CZ108599A3

CZ108599A3 - Peptid, který je fragmentem C-peptidu lidského inzulinu

Info

Publication number: CZ108599A3
Application number: CZ991085A
Authority: CZ
Inventors: John Wahren; Bo-Lennart Johansson; Hans JÖRNVALL
Original assignee: Creative Peptides Sweden Ab
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 1999-08-11
Also published as: US6610649B2; AU4391597A; WO1998013384A1; EP0938503A1; NZ335231A; SK39499A3; ATE347562T1; NO991483D0; US20020107175A1; SE9603533D0; DK0938503T3; BG103362A; JP2001500893A; TR199900694T2; RU2206336C2; SE520392C2; KR20000048643A; BR9711573A; NO991483L; IS5008A

Description

Peptid, který je fragmentem C-peptidu lidského Inzulínu, obsahuje sekvenci ELGGGPGAG /SEQ ID NO: 2/, nebo fragment peptidu charakterizovaného sekvencí SEQ ID NO: 2, nebo obsahuje sekvenci EGSLQ /SEQ ID NO: 3/, nebo fragment peptidu charakterizovaného sekvencí SEQ ID NO: 3, a má schopnost stumulovat aktivitu Na⁺K⁺ATPázy.

«« ···· »» *· ♦ · · ’ Μ »«* ♦ · * • · · · * . ...Μ.....* ·· ··

Peptid, který je fragmentem C-peptidu lidského inzulínu.

Oblast techniky

Vynález se týká fragmentů C-peptidu inzulínu a jejich použití při léčbě diabetes a diabetických komplikací.

Dosavadní stav techniky

I _Pacienti, s diabetes mellitus závislí na inzulínu (IDDM),

I což je obecné synonymum pro diabetes typ I, nemohou přežít bez terapie ’inzulínem. IDDM je klasická, život ohrožující forma diabetes. Převrat v léčbě IDDM nastal objevením inzulínu v roce 1922. -Četnost výskytu IDDM v Evropě, Severní Americe a v Japonsku je 0,25 až 0,4 % populace. Tato hodnota kolísá v závislosti na,období roku, kdy více pacientů se objevuje na podzim a v zimě.' Mezi pacienty je o trochu více mužů, ale tento rozdíl’ není tak markantní se vzrůstajícím stářím pacientů.

Klasické symptomy IDDM v akutní fázi jsou tři: velké objemy moče, ztráta hmotnosti a únava. Méně častými a minoritními symptomy jsou křeče svalů, infekce kůže a neostré vidění. V časném stádiu nemoci se vyskytuje nevolnost a zvracení a hrozí ketoacidóza a koma. Doba výskytu symptomů je krátká obvykle 2 až 3 týdny nebo méně. Pacienti vykazují v krvi a v moči vysokou koncentraci glukózy a ketonu, zatímco množství inzulínu je malé nebo nelze detekovat.

Etiologie IDDM zahrnuje více faktorů. Nejpravděpodobněji zahrnuje genetické predispozice autoimunní reaktivity, kdy impuls spuštění přichází z prostředí, možná virovou infekcí. Dochází k částečné nebo celkové destrukci pankreatických beta buněk. K destrukci beta buněk může docházet během 6 áž 12 měsíců před objevením příznaků. Dominantním patofyziologickým rysem akutní fáze IDDM je nedostatečnost inzulínu.

i

0» |»«4 00 ·»

0 0 0 0 0 0009 0 00 0

Σ t · t 0 00 000*00 • · · · · · * lil ··· ·· ··· ·· ··

Když se začne s léčbou inzulínem, u řady lze pacientů řídit obsah glukózy v krvi pouze malými dávkami inzulínu. To se děje v časné fázi onemocnění, která může trvat několik měsíců až jeden rok a která pravděpodobně reflektuje na částečnou obnovu funkce beta buněk. To je však dočasné stádium a progresivní autoimunní destrukce beta buněk vede k rozsáhlejší aplikace exogenního inzulínu.

Krátkodobé účinky hypoinzulinémie v akutní fázi IDDM se mohou dobře řídit aplikací inzulínu. Při dlouhotrvajícím onemocnění IDDM dochází k vážným komplikacím. Ty zahrnuji specifické problémy diabetes, jako je nefropatie, retinopatie a neuropatie. Tyto stavy se často zmiňují jako mikrovaskulární komplikace, dokonce dochází i k mikrovaskulárním změnám. Může se objevit arterosklerotické onemocnění velkých arterií zvláště koronárních arterií a arterií spodních končetin.

Nefropatie vzniká u přibližně 35 % pacientů s IDDM^:, zvláště u pacientů mužského pohlaví a u těch, kteří onemocněli před 15. rokem života. Diabetická nefropatie se charakterizuje vedle poškození glomerulálních kapilár trvalou albuminurií, progresivním snížením rychlosti glomerulární filtrace a eventuálně v konečném stádiu může dojít k selhání ledvin.

Výskyt diabetické retinopatie je nejvyšší u pacientů, kteří onemocněli IDDM v mládí a vzrůstá s trváním onemocnění. Proliferativní retinopatie se obecně vyskytuje u 25 % pacientů, jejichž onemocnění trvá 15 let, a u 50 % pacientů, jejichž onemocnění trvá 20 let. Nejčasnější léze diabetické retinopatie se objevují na kapilární, základní membráně, pak dochází k dilataci kapilár a tvoří se mikroaneurysmus. Následně se objevují okluze retinálních cév, což vede k hyperfúzi částí sítnice, otoku, krvácení a tvorbě nových cév a ke ztrátě vidění.

Diabetická neuropatie zahrnuje různé porušení somatických a autonomních nervových funkcí. Smyslová neuropatie může způsobit progresivní ztrátu smyslového vnímání nebo v jiném případě nepříjemné vnímání, často bolest v končetinách a chodidlech. Motorická neuropatie je obvykle doprovázena poškozením svalů a jejich oslabením. Biopsíe nervů obecně vykazují axonální degeneraci, demyelinaci a abnormality vasa nervorum. Neurofyziologické studie indikují redukované rychlosti motorické a smyslové nervové kondukce. Autonomní neuropatií trpí 40 % pacientů, u nichž IDDM trvá více než 15 let. Projevuje se poruchami termoregulece, impotencí a dysfunkcí močového měchýře, pak následují kardiovaskulární reflexní abnormality.- Pozdější projevy zahrnují poruchy pocení, posturální hypotenze, gastrointestinální problémy a redukované uvědomování si hypoglykémie. Pozdější symptomy mají vážné klinické důsledky.

