de rna de hiv em soro de um paciente infectado com hiv, e, uso do polipeptìdeo ou do conjugado
US20070015701A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-18 Samuel Zalipsky Macromolecular conjugates of bone morphogenetic protein-7
CA2609205A1 (en) * 2005-06-03 2006-12-14 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
RU2427372C2 (ru) 2005-06-17 2011-08-27 Новартис Аг Применение санглиферина для лечения вируса гепатита с
EP3725299A1 (en) * 2005-06-24 2020-10-21 Duke University A direct drug delivery system based on thermally responsive biopolymers
WO2007021297A1 (en) * 2005-08-18 2007-02-22 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF tRNA AND USES THEREOF
US20070123646A1 (en) * 2005-09-13 2007-05-31 Lele Bhalchandra S Protein-polymer conjugates and synthesis thereof
EP1776963A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-25 Gbf-Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh Hexosylceramides as adjuvants and their uses in pharmaceutical compositions
HRP20110404T1 (hr) * 2005-11-08 2011-08-31 Ambrx Ubrzivači za modifikaciju ne-prirodnih aminokiselina i polipeptida ne-prirodnih aminokiselina
US20090018029A1 (en) 2005-11-16 2009-01-15 Ambrx, Inc. Methods and Compositions Comprising Non-Natural Amino Acids
ES2529065T3 (es) * 2005-12-14 2015-02-16 Ambrx, Inc. Composiciones que contienen, procedimientos que implican y usos de aminoácidos no naturales y polipéptidos
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8334257B2 (en) 2005-12-20 2012-12-18 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
EP1985303B1 (en) 2006-01-12 2012-11-21 Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co., Ltd. Oral composition containing Interferon-alpha
TW200738752A (en) 2006-01-31 2007-10-16 Bayer Schering Pharma Ag Modulation of MDL-1 activity for treatment of inflammatory disease
DE602007008627D1 (de) * 2006-02-14 2010-10-07 Genetix Ltd Zellkulturmedium
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
EP2010222A1 (en) * 2006-03-31 2009-01-07 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
UA100666C2 (uk) 2006-04-11 2013-01-25 Новартіс Аг Інгібітори нсv/віл та їх застосування
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
KR20090013816A (ko) 2006-05-24 2009-02-05 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ⅸ 유사체
EP1897557A1 (en) 2006-09-07 2008-03-12 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Use of glycolipids as adjuvants
DK2064333T3 (da) * 2006-09-08 2014-05-05 Ambrx Inc Suppressor-trna-transkription i hvirveldyrceller
DK2615108T3 (en) 2006-09-08 2017-01-30 Ambrx Inc Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their applications
PT2061878E (pt) * 2006-09-08 2014-04-22 Ambrx Inc Supressor híbrido arnt para células de vertebrados
PL2068909T3 (pl) 2007-03-30 2012-09-28 Ambrx Inc Modyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowanie
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
EP2076533B1 (en) 2007-05-02 2014-10-08 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
BRPI0818004B8 (pt) 2007-10-16 2021-05-25 Biocon Ltd composição farmacêutica sólida administrável por via oral e o processo da mesma.
