CZ164894A3 - Novel human inhibitor of kunitz-type protease and variants thereof - Google Patents

Description

( Tento vynález se týká nového lidského inhibitoru proteasy

Kunitzova typu a jeho variant, DNA kódující tento nový inhibitor a jeho varianty, způsobu výroby tohoto nového inhibitoru a jeho variant a farmaceutického prostředku obsahujícího tento nový inhibitor a jeho varianty.

Dosavadní stav techniky

Polymorfonukleární leukocyty (neutrofily nebo PMN) a mononukleární fagocyty (monocyty) hrají důležitou roli při poranění tkáně, infekci, akutním a chronickém zánětu a při hojení ran. Tyto buňky migrují z krve do místa zánětu a po příslušné stimulaci uvolňují oxidující sloučeniny (0/, 0/, H₃0₂ a H0C1) a takéí granule, které obsahují rozmanité proteolytické enzymy. Sekretované granule obsahují mimo jiné alkalickou fosfatasu, metaloproteinasy, jako je gelatinasa a kolagenasa, a serinové proteasy, jako je neutrofilní elastasa, kathepsin G a proteinasa-3.

Latentní metaloproteinasy se uvolňují společně s tkáňovým inhibitorem metaloproteinasy (TIMP). Mechanismus aktivace není dosud zcela objasněn, ale je pravděpodobné, že v tomto procesu hraje roli oxidace thiolových skupin a/nebo proteolysa. Také aktivita volné metaloproteinasy je závislá na deaktivaci TIMP.

V azurofilních granulích leukocytů existují serinová proteasová neutrofilní elastasa, kathepsin G a proteinasa-3 jako aktivní enzymy komplexované s glukosaminoglykany. Tyto komplexy nejsou aktivní, ale při sekreci disociují a uvolňují aktivní enzymy. Pro neutralizování proteasové aktivity se v plasmě nacházejí velká množství inhibitorů inhibitoru ai-proteinasy (a_x-PI) a inhibitoru cti-chymotrypsinu ’ (ce_x-ChI). PMN jsou však schopny deaktivovat inhibitory místně. oú-PI, který je nejdůležitějším inhibitorem neutrofilní elastasy, je tedy citlivý na oxidaci v reakčním centru (Met-358) metabolity kyslíku produkovanými aktivovanými PMN. To snižuje přibližně 2000-krát afinitu α^ΡΙ na neutrofilní elastasu.

Po místní neutralizaci α^-PI je elastasa schopna degradovat četné inhibitory jiných proteolytických enzymů. Elastasa štěpí ati-Chl a podporuje tedy aktivitu kathepsinu G. Také štěpí TIMP, což vede k tkáňové degradaci metaloproteinasami. Elastasa dále štěpí antitrombin III, heparinový kofaktor II a inhibitor tkáňového faktoru TFPI (tissue factor pathway inhibitor), což možná podporuje tvorbu sraženiny. Na druhé straně se předpokládá schopnost neutrofilní elastasy degradovat koagulační faktory, což má opačný efekt, takže celkový účinek elastasy není jasný. Vliv neutrofilní elastasy na fibrinolysu je méně nejednoznačný. Fibrinolytická aktivita stoupá, jestliže elastasa štěpí inhibitor plasminogenového -aktivátoru- a—inhit>itor_ a₂_______ plasminu. Kromě toho oba tyto inhibitory jsou oxidovány a deaktivovány metabolity 0₂.

PMN obsahují velká množství serinových proteas. Denně se uvolňuje asi 200 mg každé z leukocytových proteas, aby působily na invazivní činidla v těle. Akutní zánět vede k mnohonásobnému zvýšeni množství uvolňovaných enzymů. Za normálních podmínek je proteolysa udržována na přijatelně nízké úrovni velkými množstvími inhibitorů a_x-PI, a_r-ChI a ot_a makroglobulinu. Existují však některé náznaky, že četná chronická onemocnění jsou způsobována pathologickou proteolysou díky přestimulaci PMN, způsobené například autoimunitní odpovědí, chronickou infekcí, tabákovým kouřem nebo jinými dráždivými Činidly atd.

O aprotininu (inhibitor hovězího pankreatického trypsinu) je známo, Že inhibuje různé serinové proteasy, mezi něž patří trypsin, chymotrypsin, plasmin a kalikrein, a že se terapeuticky používá při léčeni akutní pankreatitidy, různých stavů syndromů šoku, hyperfibrinolytické hemoragie a infarktu myokardu (viz například J. E. Trapnell a spol.: Brit. J. Surg. 61, 177 (1974), J. McMichan a spol.: Circulatory Shock 9, 107 (1982),

L. M. Auer a spol.: Acta Neurochir. 49. 207 (1979), G. Sher: Am. J. Obstet. Gynecol. 129. 164 (1977) a B. Schneider: Artzneim.-Forsch, 26, 1606 (1976).). Podáváni aprotininu ve vysokých dávkách významně snižuje ztrátu krve při srdeční chirurgii včetně operací s kardiopulmonárnim obchvatem (viz například B. P. Bidstrup a spol.: J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 364 (1989) a W. van Oeveren a spol.: Ann. Thorac. Surg. 44. 640 (1987).). Již dříve bylo ukázáno (viz H. R. Wenzel a H. Tschesche: Angew. Chem. Internát. Ed. 20. 295 (1981).), že některé analogy aprotininu, např. aprotinin (1-58, Vall5) vykazují relativně vysokou selektivitu na granulocytovou elastasu a inhibiční efekt na kolagenasu, aprotinin (1-58, Alal5) má slabý vliv na elastasu, zatímco aprotinin (3-58, Argl5, Alal7, Ser42) má vynikající inhibiční účinek plasmového kalikreinu (viz spis Světového úřadu WO 89/10374).

- . 4

Bylo vsak zjištěno, že v případě podávání in vivo, má a-^5, protinin nefrotoxický účinek na krysy, králíky a psy po opakovaných injekcích v relativně vysokých dávkách aprotininu (Bayer: Trasylol, Inhibitor of proteinase, E. Glaser a spol.'* ‘fe v Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fůr Innere Medizin/’ 78. Kongress, Bergmann, str. 1612 až 1614, Mnichov, 1972.).^ Nefrotoxicita (projevující se mimo jiné jako poranění) pozorovaná u aprotininu by mohla být připisována akumulaci aprotininu v proximálních tubulárních buňkách ledvin jako výsledek vysokého positivního náboje aprotininu, který způsobuje, že je navázán na negativně nabité povrchy těchto kanálků. Tato nefrotoxicita způsobuje, že aprotinin je méně vhodný pro klinické účely, zvláště takové, které vyžadují podávání velkých dávek inhibitoru (jako jsou operace s kardiopulmonárnim obchvatem). Vedle toho je aprotinin hovězím proteinem, který tedy může obsahovat jeden nebo více epitopů, což může při podávání člověku způsobovat nežádoucí imunitní odpověá.

Předmětem tohoto vynálezu je tedy identifikovat lidské inhibitory proteas stejného typu jako je aprotinin (t.j. inhibitory Kunitzova typu) s podobným inhibičním profilem nebo modifi-

kovaným tak, aby vykazoval žádoucí inhibiční profil.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká nového lidského inhibitoru proteasy Kunitzova typu inhibitoru obsahujécého následující sekvenci aminokyselin

Asp Leu Leu Pro Asn Val Cys Ala Phe Pro Met Glu Lys Gly Pro Cys

Gin Thr Tyř Met Thr Arg Trp Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly Glu Cys

Glu Leu Phe Ala Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ser Asn Asn Phe Leu

Arg Lys Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe Thr (sekvence id.

č. 1) nebo její variantu s vlastnostmi inhibitoru proteasy.

V jiném aspektu se tento vynález týká.varianty tohoto inhibitoru obsahující následující sekvenci aminokyselin

X¹ Asn Val Cys Ala Phe Phe Pro Met Glu X^a Gly X¹ Cys X⁴ X⁵ X^s X⁷ X® X* Trp Phe Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly Glu Cys Glu Leu Phe X¹⁰ Tyr Gly Gly Cys X^xl X¹² X¹³ Ser Asn Asn Phe X¹⁴ X¹⁵ X¹® Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe X¹⁷ (sekvence id. č. 2), v níž X¹ znamená atom vodíku nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys, X² až X^lfi znamenají nezávisle na sobě zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny s výjimkou Cys a X¹⁷ znamená hydroxylovou skupinu nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys s tím, že alespoň jeden z aminokyselinových zbytků X¹ až X¹⁷ znamená jiný zbytek aminokyseliny než je odpovídající zbytek aminokyseliny přirozené sekvence.