S ohledem na možný mechanizmus(mechanizmy), který se podílí na patogenezi různých diabetických komplikací, se vyslovilo několik teorií (Biochemical Basis of Microvascular Disease, C.J. Mullarkey and M. Brownl.ee, p 534-545, in Textbook of Diabetes, Volume 2, editOrs J. Pickup and G. Williams. Blackwell, Oxford 1991). Důležité mohou být metabolické faktory a současné studie ukazují, že správné řízení metabolizmu podstatně redukuje výskyt komplikací všech typů ( The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus, DCCT group. N. ,Engl. J. Med. 1993; 329; 977-983).

Nicméně po 7 až 10 letech správného řízení metabolizmu 15 až 25 % pacientů vykazují známky benigní nefropatie, 10 až 25 % má symptomy retinopatie a 15 až 20 % pacientů vykazuje zpomalenou rychlost nervové kondukce, která indikuje neuropatií. S dobou trvání onemocnění dále roste četnost výskytu komplikací.

C-peptid je část molekuly pro-inzulinu, který je prekurzorem inzulínu tvořeného v beta buňkách pankreasu.

• · · · · · * , 9 A · · * · · * · i A · · a ···»·· • · · · » · · »« ·«* ·· ·«« ·· ·♦

Lidský C-peptid obsahuje 31 aminokyselin a má následující sekvenci:

EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ (SEQ ID NO: 1) . V EP 132 769 se naznačuje, že C-peptid se může použít při léčbě diabetes a v SE 460334 se popisuje, že inzulín v kombinaci s C-peptidem se může aplikovat při léčbě diabetes a při prevenci diabetických komplikací.

V současné době je zřejmé, že diabetes typu 1 je doprovázen v několika tkáních trvale.redukovanou aktivitou ~ — Wr—irw .11 —I | I , -— ! _______ enzymu Na⁺K⁺ATPázy. Jde o tkáně renálních glomerulí, sítnice, .. ””periferních nervů, -srdce a skeletového svalstva (K. Kjeldsen,

H. Brandgaard, P. Sidenius, j. Stenfatt Larsen and A.

Nergaard. Diabetes decreases Na⁺K⁺ pump concentration in skeletal muscles,· heart ventricular muscle, and peripheral nerveš of rat, Diabetes 1987; 36: 842-848; L.C. MacGregor and F.M. Matschinsky·. Experimental diabetes .impaírs the function of the retinal pigmented epithelium. Metab Clin Exp .1986; 35: suppl 1, 28-34; D.A. Greene and S.A. Lattimer. Impaired rat sciatic nerve sodium potassium adenosine triphosphataše in acute streptozocin diabetes and its correction by dietary myoinositol supplementation. J. Clin, Invest. 1983; 72: 10581063) . Na⁺K⁺ATPáza je enzym, který se nachází v buněčné membráně a generuje energii pro transcelulární transport iontů Na⁺ a K⁺, všech spolutransportovaných nebo kontratransportovaných substrátů ve všech savčích buňkách. Je tedy zřejmé, že aktivita uvedeného enzymu je základ pro normální funkci buňky. Deficitní aktivita enzymu Na⁺K⁺ATPázy v nervové tkáni, glomerulích a v sítnici je pravděpodobně důležitý kontribuční faktor patogeneze diabetické neuropatie, nefropatie a retinopatie. Aktivita enzymu Na⁺K⁺ATPázy se reguluje prostřednictvím koncentrace iontu Na⁺ a působením hormonů; enzymovou aktivitu stimuluje (hormon štítné žlázy, noradrenalin, angiotensin, neuropeptid Y, inzulín) nebo inhibuje (dopamin, ANF) řada enzymů (T. Clausen and M.E.

« · 9 · * · · 9 · • > a a«· · · « · * · · · · · ·♦· ·♦» • · · · · · · •99 9·· ·· ·*· ·* ··

Everts. Regulatíonof the Na, K-pump in skeletal muscle. Kidney International 1989; 35: 1-13). Navzdory tomu, že léčba inzulínem je dostatečná pro dosažení dobré kontroly cukru v krvi, pacienti s diabetes typu 1 vykazují dlouhodobou nedostatečnou aktivitu enzymu Na⁺K⁺ATPázy.

Podstata vynálezu

Vynález je založen na objevu skupiny peptidů ze střední ^Jl” . .....)..... ...

oblasti a s C-terminační oblasti moIekuIy^C-pěpťřdug—která—se--—,charakterizuje schopností stimulovat aktivitu enzymu Na⁺K⁺ATPázy. Všechny tyto peptidy jsou malé fragmenty molekuly C-peptidu. C-peptid samotný je schopný stimulovat enzym Na^hK⁺ATPázu prostřednictvím aktivace G-proteinu, zvýšením koncentrace intracelulárního Ca²⁺ a aktivací proteinové fosfatázy 2B (Y. Ohtomo, A. Aperia, B.L. Johansson and J,

Wahren. C-peptide stimulates renal Na⁺K⁺ATPase activity in synergism with neuropeptide Y. Diabetologia 1996; 39: 199205) . stimulační účinek menších peptidů na aktivitu enzymu Na⁺K⁺ATPázy je podobný nebo větší než stimulační účinek samotného C-peptidu. Existují in vitro a in vivo důkazy indikující, že aplikace jednoho z těchto enzymů spolu s regulární léčbou inzulínem zlepšují funkci sítnice, čímž se překonají známky časného stádia retinopatie, a zlepší také funkce somatických a autonomních nervů. Léčba těmito specifickými peptidy v kombinaci s konvenční inzulínovou terapií se tak může použít pří prevenci nebo následném potlačení vývoje pozdních diabetických komplikací. Potencionální výhodou ve srovnání s C-peptidem je, že malé peptidy se mohou aplikovat orálně místo formou injekcí, jak je tomu v případě C-peptidu nebo inzulínu.