US8946148B2 (en) 2007-11-20 2015-02-03 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
US9938333B2 (en) 2008-02-08 2018-04-10 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
TW200946541A (en) * 2008-03-27 2009-11-16 Idenix Pharmaceuticals Inc Solid forms of an anti-HIV phosphoindole compound
TWI541020B (zh) 2008-04-17 2016-07-11 巴克斯歐塔公司 生物活性胜肽
US8173621B2 (en) 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
EP3412300A1 (en) 2008-06-27 2018-12-12 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
PL2318029T3 (pl) 2008-07-23 2018-03-30 Elanco Us Inc. Zmodyfikowane polipeptydy bydlęcego G-CSF i ich zastosowania
CN101671390B (zh) * 2008-09-10 2012-10-03 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途
US8278418B2 (en) 2008-09-26 2012-10-02 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
CA2738033C (en) 2008-09-26 2019-11-26 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
CA2748057C (en) 2008-12-23 2018-07-03 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidates
US8551973B2 (en) 2008-12-23 2013-10-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside analogs
EP2376515A1 (en) 2008-12-23 2011-10-19 Pharmasset, Inc. Synthesis of purine nucleosides
US8512690B2 (en) 2009-04-10 2013-08-20 Novartis Ag Derivatised proline containing peptide compounds as protease inhibitors
US20110182850A1 (en) 2009-04-10 2011-07-28 Trixi Brandl Organic compounds and their uses
CN101870728A (zh) 2009-04-23 2010-10-27 派格生物医药(苏州)有限公司 新型Exendin变体及其缀合物
US8618076B2 (en) 2009-05-20 2013-12-31 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
TWI598358B (zh) 2009-05-20 2017-09-11 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
ES2602629T3 (es) * 2009-06-04 2017-02-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Compuestos y métodos para tratar trastornos de los huesos y controlar el peso
US20110097302A1 (en) * 2009-07-16 2011-04-28 Ta Tung Yuan Il-1ra-polymer conjugates
US20110027229A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Medtronic, Inc. Continuous subcutaneous administration of interferon-alpha to hepatitis c infected patients
WO2011020091A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Modified vasoactive intestinal peptides
US8475652B2 (en) 2009-10-19 2013-07-02 Jan A. K. Paul Method for purification of uncatalyzed natural fuels from metal ions by means of at least one hemeprotein and use of the at least on hemeprotein
PH12012500827A1 (en) 2009-10-30 2013-01-07 Boehringer Ingelheim Int Dosage regimens for hcv combination therapy comprising bi201335, interferon alpha and ribavirin
US20120283172A1 (en) 2009-12-21 2012-11-08 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
BR112012015461A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-10 Ambrx Inc polipeptídeos de somatotropina boviina modificados e seus usos
AU2011222883B2 (en) 2010-03-05 2016-05-26 Omeros Corporation Chimeric inhibitor molecules of complement activation
PL3290428T3 (pl) 2010-03-31 2022-02-07 Gilead Pharmasset Llc Tabletka zawierająca krystaliczny (S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihydropirymidyn-1(2H)-ylo)-4-fluoro-3-hydroksy-4-metylotetrahydrofuran-2-ylo)metoksy)(fenoksy)fosforylo)amino)propanian izopropylu
CL2011000718A1 (es) 2010-03-31 2012-04-09 Gilead Pharmasset Llc Proceso para la preparacion de compuestos fosforados enantiomericos.
WO2011143274A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Perseid Therapeutics Polypeptide inhibitors of vla4
AU2011268498A1 (en) 2010-06-24 2013-01-31 Genoscience Pharma Sas Treatment of hepatitis C virus related diseases using hydroxychloroquine or a combination of hydroxychloroquine and an anti-viral agent
EP3572091B1 (en) 2010-08-17 2023-12-13 Ambrx, Inc. Modified relaxin polypeptides and their uses
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
RU2013114783A (ru) 2010-09-03 2014-10-10 Академиа Синика Anti-с-мет антитела и способы их применения
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
KR20140035305A (ko) 2010-10-05 2014-03-21 노파르티스 아게 C형 간염 바이러스 감염의 새로운 치료법
AU2011311880B2 (en) 2010-10-08 2014-07-24 Novartis Ag Vitamin E formulations of sulfamide NS3 inhibitors
