CZ145797A3

CZ145797A3 - Insulin monoacylated analog and pharmaceutical composition containing thereof

Info

Publication number: CZ145797A3
Application number: CZ971457A
Authority: CZ
Inventors: Jeffrey Clayton Baker; Jose Michael Hanquier
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-11-17
Filing date: 1995-11-14
Publication date: 1997-12-17
Also published as: KR970706842A; IL115973A; EP0712861A2; DE69530353D1; BR9509653A; TR199501420A2; JPH10511644A; ATE237635T1; YU71395A; PL320644A1; US5693609A; ZA959679B; FI972031A7; DE69530353T2; TW434259B; US5922675A; EP0712861A3; FI972031L; AU711282B2; FI972031A0

Description

Vynález se týká oboru diabetes. Především se vynález týká acylovaných derivátů inzulínu, které mají prodlouženou dobu liči nnos ti .

Dosavadní stav techniky

Dostupností terapie nahrazující inzulín se předchází úmrtí a smrtelným akutním komplikacím při onemocnění diabetes mellitus. Chronické diabetické komplikace zůstávají však hlavním zdravotním problémem v důsledku setrvávajích metabolických poruch, způsobených v podstatě špatným řízením obsahu glukózy v krvi. Výsledky kontroly diabetes a zkoušek komplikací (DCCT) ukazují, že 1% pokles Hb Ale vede k více než 35% zlepšení se zřetelem na výskyt onemocnění sítnice.

K dosažení normální glycemie musí být terapie řízena tak, aby byla paralelní co možná nejvíce se shcématem endogenní sekrece inzulínu normálních jedinců. Denní fysiologická potřeba inzulínu se mění a může být rozdělena na dvě fáze: (a) absorpční fázi vyžadující pulz inzulínu reagující na porudké změny obsahu glukózy v krvi podmíněné jídlem a (b) postabsorpční fázi vyžadující podpůrné množství inzulínu k regulaci hepatického glukózového výdaje pro udržení optimální hladiny glukózy v krvi.

Proto účinná terapie zahrnuje kombinované použití dvou • ·

- 2 typů exogenního inzulínu: rychle působící inzulín v době jídla a pomalu působící bazální inzulín.

K dosažení dlouhotrvajícího hazálního působení se inzulín v současné době formuluje za podmínek podporujících vytváření hexamerní konformace v nerozpustném, krystalickém stavu. Tyto dlouhopůsohící prostředky se označují jako Ultralente, Leňte a semi-Lente. Avšak nerozpustnost současných d1ouhopůsobících prostředků způsobuje problémy týkající se nekonsistence odezvy dávky jakož také nepředpovědite1 né doby působení. Kromě toho jeden ze současně dostupných dlouho působících inzulínových prostředků, hovězí Ultralente, je imunogenní. Přítomnost protilátek, které jsou způsobovány imunogenicitou hovězího Ultralente mění farmakokinetiku rychle působících inzulínů.

Zatímco doba působení nerozpustného farmaceutického prostředku Ultralente umožňuje podávání bazálního inzulínu jednou za den, dávají četní lékaři přednost použití přechodně působícímu inzulínu, inzu1ínprotamínovému prostředku, běžně označovanému jako inzulín-NPH. Inzulín-NPH se podává dvakrát denně jako bazální inzulín, protože se poměrně snadno nastavuje optimální dávka v případě drogy působící kratší dobu. Proto na přechodně působící prostředek připadá ve Spojených státech amerických 70 %, v Japonsku 64 % a v Evropě 45 % a celkově 55 % světovéh trhu inzulínu.

Avšak jak nerozpustný inzulín-NPH tak nerozpustný inzulín Ulralente jsou suspenzními farmaceutickými prostředky. Proto je těmto prostředkům vlastní menší předpověditelnost než rozpustným prostředkům a výsledkem je menší než přiměřená kontrola glukózy v krvi a větší citlivost k život ohrožujícím hypo• · • · ·

- 3 glycemickým příhodám. Proto je potřeba vyvinout rozpustný, dlouho působící bazální inzulín k dosažení úspěšné intenzivní terapie nahrazující inzulín. Vynález se týká inzulínových analogů, které se mohou formulovat pro rozpustnou, bazální, inzu1ínovou terapi i.

Acylaci vepřového, hovězího mebo lidského inzulínu popisuje Muranishi a Kiso (japonská zveřejněná přihláška vynálezu 1-254699). Zvláště se popisují tyto sloučeniny: B29-Ne-palmitoylinzulín (e-aminoskupina je acylována), ΒΙ-Να-palmitoylinzulín (N koncová α-aminoskupina řetězce B je acylována) a BlB29-Na,Ne-dipalmitoylinzulín (jak e-aminoskupina tak N koncová α-aminoskupina je acylována). Muranishi a Kiso uvádějí, že acylovaný inzulín má podobný biologický profil jako inzulín; neuvádějí však dávky, cesty podání nebo jiné podmínky in vivo modelu k umožnění, aby pracovníci v oboru hodnotili účinnost nebo dobu působení acylovaného inzulínu.