Vynález popisuje peptid, který je fragmentem C-peptidu lidského inzulínu. Uvedený C-peptid obsahuje sekvenci SEQ ID NO: 2) (zde se označuje jako peptid A) nebo jeho fragment nebo sekvenci EGSLQ (SEQ ID NO: 3) (zde označený jako peptid E) • Μ ··»· -«» ··* ···· • 9 » β β« 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 *9 ··«·** «»«99 · · ··· ··· ·· ··· ·· · nebo jeho fragment a má schopnost stimulovat aktivitu enzymu

Na⁺K⁺ATPázy.

V určitém provedení vynálezu se popisuje peptid, který zahrnuje sekvenci ELGGGPGAG (SEQ ID NO: 2) nebo EGSLQ (SEQ ID NO: 3), nebo jeho fragment.

Vynález' zvláště popisuje peptidy, které se mohou použít při . genové terapii a zvláště při boji s diabetes a diabetickými komplikacemi.

___Vynález, dále popisuje farmaceutickou kompozici obsahující peptid podle vynálezu nebo jeho fragment definovaný- shora . 'v~ťextu, ^!h spolu s alespoň jedním farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ekcipientem.

Vynález dále popisuje použití peptidů podle vynálezu nebo jeho fragmentu, jak se definuje shora v textu, při výrobě léčiva vhodného pro boj s diabetes nebo - s diabetickými komplikacemi.

Zde používaný termín „boj znamená jak léčbu tak profylaxi.

Vynález tak popisuje použití následujících peptidů, které jsou všechny fragmenty C-peptidu:

Peptid A (aminokyselinová sekvence ELGGGPGAG) (SEQ ID NO:

2) nebo jeho komponenty, například peptid B (aminokyselinová sekvence ELGGGP) (SEQ ID NO: 5) nebo peptid D (aminokyselinová sekvence GGPGA) (SEQ ID NO: 6). Navíc vynález zahrnuje peptid E (aminokyselinová sekvence EGSLQ) (SEQ ID NO: 3) a jeho části, například peptid F (aminokyselinová sekvence GSLQ) (SEQ ID NO: 7) . Všechny uvedené peptidy se používají při výrobě léčiva pro léčbu diabetes typu 1. Zjistilo se, že fragmenty podle vynálezu stimulují v různém rozsahu aktivitu enzymu Na⁺K⁺ATPázy, Studie, ve které se použily buňky renálního tubulu za podmínek in vitro, indikuje, že peptidy A-D stimulují aktivitu Na⁺K⁺ATPázy v rozsahu, který je srovnatelný se stimulací celou molekulou C-peptidu. Až 90 % účinku je dosaženo ve třech minutách. Peptidy E a F mají stimulační .0 »0 »·»· »

9* 0 0 · ····

0 0 09· · 9 0 · · · 9 * · ··· »#· • · · · · · »90 09* 90 000 ·· ·· účinek na aktivitu enzymu Na⁺K⁺AŤPáza renálních buněk, který je srovnatelný nebo vyšší než je stimulace, jenž vykazuje celá molekula. Kombinace peptidů A-D s peptidy E nebo F vedou ke stimulaci aktivity enzymu, která . je větší než stimulace dosažená samotným peptidem. Podrobněji se stimulační účinky shora uvedených peptidů popisují dále v textu v příkladu 1.

C-peptid se specificky váže na povrch několika typů buněk, za zmínku stojí buňky renálních tubulů a fibroblasty.. Jestliže se fluorescenčně značený C-peptid. inkubuje s buňkami, .naváže

~......^J......^;ΐ .............. · ^Lr· .......... ! ........' „I ,11,1 I, se na jejich povrch. Specifitu vazby dokazuje skutečnost, že pře-iňkubace s neznačeným C-peptidem brání navázání . fluorescenčně značeného C-peptidu. Na základě pre-inkubace s fragmenty podle vynálezu, zvláště pak s fragmenty Ě nebo F, se zjistilo, Že brání navázání fluorescenčně značeného Cpeptidu, což demonstruje, že se^r fragmenty váží specificky na .stejná vazebná místa na povrchu buňky jako samotný C-peptid. Detailnější příklad navázání fragmentu E se popisuje dále v textu v příkladu 28.

Jak se popisuje shora v textu, vynález nezahrnuje pouze peptidy obsahující sekvence peptidů . A a E, ale také jejich fragmenty. V případě nonapeptidu A délka takových fragmentů . může být 8 až 2 aminokyseliny. V případě pentapeptidu E délka takových fragmentů může být 4 až 2 aminokyseliny. Fragmenty B,

C a D {peptid A) a F (peptid E) se popisují shora v textu, ale, jsou zahrnuty i další fragmenty.

V případě peptidu A, jistá studie aktivity enzymu Na⁺K⁺ATPázy zkoumající schopnost peptidových fragmentů stimulovat aktivitu enzymu Na⁺K⁺ATPázy krysích renálních tubulových segmentů ukázala, že důležitou úlohu zastává jeden nebo více centrálních tri-glycinových zbytků a že preferované peptidové fragmenty, mezi něž se řadí i peptid A, obsahují alespoň jeden s výhodou dva z centrálních tri-glycinových zbytků. Shora uvedené peptidy B, C a D reprezentují peptidové fragmenty zahrnující sekvence GGGPGAG (SEQ ID NO: 8}, GGGPG • · * · · · · ♦ »·· · 9 9 9 • · ·« ····♦· ϊ · · · 9 9 9 »«···· ·· ··· ·· ·· (SEQ ID NO: 9), GGGP (SEQ ID NO: 10), GGP a GGPG (SEQ ID NO:

11) Dále se zjistilo, že peptidy obsahující nepřirozené Daminokyselinové izoméry mohou být také aktivní. Mezi ně například patří dipeptid D-LG nebo D,L-LG. Vynález dále popisuje nepřirozené izoméry například nativních Laminokyselinových C-peptidových sekvencí. Jestliže se účastní peptid A, věří se, že je důležitá přítomnost alespoň jednoho (D-peptid) nebo dvou (L-peptid) z centrálních ,tri-glycinových zbytků v peptídovém segmentu, který obsahuje 9 nebo méně

--aminokyselin. - V případě peptidu E mezi reprezentativní fragmenty nepatří pouze tetrapeptidy, peptid F, ale také SLQ a'LQ. Věří se, že důležitou úlohu má také C-terminální Q zbytek. Vynález dále zahrnuje nepřirozené izoméry nebo deriváty peptidů např. peptidy zahrnující D-aminokyseliny.