HRP20210642T1 (hr) 2010-11-12 2021-05-28 Nektar Therapeutics Konjugati il-2 ostatka i polimera
PT3042910T (pt) 2010-11-30 2019-04-16 Gilead Pharmasset Llc 2'-espiro-nucleósidos para utilização na terapia da hepatite c
CN105381450A (zh) 2010-11-30 2016-03-09 诺华有限公司 丙型肝炎病毒感染的新疗法
US8440309B2 (en) 2011-01-31 2013-05-14 Confluent Surgical, Inc. Crosslinked polymers with the crosslinker as therapeutic for sustained release
CN105749246A (zh) 2011-03-31 2016-07-13 诺华股份有限公司 治疗丙肝病毒感染的阿拉泊韦
RS53911B1 (sr) 2011-04-01 2015-08-31 Novartis Ag Tretman u infekciji virusom hepatitis b zasebno ili u kombinaciji sa hepatitis delta virusom i bolesti jetre koje ih prate
KR20140011379A (ko) 2011-04-13 2014-01-28 노파르티스 아게 알리스포리비르를 사용하는 c형 간염 바이러스 감염의 치료
EP2717902B1 (en) 2011-06-06 2018-01-24 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
ES2724778T3 (es) 2011-06-10 2019-09-16 Bioverativ Therapeutics Inc Compuestos procoagulantes y procedimientos de uso de los mismos
RU2014103288A (ru) 2011-07-01 2015-08-10 Байер Интеллектчуал Проперти Гмбх Слитые полипептиды релаксина и их применение
JP2014528947A (ja) 2011-09-27 2014-10-30 ノバルティス アーゲー Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療のためのアリスポリビル
US8767214B2 (en) 2011-10-06 2014-07-01 Nordson Corporation Powder flow detection
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
WO2013137869A1 (en) 2012-03-14 2013-09-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for treating hcv infection in an hcv-hiv coinfected patient population
WO2013143581A1 (en) 2012-03-28 2013-10-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for treating hcv infection in specific patient subgenotype sub-population
CN104379171A (zh) * 2012-04-25 2015-02-25 第一三共株式会社 骨修复促进剂
ES2718478T3 (es) 2012-06-08 2019-07-02 Sutro Biopharma Inc Anticuerpos que comprenden restos de aminoácidos no naturales de localización específica, métodos para su preparación y métodos para su uso
DK2863955T3 (en) 2012-06-26 2017-01-23 Sutro Biopharma Inc MODIFIED FC PROTEINS, INCLUDING LOCATION-SPECIFIC NON-NATURAL AMINO ACID RESIDUES, CONJUGATES THEREOF, METHODS OF PRODUCING ITS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
WO2014014821A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Redwood Biosciences, Inc. Antibody specific for cd22 and methods of use thereof
SI2885010T1 (sl) 2012-08-16 2020-07-31 Ipierian, Inc. Metode zdravljenja tauopatije
SG11201501464TA (en) 2012-08-31 2015-03-30 Sutro Biopharma Inc Modified amino acids comprising an azido group
CN104870475B (zh) 2012-10-25 2019-11-08 美国比奥维拉迪维股份有限公司 抗补体C1s抗体和其用途
CA2889197A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 True North Therapeutics, Inc. Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
EP2922870B1 (en) 2012-11-21 2019-08-07 The Governors of the University of Alberta Immunomodulatory peptides and methods of use thereof
US20140205566A1 (en) 2012-11-30 2014-07-24 Novartis Ag Cyclic nucleuoside derivatives and uses thereof
EA039554B1 (ru) 2013-06-10 2022-02-09 АйПИЕРИАН, ИНК. Способ снижения уровней a40 и/или a42 в нервной клетке и/или во внеклеточной жидкости
US9764039B2 (en) 2013-07-10 2017-09-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
EP3650014B1 (en) 2013-08-27 2021-10-06 Gilead Pharmasset LLC Combination formulation of two antiviral compounds
WO2015054658A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
WO2015081085A2 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
US11052132B2 (en) 2014-05-08 2021-07-06 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cystic fibrosis
EP3782652A1 (en) 2014-08-19 2021-02-24 Biogen MA Inc. Pegylation method
CN107108710B (zh) 2014-10-24 2022-02-15 百时美施贵宝公司 修饰的fgf-21多肽及其用途
CA2976038A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating muscle disease and disorders
RU2021133819A (ru) 2015-09-02 2021-12-10 Иммутеп С.A.С. Анти-lag-3 антитела
JP7407511B2 (ja) 2015-10-08 2024-01-04 ネクター セラピューティクス ＩＬ－２Ｒβ選択的作動薬と長時間作用型ＩＬ－１５作動薬との併用
MX377531B (es) 2015-11-03 2025-03-10 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de un inhibidor del ensamble de la cápside del hbv y un interferón.