Podobně Hashimoto a kol. (Pharmaceutical Research 6, str. 171 až 176 , 1989) popisují ΒΙ-Να-palmitoylinzulín (N koncová α-aminoskupina je acylována) a Bl-B29-Na,Ne-dipalmitoylinzulín (jak e-aminoskupina tak N koncová α-aminoskupina je acylována). Hashimoto a kol. studují hypog 1 ycemické působení Bl-Notpalmitoylinzulinu a Bl-B29-N«,Ne-dipalmitoylinzulinu v případě samečků krys při 25 J/ml, což je mimořádně vysoká dávka. Při této dávce dokládá obr. 5 velmi nízkou aktivitu při intravenózním podávání. Při podání intramuskulárně se zjišťuje toliko krátké hypoglycemické působení ΒΙ-Να-palmitoylinzulinu a zanedbatelné působení Bl-B29-Na,Ne-dipalmitoylinzulinu (obr. 6).

Přídavně k popisu in vivo Muranishi a Kiso a Hashimoto a ·· ·· ·· ···· • · · kol., Walder a kol. (PCT zveřejněná řihláška vynálezu číslo WO 92/01476) uvádějí, že poločas proteinů a peptidů se může prodloužit in vivo chemickým vázáním proteinu s polární skupinou, zvláště s derivátem mastné kyseliny. Mastná kyselina vytváří můstkovou skupinu mezi proteinem a albuminem. Walder a kol. uvádějí, že apolární skupina je s výhodou omezena na jediné místo nebo místa v proteinu a příklady objasňují vazbu cysteinových zbytků hemoglobinu. Obecně odkazují na deriváty mastných kyselin inzulínu. Nejsou však žádné deriváty mastné kyseliny specificky popsány nebo doloženy příklady a nejsou uvedeny hodnoty naznačující, že biologická účinnost derivátů mastných kyselin inzulínu zůstává.

Zjistilo se, že selektivní acylace volné aminoskupiny monomerního inzulínového analogu postkytuje účinnou bazální inzulínovou aktivitu. Uvádí se, že neacylované analogy inzulínu vykazují rychlé nastoupení akce a rychlé odeznění. Takové analogy jsou v oboru známy jako monomerní analogy inzulínu. Schopnost modifikace takových analogů k vyvíjení bazální kativity se většinou neočekává.

Vynález se týká monoacylovaného analogu, který vykazuje po užití prodloužené trvání působení. Tyto analogy se mohou připravovat v podobě rozpustných prostředků, což je předností před dosavadní bazální inzulínovou terapií. Analogy podle vynálezu mají také vynikající předpověditelnost na odezvu dávky, vynikající předpověditelnost působení v čase, chybí jim výrazný pík v profilu působení v čase a jsou ideálně vhodné pro přípravu směsných prostředků, obsahujících inzulínový analog a acylovaný inzulínový analog.

- 5 Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je monoacylovaný inzulínový analog vzorce:

»· ····

SEQ ID

NO

>: 1

Xaa

Ile

Val

Glu

Gin

Cys Cys

Thr

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

1

5

10

15

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

20

vhodně

ses í těná

na

SEQ ID

NO:

2

Xaa

Val

Asn

Gin

His

Leu Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

1

5

1 o

15

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Xaa

Thr

20

25

30

nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl, přičemž

Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:1 (inzulínový A řetězec) je Gly; nebo acylovaný Gly, jestliže Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 je Phe, Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala, a Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Lys nebo Pro;

Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 (inzulínový B řetězec) je Phe; nebo acylovaný Phe, jestliže Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:1 je Gly, Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala, a Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Lys nebo Pro;

Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala; nebo acylovaný Lys, jestliže Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:1 je ·· ···· » · * • · · ·

- 6 Gly, Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 je Phe, a Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Pro; a

Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Lys, Pro; nebo acylovaný Lys, jestliže Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala,; Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:1 je Gly, a Xaa v poloze 1 SEQ ID NO;2 je Phe.

Vynález se také týká způsobu ošetřování hyperglycemie podáváním jedincům v případě potřeby farmaceutického prostředku, který obsahuje jako účinnou látku účinné množství acylovaného analogy inzulínu podle vynálezu spolu s alespoň jedním farmaceuticky vhodným excipientem.

Vynález se také týká orálních farmaceutických prostředků, které obsahují acylovaný inzulínový analog podle vynálezu spolu s alespoň jedním farmaceuticky vhodným konzervačním činidlem, činidlem zajišťujícím isotonicitu nebo pufrem.

Všechny zde používané zkratky aminokyselin jsou v souhlase s ustanovením 37 C.F.R. § 1.822(B)(2) Úřadu pro patenty a obchodní známky Spojených států amerických.

Výrazem zesítěný, se míní vytvoření disulfidických můstků mezi cysteinovými zbytky. Vhodně zesítěný proinzulín, inzulín, nebo inzulínový analog obsahuje tři disulfidické můstky. První disulfidický můstek se vytváří mezi cysteinovými zbytky v poloze 6a 11 A-řetězce. Druhý disulfidický můstek váže cysteinový zbytek v poloze 7 A-řetězce na cysteinový zbytek v poloze 7 B-řetězce. Třetí disulfidický můstek váže cysteinový zbytek v poloze 20 A-řetězce na cysteinový zbytek v poloze 19 B-řetězce.

Výrazem acylovaný Gly, acylovaný Phe a acylovaný Lys se míní Gly, Phe nebo Lys acylovaný mastnou kyselinou s 6 až 21 atomy uhlíku. Výrazem acylační skupina se míní mastná kyselina chemicky vázaná na α-aminoskupinu nebo e-aminoskupinu inzulínového analogu. Volnými aminoskupinami v poloze Al a Bl jsou α-aminoskupiny. Volnou aminoskupinou Lys v poloze B28 nebo B29 je e-aminoskupina.