Vynález dále popisuje peptidy obsahující sekvence peptidů A a E. Vynález také zahrnuje peptidy, které vykazují A- a/nebo C-terminální extenze sekvencí peptidů A a C nebo lemující sekvence. Takové peptidy mohou zahrnovat přidané aminokyseliny, které mohou být buď ty nalézající se v odpovídající pozici v C-peptidu nativního lidského inzulínu nebo jde o jiné aminokyseliny (vylučující samozřejmě možnost rekonstituce celého C-peptidu inzulínu), Délka takových „rozšířených peptidů může kolísat, ale upřednostňuje se, aby peptidy podle vynálezu tvořilo ne více než 25 nebo 20 aminokyselin, zvláště se upřednostňuje ne více než 15 nebo 10 aminokyselin. Příklady peptidů zahrnují okta-, hepta- a hexapeptidy zahrnující sekvenci peptidu E, například LALEGSLQ (SEQ ID NO: 12), ALEGSLQ (SEQ ID NO: 13) a LEGSLQ (SEQ ID NO: 14) .

Peptidy podle vynálezu se mohou použít při léčbě diabetes a diabetických komplikací, za zmínku stojí diabetes typ 1 a komplikace, které mohou nastat při tomto onemocnění. Termín „diabetické komplikace zahrnuje všechny komplikace ,které

jsou spojovány s různými formami diabetes. Věří se, že peptidy jsou využitelné, jak se popisuje shora v textu, na základě

4

schopnosti stimulovat aktivitu enzymu Na⁺K⁺ATPázy. Dále vynález zahrnuje peptidy, které se využívají při výrobě léčiv pro využití při stimulaci aktivity enzymu Na⁺K⁺ATPázy.

Aktivita enzymu Na⁺K⁺ATPáza se může jednoduše testovat za použití metod známých v oboru, jak se popisuje v literatuře, a tak se může stanovit účinek peptidů při stimulaci aktivity enzymu—-NaÍKÍAT.Pázy_(popisuje se například v publikaci Y.

Ohtomo, A. Aperia, B.L. Johansson and J, Wahren. C-peptide stimulates renal Na⁺K⁺ATPasé activity in synergism with neuropeptide Y. Diabetologia 1996; 39: 199-205). Peptidy se tak mohou použít při výrobě léku určeného pro stimulaci aktivity enzymu Na⁺K⁺ATPázy, pro léčbu pacientů s diabetes typu 1 s retinopatií, pro léčbu pacientů s diabetes typu 1 s nefropatií, pro léčbu pacientů s diabetes typu 1 s neuropatíí a pro zpomalení ' vývoje komplikaci v pozdním stádiu diabetes. Léčivo může obsahovat 'inzulín. Vynález také popisuje způsob léčby nebo prevence shora uvedených indikací.

Peptidy podle vynálezu se mohou používat samostatně nebo v kombinaci a tak se může připravit farmaceutická kompozice nebo léčivo, které obsahuje jeden nebo více peptidů. Jak se uvádí shora v textu pozoroval 'se synergický vztah mezi peptidem A nebo peptidy založenými na peptidů A a peptidů E nebo od nich odvozených („skupina peptidů A) nebo peptidů založených na nebo odvozených z peptidů E („skupina peptidů E) . Synergistické kombinace peptidů ze skupinu peptidů A s peptidem ze skupiny peptidů E reprezentuje preferované provedení vynálezu.

Peptidy se také mohou použít v kombinaci nebo ve spojení s jinými činidly, které jsou účinné nebo aktivní při léčbě diabetes a/nebo komplikaci tohoto onemocnění. Mezi tyto činidla například patří inzulín. Při takové „kombinované terapii peptid(y) a druhé aktivní činidlo se může aplikovat ιό ·· · · ·· aě »» • » · · · · a # 999 9 9 « • · · · · ··· « » é » ·

999 99 · dohromady ve stejné kompozici nebo odděleně v oddělené kompozici, současně nebo sekvenčně.

Dále vynález popisuje produkt obsahující peptid podle vynálezu nebo jeho fragment, který, jak se definuje shora v textu, se kombinuje s dalším aktivním činidlem a vzniká kombinovaný přípravek pro současné, oddělené nebo sekvenční použití, který je účinný v boji proti diabetes nebo proti komplikacím tohoto onemocnění. Takovým dalším aktivním -činidl.em_-le_s_výhodou i žnul in.

z hodnoty 99,99% přijatelný v tom

V- případě uvedené kombinované terapii, kde se používá inzulín, se rozumí pod pojmem „inzulín všechny formy, typy a , deriváty inzulínu, které se mohou při' terapii použít. Je to například syntetická, modifikovaná nebo. zkrácená varianta sekvence aktivního lidského inzulínu.

Kompozice podle vynálezu se mohou aplikovat orálně nebo parenterálně podkožní, intramuskulární nebo 'intravenózní cestou. Kompozice podle vynálezu obsahují ' aktivní fragmenty/peptidy molekuly C-peptidu (například peptidy A-F), spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem a mohou být přítomny i další terapeutické ingredience, například, lidský inzulín. Celkové množství aktivních ingrediencí v kompozici kolísá % hmotnosti, Nosič musí být že je srovnatelný s dalšími komponenty kompozice a nepoškozuje příjemce.

Kompozice mohou vznikat způsoby a postupy, které jsou dobře známy v oboru a jsou dobře popsány v literatuře a mohou obsahovat libovolné známé nosiče, ředidla nebo ekcipienty. Tak například kompozice podle vynálezu, která je vhodná pro parenterální aplikaci s výhodou obsahuje sterilní vodné roztoky a/nebo suspenze farmaceuticky aktivních ' ingrediencí (například peptidy A-F), které vykazují s výhodou stejnou iontovou sílu jako krev recipienta. Obecně se používá chlorid sodný, glycerin, glukóza, manitol, sorbitol a podobně. Navíc kompozice mohou obsahovat libovolný počet adjuvans, jako jsou

4* — ·φ'· .1 na 0,01 smyslu, aa

I · · · « · ► * * * » · · · «·· ··· • * ·« ·· pufry, konzervační činidla, disperzní činidla, činidla, která podporují zahájení působení nebo prodlužují působení a podobně.