Pojem zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny znamená zbytek jakékoliv z 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin, tj. Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser,

Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg a His.

Nový inhibitor byl isolován z knihovny lidských genomových DNA klonováním homologní PCR (polymerasové řetězová reakce). Aminokyselinové sekvence známých lidských domén inhibitoru proteasy Kunitzova typu byly srovnány se sekvencemi aprotininu. Byly identifikovány dvě oblasti, I a II, odpovídající aprotininovým aminokyselinovým zbytkům 12 až 16 a 35 až 38. Byly navrženy degenerované PCR primery odpovídající homologní oblasti I a degenerované PCR primery odpovídající homologní oblasti II. PCR primery nesly 5' prodloužení obsahující restrikční rozpoznávací místo pro účely klonování. Z PCR pokusu zahrnujícího dva z těchto primerů byla identifikována DNA sekvence odpovídající nové doméně inhibitoru proteasy Kunitzova typu. Tato DNA sekvence byla použita jako sonda pro isolaci DNA sekvence o plné délce prohledáváním (testováním) lidské genomové kosmidové knihovny. Postup isolace je podrobněji popsán v níže uvedeném příkladu 1 s odkazem na obrázky 1 a 2. V další části spisu je nový inhibitor označován HKI B9.

Substituováním jedné nebo více aminokyselin v jedné nebo ve více shora uvedených polohách je možné změnit profil inhi-;

A.

bitoru HKI B9 tak, že preferenčně inhibuje neutrofilní elasta•A, su, kathepsin G a/nebo proteinasu-3. Dále je možné zkonstruovat varianty, které specificky inhibují enzymy, které jsou přítomny při koagulaci nebo fibrinolyse (např. plasmin nebo plasmový kalikrein), nebo doplňkovou kaskádu.

Jednou z výhod HKI B9 je to, že má nulový náboj na rozdíl od aprotininu, který má, jak bylo shora uvedeno, silný positivní náboj. Je tedy možné zkonstruovat varianty podle vynálezu s nižším positivním nábojem než má aprotinin a tím snížit riziko poškození ledvin při podávání velkých dávek těchto variant. Jinou výhodou je to, že na rozdíl od aprotininu jde o lidský protein (fragment), takže nežádoucí imunologické reakce při podávání lidem jsou významně sníženy.

Příklady výhodných variant HKI B9 jsou varianty, v nichž X¹ znamená Asp-Leu-Leu-Pro, nebo v nichž X² znamená zbytek a-

minokyselin, který je vybrán ze skupiny sestávající z Ala, Arg,

Thr, Asp, Pro, Glu, Lys, Gin, Ser, Ile a Val, zvláště takové, v nichž X² znamená Thr nebo Lys, nebo v nichž X³ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Pro, Thr, Leu,

Arg, Val a Ile, zvláště takové, v nichž X³ znamená Pro nebo Ile, nebo v nichž-X⁴ znamená-zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly,

Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn a Ala, zvláště takové, v nichž X⁴ znamená Lys, Val, Leu, Ile, Thr, Met, Gin nebo Arg, nebo v nichž X^s znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Ala, Gly, Thr, Arg, Phe, Gin a Asp, zvláště takové, v nichž X⁵ znamená Ala, Thr, Asp nebo Gly, nebo v nichž X⁶ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestává jící z Arg,

Ala, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr,

Phe, Asn, Ile a Met, zvláště takové, v nichž X⁶ znamená Arg,

Phe,Ala', Leu“nebo Tyr, nebo v nichž X’ znamená zbytek aminoky--— seliny vybrané ze skupiny sestávající z Ile, Met, Gin, Glu,

Thr, Leu, Val a Phe, zvláště takové v nichž X’ znamená Ile, nebo v nichž X® znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro a Phe, zvláště takové v nichž X® znamená Ile nebo Thr, nebo v nichž X⁹ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Arg, Ser, Ala, Gin, Lys a Leu, zvláště takové v nichž X® znamená Arg, nebo v nichž X¹⁰ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Gin, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp,

Ala, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg a Val, zvláště takové, v nichž X¹⁰ znamená Val nebo Ala, nebo v nichž X¹¹ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Gly, Met,

Gin, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro a Asn, zvláště takové, v nichž X¹¹ znamená Arg nebo Gly, nebo v nichž X¹² znamená Ala nebo Gly, nebo v nichž X¹³ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Lys, Asn a Asp, zvláště takové, v nichž Xⁱ³ znamená Lys nebo Asn, nebo v nichž X¹¹ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly,

Leu, Ser, Ile, Gin, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Arg, Trp a

Lys, zvláště takové, v nichž X¹⁴ znamená Lys nebo Leu, nebo v nichž X¹⁵ znamená Arg, Ser nebo Thr, nebo v nichž X¹⁶ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Glu, Lys, Gly a Ala, zvcláště takové v nichž X¹⁶ znamená Lys nebo Ala, nebo v nichž X¹⁷ znamená Thr. Ve výhodném uspořádání X¹ znamená Asp-Leu-Leu-Pro a X¹⁷ znamená Thr při čemž X² až X¹⁶ znamenají jak shora uvedeno.

Varianty HKI B9 podle vynálezu by s výhodou neměly obsahovat zbytek Met ve vazebné oblasti proteasy (tj. zbytcích aminokyselin X³ až X¹⁴). Analogicky ke shora popsanému al-PI by zbytek Met v kterékoliv z těchto poloh způsobil, že inhibitor by byl citlivý na oxidační deaktivaci metabolity kyslíku produkovanými PMN a naopak, nedostatek zbytku Met v těchto polohách by způsobil, že inhibitor by byl stabilnější v přítomnosti těchto metabolitů kyslíku.

• il·,·

Běžně výhodnou variantou podle vynálezu je ta varianta// v níž zbytky aminokyselin umístěné na Kunitzově inhibitoru (tj/ X³ aŽ X¹⁴ odpovídající polohám 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 34,* 39, 40, 41 a 46 v aprotininu) jsou substituovány aminokyselinami přítomnými ve stejných polohách přírodního aprotininu./ Tato varianta obsahuje následující sekvenci aminokyselin:

Asp Leu Leu Pro Asn Val Cys Ala Phe Pro Met Glu Lys Gly Pro Cys

Gin Ala Arg Ile Ile Arg Trp Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly Glu Cys

Glu Leu Phe Ala Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn Asn Phe Lys

Ser Lys Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe Thr (sekvence id.

č. 3)

V jiném aspektu se tento vynález týká DNA konstrukce kódující lidský inhibitor Kunitzova typu nebo jeho varianty podle vynálezu. DNA konstrukce podle vynálezu se může připravit synteticky vypracovanými standardními způsoby, např. fosfóamiditovou metodou popsanou S. L. Beaucagem a Μ. H. Caruthersem: Tetrahedron Letters 22. 1859 (1981) nebo 2působem popsaným Matthesem a spol.: EMBO J. 2, 801 (1984). Podle fosfoamiditové metody se oligonukleotidy syntetizují např. v automatickém DNA syntetizátoru, vyčistí, anelují, ligují a klonují se ve vhod8 ných vektorech.

Je možné také používat genomovou nebo cDNA kódující HKI B9 (např. získané testováním genomové knihovny). Tato DNA sekvence může být modifikována na jednom nebo více místech odpovídajících místu (místům), v němž (nichž) je žádoucí provést substituce aminokyselin, např. místně řízenou routagenesou s použitím syntetických oligonukleotidů kódujících žádanou sekvenci aminokyselin pro homologni rekombinaci podle dobře známých postupů .