Výrazem acylace se míní zavádění alespoň jedné acylové skupiny kovalentně vázané na aminoskupiny proteinu. Výrazem selektivní acylace se míní přednostní acylace alespoň jedné e-aminoskupiny před acylací alespoň jedné α-aminoskupiny.

Výrazem aminokyselina se míní nasycená nebo nenasycená mastná kyselina s 6 až 21 atomy uhlíku. Výhodnými jsou nasycené mastné kyseliny a příkladně se uvádějí kyselina myristová (14 atomů uhlíku), pentadecylová (15 atomů uhlíku), palmitová (16 atomů uhlíku), heptadecy1ová (17 atomů uhlíku) a stearová kyselina (18 atomů uhlíku). Nejvýhodnější mastnou kyselinou je kyselina palmitová. Sloučeniny podle vynálezu jsou monoacylovanými inzulínovými analogy. Inzulínové analogy se acylují na α-aminoskupině nebo na e-aminoskupině mastnou kyselinou se 6 až 21 atomy uhlíku, S výhodou jsou analogy monoacylovány na e-aminoskupině lysinu.

Výrazem aktivovaný ester aminokyseliny se míní mastná kyselina, aktivovaná obecně známým způsobem (například Methods of Enzymology, 25, str. 494 až 499, 1972 a Lapidot a kol., J of Lipid Res. 8, str. 142 až 145, 1967). Jakožto aktivované ·· ·· • · · · • · · · • · · · · • · * ·· ·· ·· · ·« • · estery mastné kyseliny se uvádějí deriváty běžně používaných ac.ylačních činidel, jako je například hydroxybenzotri azid (HOBT), N-hydroxysukcinimid a jeho deriváty. Výhodným aktivovaným esterem je N-sukcinimidylpalmitát.

Výrazem rozpustný, se míní, že je dostatečné množství esteru v kapalné fázi k acylaci inzulínového analogu. S výhodou obsahuje kapalná fáze přibližně 1 až 2 molární ekvivalenty aktivovaného esteru na 1 mol analogu inzulínu v kapalné fázi.

Výrazem monomerní inzulínový analog nebo inzulínový analog, se míní rychle působící inzulínový analog, který je méně náchylkný k dimerizaci nebo ke spontání asociaci. Monomerní inzulínový analog je lidský inzulín, přičemž Pro v poloze B28 je substituován Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a Lys v poloze B29 je lysin nebo prolin. Monomerní inzulínové analogy popsal Chance a kol. (americká přihláška vynálezu číslo 07/ 388201 odpovídající evropské zvěřejněné přihlášcea vynálezu číslo EPO 383472) a Brange a ko1.(evropská zvěřejněná přihláška vynálezu číslo EPO 214826). Pracovníkům v oboru je zřejmé, že jsou možné jiné modifikace na monomerní inzulínový analog a v oboru jsou v široké míře akceptovány. Tyto modifikace zahrují náhradu histidinového zbytku v poloze BIO asparagovou kyselinou; náhradu fenylalaninového zbytku v poloze Bl asparagovou kyselinou; náhradu threoninového zbytku v poloze B30 alaninem; náhradu serinového zbytku v poloze B9 asparagovou kyselinou; vypuštění aminokyselin v poloze Bl samotných nebo spolu s vy- puštěním v poloze B2; a vypuštění threoninu v poloze B30

Výrazem zásadité podmínky, se míní, že je reakční prostředí zásadité. Reakce se musí provádět se všemi volnými

- 9 amonoskupinami v podstatě deprotonovanými. V případě vodného rozpouštědla nebo semivodného rozpouštědla se zásaditými podmínkami míní, že se reakce provádí za hodnoty pH větší než 9,0. V nevodném organickém rozpouštědle se reakce provádí v přítomnosti zásady s ekvivalentem zásaditosti pKa. větším nebo rovném 10,75 ve vodě.

SEQ ID N0:l se týká první sekvence ze seznamu sekvencí a

znamená	analog lidského	inzulínového řetězce A	se sekvencí:
Xaa Ile	Val Glu Gin Cys	Cys Thr Ser Ile Cys Ser	Leu Tyr Gin
1	5	10	15
Leu Glu	Asn Tyr Cys Asn
	20

přičemž

Xaa v poloze 1 SEQ ID N0:í (inzulínový A řetězec) je Gly; nebo acylovaný Gly, jestliže Xaa v poloze 1 SEQ ID N0:2 je Phe; Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala; a Xaa v poloze 29 SEQ ID N0:2 je Lys nebo Pro.

SEQ ID N0;2 se týká druhé sekvence ze seznamu sekvencí a znamená analog lidského inzulínového řetězce B se sekvencí:

Xaa Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 15 lo 15

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr

25 30 při čemž ····

- 10 Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 (inzulínový B řetězec) je Phe; nebo acylovaný Phe, jestliže Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:1 je Gly; Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Bys, Leu, Val nebo Ala; a Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Lys nebo Pro;

Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala; nebo acylovaný Lys, jestliže Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:1 je Gly, Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 je Phe, a Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Pro; a

Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Lys, Pro; nebo acylovaný Lys, jestliže Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala,; Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:1 (inzulínový A řetězec) je Gly, a Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 (inzulínový B řetězec) je Phe.