Kompozice podle vynálezu vhodná pro orální aplikaci mohou například obsahovat aktivní fragmenty/peptidy molekuly Cpeptidu (například peptidy A-F) ve formě sterilního čištěného prášku, který je obsažen v kapsulích, a tak se chrání před degradací (dekarboxylací nebo hydrolýzou) aktivními peptidy AT žaludků;—“Kaps ul-e—př-í—-tom—-umožňuj. i—_abs.orp.ci uvedených substancí tkání dásní nebo tenkého střeva. Kapsule mohou počet adjuvans, jako jsou pufry, činidla zpomalují nebo zrychlují což optimalizuje zpřístupnění obsahovat libovolný konzervační činidla, uvolňování aktivních látek, kompozic.

Navíc vynález popisuje nepeptidové sloučeniny, které vykazují stejné stimulační účinky jako' produkují jejich doplňky odvozené’ od C-peptidu. Takové napodobeniny peptidů nebo „malé molekuly schopné napodobovat aktivitu přirozeně se vyskytujících proteinů nebo peptidů jsou pravděpodobně vhodnější, vzhledem k jejich zvýšené chemické stabilitě, pro například orální aplikaci (T. Clakson and J. Wells. In vitro selection from protein and peptide libraries. Trends in Biotechnology 1995, 12: 173-184; H. Nakanishi, S. Ramurthy, A. Raktabutr, R. Shen and M. Eahn. Peptidomimetics of the immunoglobulin supergene family- a review. Gene 1993, 137: 5156) .

V oboru běžně dochází k nahrazení peptidu nebo aktivního činidla založeném na proteinu, například terapeutické peptidy, takovými napodobeninami peptidů, které vykazují funkčně ekvivalentní aktivitu. Existují různé molekulární knihovny a kombinační chemické postupy, které jsou schopny umožnit identifikaci, selekci a/nebo syntézu takových látek za použití standardních metod (T. Kieber-emons, R. Murali and M.I. Greene. Therapeutic peptides and peptidomimetics. Current

9

999 ·

9 www * 9 9 9

99« 9 9 · 9

99 999 99·

9 9 9 9

999 99 99

Opinion in Biotechnology 1997, 8: 435-441). Takové standardní metody se mohou použít za účelem získání peptidomimetických látek podle .vynálezu, jmenovitě peptidomimetických organických látek, které vykazují v podstatě podobnou nebo stejnou aktivaci enzymu Na⁺K⁺ATPáza a/nebo celulární vazebné charakteristiky jako peptidy podle vynálezu, jak se například popisuje dále v textu v příkladech.

Vynález dále popisuje biomimetickou organickou látku •z'a±o-ženou-na—penfei-dech^podl,e_v.vnál.ezu, která' 'vykazuje aktivaci enzymu Na⁺K⁺ATPáza a/nebo celulární vazby charakteristické pro

-«- >9^· · buňky renálního tubulu a fibroblasty alespoň na úrovni, která odpovídá peptidům nebo peptidovým fragmentům podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 zobrazuje chromatogram.preparativního čištění lidského C-peptidu se zpětnou fází, přičemž C-peptid je značený’ tetrametylrhodaminem. Kolona se eluovala gradientem 20 až 40 % acetonitrilu {acetonitril v 0,1 % kyselině trifluorooctové (TFA)) během 20 minut. Pík A odpovídá nezreagované frakci C-peptidu. Pík B a C odpovídá C-peptidu značeném tetrametylrhodaminem. Separace píku B a C odpovídá přítomnosti dvou izomérům tetrametylrhodaminu v aktivováním reakčním činidle. Pro další studium se použil materiál z píku C. Nepřerušovaná čára odpovídá absorbanci při 220 nm (peptid) a přerušovaná čára odpovídá absorbanci při 555 nm { tetrametylrhodamín).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Testoval se stimulační účinek peptidů A-F aktivity enzymu Na⁺K⁺ATPázy buněk krysího renálního tubulu. Mikrodisekcí se připravily jednoduché proximální stočené tubuly z krysích ledvin. Tubuly se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě

9t *«?9 « w, • 9 9 · 9 · ·

9 99 9 · 9» 9 * 9 9 9 · 99® 99»

9 9 9 9

99 999 «9 99 místnosti s peptidy A-F nebo s krysím C-peptidem 1. Aktivita enzymu Na⁺K⁺ATPázy se pak měřila tak, že se tubulus se vystavil hypotonickému šoku a inkuboval se po dobu 15 minut v médiu, které obsahuje ³²P-ATP v přítomnosti nebo bez přítomnosti ouabainu.

Stimulační aktivita krysího C-peptidu 1 v koncentraci 510^Ί se stanovila 100 %. V případě stejné koncentrace peptidů A-F se získaly následující relativní aktivity:

Pepltid^-A -8-8-+-/-—3-%—-__!___

Peptid B 36 +/- 2 %

- rf.. · 4Peptid C 46 +/- 3 % *

Peptid D 65 +/- 4 %

Peptid E 110 +/- 3 %

Peptid F 96 +/- 2 %

Peptid B + C 86 +/- 3 %

Příklad určitých farmaceutických kompozic .podle vynálezu_;se popisuje v přikladu dále v textu.

Příklad 2:

Lidský inzulín : samotný peptid A nebo ekvimolární směs peptidů B, C, D, E a F (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek samotný peptid A - 16,8 mg M-kreosol - 25 mg Glycerol - 160 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu 7,0 až 7,8 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10 % hydroxidem sodným nebo kombinace s

Peptid A - 16,8 mg • · ·«· ·*·

OO *««* • · ‘ · · · · • . ♦ · ·« « w * v • · · · • · · · ««« ··· •

Φ· ··

Peptid Β - 8,8 mg Peptid C - 13, 6 mg Peptid D - 10 mg Peptid E - 12,4 mg Peptid F- 9,2 mg M-kresol - 25 mg Glycerol - 160 mg ”——Objem—kompoz-i-ee^se-up-raví~na_1.0,ml_a- konečné pH na hodnotu 7,0 - 7,8 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10' % hydroxidem sodným.

Příklad 3:

Lidský inzulín: peptid B (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě.10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid B - 8,8 mg M-kreosol - 25 mg Glycerol -160 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu 7,0 az 7,8 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10 % hydroxidem sodným.