Podle dalšího aspektu se tento vynález týká rekombinantního expresního vektoru, který obsahuje DNA konstrukci podle vynálezu. Rekombinantní expresní vektor může znamenat jakýkoliv vektor, který může být vhodně podroben postupům rekombinace

DNÁ. Výběr vektoru bude často závisetna -host itelské- buňce , do —.......

které se má zavést. Vektorem tedy může být autonomně se replikující vektor, tj. vektor, který existuje jako extrachromosomální jednotka, jehož replikace je nezávislá na chromosomální replikaci, např. plasmid. Vektorem může být také taková jednotka, která se po zavedení do hostitelské buňky integruje do genomu hostitelské buňky a replikuje se společně s chromosomem (chromosomy), do něhož (nichž) je integrována.

Ve vektoru by měla být DNA sekvence kódující HKI B9 nebo její variantu podle vynálezu odštěpitelně napojena na vhodnou promotorovou sekvenci. Promotorem může být jakákoliv DNA sekvence, která má transkripční aktivitu ve zvolené hostitelské buňce. Může být odvožen od genů kódujících proteiny, které jsou ......

s hostitelskou buňkou buá homologni nebo heterologní. Příklady vhodných promotorů pro řízení transkripce DNA kódující inhibitor podle vynálezu v savčích buňkách jsou SV 40 promotor (Subramani a spol.: Mol. Cell Biol. 1, 854 (1981).), MT-1 (metalothioneinový gen) protomor (Palmiter a spol.: Science 222, 809 (1983).) nebo adenovirus 2 hlavní pozdní promotor. Mezi promotory vhodné pro použití v kvasinkových hostitelských buňkách patří promotory z kvasinkových glykolytických genů (Hitzeman a spol.: J. Biol. Chem. 255. 12073 (1980), Alber a Kawasaki:

J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 (1982).) nebo alkohol-dehydrogenasových genů (Young a spol. v Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, (Hollaender a spol., red.), Plenům Press, New York, 1982.), TPI1 (USA patent 4 599 311) nebo ADH2-4c (Russell a spol.: Nátuře 304. 652 (1983).) promotory. Vhodnými promotory pro použití v hostitelských buňkách vláknitých hub jsou například promotor ADH3 (McKnight a spol.: The EMBO J. 4, 2093 (1985).) nebo promotor tpiA.

DNA sekvence kódující inhibitor podle vynálezu může být také odštěpitelné napojena na vhodný terminátor, jako je terminátor lidského růstového hormonu (Palmiter a spol.: shora uvedená citace) nebo (pro houbové hostitele) TPI1 (Alber a Kawasaki: shora uvedená citace) nebo ADH3 (McKnight a spol.: shora uvedená citace) promotory. Tento vektor může dále obsahovat ta-; kové prvky, jako jsou polyadenylační signály (např. z SV 40 ne-, bo Elb oblasti adenoviru 5), transkripční zesilovací sekvence (např. zesilovač SV 40) a translačni zesilovací sekvence (např. ty, které kóduji adenovirus VA RNA).

‘T

Rekombinantní expresní vektor podle vynálezu může dále obsahovat DNA sekvenci, která umožňuje, aby se vektor replikoval v příslušné hostitelské buňce. Příklady takové sekvence (jestliže hostitelskou buňkou je savčí buňka) je počátek replikace SV 40 nebo (jestliže hostitelskou buňkou je buňka kvasinky) kvasinkové plasmidové 2μ replikační geny REP 1-3 a počátek replikace. Vektor může obsahovat také selektovatelný markér, např. gen, jehož produkt doplňuje defekt v hostitelské buňce, jako je gen kódující dihydrofolátreduktasu (DHFR) nebo takový, který uděluje resistencí na léčivo, např. na neomycin, hygromycin nebo methotrexát, nebo Schi zosaccharomyces pombe TPI gen (popsaný P. R. Russellem: Gene 40, 125 (1985).).

Postupy, které jsou používány pro ligování DNA sekvencí kódujících inhibitor podle vynálezu, promotor a terminátor, a 2působy, jak je vložit do vhodných vektorů obsahujících infor10 mace nutné pro replikaci, jsou dobře známy odborníkům (viz např. Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Hostitelskou buňkou, do níž se zavádí expresní vektor podle vynálezu, může být jakákoliv buňka, -která je schopna, produ-. kovat inhibitor podle vynálezu. Touto buňkou je s výhodou eukaryotická buňka, jako je savčí, kvasinková nebo houbová buňka.

Kvasinkovým organismem používaným jako hostitelská buňka podle vynálezu může být jakýkoliv kvasinkový organismus, který při kultivaci produkuje velká množství inhibitoru podle vynálezu. Příklady vhodných kvasinkových organismů jsou kmeny kvasinek druhu Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces kluyveri, Schi zosaccharomyces pombe nebo Saccharomyces uvarum. Transformace kvasinkových buněk se“ může provádět například tvorbou protoplastů a následující transformací, která je známa sama o sobě.

Příklady vhodných savčích buněčných linií jsou buněčné linie COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) nebo CHO (ATCC CCL 61). Způsoby, kterými se provádí transfekce.savčích buněk, a způsoby, při nichž dochází k expresí DNA sekvencí zavedených do buněk, jsou popsány například Kaufmanem a Sharpera: J. Mol. Biol. 159, 601 (1982), Southernem a Bergem: J. Mol. Appl. Genet. 1, 327 (1982), Loyterem a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79. 422 (1982), Wiglerem a spol.: Cell 11, 725 (1978), Corsarem a Pearsonem: Somatic Cell Genetics 2, 603 (1981), Grahamem a van der Ebem: Virology' 52y 456 (1973) a Neumannem a spol.: EMBO J. 1, 841 (1982).

Jako hostitelské buňky podle vynálezu se mohou používat také buňky hub. Příklady vhodných buněk hub jsou buňky vláknitých hub, např. Aspergillus sp. nebo Neurospora sp.. zvláště pak kmenů Aspergillus oryzae. nebo Aspergillus niger. Použití Aspergillus sp. pro expresi proteinů je popsáno např. v evropském patentu.238 023.

Tento vynález se dále týká způsobu výroby inhibitoru podle tohoto vynálezu, způsobu kultivace buněk jak shora popsáno za podmínek podporujících expresi inhibitoru a isolace výsledného inhibitoru z kultury.

Mediem, které se používá ke kultivaci buněk, může být jakékoliv konvenční medium, které je vhodné pro růst savčích buněk nebo buněk hub (včetně kvasinkových buněk), podle toho, jaká hostitelská buňka se vybere. Inhibitor je hostitelskými buňkami sekretován do růstového media. Z tohoto media se isoluje konvenčními postupy, mezi něž patří oddělení buněk od media odstřeáováním nebo filtrací, vysrážení proteinových složek supernatantu nebo filtrátu solí, např. síranem amonným, vyčištění různými chromatografickými postupy, např. chromatografií na ionexu nebo afinitní chromatografií, nebo podobné postupy. _

Tento vynález se týká také farmaceutického prostředku, který obsahuje HKI B9 nebo jeho variantu podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem. Při pří' -:.-pravě prostředku podle vynálezu se varianta zpracovává jakými-:

O a koliv známými způsoby přípravy farmaceutických prostředků, např. tak, jak je to popsáno v *'Remington's Pharmaceutical Sci- ences”, 1985. Prostředek se typicky připravuje ve formě vhodné pro systémovou injekci nebo infusi, může být připraven jako roztok se sterilní vodou, isotonickým solným roztokem nebo roztokem glukosy.

HKI B9 nebo jeho varianta podle vynálezu je tedy určena s výhodou pro použití pro takové terapeutické aplikace, které předpokládají použití přírodního aprotininu nebo analog aprotininu s jinými inhibičními profily, zvláště tehdy, jestliže je nutné používat velké dávky aprotininu. Mezi terapeutické aplikace, pro které je indikováno použití variant podle vynálezu jako důsledek jejich schopnosti inhibovat lidské serinové proteasy, např. trypsin, plasmin, kalikrein, elastasu, kathepsin G a proteinasu-3, patří (ale není na ně omezeno) akutní pankreatitida, zánět, trombocytopenie, ochrana funkce krevních destiček, ochrana orgánů, hojení ran, šok (včetně plicního šoku) a stavy zahrnující hyperf ibrinolytickou hemoragii, emfyzém, reumatickou artritidu, syndrom úzkosti při dýchání u dospělých, chronické zánětlivé střevní onemocněni a psoriasu, jinými slovy onemocněni, o kterých se předpokládá, že jsou způsobena pathologickou proteolysou elastasou,- kathepsinem G a proteinasou-3 uvolňovanou z aktivovaných PMN.