Jak shora uvedeno, týká se vynález monoacy1 ováného inzulínového analogu vzorce: SEQ ID NO.l vhodně sesítěného na SEQ ID NO:2 nebo jeho farmaceuticky vhodné soli. Výhodný aminokyselinovým zbytkem v poloze 1 SEQ ID NO:1 (inzulínový A řetězec) je Gly. Fenylalanin je výhodnou aminokyselinou v poloze 1 SEQ ID NO:2 (inzulínový B řetězec). Výhodným aminokyselinovým zbytkem v poloze 28 SEQ ID NO;2 je Asp nebo acylovaný Lys, v případě, kdy aminokyselinovým zbytkem v poloze 29 SEQ ID NO: 2 je Pro. Výhodným aminokyselinovým zbytkem v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Lys nebo Pro, v případě, kdy aminokyselinovým zbytkem v poloze 28 SEQ ID NO:2 je acylovaný Lys. Podle standardní terminologie, známé pracovníkům v oboru, je výhodným analogem monoacylováný Lys^B2SPro^B29-lidský inzulín. Nejvýhodnějším acylovaným inzulínovým nalogem je mastnou kyselinou s 8 až 18 atomy uhlíku, s výhodou aminokyselinou se 14 až 16 atomy uhlíku monoacy1 ováný inzulínový analog. Výhodné mastné

kyseliny zahrnují tudíž oktanoyl (C8), nonanoyl (C9), dekanoyl (CIO), undekanoyl (Cil(, lauroyl (C12), tridekanoyl (C13), myristoyl (C14), pentadekanoy1 (C15), palmitoyl (C16). Jakožto výhodné sloučeniny podle vynálezu se uvádějí B29-Ne-Asp^B28-palmitoyllidský inzulín (B²⁸ je Asp, B²⁹ je acylovaný Lys), B28Ne-palmitoyl-Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín (B²⁸ je acylovaný Lys, B²⁹ je Pro), B28-Ne-oktanoyl-Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín, B28-Ne-dekanoy1-Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín, B28-Ne-myristoylLys^B2SPro^B29_lidský inzulín a B28-Ne-undekanoyl-Lys^B28Pro^B29lidský inzulín.

Acylace volných aminoskupin proteinů včetně inzulínu je obecně známa. Obecné způsoby acylace jsou známy a jsou popsány (například Methods of Enzymology, 25, str. 494 až 499, 1972) a zahrnují použití aktivovaných esterů, halogenidů nebo anhydridů kyselin. Použití aktivovaných esterů, zvláště N-hydroxysukcinimidových esterů mastných kyselin, je zvláště výhodným způsobem acylace volné aminokyseliny mastnou kyselinou. Lapidot a kol. (J. of Lipid Res., 8, str. 142 až 145, 1967) popisuje způsob příravy N-hydroxysukcinimidových esterů a jejich použití pro přípravu N-lauroylglycinu, N-lauroyl-L-serinu a N1auroyl-L-glutamové kyseliny.

Pro selektivní acylaci e-aminoskupiny se používá různých skupin ke chránění α-aminoskupiny v průběhu kopulace. Selektivita vhodných chránících skupin je pracovníkům v oboru známa a jako taková vhodná skupina přichází v úvahu p-methoxybenzoxykarbonyl (pmZ). S výhodou se však e-aminoskupina acyluje jednostupňovým způsobem bez použití chránící skupiny, Acylace se provádí reakcí aktivovaného esteru mastné kyseliny s e-aminoskupinou proteinu za zásaditých podmínek v polárním rozpouš·· ·· ·· • · · :::: ::

.· ···. . : ........

.:.....* *··’ ··*

- 12 tědle. Bazicita reakčního prostředí musí být dostatečná k deprotonizaci všech volných aminoskupin inzulínového analogu. Za slabě zásaditých podmínek se všechny volné aminoskupiny nedeprotonizují a přednostní acylace probíhá na N-koncových aminoskupinách nebo na α-aminoskupinách. Ve vodném rozpouštědle nebo korozpouštědle se zásaditými podmínkami míní provádění reakce při hodnotě pH větší než 9. Protože k odbourání proteinů dochází při hodnotě pH překračující 12,0, je hodnota pH reakční směsi s výhodou 10,0 až 11,5 a především 10,5. Hodnota pH reakční směsi ve směsném organickém a vodném rozpouštědle se stanovuje jako hodnota pH vodného rozpouštědla před smísením.

V nevodném rozpouštědle se selektivní acylace e-aminoskupiny provádí v přítomnosti zásady s bazicitou ekvialentní hodnotě pK_a větší nebo rovnou 10,75 ve vodě k dosažení dostatečné deprotonizace e-aminoskupin. To znamená, že zásada musí být alespoň tak silná jako triethy1amin. Jakožto výhodné zásady se příkladně uvádějí tetramethylguanidin, diisopropylethylamin a tetrabutaylamoniumhydroxid. Použití slabší zásady vede k acylaci α-aminoskupin.

Volha polárního rozpouštědla nemá rozhodujícího významu a závisí ve velké míře na rozpustnosti inzulínového analogu a esteru mastné kyseliny. Rozpouštědlo může být plně organické. Jakožto příklady obecně přijatelných organických rozpouštědel se uvádějí dimethylsulfoxid a dimethy1formamid. Jsou také použitelná vodná rozpouštědla a směsi vodných a organických rozpouštědel. Volba rozpouštědla je omezena toliko rozpustností reakčních složek. Výhodnými rozpouštědly a rozpouštědlovými systémy jsou dimethylsulfoxid; dimethylformamid; acetonitril a voda; isopropylalkohol, ethanol a voda; a ethanol, propanol a

- 13 voda. Výhodným rozpouštědlem je acetonitril a voda; nejvýhodnějším rozpouštědlem je 50% acetonitril. Pracovníkovi v oboru je jasné, jakých jiných polárních rozpouštědel může použít.