Příklad 4:

Lidský inzulín : peptid C (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Pří přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid C - 13,6 mg M-kreosol - 25 mg Glycerol - 160 mg * 00 »·00 V« • 0 000 0' 0 ^f 0 0

00 0 ·'· 000 0

0 0 0 0 • 00 000 00 0·· 00 0

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu 7,0 až 7,8 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10 % hydroxidem sodným.

Příklad 5:

Lidský inzulin : peptid D (1:5 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal ......ríďs-ký^inzuli-n— (-2'8--^-e dno-t ek--v-ml111.it ruj^^l_0-0_0-1jednotek peptid D - 10,0 mg

M-kreosol - 25 mg

Glycerol - 160 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu 7,0 až 7,8 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 1,0 % hydroxidem sodným.

Příklad 6:

Lidský inzulin : peptid E' (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulin (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid E - 12,4 mg M-kreosol - 25 mg Glycerol - 160 mg

Příklad 7:

Lidský inzulin : peptid E (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal

Φφ v»·»· ww »» • · ·ΐ · · ·

ΦΦΦΦ. φ φ « Φ

Φ Φ Φ ΦΦΦ ΦΦ·

Φ Φ » Φ « •Φ ΦΦΦ ΦΦ · Φ φ * • φ • · ··· φφφ lidský inzulín (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid F - 9,2 mg M-kreosol - 25 mg Glycerol - 160 mg

Příklad 8:

Lidský inzulín ‘ : samotný peptid·'A nebo ekvimolární směs s fragmenty B, C, D, E a F (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml) .

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín (28 jednotek v mililitru) - 1 0.00 .jednotek peptid A - 4, 2 mg M-kreosol - 25 mg'

Glycerol - 160 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu 7,0 až 7,8 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 1.0 % hydroxidem sodným nebo kombinace s

Peptid A - 4,2 mg

Peptid.B - 2,2 mg '

Peptid C - 3,4 mg

Peptid D - 2,5 mg

Peptid E - 3,1 mg

Peptid F- 2,3 mg

M-kresol - 25 mg

Glycerol - 160 mg

A A AA ··«» A* A·

A « AA A A* AAA· « A f A aes A' A « A

A A A· · · · * A · A · # A A · A A «

AAAA** ♦ · ·♦* AA A A

Příklad 9:

Lidský inzulín : peptid B (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml) .

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal ^ridg~ký~i~nzu'lTn— t2-8-j-edno-te-k~v^-m-il,il,i_:tr.u.)_^ '1 .0.00, jednotek peptid B - 2,2 mg

M-kreosol - 25 mg **’

Glycerol - 160 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu 7,0 až 7,8 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10.

% hydroxidem sodným.

Příklad 10:

Lidský inzulín : peptid C (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml) .

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid C - 3,4 mg M-kreosol - 25 mg Glycerol - 160 mg

Příklad 11:

Lidský inzulín ; peptid D (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml) .

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal « · « · · u· ··· , _ · · * * ·»· tft« ·* ··· ·· ·« lidský inzulín (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid D - 2,5 mg M-kreosol - 25 mg Glycerol - 160 mg

Příklad 12:

Lidský inzulín : peptid E (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid E - 3,1 mg M-kreosol - 25 mg Glycerol - 160 mg .

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu 7,0 až 7,8 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10 % hydroxidem sodným. Příklad 13:

Lidský inzulín : peptid E (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml) .

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid F - 2,3 mg M-kreosol - 25 mg Glycerol - 160 mg

«··· · · * ·<·« • « · · ··· · · · · • · · · · » · ··· ··· • · · · · · · ,,, *»· ·· ··· ·* ··'

Příklad 14:

Lidský Zinc inzulín : samotný peptid A nebo ekvimolární směs fragmentů B, C, D, £ a F (1:4 molárni poměr při 100 jednotkách inzulínu naml).

Pří přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek νΠτΓίΐίΐί’ΐτη·)^—1—ňClO~^).pdno.tP.k ...........

peptid A - 16,,8 mg

Zinek - 1,3 mg - .

Chlorid sodný - 70 mg

Acetát sodný - 16 mg 'Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a'konečné pH na hodnotu

7,1 až 7,4. vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10 ;

% hydroxidem sodným nebo kombinace s

Peptid A - 16,8 mg

Peptid B ~ 8,8 mg

Peptid C - 13,6 mg

Peptid D - 10 mg

Peptid E - 12,4 mg

Peptid F- 9,2 mg

Zinek - 1,3 mg

Chlorid sodný - 70 mg

Acetát sodný - 16 mg

Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu

7,1 až 7,4 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10 % hydroxidem sodným.

Příklad 15:

• · ♦ « ·· • k · *·* ««

Lidský Zinc inzulín : peptid B (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml) .

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid B - 8,8 mg Zinek - 1,3 mg —r-eh-l-©r-i-d^s © dný—=—7.0_mg—„—_

Acetát sodný - 16 mg

-1 rr-lK· fk ΛΤ« -inMl- . --¹ · ,

Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na.hodnotu

7,1 až 7,4 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10 % hydroxidem, sodným.

Příklad 16:

Lidský Zinc inzulín : peptid C (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid C - 13,6 mg

Zinek ~ 1,3 mg

Chlorid sodný - 70 mg

Acetát sodný - 16 mg

Metylparahydroxybenz - 10 mg · « • · · ·· « » ·

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu

Příklad 17:

Lidský Zinc inzulín : peptid D (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulinu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid D - 10,0 mg Zinek - 1,3 mg

---eh-l-or-i-d-sodn-ý-—7-0-mg-¹-^;;---,-_;;Acetát sodný - 16 mg Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu

Přiklad 18:

Lidský Zinc inzulín : peptid E (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulinu na ml) .

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid E - 12,4 mg Zinek - 1,3 mg Chlorid sodný - 70 mg Acetát sodný - 16 mg Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu

Příklad 19:

.1

4»« ·· 44 * * · ♦ • » * · • · · 4 4» • · ♦· ·4

Lidský Zinc inzulín : peptid F (1:4 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid F - 9,2 mg Zinek - 1,3 mg ~~—r—ehio-r-i-d-sodn-ý——7-Q-mg-,-——_;;—_r-,—_r

Acetát sodný - 16 mg

- --⁺ Λ I ,W _|} ______

Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na '10 ml a konečné pH na hodnotu

7,1 až 7,4 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10' % hydroxidem sodným.