Vedle shora uvedeného farmaceutického použití se ΗΚΙ B9 nebo jeho varianta jak shora uvedeno mohou používat pro isolaci přírodních látek, např. proteas nebo receptorů z lidského materiálu, které se vážou přímo nebo nepřímo na TFPI doménu II Kunitzova typu, například vyhledáváním testováním nebo afinitní chromatograf i í.

Příklady provedeni vynálezu

Obecná metodika

Standardní DNA techniky byly prováděny tak, jak je to popsáno v literatuře (Sambrook J., Fritsch E. F. a Maniatis T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NÝ, USA). Syntetické oligonukleotidy byly připraveny na automatickém DNA syntetizátoru (380B, Applied Biosystems) fosforamiditovou chemií na skleněném nosiči s regulovanou velikost pórů (Beaucagě S. L. a Caruthers Μ. H.: Tetrahedron Letters 22. 1859 (1981).). Sekvence DNA byly stanovovány dideoxy technikou (Sanger F.“Mick---len S., Coulson A. R.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977).). Polymerasové řetězové reakce (PCR) byly prováděny na přístroji DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus).

Analýza aminokyselin byla prováděna po hydrolýze v 6M HCl při 110 °C ve zkumavce (zatavené ve vakuu) po dobu 24 hodin.

Analýzy byly prováděny na automatickém analyzátoru aminokyselin

Becknam 121MB modifikovaném pro práce v mikroměřítku. Sekvenač13 ní analýza aminokyselin z N-konce byla prováděna automatizovanou Edmanovou degradací sekvenátorem Applied Biosystems 470A gas-phase sequencer. Detegování a kvantitativní stanovení uvolněných pTH aminokyselin z každého sekvenačního cyklu se provádí průběžnou analýzou HPLC s obrácenými fázemi.

Molekulové hmotnosti byly stanovovány na hmotovém spektrometru BIO-ION 20 s plasmovou desorpcí (PDMS) s náletovou trubicí o přibližné délce 15 cm, pracujícím v positivním modu. 5μ1 podíly byly analyzovány při urychlujícím napětí 15 kv. Byly isolovány ionty odpovídající 5 milionům štěpení. Přesnost přiřazení molekulových iontů je pro dobře definovaná maxima přibližně 0,1 %, v ostatních případech je poněkud menší.

Přiklad 1

Klonování lidské domény HKIB9 inhibitoru proteasy Kunitzova typu

A. PCR klonování _t5

·.?

pg lidské placentové genomové DNA (Clontech, Palo Alto, Ka., USA, kat. č. 6550-2) se použije jako templát v každé z 18 PCR reakcí se 100 pmoly pravého primeru A, B, C, E, F nebo H a 100 pmoly levého primeru X, Y nebo Z, viz obrázek 2. PCR reakce se provádějí v objemu 100 μΐ s použitím komerční sestavy (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus). Reakční směs se zahřívá na 95 °C po dobu 4 minut a potom se provede následující cyklus: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 1 minuty. Po 30 cyklech se teplota 72 °C udržuje po dobu 10 minut.

Reakční směs se zpracuje elektroforesou na 2% agarosovém gelu. Isolují se DNA fragmenty o velikosti 100 párů nukleotidů. Po rozštěpení působením EcoRI a Xbal se provede ligace s EcoRI a Xbal fragmentem o 2800 párech nukleotidů z plasmidů pTZ19R (Pharmacia LKB, Uppsala, Švédsko, kód č. 27-4986-01, Mead D. A., Szczesna-Skorupa. E. a Kemper B.: Prot. Engin. i, 67 (1986).). Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušného kmene E. coli (r, m⁺) vybraného pro ampicilinovou resistenci. Plasmidy z výsledných kolonií byly analyzovány štěpením působením EcoRI a Xbal a následující gelovou elektroforesou na 2% agarosovém gelu. DNA sekvenování bylo prováděno na plasmidech s inserty o přibližně 91 párech nukleotidů.

Lidské domény inhibitoru proteasy Kunitzova typu byly identifikovány chrakateristickou DNA sekvencí, TG(T/C)NNNNNNTT(T/C)NNN, odpovídající oblasti obsahující kodony invarianty Cys 30 a Phe 33 (aprotininové číslování, na obrázku 1 označeny hvězdičkou) ve správné vzdálenosti od dvou použitých PCR primerů.

Vedle známých lidských domén inhibitoru proteasy Kunitzova typu a nesouvisejících sekvencí byla z PCR reakce obsahující primery B á Y identifikována nová DNA sekvence-odpovídající— lidské doméně inhibitoru proteasy Kunitzova typu, HKIB9. DNA sekvence mezi dvěma takto získanými PCR primery HKIB9 a odpovídající sekvence aminokyselin jsou uvedeny níže:

TYMTRWFFNFETGECELFA

AACCTACATGACGCGATGGTTTTTCAACTTTGAAACTGGTGAATGTGAGTTATTTGCT

Shora uvedená charakteristická DNA sekvence je podtržena.

B. Prohledávání (testování) knihovny

Lidská genomová DNA kosmidová knihovna se zkonstruuje následujícím způsobem: Z úplné lidské krve se isoluje lidská ge---noroová DNA. Po částečném rozštěpení působením Sau3A se DNA ligu je do BamHI místa kosmidového vektoru pWE15 (Stratagene, La Jolla, Ka., USA). Pomocí oligonukleotidové sondy 4280 ' CAAATAACTCACATTCACCAGTTTCAAAGTTGAAAAACCATCGCGTCATGTAGGT 3 ' označené ^3aP v poloze 5' bylo testováno přibližně 420 000 kolonií. Filtr.y byly hybridizovány přes noc při 65 °C v 5xSSC,

SxDenhardtově roztoku, 0,1% SDS. Filtry se pak promývají v lxSSC, 0,1% SDS jednu hodinu při 65 °C a nakonec se exponují na film. Byl identifikován positivní kosmid. Byl isolován Pstl fragment o 3500 párech nukleotidu a subklonován do plasmidů pUCIS. Výslekem je plasmid pMb-106. DNa sekvenování pMb-106 vedlo k sekvenci uvedené jako sekvence id. č. 4.

Příklad 2

Výroba lidské domény HKIB9 inhibitoru proteasy Kunitzova typu z kvasinkového kmene KFN-1830 μφ lidské placentové genomové DNA (Clontech, Palo AIto, Ka,, USA, kat. č. 6550-2) se použije jako templát v PCR reakci se 100 pmoly primerů N-l (CCGTTTCTAGATTAGGTG-AACTTGCAGAATTTCTC), ή»* a N-2 (GCTGAGAGATTGGAGAAGAGAGATCTCCTCCC-AAATGT). N-l je doplňa kový k nukleotidům č. 346 až 367 v genomové DNA sekvenci HKIB9 na obrázku 3 a nese 5' prodloužení obsahující translačni stop kodon následovaný místem Xbal. 17 nukleotidů N-2 na 3' konci je identických s nukleotidy č. 187 až 207 v genomové DNA sekvenci HKIB9 v sekvenci id. č. 4 a 21 nukleotidů na 5' konci je identických s nukletidy 215 až 235 v syntetické leader sekvenci (sekvence id. č. 5) z níže popsaného plasmidů pKFN-1000.

PCR reakce byla prováděna v objemu 100 μΐ pomocí komerční sestavy (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus) v následujícím cyklu: 94 °C po dobu 20 sekund, 50 °C po dobu 20 sekund a 72 °C po dobu 30 sekund. Po 19 cyklech byl proveden konečný cyklus, v němž byl stupeň se 72 °C udržován po dobu 10 minut. PCR produkt, fragment o 215 párech nukleotidů, byl isolován elektroforesou na 2% agarosovém gelu.