Poměr reakčních složek nemá rozhodující význam. Obecně je výhodné, aby byl aktivovaný ester mastné kyseliny v molárním nadbytku. S výhdou se reakce provádí s 1 až 4 molárními ekvivalenty a především s 1 až 2 molárními ekvivalenty esteru. Pracovníkům v oboru je však jasné, že se při velmi vysokých koncentracích esteru ve významném množství budou produkovat bisacylované nebo triacylované produkty.

Rovněž teplota reakční směsi nemá rozhodující význam. Reakce se provádí při teplotě 20 až 40 Ca obecně je ukončena za 15 minut až 24 hodin.

Po acylaci se reakce ukončí a produkt se čistí o sobě známými způsoby například reverzní fázovou nebo hydrofobní chromatografií. Pak se produkt izoluje o sobě známými způsoby například vymražovacím sušením nebo krystalizaci.

Monomerní inzulínový analog se může připravovat jakýmkoliv známým způsobem přípravy peptidu včetně klasických způsobů (v roztoku), způsobů s pevnou fází, semisyntet ickými způsoby a nejnověji rekombinantními DNA způsoby. Například Chance a kol. (americká přihláška vynálezu číslo 07/388201, evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EPO 383472), Brange a kol. (evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EPO 214826). Řetězce A a B inzulínových analogů podle vynálezu se také mohou připravovat rekombinantními DNA technikami za použití proinzulínovité prekursorové molekuly (Frank a kol., Peptides: Synt·· · . · · ·

Symp. vyd.

hesis-Structure-Function, Proč. Seventh Am. Pept.

D. Rich a E. Gross, 1981).

Následující příklady praktického provedení vynález blíže objasňují, nijak jej však neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Acylace Lys^B28Pro^B29-lidského inzulínu za použití N-sukcinimidylpalmitátu ve směsi acetonitrilu a vody

Krystaly Lys^B2SPro^B29-inzulínu (2,22 g) se rozpustí ve 100 ml 50 mM roztoku kyseliny borité při hodnotě pH 2,5. Hodnota pH roztoku se znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se kryslaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (N-sukcinimidylpalmitátu) přidáním 270 mg pevného aktivovaného esteru do 27 ml acetonitrilu předehřátého na teplotu přibližně 50 Ca intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku nastaví na přibližně 10,22 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného a roztok se míchá při teplotě 4 C po dobu 15 minut. Do předem připraveného roztoku aktivovaného esteru s upravenou hodnotou pH se přidá acetonitril (73 ml). Směs se nechá reagovat při teplotě 4 C po dobu 85 minut. Reakce se ukončí přidáním IN kyseliny octové (600 ml), přičemž se hodnota pH upraví na 2,85. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství B28-Ne-palmitoyl Lys^B28Pro^B29-inzulinu v odebraném vzorku dělené počátečním množstvím Lys^B28Pro^B29-inzulínu, je 72,5 % • · • ·

- 15 ·· ···· » · » • · · · teorie.

Příklad 2

C8(B28) Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín

Krystaly Lys^B28Pro^B2S>-l idského inzulínu (KPB) (2 g) se rozpustí ve 200 ml 50 mM roztoku kyseliny borité jakožto pufru o hodnotě pH 2,5. Hodnota pH roztoku se znova nastaví na 2,5 použitím 10% kyseliny chlorovodíkové a roztok se míchá tak dlouho, až se kryslaly na pohled dokonale rozpustí. Připraví se roztok aktivovaného esteru (1-oktanoyl-N-hydroxysukcinimidesteru) přidáním 175 mg pevného aktivovaného esteru do 25,62 ml acetonitrilu a intenzivně se míchá až do dokonalého rozpuštění částic aktivovaného esteru na pohled. V této chvíli se hodnota pH roztoku KPB nastaví na přibližně 10,4 přidáním 10% roztoku hydroxidu sodného a roztok se míchá při teplotě okolí po dobu 5 minut. Acetonitril (176 ml) se přidá do roztoku KPB s předem upravenou hodnotou pH, načež se přidá předem připravený roztok aktivovaného esteru. Směs se nechá reagovat při teplotě okolí po dobu 90 minut. Peakce se ukončí přidáním 5,5 ml 10% kyseliny chlorovodíkové (objemově 2,75 %) a tří objemů (1200 ml) studené dH₂O, přičemž konečná hodnota pH je 2,70. Reakční výtěžek, vypočtený jako množství LysB29(C8) KPB v reakční směsi, dělené počátečním množstvím HBI, je 75,5 % teorie Tento roztok se rozdělí na dva 800 ml podíly pro čištění hydrofobní chromatografií (SP20SS). Po sloupcové chromátografi i se provádí u1trafi 1trace a lyofilizace.

Jak shora uvedeno, jsou acylované analogy inzulínu podle • ·

- 16 vynálezu účinné při ošetřování hyperglycemie podáváním účinného množství monoacylováného inzulínového analogu lidem, kteří takové ošetření potřebují. Jak shora uvedeno, účinným množstvím se míní množství alespoň jednoho acylovaného analogu podle vynálezu, potřebné ke snížení nebo udržení hladiny cukru v krvi bud terapeuticky nebo prof1 akt icky. Toto množství je zpravidla přibližně alespoň 10 jednotek za den (nebo přibližně 0,3 až 2 mg za předpokladu přibližně 29 jednotek na mg). Skutečně podávané množství však vždy stanovuje lékař se zřetelem na okolnosti případu včetně ošetřovaného stavu (to znamená příčiny hyperglycemie), určitého podávaného analogu, zvolené parenterální cesty podávání, věku, hmotnosti a odezvy jednotlivce a závažnosti symptomů jednotlivce. Shora uvedená dávka není proto míněna jako jakékoliv omezení.