'Příklad 20:

Lidský Zinc inzulín : samotný peptid A nebo ekvimolární směs fragmentů B, C, D, E a F (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid A - 4,2 mg

Zinek - 1,3 mg

Chlorid sodný - 70 mg

Acetát sodný - 16 mg

Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu

7,1 až 7,4 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10 % hydroxidem sodným nebo kombinace s « · *

i ·· · .1 t * ·· ·· β O 9 * * · 9 ··· «·» • · «· ··

Peptid A - 4,2 mg

Peptid B - 2,2 mg

Peptid C - 3,4 mg

Peptid D - 2,5 mg

Peptid E - 3,1 mg

Peptid F- 2,3 mg

Zinek - 1,3 mg

Chlorid sodný - 70 mg ~——Acetát—sodný---1-6-mg-·.-Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na.10 ml a konečné pH na hodnotu

Příklad 21:

Lidský Zinc inzulín : peptid B (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml) .

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid B - 2,2 mg Zinek - 1,3 mg Chlorid sodný - 70 mg Acetát sodný - 16 mg Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu

Příklad 22:

Lidský Zinc inzulín : peptid C (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml) .

• 0 * ·:

··· ··

• ·

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid C - 3,4 mg

Zinek - 1,3 mg

Chlorid sodný - 70 mg

Acetát. sodný - 16 mg •Metyiparahydroxybenz——Ι-Θ-mg——— --—_::;—Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu

Příklad 23

Lidský Zinc inzulín : peptid D (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a , modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid D - 2,5 mg

Zinek - 1,3 mg

Chlorid sodný - 70 mg

Acetát sodný - 16 mg

Metyiparahydroxybenz - 10 mg • I

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu

Příklad 24:

Lidský Zinc inzulín : peptid E (1:1 molární poměr při 100 jednotkách inzulínu na ml).

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid E - 3,1 mg

Zinek - 1,3 mg

Chlorid sodný - 70 mg

Acetát sodný - 16 mg _Me.ty-lparahydroxybenz - 10 mg _{_}.

Objem kompozice sé upraví na 10 ml 'a konečné pH na hodnotu' ' ·~*'· ’

7,1 až 7,4 vodou a buď 10 % kyselinou chlorovodíkovou nebo 10 % hydroxid sodný.

Příklad 25:

Lidský Zino inzulín : peptid F (1:1 molární poměr při 10.0 jednotkách inzulínu na ml).

, '1

Při přípravě 10 ml kompozice se smíchal lidský inzulín v modifikované amorfní formě 300 jednotek a modifikované krystalické formě 700 jednotek (28 jednotek v mililitru) - 1 000 jednotek peptid F - 2,3 mg

Zinek - 1,3 mg

Chlorid sodný ~ 70 mg

Acetát sodný - 16 mg

Metylparahydroxybenz - 10 mg

Objem kompozice se upraví na 10 ml a konečné pH na hodnotu

Příklad 26:

Peptid A

Při přípravě sublingválních tablet enterokapsulí, kdy každá obsahuje kompozici ekvimolární se 100 jednotkami inzulínu, se smíchalo peptid A - 0,42 mg laktóza - 30 mg et konst. q. s.

nebo kombinace peptidu A: peptidu B: peptidu C: peptidu D: peptidu E: peptidu F: (1:1:1:1:1:1 molární poměr).

Při přípravě sublingválních tablet enterokapsulí,' kdy každá obsahuje kompozici ' ekvimolární se 100 jednotkami' inzulínu, se smíchalo peptid A - 0,42 mg

Peptid B - 0,22 mg

Peptid C - 0,34 mg

Peptid D - 0,25 mg

Peptid.E 0,31 mg

Peptid F- 0,23 mg laktóza - 30 mg et konst. q. s.

Příklad 27:

Peptid A

Při přípravě sublingválních tablet enterokapsulí, kdy každá obsahuje kompozici ekvimolární se 400 jednotkami inzulínu, se smíchalo peptid A - 1,67 mg laktóza - 30 mg et konst. q. s.

Při přípravě sublingválních tablet enterokapsulí, kdy každá obsahuje kompozici ekvimolární se 400 jednotkami inzulínu, se smíchalo peptid A - 1, 68 mg Peptid B - 0,88 mg Peptid C - 1,36 mg Peptid D - 1,0 mg Peptid E - 1,24 mg Peptid F- 0,92 mg laktóza - 30 mg et konst. q. s.

Přiklad 28:

Specifické navázání peptidu E na- buněčný povrch se ilustruje následujícím způsobem. Lidský biosyntetícký C-peptid

USA) se aktivního . TluoReporter® značil činidla

Protein (Eli-Lilly, lne., Indianopolis, tetrametylrhodaminem za použití tetrametyirhodaminsuccinimidylesteru labeling kit, Art. No. F-6163; Molecular Probes Europe BV, Leiden, Netherlands). Ke kondenzační reakci došlo při pH 8,3 (v pufru 0,1 Μ ΝβΗΟΟβ) s.pětinásobným stechiometrickým přebytkem aktivovaného činidla vzhledem k C-peptidu. Tetrametylrhodaminová skupina dosahuje maxima ábsorbce/emise při vlnových délkách 555/580 nm a je inkorporovaná na N-konci C-peptidu. Značené C-peptidy se čistily gelovou filtrací (odsolením proti 50 mM fosforečnanovému pufru, 0,1 M NaCl, pH 7,4) na koloně NAP-5; Pharmacia Biotech Uppsala, Sweden) a pak preparativní chromatografii s reverzními fázemi (250 mm kolona Kromasil C8; průměr 4,6 mm, velikost partikul! 7 um, velikost pórů 10 nm, Eka-Nobel, Surte, Sweden) systému 1090 Hewlett (Obr. č. 1) . pH eluovaného materiálu se ihned, upravilo přidáním amoniaku na hodnotu 8 a materiál se lyofilizoval.

Kultivované buňky lidských renálních tubulů (proximální stočené tubuly, PCT) se inkubovaly se syntetizovaným Cpeptidem značeným rhodaminem, jak se popisuje shora v textu.

za použití Packard HPLC chromatografického (Grenoble, France) ι

Buňky se připravily ze zdravých částí lidských ledvin, které se vzhledem k hypernefromu odstranily chirurgickou cestou. V mikrotomu se odstranilo vnějších 150 um renálního kortexu a buňky se inkuboval v kolagenázovém roztoku (0,05 %) při teplotě 37 °C po dobu 15 minut. Tkáňová suspenze se centrifugovala a dvakrát se promyla 0,01 % roztokem sojového trypsinového inhibitoru (Gibco Laboratories,' Grand Island, N.Y., USA) a koncentrát fragmentů PCT a buněk .PCT.se nanesl na skleněná krycí sklíčka. Buňky se .kultivovaly Dulbekově modifikovaném, „Eagle médiu (DMEM, 20 mmol/1 4-(2hydroxyetyl)-1-piperizinetan kyseliny sírové (Hepes), 24 mmol/1 NaHCCb, 50 000 IU/1 penicilinu a 50 mg/ml streptomycinu, pH 7,4) s 10 % fetálním boviním sérem (Gibco) v inkubátoru pří teplotě 37 °C v atmosféře 95 % O2 a v 5 % CO2. Po 28 hodinách kultivace se médium zaměnilo za DMEM s 1% fetálním boviním sérem. Buňky se testovaly o přibližně 18. až .36. hodin později.

Interakce mezi C-peptidem a buněčným povrchem· buněk tubulu se zaznamenávala za použití fluorescenční korelační spektroskopie (R. Rigler. Journal of Biotechnology 1995, 41: 177-186). Zjistilo se, že při použití C-peptidu o koncentraci 5nM se 92 % peptidu váže na buněčný povrch během 50 minut... Naopak, když se buňky pre-inkubovaly s 5 uM peptidem E, navázání C-peptidu nebylo po 50 minutách větší než 12 %. Když se C-peptid po dobu 50 minut vázal na buňky a po té se přidal peptid E došlo během 4 hodin k dislokaci hlavní částí Cpeptidu s jeho vazebného místa; pouze 14 % zůstalo navázaných. Podobné podmínky se získaly v případě peptidu F. Výsledky indikují, že peptidy-podobně jako C-peptid se váží na specifické vazebné místo na povrchu buňky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptid, který je fragmentem C-peptidu lidského inzulínu, obsahuje sekvenci ELGGGPGAG (SEQ ID NO: 2), nebo fragment peptidu charakterizovaného sekvencí SEQ ID NO: 2, nebo obsahuje sekvenci EGSLQ (SEQ ID NO: 3), nebo . fragment peptidu charakterizovaného sekvencí SEQ ID NO: 3, a má schopnost stimulovat aktivitu Na⁺K⁺ATPázy.
2. Peptid podle nároku 1, který má sekvenci ELGGGPGAG (SEQ ID NO: 2) nebo sekvenci EGSLQ (SEQ ID NO: 3) nebo jeho fragment.
3. Peptid podle nároku 2, kde uvedený fragment se vybral ze skupiny zahrnující: ELGG (SEQ ID NO: 4) (peptid . Β), ELGGGP (SEQ ID NO: 5) (peptid C), GGPGA (SEQ ID NO: 6) (peptid D) a GSLQ (SEQ ID NO: 7) (peptid F).
4. Peptid nebo fragment podle nároku 1 nebo 2, jehož délka je 2 až 25 aminokyselin.
5., Peptid nebo fragment podle nároku 4, jehož délka je 2 až 9 aminokyselin.
6. Biomimetická organická látka charakterizovaná tím, že vykazuje aktivaci Na⁺K⁺ATPázy a/nebo celulární vazbu charakteristickou pro buňky renálních tubulů a fibroblastům alespoň na stejné úrovni jako peptid nebo fragment podle libovolného z nároků 1 až 5.
7. Peptid nebo fragment podle libovolného z nároků 1 až 5 nebo biomimetická organická látka podle nároku 6 určený pro použití při terapii.

·* a

♦ • ·φ

ΦΦ ··· ·· • · • *··

Φ Φ • ·'

ΦΦ»
8. Peptid nebo jeho fragment nebo jeho biomimetická organická látka podle nároku 7 používaný při léčbě a profylaxi diabetes a/nebo diabetických komplikací nebo při stimulaci aktivity Na⁺K⁺ATPázy.
9. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, ž e obsahuje peptid nebo fragment nebo jeho biomimetickou organickou látku podle libovolného z nároků 1 až 8 společně s alespoň jedním farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ekcipientem..
10. Farmaceutická kompozice podle nároku 9, vyznačující se.tím, že dále obsahuje alespoň jedno přidané aktivní činidlo, které je účinné při léčbě a profylaxi diabetes nebo diabetických komplikací.
11. Farmaceutická kompozice podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedené přidané aktivní činidlo je izulin.
12. Použití peptidu nebo jeho fragmentu nebo jeho biomimetické organické látky podle libovolného z nároků 1 až 6 při přípravě léčiva pro léčbu a profylaxi diabetes a diabetických komplikaci nebo při stimulaci aktivity Na⁴K⁺ATPázy.
13. Použití podle nároku 12, které dále zahrnuje použití inzulínu.
14 Použití podle nároku 12 nebo 13, kde uvedené léčivo se používá při léčbě diabetes typu 1 s možnou nefropatií, neuropatií nebo retinopatií nebo při oddálení pozdních diabetických komplikací.

·· ·*\ • # β »’ι

411 . · ϊ ··· ·<·

4.* a

·· *· *·*· * · * * ··· • * »|.

• « ·' ·· ··*
15. Produkt, vyznačující se tím, že obsahuje peptid, jeho fragment nebo jeho biomimetickou organickou látku podle libovolného z nároků 1 až 6 společně s alespoň jedním přidaným aktivním činidlem, které je účinné ' při léčbě a profylaxi diabetes nebo diabetických komplikací, a slouží jako kombinovaný přípravek pro současné, oddělené nebo sekvenční použití při léčbě a profylaxi diabetes a/nebo diabetických komplikací.
16. Způsob léčby a' profylaxe diabetes nebo diabetických komplikací u člověka nebo u subjektu, kterým není člověk, ^T vyznačující se tím, že zahrnuje . aplikaci uvedenému subjektu peptidu nebo jeho fragmentu nebo jeho biomimetické organické látky podle libovolného z nároků 1 až

6.