Signál-leader: 0,1 μg PvuII fragmentu o 700 párech nukleotidů z níže popsaného pKFN-1000 se použije jako templát v PCR reakci obsahující 100 pmolů obou primerů: NOR-1478 (GTAAAACGACGGCCAGT) a NOR-2523 (TCTCTTCTCCAATCTCTCAGC). NOR-1478 páruje sekvenci proti směru vlákna od místa EcoRI v sekvenci id. č.

6. Primer NOR-2523 je doplňkový k 17 nukleotidům na 3' konci syntetického leader genu plasmidu pKFN-1000, viz sekvence id. č. 6. PCR reakce se provede jak shora uvedeno. Získá se tak fragment o 257 párech nukleotidů.

Plasmid pKFN-1000 je derivátem plasmidu pTZ19R (Mead D. A., Szczesna-Skorupa E. a Kemper B.: Prot. Engin. 1, 67 (1986).) obsahujícího DNA kódující syntetický kvasinkový signál-leader peptid. Plasmid pKFN-1000 je popsán ve spisu Světového úřadu WO 90/10075. DNA sekvence o 235 párech nukleotidů po směru vlákna od místa EcoRI plasmidu pKFN-1000 a kódovaná sekvence aminokyselin syntetického kvasinkového signál-leaderu je uvedena v sekvenci id. č. 6.

Signál-leader-HKIB9: Smíchá se přibližně 0,1 pg obou shora popsaných PCR fragmentů. Provede se PCR reakce se —100 -pmoly každého z obou primerů NOR-1478 a N-l a následující cyklus: 94. °C po dobu 1 minuty, 50 ^eC dvě minuty a 71 °C tři minuty. Po 16 cyklech se provede konečný cyklus, při kterém se teplota 72 °C udržuje 10 minut.

Výsledný fragment o 451 párech nukleotidů se vyčistí elektrof oresou na 1% agarosovém gelu. Potom se rozštěpí působením EcoRI a Xbal. Výsledný fragment o 418 párech nukleotidů se ligu je s EcoRI-Xbal fragmentem o 2800 párech nukleotidů z pTZl9. Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušného kmene Jg. coli (r^-, m⁺) vybraného pro ampicilinovou resistenci. DNA sekvenování ukázalo, že plasmidy 2 výsledných kolonii obsahovaly DNA sekvenci pro HKIB9 správně napojený na syntetický kvasinkový signál-leader gen. Jeden plasmid pKFN-1826 se vybere pro další použití.

EcoRI-Xbal fragment o 418 párech nukleotidů z pKFN-1826 se liguje s Ncol-Xbal fragmentem o 9500 párech nukleotidů z pMT636 a Ncol-EcoRI fragmentem o 1400 párech nukleotidů z pMT636. Výsledkem je plasmid pKFN-1827.

Plasmid pMT636 je popsán v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/DK88/00138. Plasmid pMT636 je E. coli - S. cerevisiae vektor pro více hostitelů obsahující Schizosaccharomyces pombe TPI gen (POT) (Russell P. R.: Gene IQ, 125 (1985).), S. cereyJL· siae triosefosfát-isomerasový promotor a terminátor, TPI_p a TPI_T (Alber T. a Kawasaki G.: J. Mol. Appl. Gen. 1, 419 (1982).).

Expresní kazeta plasmidu pKFN-1827 obsahuje následující sekvenci:

TPIp - KFN1000 signál-leader - HKIB9 - TPI_T .

Konstrukce plasmidu pKFN-1827 je ilustrována na obrázku

3.

DNA sekvence EcoRI-Xbal fragmentu o 424 párech nukleotidů z pKFN-1827 je uvedena v sekvenci id. č. 8. ý

A * li

Transformace kvasinkami: S. cervisiae kmen MT663 (E2-7B XE11-36, a/α, deltatpi/deltatpi, pep 4-3/pep 4-3) se nechá růst na YPGaL (1% Bacto kvasinkový extrakt, 2% Bacto pepton, 2% galaktosa, 1% laktát) na optickou hustotu 0,6 při 600 nm.

i

100 ml kultury se zpracuje odstřeáováním, promytim vodou (10 ml), opětovným odstřeáováním a resuspendováním v 10 ml roztoku, který obsahuje 1,2M sorbitol, 25mM NaJEDTA, pH 8,0, a 6,7 mg/ml dithiothreitolu. Tato suspenze se inkubuje 15 minut při 30 °C, odstřeáuje a buňky se resuspendují v 10 ml roztoku obsahujícího 1,2M sorbitol, lOmM Na_aEDTA, 0,lM citran sodný, pH 5,8, a 2 mg Novozymu^(R) 234. Tato suspenze se inkubuje 30 minut při 30 °C, buňky se isolují odstřeáováním, promyjí se 10 ml 1,2M sorbitolu a 10 ml CAS (1,2M sorbitol, lOmM chlorid vápenatý, lOmM Tris HCl (Tris znamená tris(hydroxymethyl)arainomethan, pH 7,5) a resuspendují se ve 2 ml CAS. Pro transformaci se buňky resuspendované v CAS (0,1 ml) smíchají s přibližně 1 Mg plasmidu pKFN-1827 a nechají se za teploty místnosti 15 minut. Přidá se 1 ml směsi (20% polyethylenglykol 4000, 20mM chlorid vápenatý, lOmM chlorid vápenatý, lOmM Tris HCl, pH 7,5) a směs se nechá dalších 30 minut za teploty místnosti. Tato směs se pak odstřeluje. Peleta se resuspenduje v 0,1 ml SOS (1,2M sorbitol, 33% (obj. díly k obj. dílům) YPD, 6,7mM chlorid vápenatý, 14 Mg/ml leucinu) a inkubuje se 2 hodiny při 30 °C. Suspenze se odstřeluje. Paleta se resuspenduje v 0,5 ml 1,2M sorbitolu. Potom se při 52 °C přidá 6 ml vrchního agaru (SC medium podle Shermana a spol. (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).), obsahující 1,2M sorbitol a 2,5% agar) a suspenze se nalije na povrch desek obsahujících ztuhlý agar a medium obsahující sorbitol.

Transformované kolonie se odeberou po 3 dnech při 30 °c, opět se isolují a použijí se pro nastartování kapalných kultivace!. Jeden z těchto transformantů KFN-1830 se vybere pro další charakterizaci.

Fermentace: Kvasinkový kmen KFN-1830 se nechá růst na mediu YPD (1% kvasinkový extrakt, 2% pepton (od Difco Laboratories) a 3% glukosa). 200 ml kultury tohoto kmene se třepe při 30 °C do optické hustoty 24 při 650 nm. Po odstřeáování se supernatant isoluje.

Hodnota pH kvasinkového supernatantu se 5% kyselinou octovou a kyselinou fosforečnou upraví na 3,0, Kvasinkový supernatant se nanese na kolonu s nosičem S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) a ekvilibrujé se 50raM kyselinou mravenčí, pH 3,7. Po promytí ekvilibračním pufrem se HKI-ďoména eluuje 1M chloridem sodným. Odsolení se provede na koloně s nosičem Sephadex G-25 (Pharmacia) ekvilibrované a eluované 0,1% hydrogenuhličitanem amonným, pH 7,9. Po zahuštění odstřeáováním ve vakuu a úpravě pH na 3,0 se další čištění provádí na koloně Mono S (Pharmacia) ekvilibrované 50mM kyselinou mravenčí, pH 3,7. Po promytí ekvilibračním pufrem se použije gradientově eluce od 0 do 1M chloridu sodného v ekvilibračním pufru. Konečné vyčištění se provede na koloně Vydac C4 (The Separation Group, Ka., USA) HPLC na obrácených fázích gradientovou elucí od 5 do 55 % acetonitrilu s 0,1 % TFA. Vyčištěný produkt se lyofilizuje odstřeáováním ve vakuu a opětovným rozpuštěním ve vodě.

Podíly se analyzují hmotovou (PD-mass) spektrometrií (molekulová hmotnost: nalezeno: 6853,5, vypočteno: 6853,8) a aminokyselinovým sekvenováním z N-konce 45 Edmanovými degradačnimi cykly, které potvrdilo primární strukturu HKI B9 domény.