Acylované analogy inzulínu podle vynálezu se podávají případným jedincům (lidem trpícím hyperg1ycemií) v podobě farmaceutických prostředků, obsahujících účinné množství alespoň jednoho monoacylováného analogu inzulínu podle vynálezu spolu s alespoň jedním farmaceuticky vhodným excipientem nebo nosičem. Pro tyto účely se farmaceutické prostředky zpravidla formulují tak, aby obsahovaly přibližně 100 jednotek na ml nebo podobné koncentrace účinného množství alespoň jednoho monoacy1 ováného analogu inzulínu. Tyto farmaceutické prostředky jsou zpravidla nikoliv však nutně parenterální povahy a mohou se připravovat nejrůznějšími způsoby za použití o sobě známých excipientů nebo nosičů pro parenterální rostředky, které jsou v oboru známy (například Remington s Pharmaceutical Sciences, 17. vydání, Mack Publishing Company, Easton, PA, Spojené státy americké, 1985). Například se dávkovači formy pro parenterální podání mohou připravovat suspendováním nebo rozpouštěním žádá-

- 17 ného množství alespoň jednoho monoacy1 ováného analogu inzulínu v netoxickém kapalném nosiči, vhodném pro vstřikování, jako je například vodné prostředí a sterilizací suspenze nebo roztoku. Nebo se odměřené množství alespoň jednoho monoacy1 ováného analogu inzulínu může vnášet do fioly, načež se fiola a její obsah sterilizuje a uzavře. Fiola nebo nosič se může upravit pro řičely míšení před podáním. Pro farmaceutické prostředky, přizpůsobené pro parenterální podání, se používá ředidel, excipientů a nosičů, jako jsou například voda a s vodou mísitelná organická rozpouštědla, jako jsou například glycerin, sezamový olej, podzemnicový olej, vodný ethy1englykol a N,N-dimethylformamid. Takové farmaceutické prostředky obsahují příkladně sterilní, isotonické, vodné solankové roztoky monoacylovaného analogu inzulínu, které se mohou pufrovat farmaceuticky vhodnými pufry a které jsou prosté pyrogenu. Kromě toho takové farmaceutické prostředky mohou obsahová konzervační přísady například meta-kresol nebo činidla k úpravě hodnoty pH konečného produktu, jako například hydroxid sodný nebo kyselinu chlorovodíkovou.

Monoacy1 ováné analogy inzulínu podle vynálezu se také mohou formulovat jakožto směsi. Směsné prostředky obsahují neacylovaný inzulín nebo inzulínový analog a acylovaný analog inzulínu. Hmotnostní poměr neacy1 ováného inzulínu nebo inzulínového analogu a acylovaného analogu inzulínu je 1:99 až 99:1. Výhodný hmotnostní poměr je 75:25 až 25:75, ještě výhodnější je 40:60 až 60:40 a nejvýhodnější hmotnostní poměru je 50:50. Směsné prostředky se připravují míšením žádaných objemů složek ve standardních parenterálních ředidlech. Jakožto standardní ředidla se uvádějí isotonická činidla, zinek, fysiologicky vhodné pufry a konzervační činidla. Jakožto fysiologicky vhod• · * · · ” * A Λ ·

- · * » * ·¹ • · · · · * *

- 18 né pufry přicházejí v úvahu fosfátové pufry jako dibazický fosforečnan sodný. Jakožto další fasiologicky vhodné pufry se uvádí TPIS nebo octan sodný. Volba a koncentrace pufru jsou o sobě známy. Jakožto farmaceuticky vhodná konzervační činidla se příkladně uvádějí fenol, tn-kresol, resorcinol a methylparaben. Směsné prostředky podle vynálezu jsou farmaceuticky výhodné, protože obsahují jak poměrně rychle působící inzulín nebo inzulínový analog, tak monoacylováný inzulínový analog, rozpuštěné ve farmaceutickém prostředku. Proto poskytují předpověditelné trvání profilu účinnosti.

Následující příklad objasňuje farmaceutický prostředek avšak bez záměru na jakémkoliv omezení. Procenta jsou míněna hmotnostně.

Složka Množství f eno 1 glycerin acylovaný Lys^B2SPro^B29-lidský inzulín zinek octan sodný mM 16 mg/ml 100 jednotek 0,7 %

3,8 mg/ml

Poztok shora uvedených složek se podává vstřikováním jedincům, kteří takové ošetření potřebují.