US10934347B2 (en) 2016-04-04 2021-03-02 Genzyme Corporation Anti-complement factor BB antibodies and uses thereof
WO2018087345A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 F. Hoffmann-La Roche Ag COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON
PE20191716A1 (es) 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos
TW202426655A (zh) 2017-07-11 2024-07-01 美商新索思股份有限公司 非天然核苷酸之導入及其方法
MA49767A (fr) 2017-08-03 2021-05-26 Synthorx Inc Conjugués de cytokine pour le traitement de maladies auto-immunes
DK3849614T3 (da) 2018-09-11 2024-02-26 Ambrx Inc Interleukin-2-polypeptidkonjugater og anvendelser deraf
WO2020082057A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
CA3127689A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Synthorx, Inc. Il-2 conjugates and methods of use thereof
AU2020223031B2 (en) 2019-02-12 2024-08-29 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods and uses of antibody-TLR agonist conjugates
MX2022011163A (es) 2020-03-11 2022-10-18 Ambrx Inc Conjugados de polipeptidos de interleucina-2 y sus usos.
AU2021327396A1 (en) 2020-08-20 2023-03-23 Ambrx, Inc. Antibody-TLR agonist conjugates, methods and uses thereof
EP4313163A1 (en) 2021-04-03 2024-02-07 Ambrx, Inc. Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
CN119431229A (zh) * 2023-08-04 2025-02-14 华为技术有限公司 缩合剂及其在制备异硫氰酸酯中的用途
WO2026043823A2 (en) 2024-08-19 2026-02-26 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of preparation and uses thereof

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE337223B (cs) * 1967-05-23 1971-08-02 Pharmacia Ab
US3619371A (en) * 1967-07-03 1971-11-09 Nat Res Dev Production of a polymeric matrix having a biologically active substance bound thereto
SE343210B (cs) * 1967-12-20 1972-03-06 Pharmacia Ab
DK132327A (cs) * 1968-07-16
BE758425A (fr) * 1969-12-02 1971-04-16 Baxter Laboratories Inc Streptokinase liee chimiquement a une matrice en carbohydrate (
DE2247163A1 (de) * 1972-09-26 1974-03-28 Merck Patent Gmbh Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4100271A (en) * 1976-02-26 1978-07-11 Cooper Laboratories, Inc. Clear, water-miscible, liquid pharmaceutical vehicles and compositions which gel at body temperature for drug delivery to mucous membranes
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
US4094744A (en) * 1976-11-18 1978-06-13 W. R. Grace & Co. Water-dispersible protein/polyurethane reaction product
US4275000A (en) * 1977-08-22 1981-06-23 National Research Development Corporation Peptide macromolecular complexes
JPS55110105A (en) * 1979-02-19 1980-08-25 Japan Atom Energy Res Inst Preparation of polymer composition containing physiologically active material
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
JPS5896785A (ja) * 1981-12-04 1983-06-08 Stanley Electric Co Ltd 発光ダイオ−ドの合成樹脂レンズ成形方法
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4486344A (en) * 1983-03-28 1984-12-04 Miles Laboratories, Inc. Urea-linked immunogens, antibodies, and preparative method
JPS6098988A (ja) * 1983-11-01 1985-06-01 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｌｐｆ−ｈａの精製法
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0154316B1 (en) * 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4847079A (en) * 1985-07-29 1989-07-11 Schering Corporation Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal
US5102872A (en) * 1985-09-20 1992-04-07 Cetus Corporation Controlled-release formulations of interleukin-2
US4818769A (en) * 1985-09-20 1989-04-04 Cetus Corporation Method of controlling stress-related disease in livestock by administration of human IL-2
US5100664A (en) * 1985-09-20 1992-03-31 Cetus Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US5034514A (en) * 1986-03-17 1991-07-23 Cetus Corporation Novel cross-linking agents
US4797491A (en) * 1986-03-17 1989-01-10 Cetus Corporation Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane
JPH0443882Y2 (cs) * 1986-06-23 1992-10-16
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4810638A (en) * 1986-07-24 1989-03-07 Miles Inc. Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US4851220A (en) * 1986-11-26 1989-07-25 Schering Corporation Stable oleaginous gel
US4871538A (en) * 1987-07-13 1989-10-03 Schering Corporation Insoluble copper-alpha interferon complex
AU611932B2 (en) * 1987-08-21 1991-06-27 Wellcome Foundation Limited, The Novel complex
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5214131A (en) * 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
AU4660789A (en) * 1988-11-23 1990-06-12 Genentech Inc. Polypeptide derivatives
US5089261A (en) * 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US4902502A (en) * 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
WO1990013540A1 (en) * 1989-04-19 1990-11-15 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5234903A (en) * 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
JP3187044B2 (ja) * 1989-12-01 2001-07-11 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト ヒルジン突然変異蛋白質及びヒルジンポリアルキレングリコール複合体
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
AU657311B2 (en) 1995-03-09
ES2128329T3 (es) 1999-05-16
US5747646A (en) 1998-05-05
EP0510356B1 (en) 1999-01-27
ZW4392A1 (en) 1992-09-23
CN1038035C (zh) 1998-04-15
FI921267A0 (fi) 1992-03-24
NZ248022A (en) 1993-12-23
OA09760A (fr) 1993-11-30
US5559213A (en) 1996-09-24
US5834594A (en) 1998-11-10
HU211945A9 (en) 1996-01-29
FI107927B (fi) 2001-10-31
GR3030049T3 (en) 1999-07-30
US5595732A (en) 1997-01-21
EP0510356A1 (en) 1992-10-28
HUT60512A (en) 1992-09-28
MW1892A1 (en) 1994-01-12
US5539063A (en) 1996-07-23
AU7761594A (en) 1995-01-12
MY131095A (en) 2007-07-31
US5849860A (en) 1998-12-15
IE920936A1 (en) 1992-10-07
EE9400356A (et) 1996-04-15
JPH05117300A (ja) 1993-05-14
CA2063886C (en) 2002-08-20
DE69228269T2 (de) 1999-07-08
IS3824A (is) 1992-09-26
AU671045B2 (en) 1996-08-08
BG60800B2 (bg) 1996-03-29
CN1175465A (zh) 1998-03-11
CA2063886A1 (en) 1992-09-26
SI9210294A (en) 1995-10-31
MX9201298A (es) 1992-10-01
CY2169B1 (en) 2002-08-23
FI20011554L (fi) 2001-07-17
NZ242084A (en) 1993-12-23
DK0510356T3 (da) 1999-09-13
CN1065465A (zh) 1992-10-21
ZA922110B (en) 1992-11-25
IL101348A0 (en) 1992-11-15
JP2637010B2 (ja) 1997-08-06
AU1316092A (en) 1992-10-01
RO109543B1 (ro) 1995-03-30
KR920018079A (ko) 1992-10-21
NO921142L (no) 1992-09-28
HU9200955D0 (en) 1992-05-28
US5792834A (en) 1998-08-11
ATE176159T1 (de) 1999-02-15
FI20011554A7 (fi) 2001-07-17
CN1108814C (zh) 2003-05-21
BR9201015A (pt) 1992-11-24
NO921142D0 (no) 1992-03-24
FI921267L (fi) 1992-09-26
DE69228269D1 (de) 1999-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS87192A3 (en) Novel polyethylene glycol (peg)conjugates of proteins
KR100295520B1 (ko) 피이지(peg)-인터페론결합체
CA1163198A (en) Antitumor protein hybrid and process for the preparation thereof
RU2318004C2 (ru) Добавки в виде полиалкиленгликолевой кислоты
CZ292775B6 (cs) Fyziologicky aktivní konjugát polyethylenglykol-interferon alfa, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje
CZ298579B6 (cs) Konjugát polyolu a interferonu-beta
JP2002538079A (ja) 代謝、増殖、分化およびアポトーシスを調節する、安定化されたジスルフィド結合を有するヘキサペプチドおよびその誘導体
CZ256482A3 (en) Medicaments suitable particularly for treating melanoma and process for preparing thereof
EA009783B1 (ru) Полиалкиленгликоль с остатком для конъюгации биологически активного соединения
JP2005514505A (ja) マルチアーム樹枝状および機能的なｐｅｇの調製法および用途
JPS6016924A (ja) 抗腫瘍剤
CN111205350A (zh) 作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的大环硫代酸酯前体药物
JP7734891B2 (ja) 新規な構造を有するポリペプチド薬物複合体及びその使用
JPH01259001A (ja) 活性ジスルフイド基含有共重合体
CN1966547B (zh) 双链结构的聚乙二醇衍生物的制备及其与药物分子的结合
JPH01257479A (ja) スーパーオキシドジスムターゼ誘導体およびその製造方法
JPWO1992000971A1 (ja) 水溶性ビスージオキソピペラジン誘導体