Příklad 3

Násobné mutace HKIB9 v poloze 15 a 16

0,1 pg SphI-BamHI fragmentu o 1300 párech nukleotidů kódující HKIB9 z plasmidů pKFN-1827 se použije jako templát ve dvou PCR reakcích: V první PCR reakci se použije 100 pmolů obou primerů: NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) a M-752 (GAAAAACCATCGCGTCATGTAG(C/G)C(C/G)A(A/C)ACAAGGGC). V druhé PCR reakci se použije po 100 pmolech primeru NOR-1495 (TAAGTGGCTCAGAATGA) a M-751 (GC<

CCTTGT(T/G)T(C/G)G(C/G)CTACATGACGCGATGGTTTTTC). NOR-2022 se očkuje v poloze 94 párů nukleotidů po směru vlákna od místa Sphl. M-752 je doplňkový k polohám 276 až 310 HKIB9 DNA sekvence (sekvence id. č. 8) až na 5 chybných spárování. NOR-1495 se očkuje v poloze 561 párů nukleotidů proti směru vlákna od místa BamHI. M-751 je doplňkový k M-752.

PCR reakce se provádí v objemu 100 μΐ s použitím komerční sestavy (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus) s následujícím cyklem: 95° c po dobu 1 minuty, 50 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 1 minuty. Po 24 cyklech byl proveden konečný cyklus, v němž byl stupeň se 72 °C udržován po dobu 10 minut. PCR produkty, fragment o 449 párech nukleotidů z první PCR a fragment o 279 párech nukleotidů z druhé PCR reakce, byly isolovány elektroforesou na 2% agarosovém gelu.

Smíchá se přibližně 0,1 μg obou shora popsaných PCR fragmentů. PCR reakce byla prováděna se 100 pmoly každého z obou primerů: NOR-2022 a NOR-1495 v následujícím cyklu: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C po dobu 2 minut a 72 °C po dobu 3 minut.

Po 22 cyklech byl proveden konečný cyklus, v němž byl stupeň se 72 °C udržován po dobu 10 minut.

Výsledný fragment o 693 párech nukleotidů se vyčistí elektrof oresou na 1% agarosovém gelu. Potom se rozštěpí působením, EcoRI a Xbal. Výsledný fragment o 418 párech nukleotidů se liguje s EcoRI-Xbal fragmentem o 2800 párech nukleotidů z plasmidu pTX19R (Mead D. A. , Szczesna-Skorupa E., Kemper B.: Prot. Engin. 1, 67 (1986),).

Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušného kmene g. coli (r‘, m*) vybraného pro ampicilinovou resistenci. DNA sekvenováním bylo identifikováno následujících pět plasmidů kódujících označené HKIB9 analogy napojené na syntetický kvasinkový signál-leader gen:

plasraid analog

pKFN-1892	CQ15V,	T16G]-HKIB9
pKFN-1916	[Q15V,	T16A]-HKIB9
pKFN-1909	[Q15F,	T16G]-HKIB9
pKFN-1912	[Q15F,	716A]-HKIB9
pKFN-1913	[Q15L,	T16A]-HKIB9

EcoRI-Xbal fragmenty o 418 párech nukeotidů z těchto plasmidů se použijí pro konstrukci expresních plasmidů, jak je to popsáno v příkladu 2.

Transformace kvasinkového kmene MT0663, jak je shora popsáno v příkladu 2, vedla k následujícím kvasinkovým kmenům:

kmen kvasinek analog

KFN-1902	[Q15V,	T16G]-HKIB9
KFN-1930	[Q15V,	T16AJ-HKIB9
KFN-1932	[Q15F,	T16G]-HKIB9
KFN-1965	[Q15F,	716A3-HKIB9
KFN-1966	[Q15L,	T16A]-HKIB9

Kultivace transformovaných kvasinkových kmenů v mediu YPD se provádí jak je to popsáno v příkladu 2.

Příklad 4

Výroba [Q15KJ-HKIB9 a [Q15K,T16A)-HKIB9 z kvasinkových kmenů KFN-1974 a KFN-1975

0,1 pg SphI-BamHI fragmentu o 1300 párech nukleotidů kódující HKIB9 z plasmidu pKFN-1827 se použije jako templát ve dvou PCR reakcích: V první PCR reakci se použije po 100 pmolech obou primerů; NOR-2022 (GGAGTTTAGTGAACTTGC) a N-755 (GCGTCATGTAGG(C/T)TTTACAAGGGC). V druhé PCR reakci se použije po 100 pmolech primeru NOR-1495 (TAAGŤGGCTCAGAATGA) a M-759 (GCCCTTGTAAA(G/A)CCTACATGACGC).

NOR-2022 se očkuje v poloze 94 po směru vlákna od místa SphI. M-755 je doplňkový k polohám 276 až 299 HKIB9 DNA sekvence (sekvence id. č. 8) až na dvě chybná spárování. NOR-1495 se očkuje do místa 561 párů nukleotidů proti směru vlákna od místa BamHI. M-759 je doplňkový k M-755.

PCR reakce se provádí v objemu 100 μΐ s použitím komerční sestavy (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus) s následujícím cyklem: 95° C po dobu 1 minuty, 50 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 1 minuty. Po 24 cyklech byl proveden konečný cyklus, v němž byl stupeň se 72 °C udržován po dobu 10 minut. PCR produkty, fragment o 438 párech nukleotidů z první PCR a fragment o 279 pá22 rech nukleotidů z druhé PCR reakce, byly isolovány elektroforesou na 2% agarosovém gelu.

Smíchá se přibližně 0,1 Mg obou shora popsaných PCR fragmentů. PCR reakce byla prováděna se 100 pmoly každého z obou primerů: NOR-2022 a NOR-1495 v následujícím cyklu: 95 °C po dobu 1 minuty, 50 °C po dobu 2 minut a 72 °C po dobu 3 minut. Po 22 cyklech byl proveden konečný cyklus, v němž byl stupeň se 72 °C udržován po dobu 10 minut.

Výsledný fragment o 693 párech nukleotidů se vyčistí elektrof oresou na 1% agarosovém gelu. Potom se rozštěpí působením, EcoRI a Xbal. Výsledný fragment o 418 párech nukleotidů še liguje s EcoRI-Xbal fragmentem o 2800 párech nukleotidů z plasmidu pTX19R (Mead D. A., Szczesna-Skorupa Ε., Kemper B.: Prot. Engin. 1, 67 (1986).). ’ ........... “ - ------------------------------------Tato ligační směs se použije pro transformaci příslušného kmene £. coli (r, m⁺) vybraného pro ampicilinovou resistenci. DNA sekvenováním byly identifikovány následující dva plasmidy kódující označené HKIB9 analogy napojené na syntetický kvasinkový signál-leader gen:

plasmid analog pKFN-1919 [Q15K]-HKIB9 pKFN-1921 [Q15K, T16AJ-HKIB9

EcoRI-Xbal fragmenty o 418 párech nukeotidů z těchto plasmidů se použijí pro konstrukci expresních plasmidu, jak je to shora popsáno v příkladu 2.

Transformace kvasinkového kmene MT-663, jak je to popsáno v příkladu 2, vedla k následujícím kvasinkovým kmenům:

kmen kvasinek analog

KFN-1974 [Q15K]-HKIB9

KFN-1975 [Q15K, T16AJ-HKIB9

Kultivace transformovaných kvasinkových kmenů v mediu YPD se provádí jak je to popsáno v příkladu 2.

Přiklad 5

Inhibice serinových proteinas HKIB9 variantami KFN 1902 a 1930

Z kvasinkového kultivačního media se způsobem popsaným v příkladu 2 vyčistí varianty Kunitzovy domény.

Jejich koncentrace se stanoví z absorbance při 214 nm s aprotininem jako standardem. Vepřový trypsin se získá od Novo Nordisk A/S, hovězí chymotrypsin (zpracovaný TLCK) se získá od firmy Sigma Chemical Co. (St.,Louis, Mo., USA). Lidský neutrofilní kathepsin G a elastasa se vyčistí z extraktů PMN podle způsobu popsaného Baughem a Travisem: Biochemistry 15, 836 (1976).

Peptidy1-nitroanilidové substráty S2251 a S2586 se získají od firmy Kabi (Stockholm, Švédsko), S7388 a M4765 se získají od firmy Sigma Chemical Co.