K doložení účinnosti monoacylováného analogu inzulínu podle vynálezu se B28-Ne-palmitoy1 Lys^B28Pro^B29-lidský inzulín zkouší na psu ve bdělém stavu. Test se provádí na samci nebo samičce psa rasy beagle, kterému se v průběhu noci nepodává potrava, je ve bdělém stavu, dospělý (stáří 1 až 2 roky) • · ·· ···· • * • · · · • · · · * ···»··· ·· ··

- 19 o hmotnosti 8 až 15 kg. Alespoň 10 dní před testem se zvířata anestetizují isofluranem a vyřízne se jim levá nebo pravá tří— selná (inkvinální) oblast. Silastické kathetry se včlení do stehenní arterie a do proximální kaudální cévy a zajistí se sešitím hedbábím 4-0. Volné konce kathetru se vedou subkutanně na záda za použití trokarové jehly. Katethry se pak naplní roztokem glycerolu a heparinu (objemově 3:3, konečná koncentrace heparinu 250 KlU/ml) a volné konce se zavážou a umístí se do subkutanní kapsy k umožnění dokonalého uzavření kůže. Reflex se podává jak před zásahem (20 mg/kg, i.v. a 30 mg/kg i. m.) tak po zásadu (250 mg p.o. jednou denně po 7 dní) k předejití infekce. Pro tišení bolesti se po zásahu podává Torbugesic (1,5 mg/kg i.m.). Krev se odebere těsně přede dnem studie ke stanovení zdraví zvířete. Používá se pouze zvířat se hematocrit nad 38 % a s počtem leukocytů pod 16000/mm³. Odpoledne před zkouškou se odkryjí volné konce kathetrů ze subkutanní kapsy malým řezem za lokální anestesie (2% lidokain) a pes se vybaví připevněným systémem souboru pláště a límce.

Ráno v den zkoušky se nasaje obsah arteriálního kathetru (při této studii se používá pouze arteriální cesty), katheter se promyje solankou a ke kathetru se připojí prodlužovač (chráněný uevněním z nerezavějící oceli). Pes se umístí do metabolické klece a prodlužovač kathetru a upevňovač se připojí na systém umožňující psovi pohyb v kleci. Po 15 minutách (45 minut, kontrola) se odtáhne krev (2 až 3,5 ml) pro stanovení koncentrace glukózy v plasmě. Druhý vzorek se odtáne za 15 minut (čas 0). Zkoušená látka (fosfátem pufrovaná solanka nebo 10,5 mmol/kg B28-Ne-palmitoyl Lys^B2SPro^B29-lidský inzulín, což je molární ekvivalent 1,75 J/kg lidského inzulínu) se podá subkutanně na zadní části šíje.

• · · · • · • · · · · »· · * • · · · ····· · · · · • · · · · · * ······· · · · · · · *

- 20 Vzorky arteriální krve (1 až 3,5 ml) se pak odebírají každých 30 minut po dalších dvou (kontroly) až šesti (B28-Nepalmitoyl Lys^B2SPro^B29-lidský inzulín) hodinách. Vzorky se shromažďují ve vakuovaných zkumavkách pro krev obsahujících dvojsodnou sůl ethy1endiamintetraoctové kyseliny a bezprostředně se umístí do ledu. Vzorky se odstředí, a získaná plasma se převede do polypropylenových zkumavek a uloží se do ledu nebo se zmrazí po dobu testu.

Na závěru pokusu se psi anestetizují (isofluran), katheter se propláchne čerstvou solankou a vyplní se směsí glycerolu a heparinu. Volné konce kathetru se zavážou a umístí se do subkutánní kapsy, jak shora popsáno. Podají se antibiotika (300 mg Reflexu, i.m.). Stanoví se koncentrace glukózy v plasmě v den testu za použití g1ukosooxidázového způsobu v Beckmanově analyzátoru glukózy. Hodnoty se zaznamenají jako střední +/- standardní ochylka (SEM).

Koncentrace glukózy v plasmě se nemění výrazně od základní hodnoty v průběhu dvouhodinového pozorování po vstřiknutí fosfátem pufrované solanky (tabulka I). V téže době subkutanně podaný B28-Ne-palmitoyl Lys^B2SPro^B29-lidský inzulín vede k 15% poklesu koncentrace glukózy v plasmě. Koncentrace glukózy v plasmě zvířat ošetřených B28-Ne-palmitoy1 Lys^B2SPro^B29-lidským inzulínem postupně klesá v příštích čtyřech hodinách až na hodnotu koncentrace glukózy 41 mg/dl pod základní hodnotu (35% pokles) šest hodin po vstřiknutí.

V literatuře se zjistilo, že koncentrace glukózy v plasmě psů neklesá výrzně po týdnu hladovění. Pkles koncentrace glukózy, pozorovaný při této studii v důsledku podání B28-Nepalmitoyl Lys^B28Pro^B29-lidského inzulínu dokládá aktivitu • · · · • · · · · · · • · · · * · · • · · · · · ··· · • · · · · • · · · · · ·

- 21 zkoušené sloučeniny podobnou inzulínu.

Tabulka I

Koncentrace glukózy v plasmě po subkutánním vstřiknutí fosfátem pufrované solanky (kontrola) nebo B28-Ne-palmitoy1 Lys^B2SPro^B29-lidského inzulínu

Doba Kontrola (n=5) B28-Ne-palmitoyl Lys^B2S-Pro^B29-lidský i nzulίn

(minuty)	mg/dl	mg/dl
-15	114 +/-3	1 16
0	112 +/-3	116
30	117 +/-4	114
60	114 +/-3	107
90	115 +/-3	102
120	117 +/-5	99
150		101
180		100
210		100
240		98
270		87
300		82
330		79
360		75
Průmvs1ová	vvuži te1 nos t

Monoacy1 ováný analog inzulínu vzorce SEQ ID NO:1 vhodně sesítěné na SEQ ID NO:2 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl pro výrobu parenterálního farmaceutického prostředku pro terapii nebo profylaxi diabetes mellitus.

• · ·

- 22 Seznam sekvencí (1) Obecné informace

i) Přihlašovatel: Baker a kol.

i i) Název vynálezu: Monoacylováný analog inzulínu a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje iii) Počet sekvencí:2 iv) Adresy pro korespondenci

A. Adresát: Eli Lilly amd Compan Patent Division/SPC

B. Ulice : Lilly Corporate Center

C. Město: Indianapolis

D. Stát: In

E. Země: Spojené státy americké

F. ZIP: 46285

v) Forma pro počítač

A. Typ média: disketa 3,5 palce, 1,4 Mb skladování

B. Počítač: Macintosh

C. Operační systém: Macintosh

D. Software: Microsoft Word vi) Platné přihlašovací údaje

A. Číslo přihlášky:

B. Datum podání

C. Klasifikace vii) Předchozí přihlašovací údaje

A. Číslo přihlášky:

B. Datum podání viii) Informace o zástupci/zmocněné i

A. Jméno: Steven P. Caltrider

B. Registrační číslo: 36467

C. Referenční/štítkové číslo: X972O ix) Telekomunikační informace

A. Telefon: (317) 276-0757 • · • · • · · ·

- 23 B. Telefax: (317) 277-1917

C. Telex:

2. Informace o SEQ ID. C.l:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 21 aminokyselin

B. Typ:aminokyseli na

C. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: polypeptid ix) Charakteristiky

A. Jméno/klíč: variabilní místo

B. Lokace: 1

C. Identifikační způsob

D. další informace

Xaa v poloze 1 SEQ TD NO: 1 je Gly; nebo acylovaný Gly, jestliže Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 je Phe, Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala, a Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Lys nebo Pro;

xi) Popis sekvence ID. č.l

Xaa Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Tle Cys Ser Leu Tyr Gin 1 5 10 15

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (2) Informace pro SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristiky sekvence:

A. Délka: 30 aminokyselin

B. Typ: aminokyselina

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: polypeptid ix) Charakteristiky

A. Jméno/klíč: variabilní místo • · • · · ·

- 24 B. Lokace: 1

C. Identifikační způsob

D. další informace

Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 je Phe; nebo acylovaný Phe, jestliže Xaa v poloze 1 SEQ ID N0:l je Gly, Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala, a Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Lys nebo Pro;

ix) Charakteristiky

A. Jméno/klíč: variabilní místo

B. Lokace: 28

C. Identifikační způsob

D. další informace

Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala; nebo acylovaný Lys, jestliže Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:1 je Gly, Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 je Phe, a Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Pro;

ix) Charakteristiky

A. Jméno/klíč: variabilní místo

B. Lokace: 29

C. Identifikační způsob

D. další informace

Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Lys, Pro; nebo acylovaný Lys, jestliže Xaa v poloze 28 SEQ ID NO:2 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala,; Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:1 je Gly, a Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 je Phe.

xi)

Popis sekvei

ice

ID. c

;.2

Xaa

Val A s n

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

1

5

1 o

15

Tyr

Leu Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Xaa

Thr

20

25

30

• · · · · « • · • ·

Claims

1. Monoacylováný analog inzulínu vzorce SEQ ID NO:1 vhodně sesítěné na SEQ ID NO:2 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl .

2. Monoacylováný analog inzulínu podle nároku 1, kde XAA v poloze 28 SEQ ID N0:2 je acylovaný Lys a Xaa v poloze 29 SEQ ID NO:2 je Pro.

3.

acylační

Monoacylováný analog inzulínu podle nároku 2, kde skupinou je mastná kyselina se 6 až 17 atomy uhlíku.

4. Monoacylováný analog inzulínu podle nároku 2, kde acylační skupinou je mastná kyselina se 13 až 17 atomy uhlíku.

5. Monoacylováný analog inzulínu podle nároku 1, kterým je B28~Ne-palmitoy1 Lys^B2SPro^B29-lidský inzulín.

6. Monoacylováný analog inzulínu podle nároku 1, kterým je B28-Ne-myristoy1 Lys^B2SPro^B29-lidský inzulín

7. Parenterální farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje jako účinnou látku monoacylovaný analog inzulínu podle nároku 1 až 6 spolu s alespoň jednou terapeuticky vhodnou přísadou ze souboru zahrnujícího konzervační činidlo, isotonické činidlo a pufr.

8.

j í

Parenterální farmaceutický prostředek, vyznač um, že obsahuje jako účinnou látku směs in• · · · · · • · • · • · · · · · ··*> ···· ·· • · · · · · · · · * • ··· · · · · · ··· * • · · · » · · ···· ··· ·· ·· ·· ·

- zulínu nebo inzulínového analogu a monoacylováný analog inzulínu podle nároku 1 až 6 ve hmotnostním poměru 1 až 99 : 99 až

1 .

9. Parenterální farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje jako účinnou látku směs Lys^B28Pro^B29-lidského inzulínu a B28-Ne-acy1 ováného Lys^B2SPro^B29-lidského inzulínu.

10. Způsob ošetřování nemocných trpících hyperglycemií, vyznačující se t í m , že se jim podává parenterální farmaceutický prostředek obsahující tičinné množství monoacylováného analogu inzulínu podle nároku 1 až 6.

11. Způsob příprvy parenterálηího farmaceutického prostředku, vyznačující se t í m , že se mísí monoacy1 ováný analog inzulínu podle nároku 1 až 6 s isotonickým činidlem a pufrem.

12. Monoacylováný analog inzulínu podle nároku 1 až 6 pro ošetřování diabetes mellitus.

13. Monoacy1 ováný analog inzulínu podle nároku 1 až 6 pro ošetřování diabetes mellitus popsaný v příkladech.