Serinové proteinasy se inkubují různými koncentracemi variant po dobu 30 minut. Potom se přidá substrát a zbytková proteinasová aktivita se měří při 405 nm.

Bylo zjištěno, že KFN 1902 a KFN 1930 jsou inhibitory neutrofilní elastasy, Ki = 140 nM a 64 nM, mírně inhibují chymotrypsin (5 %) při 1 μΜ, ale za těchto podmínek neinhibují trypsin a kathepsin G.

Tento pokus ukazuje, že je možné převést Kunit2ovu doménu se žádnou známou inhibiční funkcí na inhibitor elastasy.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Žadatel:

(A) jméno: Novo Nordisk A/S (B) ulice: Novo Alle (C) město: Bagsvaerd (E) země: Dánsko (F) poštovní směrovací číslo: DK-2880 (G) telefon: +45 4444 8888 (H) fax: +45 4449 3256 (I) telex: 37304 (ii) Název vynálezu: Nový lidský inhibitor proteasy

Kunitzova typu a jeho varianty (iii) Počet sekvencí: 9 (iv) Počítačová čtecí forma:

(A) typ media: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) počítačový program (software): Patentln Release

č. 1.0, verse č. 1.25 (EPO) (2) Informace o sekvenci id. č. 1:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 60 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Homo sapiens (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 1:

Asp Leu Leu Pro Asn Val Cys Ala Phe Pro Met Glu Lys Gly Pro 15 10 15

Čys Gin Thr Tyr Met Thr Arg Trp Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly 20 25 30

Glu Cys Glu Leu Phe Ala Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ser Asn 35 40 45

Asn Phe Leu Arg Lys Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe Thr 50 55 60 (2) Informace o sekvenci id. č. 2:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 57 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:

(A) organismus: syntetický (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 2:

Xaa Asn Val Cys Ala Phe Pro Met Glu Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa

5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly Glu Cys Glu

30

Leu	Phe Xaa Tyr	Gly Gly Cys Xaa	Xaa	Xaa	Ser	Asn Asn Phe	Xaa
		35		40			45
Xaa	Xaa Glu Lys	Cys Glu Lys Phe	Cys	Lys	Phe	Xaa
		50		55
(2)	Informace o	sekvenci id. č.	3:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 60 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (vi) původní zdroj:

(A) organismus: syntetický (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 3:

Asp Leu Leu Pro Asn Val Cys Ala Phe Pro Met Glu Lys Gly Pro 15 10 15

Cys Lys Ala Arg lle lle Arg Trp Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly 20 25 30

Glu Cys Glu Leu Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Ser Asn 35 40 45

Asn Phe Lys Ser Lys Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe Thr 50 55 60 (2) Informace o sekvence id. č. 4:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 502 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Homo sapiens (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: Ϊ87'Ϊ~366“~' * (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 4:

AAATGTCAAC TTCTGTGTAG ACAGATCAGA CCATAGCTGG GTAGAAAGAG

GTACAGAGCA CAGCCATTGT GGATGGCCTC ACAATTGTGC CCAGGGCTGT

CACAGCCCCT GGCATATGAG GCAAACAAGG AGAAGGTGAT GGGTTTGGTC

TCCTTCAACC ACTTTCTCTC TTCAGACACT ATCAAG GAT CTC CTC CCA Asp Leu Leu Pro

100

150

198

240

282

AAT GTA TGC GCT TTT CCT Asn Val Cys Ala Phe Pro

ATG GAA AAG GGC CCT TGT CAA ACC

Met

Glu Lys

Gly Pro Cys 15

Gin

Thr

5

10

TAC

ATG

ACG

CGA

TGG

TTT

TTC

AAC

TTT

GAA

ACT

GGT

GAA

TGT

Tyr

Met

Thr

Arg

Trp

Phe

Phe

Asn

Phe

Glu

Thr

Gly

Glu

Cys

20

25

30

GAG TTA Glu Leu

TTT Phe 35

GCT Ala

TAC GGA GGC TGC

GGA GGC AAC AGC AAC AAC

324

Tyr

Gly Gly Cys 40

Gly

Gly Asn

Sér

Asn 45

Asn

TTT

TTG

AGG

AAA

GAA

AAA

TGT

GAG

AAA

TTC

TGC

AAG

TTC

ACC

366

Phe

Leu

Arg

Lys

Glu

Lys

Cys

Glu

Lys

Phe

Cys

Lys

Phe

Thr

	50		55	60
TGATTTŤCTA	ACAAGAACAC	AGCCCTCCAT	GGATTCGGGA	TTGCTCTGAG	416
GGCCATAGAA	GGCATTTGCG	TGTGTGTGTG	TGTGTGTGTG	TGAACAAGAG	466
GTTCATTTCC	TCTACCCCCA	CATTTATTCT	CCCTGA		502

(2) Informace o sekvenci id. č. 5:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 60 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein

	(xi) popis	sekvence: sekvence	id.	č. 5:
Asp 1	Leu Leu Pro	Asn Val Cys Ala Phe 5	Pro 10	Met Glu Lys Gly Pro 15
Cys	Gin Thr Tyr	Met Thr Arg Trp Phe 20	Phe 25	Asn Phe Glu Thr Gly 30
Glu	Cys Glu Leu	Phe Ala Tyr Gly Gly 35	Cys 40	Gly Gly Asn Ser Asn 45

Asn Phe Leu Arg Lys Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe Thr 50 55 60 (2) Informace o sekvenci id. č. 6:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 235 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (vi) původní zdroj:

(A) organismus: syntetický (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 77.”.235 ‘ ---- ----------------------(xi) popis sekvence: sekvence id. č. 6

GAATTCCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATŤACAAA CTATCAATTT 50

CATACACAAT ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT 97 Met Lys Ala val Phe Leu Val l 5

TTG Leu

TCC TTG ATC Ser Leu Ile 10

GGA TTC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC

139

Gly

Phe

Cys

Trp 15

Ala Gin Pro

Val

Thr Gly 20

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

ATC

181

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

Ile

Ile

25

30

35

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

GAG

AGA

223

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Glu

Arg

45

235

TTG GAG AAG AGA

Leu Glu Lys Arg (2) Informace o sekvenci id. č. 7:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 53 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 7

Met

Lys

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Ile

Gly

Phe

Cys

Trp

1

5

10

15

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

Ile

Pro

Glu

20

25

30

Glu

Ser

Leu

Ile

Ile

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

' 35

40

45

Met

Ala

Glu

Arg

Leu

Glu

Lys

Arg

(2) Informace o sekvenci id. č. 8:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 424 párů nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednovláknová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA

-» Λ

JZ (vi) původní zdroj:

(A) organismus: syntetický/lidský (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: sig_peptid (B) umístění: 77..235 (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: mat_peptid (B) umístění: 236..415 (ix) vlastnosti: .......

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 77..415 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 8:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT 50

CATACACAAT ATAAACGACC AAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT 97 Met Lys Ala Val Phe Leu Val -53 -50

TTG TCC TTG ATC

GGA TTC TGC TGG

GCC CAA CCA GTC ACT GGC

139

Leu Ser Leu

Xle

Gly Phe Cys -40

Trp

Ala Gin Pro

Val -35

Thr

Gly

-45

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

ATC

181

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

lle

Pro

Glu

Glu

Šer

Leu

lle

lle

-30

-25

-20

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

GAG

AGA

223

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Glu

Arg

-15 -10 -5

TTG Leu

GAG AAG AGA

GAT CTC CTC CCA AAT GTA TGC GCT TTT CCT Asp Glu Leu Pro Asn Val Cys Ala Phe Pro

5

Glu Lys

Arg

1

5

10

ATG

GAA

AAG

GGC

CCT

TGT

CAA

ACC

TAC

ATG

ACG

CGA

TGC

TTT

307

Met

Glu

Lys

Gly

Pro

Cys

Glu

Thr

Tyr

Met

Thr

Arg

Trp

Phe

15

20

TTC

AAC

TTT

GAA

ACT

GGT

GAA

TGT

GAG

TTA

TTT

GCT

TAC

GGA

349

Phe

Asn

Phe

Glu

Thr

Gly

Glu

Cys

GlU

Leu

Phe

Ala

Tyr

Gly

25

30

35

GGC

TGC

GGA

GGC

AAC

AGC

AAC

AAC

TTT

TTG

AGG

AAA

GAA

AAA

391

Gly

Cys

Gly

Gly

Asn

Ser

Asn

Asn

Phe

Leu

Arg

Lys

Glu

Lys

40

45

50

TGT

GAG

AAA

TTC

TGC

AAG

TTC

ACC

TAATCTAGA

424

Cys

Glu

Lys

Phe

Cys

Lys

Phe

Thr

(2) Informace o sekvenci id. č. 9:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 113 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 9:

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp

-53 -50 -45 -35

Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu

-30 -30 -25

Glu

Ser

Leu Ile Ile -20

Ala Glu

Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala

— 1 R •1» w

-10

Met

Ala

Glu

Arg

Leu

Glu

Lys

Arg

Asp

Leu

Leu

Pro

Asn

Val

Cys

-5

1

5

-

Ala

Phe

Pro

Met

Glu

Lys

Gly

Pro

Cys

Gin

Thr

Tyr

Met

Thr

Arg

10

15

20

Trp

Phe

Phe

Asn

Phe

Glu

Thr

Gly

Glu

Cys

Glu

Leu

Phe

Ala

Tyr

25

30

35

Gly

Gly

Cys

Gly

Gly

Asn

Ser

Asn

Asn

Phe

Leu

Arg

Lys

Glu

Lys

40

45

50

Cys

Glu

Lys

Phe

Cys

Lys

Phe

Thr

60

Claims (12)

1. Lidský inhibitor proteasy Kunitzova typu, vyznačující se tím , že obsahuje následující sekvenci aminokyselin

Leu Pro Asn Val Cys Ala Phe Pro Met Glu Lys Gly Pro Cys Gin Thr Tyr Met Thr Arg Trp Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly Glu Cys Glu Leu Phe Ala Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Ser Asn Asn Phe Leu Arg Lys Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe Thr (sekvence id . č. 1)

nebo jeho varianta s vlastnostmi inhibitoru proteasy.

2. Varianta lidského inhibitoru proteasy Kunitzova typu podle nároku 1, vyznačující se tím ,že obsahuje následující sekvenci aminokyselin

X¹ Asn Val Cys Ala Phe Pro Met Glu X² Gly X³ Cys X⁴ X⁵ X⁶ X⁷ X⁸ X⁹ Trp Phe Phe Asn Phe Glu Thr Gly Glu Cys Glu Leu Phe X¹⁰ Tyr Gly Gly Cys X^X1 X¹² X¹³ Ser Asn Asn Phe X¹⁴ Arg Lys Glu Lys Cys Glu Lys Phe Cys Lys Phe X^1S (sekvence id. č. 2), v níž X¹ znamená atom vodíku nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys, X² až X¹⁴ znamenají nezávisle na sobě zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny a X^1S znamená hydroxylovou skupinu nebo 1 až 5 zbytků přirozeně se vyskytujících aminokyselin s výjimkou Cys s tím, že alespoň jeden z aminokyselinových zbytků X¹ až X¹⁷ znamená jiný zbytek aminokyseliny než je odpovídající zbytek aminokyseliny přirozené sekvence.

3. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X¹ znamená Leu-Pro.

4. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X² znamená zbytek aminokyseliny, která je vybrána ze skupiny sestávající z Ala, Arg, Thr, Asp, Pro,

Glu, Lys, Gin, Ser, Ile a Val. 5. Varianta podle nároku 4, vyznačující se tím , že X² znamená Thr nebo Lys. 6. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X³ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Pro, Thr, Leu, Arg, Val a Ile. 7. Varianta podle nároku 6, vyznačující se tím , že X³ znamená Pro nebo Ile. - 8. Varianta podle nároku 2, vyznačující se

----------1 í--m—, -že X⁴—znamená-zbytek .aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Lys, Arg, Val, Thr, Ile, Leu, Phe, Gly, Ser, Met, Trp, Tyr, Gin, Asn a Ala.

9. Varianta podle nároku 8, vyznačující ,se tím , že X* znamená Lys, Val, Leu, Ile, Thr, Met, Gin nebo Arg.'

10. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X^s znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Ala, Gly, Thr, Arg, Phe, Gin a Asp.

11. Varianta podle nároku 10, vyznačující se -tím , že X⁵ znamená Ala,. Thr, Asp nebo Gly.

12. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím, že X^e znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Arg, Ala, Lys, Leu, Gly, His, Ser, Asp, Gin, Glu, Val, Thr, Tyr, Phe, Asn, Ile a Met.

13. Varianta podle nároku 12, vyznačující se tím , že X⁶ znamená Arg, Phe, Ala, Leu nebo Tyr.

14. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X⁷ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Ile, Met, Gin, Glu, Thr, Leu, Val a Phe.

15. Varianta podle nároku 14, vyznačující se tím , že X⁷ znamená Ile.

16. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X⁴ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze

skupiny sestávající z Ile, Thr, Leu, Asn, Lys, Ser, Gin, Glu, Arg, Pro a Phe. 17. Varianta podle nároku 16, vyznačující se tím , že X⁸ znamená Ile nebo Thr.' λ 18. Varianta podle nároku 2, vyznačující se

tím , že X® znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze

skupiny sestávající z Arg, Ser, Ala, Gin, Lys a Leu. 19. Varianta podle nároku 18, vyznačujícíse tím , Že X* znamená Arg. 20. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X¹⁰ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Gin, Pro, Phe, Ile, Lys, Trp, Ala, Thr, Leu, Ser, Tyr, His, Asp, Met, Arg a Val. 21. Varianta podle nároku 20, vyznačující se tím , že X¹⁰ znamená Val nebo Ala. 22. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X¹¹ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Gly, Met, Gin, Glu, Leu, Arg, Lys, Pro a Asn. 23. Varianta podle nároku 22, vyznačující se

tím, že X¹¹ znamená Arg nebo Gly.

Varianta podle nároku 2, vyznačující tím , že znamená Ala nebo Gly.

25. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , Že X¹³ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Lys, Asn a Asp.

26. Varianta podle nároku 25, vyznačující se tím , že X¹³ znamená Lys nebo Asn.

27. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X¹⁴ znamená zbytek aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z Val, Tyr, Asp, Glu, Thr, Gly, Leu, Ser, Ile, Gin, His, Asn, Pro, Phe, Met, Ala, Árg, Trp a Lys.

28. Varianta podle nároku 27, vyznačující se tím , že X¹⁴ znamená Lys nebo Leu.

29. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X¹⁵ znamená Thr.

30. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že X¹ znamená Leu-Pro a X¹⁵ znamená Thr.

31. Varianta podle nároku 2, vyznačující se tím , že obsahuje následují sekvenci aminokyselin:

32.

Leu Pro Asn Val Cys Ala Phe Lys Ala Arg Ile Ile Arg Trp Glu Cys Glu Leu Phe Val Tyr Asn Asn Phe Leu Arg Lys Glu Phe Thr (sekvence id . č. 3).

Pro

Phe

Gly

Lys

DNA konstrukce, vyzná

Met Glu Lys Phe Asn Phe Gly Cys Arg Cys Glu Lys j í-c -í

Gly Pro Cys Glu Thr Gly Ala Lys Ser Phe Cys Lys tím, že obsahuje DNA sekvenci kódující lidský inhibitor proteasy Kunitzova typu podle nároku 1 nebo jeho variantu podle kteréhokoliv z nároků 2 až 31.

33. Rekombinantní expresní vektor, vyznačující se tím, že obsahuje DNA konstrukci podle nároku 32.

34. Buňka, vyznačující se tím, že obsahuje DNA konstrukci podle nároku 32 nebo expresní vektor podle nároku 33.

35. Způsob výroby lidského inhibitoru proteasy Kunitzova typu podle nároku 1 nebo jeho varianty podle kteréhokoliv z nároků 2 až 31, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivování buňky podle nároku 34 za podmínek přispívajících k expresi proteinu a isolování výsledného proteinu z kultury.

36. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje lidský inhibitor proteasy Kunitzova typu podle nároku 1 nebo jeho varinatu podle kteréhokoliv z nároků 2 až 31 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient.