CZ174199A3 - Způsob přípravy benzyletherů - Google Patents

Description

Oblast techniky I ^r j I -3 o |

Vynález se týká způsobu~a <kompozicí ^použitelných J k indukci cytotoxických odpovědí zprostředkovaných T-lymfocyty u lidí a domestikovaných nebo hospodářských zvířat.

Dosavadní stav techniky . Předpokládá se, že cytotoxické T-lymfocyty (CTL) jsou hlavním obranným mechanizmem hostitele při -odpovědi na nej různější virové infekce a neoplastický nebo rakovinný růst buněk. Tyto cytotoxické T-lymfocyty ničí infikované nebo pozměněné buňky. Infikované nebo pozměněné buňky na svém povrchu vystavují v komplexech s různými molekulami (nazývanými MHC molekuly I. třídy) množství fragmentů nejrůznějších antigenů, podle nichž jsou tyto buňky rozpoznávány příslušnými CTL. Experimentálně mohou být CTL indukovány prostřednictvím specifických buněk, do jejichž cytoplazmy jsou dodány určité rozpustné antigeny. Imunizace samotným rozpustným antigenem obvykle nedostačuje ke specifické indukci cytotoxických T-lymfocytú.

Jedním ze způsobů, které mohou být použity pro indukci odpovědi CTL, je využití technik genového inženýrství, při kterých jsou do genomu neškodného infekčního agens inkorporovány - části příslušného antigenů. -Cílem·· takové strategie je generovat . antigen-specifickou odpověď cytotoxických T-lymfocytů proti požadovanému epitopu tím, že vystavíme hostitele nepřenosné infekci s mírným průběhem. Byly popsány chimérické vektory, které jako neškodné infekční agens využívají viry vakcinia, polioviry, adenoviry a retroviry a rovněž bakterie jako například bakteria rodu Listeria nebo BCG. Například Takahashi a další, 85 Proč. Natl. Acad. Sci. USA 3105, 1988 popisuje použití

-2ΐ>

rekombinantního viru vakcinia exprimujícího gen gpl60 viru HIV, který slouží jako potenciální nástroj k indukci cytotoxických T-lymfocytů.

Při jiném způsobu, který může být použit k indukci buněčně zprostředkované imunitní odpovědi, se využívá určitých adjuvans. Zatímco současná odborná literatura se ve velké míře věnuje diskuzím týkajícím se využívání adjuvans, není vůbec zřejmé, zda-li používání adjuvans muže indukovat buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď a jestliže ano, pak jestli taková buněčně zprostředkovaná imunitní odpověď v sobě zahrnuje cytotoxickou odpověď T-lymfocytů. V následujícím textu jsou nicméně uvedeny příklady néjrůznějších publikací z této oblasti.

Stover a další, 351 Nature 456, 1991 popisuje odpověď CTL na přítomnost β-galaktosidázy za použití rekombinantních bakterií BCG nesoucích gen pro β-galaktosidázu. Při použití β-galaktosidázy spolu s neúplným Freundovým adjuvans nebyla taková odpověď CTL vůbec detekována.

Mitchell a další, 8 J. Clinical Oncology 856, 1990 (tato publikace nemusí obsahovat nejnovější poznatky související s patentem) popisuje léčbu pacientů trpících metastázujícím melanomem za použití adjuvans nazývaného DETOX a allogenních lyzátů melanomu, které byly pacientům podávány celkem pětkrát v průběhu Šesti týdnů. U malé části ze skupiny pacientů bylo pozorováno zvýšení cytolytické aktivity T-buněk. Autoři popisují nezbytnost zvýšit množství nově vytvořených cytotoxických T-lymfocytů a navrhují kombinovanou terapii, která využívá adjuvas spolu s 'interleukinem-2, a součástí které je rovněž předběžné působení cyklofosfamidem, účelem kterého je snížit množství supresorových T-buněk (které snad existují) specifických pro daný nádor. DETOX se skládá z detoxifikovaného endotoxinu (monofosfát lipidu A) z bakterií Salmonella minnesota,

-3buněčných stěn bakterií Mycobacterium phlei, skvalenového oleje a emulzifikátoru.

Allison a Gregoriadis, 11 Immunology Today 427, 1990 (tato publikace nemusí obsahovat nej novější poznatky související s patentem) poznamenává, že jediným adjuvans schváleným pro použití při vakcinaci lidí jsou soli obahující hliník (hlinité soli - Alum), které zaručeně nevyvolávají buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď. Allison a Gregoriadis tvrdí že je tudíž nezbytné vyvinout adjuvans, která mají stejnou účinnost jako kompletní Freundovo adjuvans, ale která nemají nežádoucí vedlejší účinky kompletního Freundova adjuvans, jakými je například tvorba granulomů. Dále pak pokračují tvrzením, že existují tři využitelné strategie, například: použití lipozomů; použití adjuvans nazývaných imunostimulační komplexy (ISCOM - immunostimulating complexes, která obsahují saponin nebo Quil A [ triterpen se třemi sacharidovými řetězci ], cholesterol a fosfatidyl cholin), která jsou schválena pro použití při vakcinaci proti chřipce koní (Morein a další, Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153) ; a použití emulzí (SAF) skvalenu nebo skvalanu (s nebo bez kopolymeru pluronic) a muramyl dipeptidu (MDP - muramyl dipeptide) . Tvrdí se, že SAF vyvolává u myší buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď, ačkoliv dlouhou dobu se předpokládalo, že podjednotkové antigeny nemohou indukovat odpověď cytotoxických T-buněk.

.. . ...Takahashi, .a ..další, . 344 . Nature .,873, 1990 popisuje,, indukci pomocných T-lymfocytů, které rozpoznávají antigen v kontextu MHC glykoproteinů II. třídy, a cytotoxických T-lymfocytú prostřednictvím ISCOM. Této indukce je u myší dosaženo jedinou subkutánní imunizací. Takahashi a další, 344 Nature 873, 1990 dále tvrdí, že použití Freundova adjuvans, nekompletního Freundova adjuvans a fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrem nevede k indukci cytotoxické aktivity T-lymfocytů proti cílovým buňkám, proti

-4nimž měla být tato cytotoxická aktivita namířena. Dále tvrdí, že, narozdíl od výsledků experimentů, při kterých byly použity exogenní rozpustné proteinové antigeny v jiné formě, jejich skupina prokázala, že je možné použít exogenní intaktní protein v kombinaci s ISCOM k imunizaci vedoucí k primární aktivaci CD8+ CD4- cytotoxických T-lymfocytu, které rozpoznávají antigen v kontextu s MHC glykoproteiny I. třídy. Tato skupina rovněž tvrdí, že popsané experimenty naznačují, že je možné za použití ISCOM obsahujících proteiny viru HIV, vyvolat u lidí odpověď CTL, a že použitím vakcín na bázi ISCOM může být dosaženo dlouho hledaného cíle, kterým je současná indukce odpovědi CTL a indukce tvorby protilátek při použití purifikovaného proteinu.

Byars a Allison, 5 Vaccines 223, 1987 popisují použití SAF-1, které obsahuje Tween 80, PLURONIC L121 a skvalen nebo Skvalan, v kombinaci s nebo bez muramyl dipeptidu. Jejich data naznačují, že přípravek obsahující muramyl dipeptid budou vhodné k přípravě vakcín použitelných k očkování lidí nebo k přípravě vakcín použitelných ve veterinářství. Při druhé imunizaci (upomínací dávka) bylo použito adjuvans bez muramyl dipeptidu. Zdá se, že použití muramyl dipeptidu podstatně zvyšuje produkci protilátek ve srovnání s použitím adjuvans bez muramyl dipeptidu. Buněčně zprostředkovaná imunita byla měřena kožními testy jako přecitlivělost oddáleného typu; cílem tohoto měření bylo stanovit, jestli došlo k aktivaci pomocných T-buněk. Jestliže byl jako součást adjuvans přítomen muramyl dipeptid, pak byla tato přecitlivělost oddáleného typu silnější a ďéletrvající. Podobná adjuvans jsou popsána v Allison a další, Patent Spojených Států Amerických 4770874 (popisuje vyvolání silné buněčně zprostředkované a humorální odpovědi proti vaječnému albuminu pomocí směsi muramyl dipeptidu a polyolu PLURONIC); v Allison a další, Patent Spojených Států Amerických 4772466; v Murphy-Corb a další, 246 Science 1293, 1989 (popisuje použití kombinovaných adjuvans s muramyl dipeptidem, které může zesílit indukci jak humorální

-5imunitní odpovědi tak buněčně zprostředkované imunitní odpovědi); v Allison a Byars, 87 Vaccines 56, 1987 (buněčně zprostředkovanou imunita je indukována při použití SAF (s muramyl dipeptidem), což bylo prokázáno existencí přecitlivělosti oddáleného typu, zvýšenou proliferací T-buněk za přítomnosti antigenu, produkcí interleukinu-2 a specifickou lýzou cílových buněk, které nesly antigen použitý k imunizaci); v Allison a Byars, Immunopharmacology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-specific Resistance, strany 191 až 201, 1987; v Morgan a další, 29 J. Medical Virology 74, 1989; v Kenney a další, 121 J. Immunological Methods 157, 1989; v Allison a Byars, 95 J, Immunological Methods 157, 1986 (kde bylo prokázáno, že hlinité soli a emulze minerálních olejů zvyšují produkci protilátek, ale neovlivňují buněčně zprostředkovanou imunitu; a bylo prokázáno, že přípravky obsahující muramyl dipeptid vyvolávají buněčně zprostředkovanou imunitu); v Byars a další, 8 Vaccine 49, 1990 (tato publikace nemusí obsahovat nej novější poznatky související s patentem; kde je řečeno, že jimi použité adjuvans podstatně zvyšuje humorální imunitní odpověď a menší měrou zvyšuje buněčně zprostředkované reakce proti hemaglutininovému antigenu viru chřipky) ; v Allison a Byars, 28 Molecular Immunology 279', 1991 (tato publikace nemusí obsahovat nej novější poznatky související s patentem; kde je řečeno, že úkolem muramyl dipeptidu je indukovat expresi cytokinů a zvýšit expresi genů kódujících velké histokompatibilitní komplexy (MHC); a -že s tímto- adjuvans byly· získány lepší humorální a.. . buněčně. ...... zprostředkované odpovědi, než tomu bylo při použití jiných adjuvans, a že se, doufejme, zjistí, jsou-li podobné strategie účinné i u lidí); v Allison a Byars, Technology Advances in Vaccine Developement 401, 1988 (kde je popsána indukce buněčně zprostředkované imunity za použití SAF) ,- v Epstein a další, 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (tato publikace poskytuje přehled nejrůznějších adjuvans používaných při přípravě vakcín) ,- v Allison a Byars, 95 J.

-6Immunological Methods 157, 1986 (kde je řečeno, že přidání muramyl dipeptidu.k adjuvans má za následek značné zesílení buněčně zprostředkovaných odpovědí na přítomnost nej různějších antigenů, včetně monoklonálních imunoglobulinů a virálních antigenů); a v Morgan a další, 29 J. Medical Virology 74, 1989 (kde je popsáno použití SAF-1 k přípravě vakcíny proti viru Epstein-Barrové).

Kwak a další, Idiotype Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, strana 163, 1990 (tato publikace nemusí obsahovat nej novější poznatky související s patentem) popisuje použití SAF bez muramyl dipeptidu jako adjuvans pro idiotyp lymfomu B-buněk u lidí. Přesněji řečeno, spolu s příslušným idiotypem byla administrována emulze obsahující polymer Pluronic L121, Skvalan a 0,4%.Tween-80 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem. V této publikaci se tvrdí, že přídavek nějakého adjuvans může dále zesílit ... humorální odpovědi a může rovněž usnadnit indukci buněčně zprostředkovaných odpovědí.

Mezi jiné imunologické přípravky patří lipozomy (Allison a další, Patenty Spojených Států Amerických 4053585' a 4117113); cyklické peptidy (Dreesman a další, Patent Spojených Států Amerických 478784); Freundovo kompletní adjuvans (Asherson a další, 22 Immunology 465, 1972; Berman a další, 2 International J. Cancer 539, 1967; Allison 18

Immunopotentiation 73, 1973; a Allison, Non-Specific Factors - Influencing Host Resistance 24.7, 1.973).,- ISCOM (Letvin.. a

I další, 87 Vaccines 209, 1987); adjuvans tvořené minerálním

I olejem, povrchově aktivním činidlem a Tweenem 80, obsahující * neiontové blokové polymery (Hunter a Bennett, 133 J. Immunology 3167, 1984; a Hunter a další, 127 J. Immunology 1244, 1981); adjuvans tvořené minerálním olejem a emulzifikujícím činidlem v kombinaci s nebo bez mrtvých mykobaktérií (Sanchez-Pescador a další, 141 J. Immunology 1720, 1988); a jiná adjuvans jako například lipofilní

-Ίderiváty muramyl tripeptidu a muramyl dipeptid kovalentně spojený s rekombinantním proteinem.

Podstata vynálezu

Přihlašovatel vynalezl bezpečný a výhodný způsob a bezpečné a výhodné kompozice, s jejichž využitím mohou být u lidí a domestikovaných nebo hospodářských zvířat indukovány imunitní odpovědi CTL. Tento způsob zahrnuje použití antigenního přípravku, který je pro živočichy velmi málo nebo dokonce není vůbec toxický, a který neobsahuje žádný imunostimulační peptid (například muramyl dipeptid), jehož přítomnost by snížila intenzitu požadované buněčně zprostředkované odpovědi. Použití této metodologie je velmi jednoduché a není při ní třeba provádět rozsáhlé činnosti in vivo, při kterých jsou pomocí rekombinantních DNA technik pozměňovány buňky za účelem zvýšení jejich antigenicity. Tento objev je velmi překvapivý, protože se nepředpokládalo, že použití těchto antigenních přípravků neobsahujících imunostimulační peptidy nebo jejich ekvivalenty, by mohlo indukovat odpověď CTL. Tato zjištění uskutečněná podavatelem patentu umožňují použití těchto antigenních přípravků u širokého spektra nemocí nebo použití těchto antigenních přípravků jako činidel použitelných pro prevenci. Takové antigenní přípravky mohou být například použity k léčbě virových onemocnění, při kterých je důležitá odpověd CTL. Mezi taková virová onemocnění patří například infekce virem HIV· .nebo chřipka; -použití těchto antigenních přípravků může být rozšířeno i na použití při léčbě bakteriálních infekcí, rakoviny, infekcí způsobených parazity a podobných onemocnění. Jako činidlo použitelné pro prevenci může být antigenní přípravek spolu s vhodným antigenem použito při prevenci virových infekcí zmíněných výše, zvláště pak při prevenci infekce způsobené virem HIV. Jinou možností je použití antigenního přípravku spolu s vhodným antigenem při

-8prevenci u pacientů vystavených zvýšenému riziku vzniku rakoviny, například u pacientů po resekci primárního nádoru.

Vynález popisuje způsob sloužící k indukci odpovědi CTL u lidí nebo domestikovaných (například koček nebo psú) nebo hospodářských zvířat (například koní, skotu nebo vepřů) . Tato odpověď je namířena proti nějakému antigenu mimo antigenu lymfomu B-buněk a vaječnému albuminu. Tento způsob se skládá z kroků, při kterých je získán antigen, proti kterému chceme vyvolat odpověď CTL, a dále tento způsob poskytuje návod pro přípravu antigenního přípravku, který obsahuje. Tento antigenní přípravek obsahuje, skládá se nebo skládá se téměř výhradně ze stabilizujícího detergentu, činidla podporujícího tvorbu micel a biodegradovatelného a biokompatibilního oleje. Ve výhodném provedení vynálezu neobsahuje tento antigenní přípravek složku tvořenou imunostimulačním peptidem nebo obsahuje malé množství této složky dostačující k tomu, aby nedošlo ke snížení požadované odpovědi CTL. Ve výhodném provedení vynálezu je tento přípravek připraven ve formě stabilní emulze oleje ve vodě. To znamená, že každá z použitých složek je vybrána tak, aby se daná emulze udržela v emulzifikovaném stavu po dobu nejméně jednoho měsíce a ve výhodném provedení vynálezu pak po dobu delší než jeden rok, aniž by došlo k oddělení fází. Při tomto způsobu jsou antigen a antigenní přípravek smíchány dohromady a výsledkem je vytvoření směsi (ve výhodném provedení vynálezu mikrofluidizací), která je administrována do organizmu • živočicha v množství dostačujícím k indukci odpovědi CTL.

a Tuto administraci stačí provést pouze jednou.

Termínem stabilizující detergent rozumíme detergent, který umožňuje jednotlivým složkám emulze zůstat ve formě stabilní emulze. Mezi takové detergenty patří polysorbát 80 (Tween) (Sorbitan-mono-9-oktadekanoát-poly(oxy-1,

2-ethandiyl; produkt ICI Americas, Wilmington, DE), Tween 40, Tween 20, Tween 60, Zwittergent 3-12, TEEPOL HB7 a SPAN

-985. Tyto detergenty jsou obvykle používány v množstvích přibližně 0,05 až 0,5%, ve výhodném provedení vynálezu pak v množstvích přibližně 0,2%.

Termínem činidlo podporující tvorbu micel rozumíme činidlo, které je schopno stabilizovat emulzi tvořenou jinými složkami takovým způsobem, že dojde k vytvoření struktury podobné micelám. Taková činidla způsobují ve výhodném provedení vynálezu podráždění v místě, do něhož jsou injikovány. Toto podráždění má za následek infiltraci makrofágú do místa injekce a tím zesílení buněčně zprostředkované odpovědi. Příkladem takovýchto činidel jsou polymerní povrchově aktivní látky PLURONIC L62LF, L101 a L64, PEG1000 a TETRONIC 1501, 150R1, 701, 901, 1301 a 130R1, popsané v publikacích BASF Wyandotte, například Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977; a Hunter a další, 129 J. Immunol. 1244, 1981. Chemické struktury těchto činidel jsou v současnosti dobře známé. Ve výhodném provedení vynálezu je toto činidlo vybráno tak, aby se jeho rovnováha na rozhraní hydrofilní látka-lipofilní látka (HLB - hydrophile-lipophile balance), jak je definována v článku Hunter a Bennett, 133 Journal of Immunology 3167, 1984, pohybovala v intervalu 0 až 2. Ve výhodném provedení vynálezu je toto činidlo používáno v množstvích 0,5 až 10%, výhodněji pak v množstvích mezi 1,25 až 5%.

Olej je vybrán za účelem podpory při udržení příslušného antigenu v emulzi oleje ve vodě. To znamená, že 'olej vlastně ' slouží jako nosič příslušného· antigenu·. Ve výhodném provedení vynálezu má tento olej teplotu taní nižší než· 65°C, takže emulze je vytvořena buď při pokojové teplotě (přibližně 20°C až 25°C) nebo ve chvíli, kdy je teplota emulze snížena na hodnotu pokojové teploty. Příkladem takových olejů jsou skvalen, Skvalan, EICOSANE, tetratetrakontan, glycerol a olej z burských oříšků nebo jiné rostlinné oleje. Ve výhodném provedení vynálezu je tento olej používán v množstvích 1 až 10%, výhodněji pak v

-10množstvích mezi 2,5 až 5%. Je důležité, aby byl zmíněný olej biodegradovatelný a biokompatibilní, což znamená, že za určitý časový interval je organizmus schopen tento olej degradovat, a že při použití nemá tento olej v organizmu žádné nežádoucí účinky, jakými je například tvorba granulomů.

U výše zmíněných přípravků je důležité, aby tyto přípravky neobsahovaly peptidovou složku, zvláště pak, aby neobsahovaly muramyl dipeptid (MDP). Jestliže bude takový peptid administrován v přípravku do organizmu člověka v množství větším něž 20 mikrogramů na jednu dávku, bude tento peptid interferovat s indukcí odpovědi CTL. Ve výhodném provedení vynálezu by takové peptidy neměly být vůbec přítomny v antigenních přípravcích, i když je zjevný jejich pozitivní vliv na stimulaci humorální složky imunitního systému. To· znamená, žé podáváte! patentu zjistil, že ačkoliv mohou tyto peptidy zesilovat humorální odpověď, je jejich použití nevýhodné v případech, kdy je požadována indukce odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.

Vynález dále popisuje kompozice, ve kterých je antigenní přípravek tvořen jenom dvěmi ze tří výše zmíněných složek a tento přípravek je použit spolu příslušným antigenem (tímto termínem označujeme proteiny, polypeptidy a jejich fragmenty, které jsou imunogenní), kromě vaječného albuminu (nebo jiných albuminů, například HSA-lidského sérového albuminu, BSA-hovězího sérového albuminu- a· ovalbuminu), k indukci odpovědi CŤL u výše zmíněných zvířat nebo lidí.

Přihlašovatel věří, že při použití u lidí jsou výše zmíněné přípravky daleko výhodnější než přípravky v současnosti používané (včetně ISCOM, DETOX a SAF). Na rozdíl od těchto přípravků známých ze stavu techniky je společným rysem přípravků podle vynálezu skutečnost, že obsahují činidlo podporující tvorbu micel a zároveň neobsahují žádné peptidy, části cytoskeletu nebo části bakteriálních buněk.

-11Přípravky podle vynálezu rovněž indukují takovou odpověď CTL, ke které buď nedochází při použití přípravků známých ze stavu techniky anebo je tato odpověď CTL při použití přípravků podle vynálezu značně silnější, než je tomu při použití přípravku známých ze stavu techniky.

Termínem netoxický rozumíme skutečnost, že při použití antigenního přípravku nejsou u léčených živočichů ani u lidí pozorovány žádné nebo jen nepatrné vedlejší účinky. Odbornici v lékařství nebo ve veterinářství pochopí, že termín netoxický má velmi široký význam. Například u v podstatě zdravých živočichů nebo lidí může být tolerována jen nízká toxicita, kdežto u lidí trpících nemocí ohrožujících jejich život, můžeme připustit i silnější toxicitu podávaného antigenního přípravku.

Ve výhodných provedeních vynálezu se antigenního přípravku podle vynálezu v podstatě skládá ze dvou nebo ze tří následujících složek: z detergentu, činidla a oleje; způsob podle vynálezu v podstatě zahrnuje pouze jedinou administraci směsi (antigenu v kombinaci s antigenním přípravkem) do organizmu živočicha nebo Člověka; tento člověk nebo živočich je infikován nějakým virem a vykazuje jeden nebo více příznaků (tak, jak jsou obecně definovány odborníky v dané oblasti) typických pro danou virovou infekci; a daný antigenní přípravek je pro člověka nebo živočicha netoxický.

* V jiných výhodných provedeních vynálezu je příslušný antigen vybrán z antigenních oblastí příslušejících antigenum viru HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat a Rev; z antigenních oblastí příslušejících antigenum malárie: proteinu CS a povrchovému proteinu 2 sporozoitu; z antigenních oblastí příslušejících povrchovým antigenum viru Hepatitidy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a HBe Ag; z antigenních oblastí příslušejících antigenum viru chřipky: HA, NP a NA; z antigenních oblastí příslušejících povrchovým antigenum viru Hepatitidy A: z antigenních oblastí příslušejících

-12antigenům Herpes viru; EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gD, časný proteinový produkt HSV, z antigenních oblastí příslušejících antigenúm lidského papilomaviru (například antigenů HPV jako například antigenů LI, E4, E6 a E7, zvláště pak antigenů E6 a E7 z HPV16 a HPV18 (tyto typy virů jsou nej obvykleji se vyskytující formy viru spojené s karcinomem děložního hrdla), antigenu E4 a LI odvozených od HPV6 a HPV11 (tyto typy virů jsou nej obvykleji se vyskytující formy asociovaných se špičatým kondylomem condyloma acuminatum); z antigenních oblastí příslušejících antigenu prostaty (PSA - prostate specific antigen), cytomegaloviru gB, cytomegaloviru gH a proteinu gP72 IE; z antigenních oblastí příslušejících antigenúm syncýciálního viru napadajícího respirační systém: proteinu F, proteinu G a proteinu N; a z antigenních oblastí příslušejících antigenúm spojených s nádory: produkt CEA karcinomu, mucin spojený s karcinomy, produkt P21 karcinomu, produkt P53 karcinomu, produkt MPG melanomu, produkt p97 melanornu a produkt onkogenu Neu karcinomu, produkt genu p53 karcinomu, antigen' melanomu nazývaný MAGE a mutovaný· protein p21 ras přítomný u velkého množství maligních nádorů.

Podobně vynález popisuje kompozice, které obsahují, skládají se nebo skládají se téměř výhradně z nějakého antigenu smíchaného s antigenním přípravkem popsaným výše, přičemž příslušný antigen je vybrán z antigenních oblastí vyjmenovaných v předešlém textu.

---Jinou podobnou Stánkou vynálezu je. popis .způsobů sloužících k léčbě pacientů infikovaných virem HIV, trpících malárií, trpících chřipkou, trpících hepatitidou, trpících rakoviným bujením, infikovaných Herpes virem, trpících karcinomem děložního hrdla, trpících špičatým kondylomem (condyloma acuminata - genitální bradavice) nebo infikovaných syncyciálním virem napadajícím respirační systém. Tato léčba je prováděna pomocí podání kompozice, která obsahuje příslušný antigen (například antigen vybraný

-13ze skupiny antigenú vyjmenovaných v předešlém textu) smíšený s jedním z výše zmíněných antigenních přípravků. Zmíněné antigeny a způsoby léčby jsou jenom příkladem antigenú, které mohou být použity v kombinaci s antigenními přípravky.

Jiné stránky a výhody vynálezu budou zřejmé z následujících příkladů provedení vynálezu a z patentových nároků.

Příklady provedení vynálezu

Nejprve budou stručně popsány jednotlivé obrázky.

Popis obrázků

Obrázky 1A až IC a 4A až 4C jsou grafickým znázorněním dat srovnávajících indukci CTL dosaženou použitím různých přípravků s ovalbuminem; poměr E:T označuje na všech obrázcích poměr efektorových buněk k cílovýn buňkám a je vyznačen na vodorovné ose (obrázky 1 až 11) . Na svislé ose je vyznačeno procento specifické cytoxicity, rovněž popis svislé osy platí pro všechny obrázky 1 až 9.

Obrázek 1A popisuje indukci CTL po podání ovalbuminu v HESS, data pro buňky EL4 a EG7-ova jsou shodná.

Obrázek 1B popisuje indukci CTL po podání ovalbuminu obsaženého v cytoplazmě. Odpověd měřená na buňkách EL4 ' je znázorněná prázdnými' čtverečky,' odpověď na EG-7 ova plnými.

Obrázek 1C popisuje indukci CTL po imunizaci ovalbuminem v antigenním přípravku. Odpověď měřená na buňkách EL4 je znázorněna prázdnými čtverečky, odpověď na EG-7 ova plnými.

Obrázky 2A a 2B jsou grafickým znázorněním dat srovnávajících indukci CTL dosaženou použitím

-14β-galaktosidázy v HBSS (2a) a β-galaktosidázy s antigenním přípravkem (2b) . Prázdné čtverečky platí pro buňky C3-4, plné pro buňky P815 (na obrázku 2a jsou tyto body shodné s vodorovnou osou).

Obrázek 3 je grafickým znázorněním dat srovnávajících indukci CTL dosaženou použitím ovalbuminu v lipozomech (čtverečky) a použitím ovalbuminu v kombinaci s antigenním přípravkem (plná kolečka).

Obrázek 4A popisuje indukci CTL po podání ovalbuminu v HBSS.

Obrázek 4B popisuje indukci CTL po podání ovalbuminu obsaženého v cytoplazmě.

Obrázek 4C popisuje indukci CTL po imunizaci ovalbuminem v antigenním přípravku.

Obrázek 5 je grafickým znázorněním dat ukazujících, jaký vliv má na indukci CTL selektivní odstranění buď CD4 buněk (plná kolečka) nebo CD8 buněk (plné čtverečky) , kontrola bez odstraněných lymfocytů je značena prázdnými čtverečky.

Obrázek 6 popisuje účinek selektivního odstranění těchto subpopulací T-lymfocytů: primárně aktivovaných CD4 (A) , primárně aktivovaných cd3 (B) , CD8n a CD4p (C) , CD4n a CD8p (D) a CD4p a CD8p (E).

Obrázek 7 je grafickým znázorněním dat ukazujících indukci _r ... . _CTL p_Omocf gpi2Q v HBSS (prázdné čtverečky) a v IdoxU (plná kolečka).

-15Obrázek 8 je grafickým znázorněním dat ukazujících indukci CTL pomocí směsi kopolymeru Pluronic a Tweenu spolu s antigenem. Účinek na buňky EL4 je vyjádřen prázdnými čtverečky, na buňky EG7 plnými kolečky.

Obrázek 9 je grafickým znázorněním dat ukazujících indukci CTL pomocí směsi skvalanu a Tweenu v kombinaci s antigenem. Účinek na buňky EL4 je vyjádřen prázdnými čtverečky, na buňky EG7 plnými kolečky.

Obrázek 10 je grafickým znázorněním dat ukazujících indukci CTL pomocí směsi skvalanu a kopolymeru Pluronic v kombimaci s antigenem. Účinek na buňky EL4 je vyjádřen prázdnými čtverečky, na buňky EG7 plnými kolečky.

Obrázek 11 je grafickým znázorněním účinků ova v kombinaci s těmito dvoj, či troj složkovými antigenními přípravky na odpověď CTL: antigenní přípravek S-T-P (A), antigenní přípravek S-T (B) , antigenní přípravek P-T (C) , antigenní přípravek S-P (D) , BBSS (E) a antigenní přípravek SAF-M (F).

Obrázek 12 je grafickým znázorněním indukce protilátek proti gpl20IIIb u opic, které je dosaženo použitím různých antigenních přípravků. Na svislé ose je vyznačena hodnota absorbance při 405 nm, na vodorovné je ředění séra. Jednotlivé experimenty jsou označeny těmito symboly: 854/SPT/2d (A), 220/SPT/2d (B) , 207/ST/2d (C) , 222/ST/2d (d) , 720/SAFm/2d (E), 722/SAFm/2d (F), 225/HBSS/2d (g) , 208/HBSS/2d (H).

Obrázek 13 znázorňuje protinádorovou aktivitu buněk HOPE2, kterou vykazovaly deset dnů po jediné imunizaci rozpustným proteinem E7 v kombinaci s adjuvans. Na svislé ose je vyznačena velikost tumorů v mm³ , na vodorovné dny po implantaci. Symboly odpovídají. 30/antigenní přípravek/lx (A), 90/antigenní přípravek/lx (B), 90/Alum/lx (C) a kontrola (D).

-16Obrázek 14 znázorňuje protinádorovou aktivitu buněk HOPE2, kterou měly v časech 10 a 19 dnu po dvou imunizacích rozpustným proteinem E7 v kombinaci s adjuvans. Na svislé ose je vyznačena velikost tumorů v mm³ , na vodorovné dny po implantaci. Symboly odpovídají: 30/antigenní přípravek/2x (A), 90/antigenní přípravek/2x (B), 90/Alum/2x (C) a kontrola (D).

Antigenní přípravky

Antigenní přípravky vhodné pro použití ve vynálezu jsou obecně popsány v předchozím textu. Odborníci zjistí, že mohou být poměrně snadno připraveny ekvivalentní přípravky, a že od těchto přípravků můžeme očekávat ekvivalentní vlastnosti ve vztahu k indukci odpovědi CTL. Vlastnosti takových přípravků mohou být poměrně snadno testovány za použití technik podobných níže popsaným technikám.

Následují příklady použití vynálezu, ve kterých je použit antigenní přípravek (AF-antigen formulation) tvořený přibližně 2,5¾ skvalanu, 5% pluronové kyseliny a Tweenem 80 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem. Emulze AF přesněji obsahuje: 15 mg skvalanu, 37,5 mg poloxameru 401 (PLURONIC L121), 6 mg polysorbátu 80 (Tween 80), 0,184 mg chloridu draselného, 0,552 mg dihydrogenfosforecnanu draselného, 7,36 mg chloridu sodného, 3,3 mg hydrogenfosforečnanu sodného (bezvodého) v 1 ml vody,výsledné pH = 7,4. Tato emulze byla mikrofluidizována -prostřednictvím standardních technik -(Microfluidics, model M110F) za použití modulu o zpětném tlaku 11000 až 14000 psi (75,9 MPa až 96,5 MPa) s postupným návratem tlaku na hodnotu atmosférického tlaku a chlazením pomocí ledu.

V jiných příkladech byl antigen smíchán s mikrofluidizovanou směsí skvalanu (S) , kopolymeru Pluronic (P) a Tweenu 80 (T), v níž bylo dosaženo finální koncentrace jednotlivých složek: 0,2¾ Tweenu 80, 1,25¾ kopolymeru pluronic a 5¾ skvalanu. Za účelem stanovení, které z těchto li

-17složek jsou nezbytné k indukci antigen-specifické imunitní odpovědi, byly v koncentracích odpovídajících třísložkové směsi připraveny dvoj složkové směsi Skvalan-Tween 80, Pluronic-Tween 80 a Skvalan-Pluronic. Pluronic, Svalan a Tween 80 byly rovněž použity individuálně za účelem stanovení vlivu těchto jednotlivých složek na indukci CTL. Za účelem stanovení účinků různých derivátů Tweenu na indukci CTL byly v ova systému namísto Tweenu 80 použity Tween 20, Tween 40 nebo Zwittergent. Ve třísložkových přípravcích byl Skvalan nahrazen Eikosonem nebo Triakontonem a namísto kopolymeru Pluronic byly ve stejných třísložkových přípravcích použity PEG1000, Pleuronic L62LF a Tetronic 1501 a Tetronic 150R1. Co se týká dvoj složkových přípravků, za účelem testování indukce CTL specificky namířené proti antigenu ova, byly použity směsi nejrůznějších analog zmíněných složek v různých kombinacích. Patří sem například směsi cholesterol - Tween 80, Skvalan - Tween 20, Přistaň Tween 80 nebo olivový olej - Tween 80. Při studii zaměřené na stanovení stability, byla mikrofluidizovaná směs Skvalan-Tween 80 smíchána s dextrózou tak, aby bylo odsazeno finální koncentrace dextrózy 5%. Ve všech případech byly kombinace jednotlivých aditiv smíchány v mikrofluidizéru za účelem vytvoření stabilní emulze. V některých experimentech byl, za účelem indukce odpovědi CTL a indukce humorální odpovědi, do dvoj složkových přípravků přidán muramyl dipeptid v různých koncentracích. V Tabulce 1 je znázorněn úplný seznam nej různějších přípravků použitých v této studii. .

	Tabulka 1: Účinky různých substitucí provedených ve
	dvoj složkových nebo	třísložkových systémech
	Substituce provedená ve třísložkových formulacích	počet usmrcených buněk (v % při poměru E:T-100:l
	STP	84,0
	TWEEN 40 (T)	66,0
	TWEEN 20	48,0
	T1501 (P)48	0,0
	T150R1 (P)	0,0
	Pluronic L62LF (P)	47,0
	Eikosan (S)	it
	PEG1000 (P)	*
	Triakontan (S)	★
	Zwittergent (T)	•k
	Substituce provedená ve dvousložkových formulacích
	ST	76,0
	PT	45,0
	SP	26,0
	Cholesterol (S) + TWEEN 80	0,0
	Skvalan + TWEEN 29 (T)	65,0
	Přistaň (S)+ TWEEN 80	42,0
	ulivový olej (b) + TWEEN 80	69,0
	Jednosložková formulace
	PluronicL121	0,0
	Skvalan	0,0
	....... .TWEEN. 80 ................ .	.0,0.. ________'.
	Skvalan + TWEEN 90+5¾ dextróza	86,0
	* stanovení cytotoxické aktivity	CTL je prováděno znovu

Jako kontrolní adjuvans byl použit přípravek Syntex adjuvans (mikrofluidizovaný; SAFm - Syntex adjuvants formulation). Tento přípravek se skládá ze dvou částí. Část I se skládá z fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým

-19pufrem obsahujícího finální koncentrace jednotlivých složek; Skvalan - 5%, kopolymer Pluronic - 1,25% a Tween 80 - 0,2% (tato část se nazývá nosič nebo I-SAF) . Část II se skládá z N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-izoglutaminu (Thr-MDP), který je vlastně derivátem složky buněčné stěny mikroorganizmu rodu Mykobakterium. Za účelem imunizace byl antigen smíchán s mikrofluidizovaným nosičem (část I) a výsledkem byl vznik homogenní emulze. K takto vytvořenému SAFm byl přidán MDP a celá směs byla krátce vortexována. Ve směsi bylo použito několik různých koncentrací MDP, aby bylo možné zjistit optimální koncentraci MDP pro indukci CTL. Myši byly rovněž imunizovány rozpustnými antigeny smíchanými podle návodu poskytovaného výrobcem (Pierce Chemical, Rockford, IL) s alum nebo smíchanými s Freundovým kompletním adjuvans (CFA).

Antigenní přípravek podle vynálezu je použit k indukci odpovědí cytotoxických T-lymfocytů u myší. Odborníkům je zřejmé, že takový myší model naznačuje, že stejné experimenty nebo stejná léčba budou vést k indukci odpovědí cytotoxických T-lymfocytů u lidí, domestikovaných nebo hospodářských zvířat. Množství antigenního přípravku a antigenu' použitelné k vyvolání požadované buněčně zprostředkované odpovědi může být stanoveno empiricky pomocí standardních způsobů odborníkům dobře známým a není přitom třeba provádět přílišné množství experimentů. Jestliže je tedy žádoucí minimalizovat vedlejší účinky těchto směsí při léčbě, jejíž cílem je vyvolat odpověď CTL a tudíž indukovat imunitu proti požadovanému antigenu, mohou odborníci určit minimální množství takové směsi určené k administraci do organizmu člověka, domestikovaného nebo hospodářsky významného živočicha. Při normálním použití bude taková směs do organizmu injikována jedním ze standardních způsobů, nicméně jako nejvýhodnější se jeví intramuskulární injekce do místa, kde bude umožněno, aby emulze zůstala ve své stabilní formě po dobu několika dnů nebo týdnů.

-20Způsoby

Není-li řečeno jinak, byly v níže uvedených příkladech použity následující materiály a způsoby:

Myši

Samice myší C57BL/6 (H-2b) a BALB/c (H-2d) byly zakoupeny od firmy Harlen Sprague (San Diego, California).

Antigeny

Ovalbumin (ova, třída VII; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) byl použit v nativním stavu, β-galaktosidáza (β-gal, třída VIII; ERL) byla použita jednak v nativním stavu a jednak po alkalické lýze prováděné v 1 M NaOH po dobu 2 minut při 100 °C. Rekombinantní protein gpl20 byl zakoupen od firmy American Biotechnology.

Nádorové buňky a transfikované buňky

Jako nádorové buňky byly použity la- linie buněk EL4 (thymon C57BL/6, H-2b) a buněk P815 (mastocytom DBA/2, H-2d). Příprava buněk EG7-ova, které jsou odvozeny od transfikované buněčné linie EL4 produkující ova, byla již dříve popsána v článku Moore a další, 54 Cell 777, 1988. Transfikované buňky P13.1, které produkují β-gal byly odvozeny elektroporací z buněčné linie P815 o celkovém počtu buněk přibližně 10⁷. Elektřoporace byla provedena v 1 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrem (PBS). .a. bylo k ní použito 10 mg plazmidu pCHHO (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) linearizovaného restrikční endonukleázou Pst I a 1 mg plazmidu pSV2 neo (Southern a další, 1 J. Mol. Appl. Genet. 327, 1982) linearizovaného restrikční endonukleázou Pvu I. Po této elektroporací následovala selekce v médiu obsahujícím 400 ^g/ml antibiotika G418. Transfikovaná buněčná linie C3-4 byla odvozena od linie hybridomů BALB/c Igm 662

-21prostřednictvím transfekce těchto hybridomů plazmidem kódujícím gen pro β-gal; tento gen byl připojen ke třetímu a čtvrtému exonu kódujícímu těžký řetězec IgM (Rammensee a další, 30 Immunogenetics 296, 1989). Fibroblasty 3T3 exprimující gpl60IIIb (linie 15-12) byly poskytnuty Dr. Germainem z NIH (Bethesda, MD) . Buněčnou linii L buněk transfikovanou genem Kb nám poskytl Dr. Carbone, Monash University, Australia. Buněčné linie L buněk transfikované geny Dl a Ld nám poskytl Dr. Ted Hensen, Washington University, St. Louis.

Imunizace

Myši byly imunizovány intravenózne 200 μΐ suspenze obsahující splenocyty (které byly předem nasyceny příslušným antigenem) v množství 25 x 10^s, jak je popsáno v článcích Moore a další, 54 Cell 777, 1988 a Carbone a další, J. Exp. Med. 169:603, 1989. Při imunizacích směsmi ova-antigenní přípravek nebo β-gal-antigenní přípravek bylo na imunizaci jedné myši použito 30 μ$ jednotlivých proteinových antigenů. Myši byly imunizovány subkutánně (do podkožní vrstvy) u kořene ocasu nebo na polštářku chodidla. Každá injekce obsahovala 67 μΐ mikrofluidizovaného antigenního přípravku (připraveného pomocí standardních způsobů) a 30 μ$ proteinového antigenů v celkovém objemu 200 μΐ. Celkového objemu 200 μΐ bylo dosaženo přidáním HESS, viz. Wittaker manual (Welkersville, MD). MDP bylo připraveno v množstvích 0 až 300 ;xg. Tam kde je řečeno, byly myši imunizovány rozpustnými antigeny v kombinaci s CFA nebo s alum o celkovém objemu 200 μΐ.

In vitro stimulace populace efektorových buněk

Slezinné buňky (30 x 10^s) získané z normálních nebo imunizovaných myší (tyto myši byly imunizovány nejméně o 14 dní dříve) byly, za účelem měření odpovědi na přítomnost ova, inkubovány s 1,5 x 10^s buněk EG7-ova (ozářených 20000

-22rad) na 24 jamkových plotnách při 37°c v atmosféře obsahující 7% C0₂. Za účelem měření odpovědi na přítomnost β-gal byly slezinné buňky (30 x 10⁶) získané z normálních nebo imunizovaných myší (tyto myši byly imunizovány nejméně o 14 dní dříve) inkubovány s 1,5 x 10^s buněk C3-4 (ozářených 20000 rad) na 24 jamkových plotnách při 37°C v atmosféře obsahující 7% C0₂. Všechny experimenty na tkáňových kulturách byly prováděny v kompletním médiu, které je tvořeno IMDM médiem, viz. Wittaker manual (Welkersville, MD) doplněným 10% fetálního telecího séra (FCS), 2 mM glutaminem, gentamycinem a 2 x 10’⁵ M 2-merkaptoethanolem. Při in vitro experimentech, při nichž je ze směsi buněk selektivně odstraněn určitý typ buněk, byly in vivo primárně aktivované nebo in vitro stimulované buňky vystaveny působení monoklonálních protilátek (mAbs) RL.172 (anti-CD4) nebo monoklonálních protilátek 3.168 (anti-CD8). Toto působení monoklonálními protilátkami slouží k odstranění CD4+ nebo CD8+ T-buněk (Sarmiento a další, 125 J. Immunol. 2665, 1980 a Ceredig a další, 314 Nature 98, 1985). Monoklonální protilátky RL.172 a 3.168 byly získány od Dr. Johathana Sprenta ze Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.

Slezinné buňky (30 x 10⁶) získané z normálních nebo imunizovaných myší (tyto myši byly imunizovány nejméně o 21 dní dříve) byly inkubovány s 1,5 x 10^s buněk 15-12 (na které bylo předběžně, po dobu 45, minut působeno mitomycinem C v množství 200 jig/10⁸ buněk) , nebo byly tyto slezinné buňky inkubovány v kompletním IMDM médiu (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) obsahujícím 10%-ní předem otestovaného FCS (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2 mM glutamin, gentamycin a 2 x ΙΟ'⁵ M 2-merkaptoethanol, v němž je rovněž přítomno 500 μg peptidu 18111b obsahujícího epitop dominantní pro CTL myší Balb/c. Při in vitro stimulaci prostřednictvím peptidů byly slezinné buňky kultivovány v kompletním IMDM médiu obsahujícím 5% supernatantu ConA.

-23Při experimentech, při nichž je ze směsi buněk selektivně odstraněn určitý typ buněk, byly in vivo primárně aktivované nebo in vitro stimulované buňky podrobeny působení monoklonálními protilátkami (mAbs) RL.172 (anti-CD4) nebo monoklonálními protilátkami 3.168 (anti-CD8) za přítomnosti králičího komplementu o nízké toxicitě (Cederlane Laboratories, Ltd., Hornby Ontario, Canada). Toto působení monoklonálními protilátkami slouží k odstranění CD4+ nebo CD8+ T-buněk (22, 23) . Monoklonální protilátky RL.172 a 3.168 byly získány od Dr. Johathana Sprenta ze Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.

Stanovení cytotoxicity

Cílové’ buňky (1 x 10⁶) byly značeny po dobu 60 minut [⁵¹Cr] chromanem sodným o aktivitě 100 /xCi. K cílovým buňkám, která byly za účelem experimentu povlečeny peptidovými fragmenty, bylo v průběhu jejich značení izotopem ^slCr přidáno 50 μΐ roztoku 1 mg/ml peptidu v HESS. Po promytí bylo ΙΟ⁴ značených cílových buněk inkubováno po dobu 4 hodin pri 37°C s postupně zředovanymi efektorovými buňkami v 200 μΐ RP10. Po skončení inkubace bylo odebráno 100 μΐ supernatantu a specifická lýza byla stanovena jako:· Specifická lýza (v procentech) = 100 x {(aktivita uvolněná působením CTL - spontánně uvolněná aktivita) / (maximální uvolněná aktivita - spontánně uvolněná aktivita)}. Spontánně uvolněná aktivita za nepřítomnosti cytotoxických T-lymfocytů (CTL) byla ve všech experimentech menší než 25 % maximálně uvolněně aktivity dosazené působením detergentu.

Stanovení protilátkových odpovědí u myší a opic

Kazda z jamek na 96-ti jamkových plotnách, s průřezem jamek ve tvaru U (Costar, Cambridge,· MA) , byla povlečena 15 0 ng ova nebo gpl20 rozpuštěnými v 50 μΐ HBSS a inkubována přes noc při 4°C. Při stanovení protilátkových odpovědí proti ova a proti gpl20 u myší, byly plotny blokovány po

-24dobu 1 hodiny roztokem 1%-ho BSA. Do každé jamky byla přidána postupně ředěná séra v objemech 25 μΐ/jamka a inkubována po dobu 2 hodin. Plotny byly promyty a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ kozího IgG proti myším protilátkám ve zředění 1:1000 konjugovaného s křenovou peroxidázou (HRPO- horse radish peroxidase, SBT, Alabama) v roztoku obsahujícím 1%-ní BSA. Po jedné hodině inkubace byly plotny promyty a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ substrátu. Po 10 až 15 minutách byla odečítáná OD405. Při stanovení protilátkových odpovědí proti gp!20 u opic byly všechny kroky totožné s výše zmíněnými kroky s výjimkou faktu, že jak blokování ploten, tak zřeďování sér bylo prováděno v 5%-ním kozím séru v Hankově rovnovážném roztoku.

Syntéza peptidú

Syntetické peptidy odpovídající aminokyselinové' sekvenci ovalbuminu (ova 253 až 276) tvořené aminokyselinami 253 až 276 (Sekvence číslo 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; kde je použit standardní jednopísmenný kód aminokyselin), aminokyselinové sekvenci myelinového bazického proteinu (MBP 84 až 102) tvořené aminokyselinami 84 až 102 (Sekvence číslo 2: DENPWHFFKNIVTPRTPP) a syntetické peptidy odpovídající' aminokyselinové sekvenci gp 120111b tvořené aminokyselinami 308 až 322 (sekvence 18111b) byly syntetizovány peptidovou syntézou na pevné fázi za použití syntetizéru Applied Biosystems 430A. Aminokyseliny byly kondenzačně připojovány ve formě symetrických anhydridůs výjimkou asparaginu, glutaminu a argininu, které byly připojovány ve formě esterů hydroxybenzotriazolu. Účinnost tvorby peptidových vazeb byla sledována pomocí ninhydrinové reakce způsobem popsaným v článku Kaiser a další, 34 Anal. Biochem. 595, 1970. Peptidy byly z matrice uvolněny působením HF za využití high-low způsobu popsaného v článku Tam a další, 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983. Peptidy byly následně od matrice odděleny extrakcí 10% kyselinou octovou. Po lyofilizaci byly peptidy

-25odsoleny na koloně Sephadex G-25 a jednotlivé peptidy byly poté purifikovány HPLC chromatografií na reverzní fázi na preparativní koloně C-18 Vydac. Purifikované peptidy (98%) byly solubilizovány v HESS do finální koncentrace 10 mg/ml a následně zředěny v kompletním médiu na požadovanou koncentraci.

Štěpení pomocí CNBr

Vzorky proteinů (například β-galaktosidáza) byly vystaveny působení 100 násobného molárního nadbytku bromkyanu v roztoku 100 mM kyseliny trifluoroctové. Reakce probíhala 18 hodin při pokojové teplotě (okolo 20°C) za stálého promíchávání. Po uplynutí reakčního času byly peptidové štěpy separovány od reaktantů pomocí zařízení SEP-PAK C-18 (Waters), eluovány 95%-ním acetonitrilem a lyofilizovány.

Alkalické štěpení

Vzorky proteinů (například β-galaktosidáza) byly vystaveny působení 1 N NaOH a povařeny po dobu dvou minut. Získané peptidové fragmenty byly separovány od reaktantů pomocí zařízení SEP-PAK C-18 (Waters), eluovány 95%-ním acetonitrilem a lyofilizovány.

Příklad 1: Primární aktivace CTL namířených proti buňkám exprimujícím antigen v komplexu s MHC glykoproteiny I. třídy

Moore a další, 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989 a Carbone a Bevan, 171 J. Exp. Medicine 377, 1990 ukázali, že u myší imunizovaných slezinnými buňkami, jejichž cytolazma byla- nasycena rozpustným ova, došlo k indukci odpovědi CTL, která byla specificky namířená proti ova prezentovanému v komplexu s MHC glykoproteiny I. třídy. Buněčná linie EG7-ova, což jsou vlastně transfikované buňky EL7

-26exprimující ova, byla použita k in vitro stimulaci primárně aktivovaných (in vivo) lymfocytú přítomných ve slezině a buňky EG7-ova byly rovněž využity jako cílové buňky, které jsou zabíjeny činností CTL·, specificky namířených proti ova. Tato studie rovněž prokázala, že CD8+ efektorové buňky indukované prostřednictvím transfikovaných buněk EG7-ova nebo prostřednictvím slezinných buněk s cytoplazmou nasycenou antigenem ova rozpoznávají část ova tvořenou aminokyselinami 25Θ až 276 v komplexu s H-2Kb, lyžují buňky EG7-ova a rovněž ničí buňky EL4 pokryté částí ova tvořenou aminokyselinami 258 až 276. Za účelem stanovení, jestli může být, za použití rozpustného antigenu, indukována dráha zprostředkovaná endogenními CD8+ T-buňkami namířenými proti buňkám nesoucím antigen v komplexu s MHC glykoproteiny I. třídy, byl tudíž použit výše zmíněný systém, který umožňuje určit, jestli nějaký antigenní přípravek může být použit, spolu s rozpustným antigenem, k indukci odpovědi CTL namířené proti buňkám nesoucím antigen v komplexu s MHC glykoproteiny I. třídy.

a) ova

Myši C57BL/6 byly jednou imunizovány různými množstvími ova (30 μg až 1 mg ova na jednoho jedince) v kombinaci s nebo bez antigenním přípravkem. Myši byly injikovány subkutánně a do kořene ocasu. Nejdříve dva týdny po imunizaci byly z imunizovaných myší odebrány slezinné buňky a tyto buňky byly in vitro stimulovány prostřednictvím transfikovaných buněk EG7-ova. Použití antigenu ova v množství kolem 30 ^g bylo stejně účinné jako dávka obsahující 1 mg ova. Studie CTL byly tudíž rutinně prováděny se slezinnými buňkami získanými z myší imunizovaných 30 μg ova. Po pěti dnech kultivace slezinných buněk s EG7-ova byla existence primární aktivace stanovena na základě přítomnosti efektorových buněk specificky namířených proti ova, které jsou schopny lyžovat buňky EG7-ova.

-27Myši injikované ova rozpuštěným v HBSS, kde množství ova použité na jednu imunizaci dosahovalo až 1 mg, nevykazovala žádné stopy indukce CTL (Obrázek 1A) . Nicméně myši imunizované 30 μg ova v kombinaci s antigenním přípravkem popsaným výše vykazovaly výraznou odpověď CTL namířenou proti buňkám transfikovaným příslušným antigenem (obrázek 1C). Navíc množství buněk EG7-ova usmrcených prostřednictvím slezinných buněk získaných z myší imunizovaných pomocí ova-AF bylo srovnatelné s množstvím buněk EG7-ova usmrcených prostřednictvím slezinných buněk získaných z myší imunizovaných pomocí slezinných buněk nasycených antigenem ova (obrázek 1B).

Skutečnost, že in vivo primární aktivace CTL byla antigen specifická, byla prokázána tak, že slezinné buňky získané z myší imunizovaných β-galaktosidázou nevykazovaly in vitro sekundární odpověď CTL, jestliže byly stimulovány buňkami EG7-ova. Nebyla pozorována žádná indukce CTL namířená proti ova.

b) β-galaktosidáza

Obdobné výsledky byly získány při použití jiného rozpustného proteinového antigenu, kterým byla β-gal. Za účelem stanovení odpovědi CTL specificky namířené proti β-gal byly jako cílové buňky použity buňky C3-4 exprimující β-gal, odvozené transfekcí od buněčné linie získané z myší BALB/c. .Při imunizaci myší BALB/c rozpustnou β-gal bylo zjištěno určité pozadí u odpovědi CTL. Za účelem stanovení specifické odpovědi CTL byla tedy izolace slezinných lymfocytů odložena přinejmenším o osm týdnů a tyto lymfocyty byly následně kultivovány po dobu pěti dnů za přítomnosti ozářených transfikovaných buněk C3-4.

Obrázek 2B ukazuje, že 30 μρ β-galaktosidázy v AF indukovalo silnou odpověď CTL specificky namířenou proti transfikonaným buňkám C3-4. Při poměrech efektorová buňka ku cílové buňce (E:T) 3 ku 1, byly buňky izolované z myší

-28imunizovaných β-galaktosidázou použitou v kombinaci s AF schopny specificky usmrtit přibližně 80% buněk C3-4. Nicméně při použití efektorových buněk izolovaných z myší imunizovaných β-gal v HBSS bylo při stejném poměru E:T dosaženo usmrcení pouze 20% cílových buněk (obrázek 2A) Jelikož ani buňky EL4 ani buňky P815 neexprimují na svém povrchu MHC glykoproteiny II, třídy a lýza buněk je syngenně omezená, jsou efektorové buňky specificky namířené proti ova a β-gal ve svém působení omezené na cílové buňky exprimující MHC glykoproteiny I. třídy.

Aby byla prokázána efektivita antigenního přípravku, byly myši imunizovány rozpustným ova zapouzdřeným do dvou typu lipozomů, z nichž jedním typem byly lipozomy citlivé na změny v pH. Po jednom týdnu byly slezinné buňky in vitro stimulovány způsobem popsaným výše a bylo testováno jejich působení proti buňkám EG7-ova nebo EL4 značených izotopem 51Cr. Na Obrázku 3 jsou znázorněny reprezentativní výsledky ze kterých vyplývá, že antigen ova v lipozomech není u myší schopen vyvolat indukci CTL. Podobné výsledky byly získány v experimentech, kdy byly myši imunizovány antigenem ova v alum.

Příklad 2; Rozpoznání epitopu prostřednictvím CTL

Carbone a Bevan, viz výše, prokázali, že CTL indukované v myších C57BL/6 pomocí transfikovaných buněk EG7-ova anebo pomocí splenocytů, jejichž cytoplazma je nasycena ova, rozpoznávají buňky EL4, na jejichž povrchu jé přítomen peptid tvořený aminokyselinami 258 až 276 z ova. Za účelem stanovení, jestli rozpustný ovalbumin v kombinaci s AF indukuje podobné odpovědi CTL, byly z imunizovaných myší izolovány slezinné buňky a tyto buňky byly následně in vitro stimulovány s využitím EG7-ova. U efektorových buněk bylo testováno jejich působení proti buňkám EL4, na jejichž povrchu je přítomen peptid tvořený aminokyselinami 258 až 276 z ova, nebo proti buňkám EL4, na jejichž povrchu je

-29přítomen peptid odvozený z myelinového bazického proteinu (MBP 84-102). Získané výsledky ukazují, že CTL primárně aktivované pomocí ova-AF mají podobnou specifitu jako CTL primárně aktivované pomocí transfikovaných buněk nebo pomocí buněk, jejichž cytoplazma je nasycena ova (Obrázky 1A, IB a 1C) . Efektorové buňky primárně aktivované pomocí ova-AF účinně lyžovaly buňky EG7-ova a netransfikované buňky, jejichž povrch byl pokryt peptidem ova v množství 50 ^g/10^s buněk, ale tyto efektorové buňky nelyžovaly buňky EL4, jejichž povrch byl pokryt peptidem MBP v množství 50 /xg/10^a buněk.

Článek Carbone a Bevan, viz. výše, naznačuje, že v systému s β-galaktosidázou, v němž byly CTL indukované prostřednictvím transfikovaných buněk exprimujících β-gal nebo v němž byly CTL indukovány prostřednictvím splenocytů cytoplazmaticky nasycených rozpustnou β-galaktosidázou, lyžovaly tyto CTL indukované prostřednictvím splenocytů cytoplazmaticky nasycených rozpustnou β-galaktosidázou, lyžovaly netransfikované buňky P815, jejichž povrch byl pokryt fragmenty získanými alkalickou lýzou β-galaktosidázy. Jestliže byly myši imunizované rozpustnou β-galaktosidázou v kombinaci s AF, došlo k indukci CTL, a takto indukované buňky měly podobnou specifitu jako buňky indukované způsobem zmíněným výše (Obrázek 2).

Příklad 3: Efektorové buňky CTL jsou CD8+ T-buňky

Skutečnost', že rozpustné proteinové antigeny v kombinaci s AF indukují CD8+ efektorové T-buňky, byla prokázána následovně. Splenocyty získané z imunizovaných myší byly in vitro kultivovány spolu s ozářenými transfikovanými buňkami po dobu pěti dní. Následně byly buňky posbírány a ze směsi buněk byly za použití monoklonálních protilátek proti CD4 a proti CD8 spolu s komplementem selektivně odstraněny CD4+ a CD8+ T-buňky. Takto upravené buněčné populace byly poté testovány proti

-30buňkám EG7-ova značeným izotopem 51Cr (v ova systému.) nebo proti buňkám P13.1 značeným izotopem 51Cr (v β-gal systému). Data znázorněná na obrázku 4. naznačují, že v ova systému byla při použití populace buněk, z níž byly selektivně odstraněny CD8+ T-buňky, úplně zrušena cytolytická aktivita celé této populace efektorových buněk. Nicméně selektivní odstranění populace CD4+ T-buněk nemělo žádný vliv na lýzu buněk EG7-ova.

Podobně v β-gal systému vedlo selektivní odstranění CD8+ T-buněk ke zrušení cytolytické aktivity slezinných buněk získaných z myší imunizovaných antigenním přípravkem v kombinaci s antigenem β-gal.

Příklad 4: Rozpustný ova v kombinaci s AF primárně aktivuje CD8 + T-buňky

Za účelem prokázat, že směs ova-AF in vivo primárně aktivuje populace CD8+ T-buněk, a že tato primární aktivace je nezbytná k vyvolání sekundární odpovědi in vitro, byly ze slezinných buněk získaných z myší imunizovaných směsí ova-AF a z neimunizovaných myší selektivně odstraněny populace CD4+ buněk a CD8+ buněk. Takto zpracované populace byly následně in vitro stimulovány za použití samotných buněk EG7-ova nebo buněk EG7-ova spolu s CD4+ a CD8+ T-buňkami získanými z myší imunizovaných směsí ova-AF, nebo za použití buněk EG7-ova použitých v různých kombinacích s CD4+ buňkami nebo CD8+ buňkami získanými z myší imunizovaných směsí ova-AF spolu s CD4+ buňkami nebo CD8+ buňkami získanými z neimunizovaných myší. Obrázek 5 ukazuje, že primárně aktivované CD8+ buňky jsou nezbytné k manifestaci sekundární odpovědi CTL in vitro. Tato data rovněž naznačují, že k účinné sekundární odpovědi CTL in vitro jsou zapotřebí CD4+ T-buňky. CD4+ buňky nejsou potřebné k primární aktivaci. Obdobně, CD8+ T-buňky jsou nezbytné k in vitro manifestaci sekundární odpovědi CTL specificky namířené proti β-gal.

-31Výše zmíněné příklady ukazují účinky zmiňovaného antigenního přípravku na indukci odpovědí CTL namířených proti rozpustným proteinovým antigenům, přičemž tyto antigeny jsou rozpoznávány v kontextu MHC glykoproteinú I. třídy. Antigenní přípravek zprostředkoval primární aktivaci CTL rozpustnými antigeny a takto indukované CTL mají podobnou aktivitu jako CTL indukované prostřednictvím transfikovaných buněk a splenocytú cytoplazmaticky nasycených rozpustným ova nebo β-gal. V systému s ovalbuminem buňky EG7-ova, splenocyty cytoplazmaticky nasycené ova a směs ova-AF indukují: (a) CD8+ CTL, které rozpoznávají antigen v kontextu MHC glykoproteinú I. třídy; (b) CTL, které rozpoznávají cílové buňky senzitizované syntetickým peptidem o aminokyselinové sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci ova 253 až 276; a ( c) dlouhožijící CTL po jediné .imunizaci. V β-galaktosidázovém systému indukuje směs β-gal-AF CTL, které rozpoznávají transfikované buňky C3-4 exprimující β-gal, a rovněž rozpoznávají netransfikovaná buňky P815 senzitizované peptidovými fragmenty získanými alkalickou lýzou β-gal. Tato skutečnost je analogická dějům pozorovaným při indukci CTL prostřednictvím imunizace pomocí slezinných buněk cytoplazmaticky nasycených β-galaktosidázou. Indukce CTL, specificky namířených proti ova, prostřednictvím antigenního přípravku je unikátní, protože ani ova zapouzdřený v lipozomech reagujících na změnu pH, ani ova ve směsi s alum nejsou schopny in vivo primárně aktivovat CTL.

Zmíněné příklady naznačují, že antigenní přípravek použitý výše a jeho ekvivalenty, jsou využitelné k léčbě lidí a k vývoji vakcín sloužících k indukci CTL při různých rakovinných bujeních a virových onemocněních.

Příklad 5:

Tento specifický příklad ukazuje použití výše zmíněné AF za účelem primární aktivace CTL rozpoznávajících antigen

-32v kontextu MHC glykoproteinů I. třídy prostřednictvím rozpustného gpl20 viru HIV.

Buněčná linie exprimující gplSO IIIB (15-12) byla vytvořena z buněčné linie 3T3 odvozené od linie fibroblastú získaných z myší Balb/c. Tato linie byla získána od Dr. Rona Germaina a Dr. Jaye Berzofskeho z National Institute of Health, Bethesda, M. D. Buněčná linie exprimující gplSO byla využita k in vitro stimulaci in vivo primárně aktivovaných slezinných lymfocytú a rovněž byla použita jako cílová linie pro měření indukce CTL specificky namířených proti gpl60. Myši Balb/c byly jednou imunizovány 10 /zg gpl60 v kombinaci s nebo bez AF. Imunizace byla provedena subkutánní injekcí do polštářku na chodidle nebo do kořene ocasu. Dva týdny po imunizaci byly z imunizovaných myší izolovány slezinné buňky, a tyto buňky byly in vitro stimulovány prostřednictvím ozářených buněk transfikovaných gpl60. Po pětidenní kultivaci in vitro byla účinnost primární aktivace stanovována měřením přítomnosti efektorových buněk schopných specificky lyžovat buňky transfikované gpl60 a nelyžovat netransfikované buněčné linie. Získané výsledky jsou zobrazeny na obrázku 7, na němž vidíme, že odpověď CTL je monohonásobně zesílena přítomností AF a gpl20.

Následující příklad demonstruje použití antigenních přípravků podle vynálezu s využitím pouze jedné nebo dvou složek. Tyto příklady ukazují, že odpovědi CTL mohou být indukovány za použití pouze dvou z výše zmíněných tří -složek. .....

Příklad 6: Stanovení složek nepostradatelných k indukci CTL

Za účelem zjištění, zda-li jsou všechny z výše zmíněných komponent nezbytné, k antigen-specifické indukci CTL, byly myši imunizovány ovalbuminem v kombinaci s mikrofluidizovanou přípravkem tvořeným různými kombinacemi dvou nebo tří komponent přítomných ve výše zmíněné AF. Byly použity následující dvoj složkové přípravky; Skvalan/Tween v

-33PBS, Skvalan/Pluronic v PBS nebo Pluronic/Tween v PBS. Jiné sady přípravků byly použity v experimentech, ve kterých byly myši imunizovány pomocí ova v kombinaci s jednosložkovým systémem, například v kombinaci se Skvalanem v PBS, kopolymerem Pluronic v PBS nebo Tweenem v PBS. Výše zmíněný třísložkový antigenní přípravek byl modifikován tak, že byly postupně vyčleňovány jednotlivé složky a tyto složky byly nahrazeny PBS.

Výše zmíněné antigenní přípravky obsahují: 0,300 g Tweenu 80 (Aldrich, WI) , 1,875 g Pluronic L121 (BASF, NJ) a 7,5 g Skvalanu (Aldrich, WI) doplněné do celkového objemu 50 ml PBS.

Použité dvoj složkové přípravky:

Skvalan/Tween: 0,300 g Tweenu 80 a 7,5 g Skvalanu doplněné do celkového objemu 50 ml PBS.

Pluronic/Tween: 1,875 g Pluronic L121 a 0,300 g Tweenu 80 doplněné do celkového objemu 50 ml PBS.

Pluronic/Skvalan: 1,875 g Pluronic L121 a 7,5 g Skvalanu doplněné do celkového objemu 50 ml PBS.

Vzorky byly zpracovány v mikrofluidizéru, typ 110T, Microfluidics corp, uzavřeny do lahví a skladovány při 4°C až do doby použití.

Ovalbumin (Sigma, MO) byl zvážen a rozpuštěn v HBSS (Whittaker,, viz výše) na výslednou koncentraci 0,3 mg/ml.· Tento zásobní roztok ovalbuminu o koncentraci 0,3 mg/ml byl smíchán v následujících poměrech s dvoj složkovým přípravkem: 5 dílů roztoku ovalbuminu o koncentraci 0,3 mg/ml, 3,3 dílu dvoj složkového přípravku a 1,7 dílu HBSS.

Připravený přípravek byl vortexován a uchováván na ledu až do doby, kdy byl injikován. Všechny roztoky byly smíchány těsně před injikováním.

-34Každá myš obdržela prostřednictvím injekce do obou polštářků na chodidlech 200 μΐ některého z přípravků obsahující 30 gg ova a zbylý roztok byl injikován subkutánně do kořene ocasu. Vlastní odebrání sleziny bylo provedeno dva až čtyři týdny po imunizaci.

Dva týdny po imunizaci byly z myší izolovány slezinné buňky a tyto buňky byly in vitro stimulovány prostřednictvím ozářených buněk EG7-ova. Po pěti dnech kultivace byla přítomnost CTL specificky namířených proti ova měřena pomocí testů prováděných při 4°C na buňkách EG7-ova značených izotopem 51Cr nebo na buňkách EL4 značených izotopem 51Cr, při kterých bylo měřeno uvolňování iztopu 51Cr. Data znázorněná na obrázcích 8 až 10 ukazují, Že ovalbumin vpravený do mikrofluidizovaného dvoj složkového přípravku může in vivo specificky (proti ova) primárně aktivovat CTL.

Dále jsme hodnotili relativní příspěvky jednotlivých složek vzhledem k jejich schopnosti indukovat, jsou-li přítomny v kombinaci s proteinovými antigeny, CTL. Za účelem imunizace byl rozpustný antigen smíchán s mikrofluidizovanými excipienty a výsledkem byl vznik stabilní homogenní emulze tvořené částicemi o velikosti 250 az 300 nm. Za účelem určení, které ze složek přípravku tvořené Skvalanem-Tweenem 80-Pluronic (STP) jsou zodpovědné za indukci CTL, jsme imunizovali myši antigenem ova v kombinaci se směsí Skvalan-Tween 80 (ST), se směsí Pluronic-Tween 80 (PT) nebo se směsí Skvalan-Pluronic (SP) a jako kontrola byl použit antigen ova v kombinaci se Skvalanem (S), Tweenem 80 (T) nebokopolymerem Pluronic (P) Myši byly rovněž imunizovány pomocí ova-SAF (obsahujícího 70 /zg MDP) nebo pomocí ova-alum, které sloužily jako kontolní adjuvans. Jako pozitivní kontrola byly použity myši imunizované· slezinnými buňkami cytoplazmaticky nasycenými rozpustným ova. Byly rovněž použity další kombinace složek a také přípravky, ve kterých byla některá ze složek nahrazena

-35nějakým substituentem. Získané výsledky jsou, znázorněny v Tabulce 1.

Při experimentech sloužících k detekci primární aktivace CTL byly myši imunizovány pouze jednou. Dva týdny po imunizaci byly slezinné buňky smíchány s ozářenými buňkami EG7-ova (buňkami EL4 exprimujícími ova) a po pěti dnech kultivace bylo testováno jejich působení proti buňkám EG7-oVa značených izotopem 51Cr nebo proti buňkám EL4 značených izotopem 51Cr. Získané výsledky (Obrázek 11) ukazují, že 3 0 ptg ova v kombinaci s STP nebo ST primárně aktivuje u myší odpověď CTL, které rozpoznávají antigen v kontextu MHC glykoproteinů I. třídy. Primární aktivace CTL specificky namířených proti ova byla při použití ova v kombinaci s STP nebo s ST lepší, než tomu bylo u primární aktivace CTL pomocí slezinných buněk cytoplazmaticky nasycených rozpustným ova. Ova v kombinaci s PT nebo s SP móhl sice u myší indukovat specifické odpovědi CTL, ale jen velmi slabě a nedůsledně. Přidání MDP do přípravku obsahující ST neblokovalo, na rozdíl od účinků na přípravek SAFm, u myší indukci CTL specificky namířených proti ova (Tabulka 2) . Jestliže byly myši imunizovány pomocí ova smíchaného s jednotlivými složkami - S, P nebo T - nebo jestliže byly myši imunizovány pomocí ova-SAF nebo ova-alum, nedošlo k zádně indukci CTL specificky namířených proti ova. U myší imunizovaných ova v množství až 1 mg v (a) kombinaci s HESS, (b) v kombinaci s SAF nebo (c) absorbovaným v alum nedošlo k primární aktivaci CTL specificky namířených proti ova.

-36Tabulka 2:

Indukce odpovědi CTL specificky namířené proti ova není blokována prostřednictvím ST + MDP

Stimulant	Cílové buňky **	E:T	cytotoxicyta (v %) -ova-ST ova-ST	u myší imunizovaných porno ova-ST-MDP ova-ST-MDP 300 Mg/myš 72 /ig/myš
EG7-ova	EG7-ova	100:1	0	100	82	76
		33:1	0	86	67	62
		11:1	0	33	39	2S
		3:1	0	6	13	3
		1:1	0	0	0	0
		1:3	0	0	0	0

* myši byly imunizovány 3 0 μς ova v kombinaci s různými formulacemi * * cytotoxicita (v procentech) byla vypočítána tak, že od procentuálního množství usmrcených buněk daného typu bylo odečteno procento usmrcených buněk u linií, které neexprimují antigen

Příklad 7: Složky nezbytné k produkci protilátek specificky namířených proti ova

Myši byly celkem třikrát ve dvoutýdenních intervalech imunizovány pomocí 30 /ig ova v kombinaci s HBSS, STP, ST, PT nebo SP. Jako pozitivní kontrola byly použity myši imunizované pomocí ova-SAF, protože je známo, že SAF indukuje silnou protilátkovou odpověď. Sedm dní po druhé a po třetí imunizaci byla myším odebrána krev a séra byla testována na přítomnost protilátek specificky namířených proti ova. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 3. Tyto výsledky naznačují, že myši imunizované pomocí ova v kombinaci s STP, ST nebo SAF vykazují po dvou imunizacích podobné humorální odpovědi specificky namířené proti ova.

-37Tabulka 3: Indukce protilátkové odpovědi namířené proti ova

30 ^g ova/zvíře přípravek	počet myší, u kterých nastala reakce/počet myší injikovaných	1/zředění titr séra
HBSS	0/3	<1/20, <1/20, <1/20
STP	3/3	<1/4860, >1/4860, <1/4860
ST	3/3	>1/4860, >1/4860, >1/4860
PT	NA	NA, NA, NA
SP	NA	NA, NA, NA
SAF-M	3/3	1/4860, 1/4860, 1/4860
* NA; není k di	spozici

Příklad 8:Indukce CTL· specificky namířená proti gpl20 viru HIV

Za účelem měření indukce CTL byl jako druhý antigenní systém použit gpl20 IIIB viru HIV v kombinaci s STP, ST nebo MP-T. Myši byly imunizovány 1/ig gp210 Illb v kombinaci s HBSS, STP, PT nebo ST. Jako kontrola byly použity myši imunizované 1 μν gpi20 II Ib v kombinaci s SAF nebo CFA (kompletní Freundovo adjuvans) nebo v systému RIBI, který obsahuje MPL (monofosfátu lipidu A) a TDM (Trehalose dimycolite - dimykolit trehalózy). Tři týdny po imunizaci byly získány slezinné buňky a tyto buňky byly in vitro stimulovány transfikovanými buňkami 15-12 vystavenými působení mitomycinu nebo byly stimulovány peptidem 18111b. Po pěti dnech kultivace byly vzniklé efektorové buňky testovány v působení proti buňkám P815 infikovaným virem vacciniargplSO nebo rodičovským virem vakcinia.

Získané výsledky ukazují, že přípravek gpl20-Skvalan-Tween 80 indukoval u myší odpověď CTL specificky namířenou proti gpl20, ale k této indukci nedošlo

-38při použití přípravku gpl20-Skvalan-Tween 80-Pluronic nebo gpl2Ó-HBSS (Tabulka 4).

Tabulka 4: Indukce odpovědi CTL specificky namířené proti gp!20 u myší

Stimulant	Cílové buňky **	cytotoxicita (v %) u myší imunizovaných pomocí*
E:T	gpl20-HBSS	gpl20-ST	gpl20-STP
18IIIb/lL2	vakc:gpl20	100:1	23	42	NA***
		33:1	23	38	NA
		11:1	0	0	NA
		3:1	0	35	NA
18IIIb/lL2	15-12	100:1	0	50	0
		33:1	o'	35	0
		11:1	0	27	0
		3:1	0	18	0
18IIIb/IL2	3T3 +	100:1	0	59	13
	18111b	33:1	0	59	2
		11:1	0	57	0
		3:1	0	29	0
15-12	vakc:gpl20	100:1	35	84	NA
		33:1	19	65	NA
		11:1	12	37	NA
		3:1	0	22	NA
		1:1	0	0	NA

* myši byly imunizovány 1 /xg gp!20III v kombinaci s různými formulacemi ** cytotoxicita (v procentech) byla vypočítána tak, že ód procentuálního množství usmrcených buněk daného typu bylo odečteno procento usmrcených buněk u linií, které neexprimují antigen *** NA; není k dispozici

-39Příklad 9: Indukce humorální odpovědi u myší specificky namířené proti gpl20

Za účelem indukce humorální odpovědi specificky namířené proti gp!20 byly myši imunizovány 1 μ<3 gpl20IIIb celkem třikrát ve dvoutýdenních intervalech. Těmto zvířatům byla odebrána krev a získané sérum bylo metodou ELISA na pevné fázi testováno na přítomnost protilátek typu IgG namířených proti gpl20IIIb. Získané výsledky ukazují, že gpl20-ST je více imunogenní než gpl20-HBSS, gpl20-SAF .nebo gpl20-STP (Tabulka 5) .

Tabulka 5: Indukce protilátkové odpovědi namířené proti gpl20

1μ<3 gpl20/zvíře formulace	počet myší, u kterých nastala reakce/počet myší injikovaných	1/zředění titr séra
HESS	0/3	<1/20, <1/20, <1/20
STP	1/3	<1/20, >1/4860, <1/20
ST	3/3	>1/4860, >1/4860, >1/4860
PT	3/3	>1/4860, >1/4860, >1/4860
SP	2/3	<1/20, 1/540, 1/540
SAF-M	2/3	1/180, >1/4860, 1/540

Příklad 10: Protilátkové odpovědi specificky namířené proti gpl20 u opic

Opice (dvě ve skupině) byly imunizovány pomocí gpl20-SAFm, gpl20-SPT, gpl20-ST nebo gpl20-HBSS. Jako kontrola byla použita skupina opic, kde byla zvířata imunizována rekombinantním virem vakcinia nesoucím gpl60 Illb. Opice byly imunizovány ve dvoutýdenních intervalech a krev jim byla odebrána tři týdny po druhé imunizaci. Séra získaná z každé opice před imunizací a po imunizaci byla postupně zřeďována a metodou ELISA, tak jak je popsáno v oddíle Materiál a metody, byla v sérech stanovována

-40protilátková aktivita proti gpl20. Data (obrázek 12) naznačují, že u opic imunizovaných gpl20-STP nebo gpl20-SAFm jsou indukovány podobně silné humorální odpovědi. U jedné opice imunizované pomocí gpl20-ST byla indukována odpověď proti gpl20 podobná odpovědím u opic imunizovaných pomocí gpl20-SAFm nebo gpl20-SPT. U jedné opice imunizované pomocí gpl20-ST nedošlo ani po dvou imunizacích k indukci silné odpovědi proti gpl20.

Příklad 11: In vivo aktivita AF použité v kombinaci s HPV 16 E7

1. Tvorba rekombinantního proteinu HPV 16 E7 použitého k imunizaci

a) PCR a klonování genu E7

Gen HPV 16 E7 byl klonován z plazmidu získaného od Dr. Karen Vousdenové (Ludwig Institute) kódujícího gen E.7 odvozený z buněčné linie karcinomu CaSki. Kódující oblasti byly amplifikovány pomocí PCR za použití primerů, které jsou komplementární k 5' a 3' koncům kódující sekvence genu a navíc obsahují klonovací místa pro restrikční enzymy BamHI a Sal I. PCR produkt E7 byl zaligován do expresívního vektoru pGEX - 4T.-1 (Pharmacia Biotech) a výsledkem této ligace byl expresívní plazmid pGEX.E7. Tímto expresívním plazmidem pGEX.E7 byly transfikovány baktérie E. coli kmene XL1 - blue (Stratagene). Sekvence genu E7 získaná z plazmidů .izolovaných z vyrostlých kolonií byla stejná jako sekvence genu E7 získaného z buněk CaSki.

b) Produkce a purifikace proteinu E7 produkovaného bakteriemi

Bakteriální expresívní plazmid pGEX.E7 kóduje fůzní protein glutathion-S-transferázy (GST), který se skládá z GST na NH2 konci následované štěpným místem rozpoznávaným proteázou thrombin a karboxy-konec je tvořen proteinem E7. Protein E7 byl produkován a purifikován způsobem popsaným v

-41katalogu získaném od výrobce vektoru pGEX-4T-l (Pharmacia Biotech). Stručně řečeno, u bakterií obsahujících expresívní plazmid pGEX.E7 byla exprese tohoto fůzního proteinu indukovaná přidáním izopropyl-p-D-thiogalaktosidázy do kultivačního média. Buňky byly sklizeny a lyžovány mírnou sonikací. Buněčný lyzát byl vpraven do roztoku Glutathion Sepharozy 4B (Pharmacia Biotech). Poté co se fůzní protein naváže na matrix, je tato matrix promyta za účelem odstranění nespecificky navázaných proteinů. Navázáný fůzní protein byl rozštěpen thrombinem. Při tomto štěpení byl protein E7 odštěpen od GST na fůzním proteinu.

Takto připravený protein E7 byl analyzován prostřednictvím SDS elektroforézy na polyakrylamidovém gelu a koncentrace proteinu byla stanovena metodou podle Bradfordové (BioRad). Z jednoho litru bakteriální kultury bylo získáno 9 mg rozpustného proteinu E7.

2. Vytvoření transfektantů X21 transfikovaných genem kódujícím protein E7

Kódující sekvence proteinu E7 viru HPV16 (viz výše) byly vloženy do eukaryotického expresívního plazmidu INPEP4 (chráněná známka firmy IDEC). V tomto vektoru je exprese genu E7 řízena transkripčními prvky, promotorem/zesilovačem transkripce, Cytomegaloviru. Navíc, první tři nukleotidy kódující sekvence genu E7 byly odstraněny a nahrazeny vedoucí sekvencí imunoglobulinového lehkého řetězce, která byla umístěna do místa ležícího proti směru transkripce hned vedle kódující oblasti genu E7 a nacházejícího se ve stejném čtecím rámci jako kódující oblast genu E7. Po transfekci myší buněčné linie X21 tímto konstruktem byla u jednotlivých klonů buněk rezistentních vůči antibiotiku.G418 zjišfována, pomocí analýzy metodou Northern blot, produkce messengerové RNA kódující protein E7. Každý klon vykazoval detekovatelné množství messengerové RNA kódující protein E7. U buněčných lyzátů dvou klonů 4E7 a 1C7 (nazývané též HOPEI a HOPE2)

-42byla provedena analýza metodou Western blot a tato analýza prokázala produkci proteinu E7 v těchto klonech.

3. In vivo účinnost imunizace pomocí rozpustného antigenu E7/AF

K těmto studiím byly použity samice myší C3H (H2^k/k, Harlan Sprague Dawley). Se zvířaty byly zacházeno v souladu s Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (DHHS Publication No. NIH 86 až 123, Bethesda, MD:NIH, 1985), byl jim poskytován dostatek potavy a vody. Při těchto studiích byla použita buněčná linie buněk HOPE2 H2^k/k transfikovaná genem E7. Linie nádorových buněk byla in vitro udržována opakovaným pasážováním.

U této buněčné linie bylo prokázáno, že je i po opakovaném pasážování in vitro schopna cytoplazmatické exprese antigenu E7. Tato skutečnost byla prokázána Western blotovou analýzou. Růst nádorů byl u syngenních myší C3H iniciován prostřednictvím subkutánní injikace buněk pasážovaných in vitro v množství 150000 buněk.

Velikost nádoru byla měřena ve dvou na sebe kolmých směrech v intervalech dvou týdnů. Objem jednotlivých nádorů (V) byl spočítán podle následujícího vzorce:

V (mm³) = (LxW²)/2 kde:

L = nejdelší naměřená osa v mm

W = osa kolmá k L (mm)

Data v Tabulce 6 jsou prezentována jako Počet myší s nádorem (počet zvířat majících nádor vzhledem k celkovému počtu injikovaných zvířat) . Data na obrázcích 13 a 14 jsou prezentovány jako medián velikosti nádorů (mm³) u každé léčené skupiny a u kontrolní skupiny. Každá léčená skupina byla srovnávána s kontrolní skupinou, která nepodstupovala terapii. Terapie byla zahájena 10 dní po inokulaci zvířat

-43buňkama H0PE2, když byla většina nádoru už hmatatelná (přibližně 50 až 75 mm³) . Terapie byla zahájena imunizací myší rozpustným proteinem E7 v kombinaci s AF nebo s adjuvans Alum (subkutánně, celkový objem 0,2 ml). Těsně před imunizací byla AF míchána po dobu 30 sekund s proteinem E7 v Hankově rovnovážném roztoku solí (HESS) tím způsobem, aby každá mys obdržela buď 30 pg nebo 90 pg proteinu E7 v 0,2 ml roztoku. Alum (Pierce Chemical Co.) bylo smícháno s proteinem E7 podle instrukcí výrobce, tak aby každá myš obdržela 90 pg proteinu E7 v 0,2 ml roztoku. Zvířata ve druhé léčené skupině byla imunizována o 9 dní později (19 dní po inokulaci nádorových buněk). Složky použité pro druhou imunizaci (upomínací dávka) byly připraveny těsně před inokulaci způsobem popsaným výše.

V tomto příkladu (tabulka 6: experiment #223), 41 dní po inokulaci nádorových buněk, jenom 4/8 a 5/8 z myší imunizovaných jednou injekcí rozpustného E7 v kombinaci s AF (30 pg v prvním případě nebo 90 pg ve druhém případě) mělo měřitelné nádory. Naopak všechny myši imunizované proteinem E7 v kombinaci s Alum (8/8) měly aktivně rostoucí nádory. Navíc, jak je zobrazeno na obrázku 13, jenom u léčených skupin imunizovaných proteinem E7 v kombinaci s AF byla pozorována významná inhibice růstu nádorů, jak je patrné ze srovnání těchto skupin s kontrolní skupinou (neléčenou) nebo s léčenými skupinami imunizovanými proteinem E7 v kombinaci s Alum. U myší imunizovaných jednou injekcí proteinu E7 v Alum nebyla pozorována inhibice růstu nádorů (obrázek 13) nebo zvýšená rychlost regrese nádorů (tabulka 6).

Podobné výsledky byly rovněž pozorovány u' léčených skupin, které byly imunizovány celkem dvakrát, 10 a 19. dní po inokulaci nádorovými buňkami (tabulka 6 á obrázek 14) , ačkoliv částečné zpomalení růstu nádorů bylo pozorováno i u myší imunizovaných dvěma injekcemi proteinu E7 v kombinaci s Alum.

-44Získané výsledky naznačují, že významná protinádorová aktivita, která byla měřena prostřednictvím snížení počtu myší nesoucích nádory a inhibicí růstu nádorů, byla pozorována následně po imunizaci rozpustným E7 v kombinaci s AF. Naopak u všech zvířat imunizovaných buď jedinou nebo dvěma injekcemi rozpustného proteinu E7 v kombinaci s Alum, byly přítomny rostoucí nádory. Celkově lze tedy shrnout, že imunizace pomocí rozpustného proteinu E7 v kombinaci s AF měla za následek významnou inhibici růstu nádorových buněk, která nebyla pozorována při imunizaci pomocí rozpustného proteinu E7 v kombinaci s Alum.

Tabulka 6: Protinádorová aktivita při imunizaci pomocí rozpustného proteinu E7 v kombinaci s adjuvans

Experiment č.	Léčba	Dávka (^g/myš)	Počet zvířat s nádory a 41. den
223	kontrola	-	7/8
223	E7 v kombinaci s AF	30 μς x lb	4/8
223	E7 v kombinaci s AF	90 gg x 1	5/8
223 '	E7 v kombinaci s Alum	90 gg x 1	8/8
223	E7 v kombinaci s AF	30 μ$ x 2C	3/8
223	E7 v kombinaci s AF	90 gg x 2	1/4
223	Ξ7 v kombinaci s Alum	90 gg x 2	8/8

a. Počet myší majících nádory/celkový počet myší, které byly inokulovány

b. Všechny imunizace začaly 10. den po implantaci

c. Druhá imunizace (x2) byla provedena 19. den po implantaci

Další provedení vynálezu jsou popsána v následujících patentových nárocích.

Claims (43)

1. PATENTOVÉNÁROKY

   1. Kompozice vyznačující se tím, že obsahuje antigen smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem obsahujícím:

   a) stabilizující detergent

   b) činidlo podporující tvorbu micel

   c) biologicky degradovatelný a biokompatibilní olej přičemž tento antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, v podstatě neobsahuje žádné imunostimulující peptidy a po administraci do zvířete vybraného ze skupiny tvořené člověkem, domácími zvířaty a zemědělskými zvířaty, je schopen indukovat specifickou odpověď cytotoxických T-lymfocytú proti antigenu, který je v této kompozici obsažen.
2. 2. Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že antigen je vybrán ze skupiny tvořené antigenními oblastmi antigenu viru HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat. a Rev; z antigenních oblastí antigenů malárie: proteinu CS a povrchovému proteinu 2 sporozoitu,- z antigenních oblastí povrchových antigenů viru hepatitidy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a HBe Ag; z antigenních oblastí antigenů viru chřipky: HA, NP a NA; z antigenních oblastí povrchových antigenů viru hepatitidy A; z antigenních oblastí antigenů herpetického viru: EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gD, časného proteinového produktu HSV, cytomegaloviru gB, cytomegaloviru gH a proteinu gP72 IE; z antigenních oblastí antigenů syncyciálního viru napadajícího respirační systém: proteinu F, proteinu G a proteinu N; a z antigenních oblastí antigenů spojených s rakovinou: produktu CEA karcinomu, mucinu asociovaného s karcinomy, produktu P21 karcinomu, produktu P53 karcinomu, produktu MPG melanomu, produktu p97 melanomu

   -46a produktu onkogenu Neu karcinomu, produktu genu p53 karcinomu a mutovaného proteinu p21 ras.
3. 3. Kompozice vyznačující se tím, že obsahuje antigen smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem obsahujícím:

   a) stabilizující detergent

   b) činidlo podporující tvorbu micel

   c) biologicky degradovatelný a biokompatibilní olej přičemž tento antigenní přípravek je. tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, neobsahuje žádné imunostimulující peptidy a po administraci ' do zvířete vybraného ze skupiny tvořené člověkem, domácími zvířaty a zemědělskými zvířaty, je schopen indukovat specifickou odpověď cytotoxických T-lymfocytú proti antigenu, který je v této kompozici obsažen.
4. 4. Kompozice podle nároku 3 vyznačující se tím, že antigenní přípravek sestává v podstatě z uvedeného detergentu, činidla a oleje.
5. 5. Kompozice podle nároku 3 vyznačující se tím, že antigenní přípravek je netoxický pro člověka nebo pro domácí či zemědělské zvíře.
6. 6. Kompozice podle nároku 3 vyznačující se tím, že antigen je vybrán ze skupiny tvořené antigenními oblastmi antigenů viru HIV: gplSO, gag, pol, Nef, Tat a Rev; antigeny malárie: proteinem CS a povrchovým proteinem 2 sporozoitu; povrchovými antigeny viru hepatitidy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a HBe Ag; antigeny viru chřipky: HA, NP a NA; povrchovými antigeny viru hepatitidy A; z antigenními oblastmi antigenů herpetického viru: EBV gp340, EBV gp85, HSV

   -47gb, HSV gD, časným proteinovým© produktem HSV, cytomegalovirem gB, cytomegalovirem gH a proteinem gP72 IE; antigeny syncyciálního viru napadajícího respirační systém: proteinem F, proteinem G a proteinem N; a antigeny spojenými s rakovinou: produktem CEA karcinomu, mucinem asociovaným s karcinomy, produktem P21 karcinomu, produktem P53 karcinomu, produktem MPG melanomu, produktem p97 melanomu a produktem onkogenu Neu karcinomu, produktem genu p53 karcinomu a mutovaným proteinem p21 ras.
7. 7. Způsob indukce odpovědi cytotoxických T-lymfocytů ve zvířeti vybraném ze skupiny tvořené člověkem, domácími a zemědělskými zvířaty vyznačující se tím, že obsahuje podání takové příměsi uvedenému zvířeti, která obsahuje antigen a mikrofluidizovaný antigenní přípravek sestávající ze a) stabilizujícího detergentu b) činidla podporujícího tvorbu micel

   c) biologicky degradovatelného a biokompatibilního oleje přičemž tento antigenní přípravek neobsahuje žádnou složku tvořenou imunostimulujícími peptidy a je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, přičemž je tato příměs tomuto zvířeti podána v množství dostatečném k vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů proti antigenu, který je v této příměsi obsažen.
8. 8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že antigenní přípravek sestává v podstatě z uvedeného detergentu, činidla a oleje.
9. 9. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že sestává v podstatě z jediného podání uvedené směsi člověku nebo uvedenému zvířeti.
10. 10. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že člověk nebo uvedené zvíře je nakaženo virem nebo vykazuje jeden nebo více příznaků virové infekce.
11. 11. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že antigenní přípravek je netoxický pro člověka nebo pro domácí či zemědělské zvíře.
12. 12. Způsob podle nároku 7 vyznačující se t ΐ ^m > že antigen je vybrán ze skupiny tvořené antigeny viru HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat a Rev; antigeny malárie: proteinem CS a povrchovým proteinem 2 sporozoitu; povrchovými antigeny viru hepatitidy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a HBe Ag; antigeny viru chřipky: HA, NP a NA; antigeny viru hepatitidy A; antigeny herpetického viru: EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gD, časným proteinovým produktem HSV, cytomegalovirem gB, cytomegalovirem gH a proteinem gP72 IE; antigeny syncyciálního viru napadajícího respirační systém: proteinem F, proteinem G a proteinem N; a antigeny spojenými s rakovinou: produktem CEA karcinomu, mucinem spojeným s karcinomy, produktem P21 karcinomu, produktem P53 karcinomu, produktem MPG melanomu, produktem p97 melanomu a produktem onkogenu Neu karcinomu, produktem genu p53 karcinomu a mutovaným proteinem p21 ras.
13. 13. Způsob léčby pacienta infikovaného virem HIV vyznačující se tím, že zahrnuje podání kompozice obsahující antigen viru HIV smíšený s

    -49mikrofluidizovaným antigenním přípravkem, který obsahuje:

    a) stabilizující detergent

    b) činidlo podporující tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelný a biokompatibilní olej přičemž tento antigenní přípravek neobsahuje žádnou složku tvořenou imunostimulující peptidy a je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, přičemž je tato příměs pacientovi podána v množství dostatečném pro vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytú.
14. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že antigen viru HIV je vybrán ze skupiny tvořené antigeny gplSO, gag, pol, Nef, Tat a Rev.
15. 15. Způsob léčby pacienta trpícího ' malárií vyznačující se tím, že zahrnuje podání mikrofluidizované kompozice obsahující antigen spojený s malárií smíšený s antigenním přípravkem, který obsahuje:

    a) stabilizující detergent

    b) činidlo podporující tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelný a biokompatibilní olej přičemž tento antigenní přípravek neobsahuje žádnou složku tvořenou imunostimulující peptidy a je tvořen .stabilní emulzí olej· ve vodě, přičemž je tato příměs pacientovi podána v množství dostatečném pro vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytú.
16. 16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že antigen spojený s malárií je vybrán ze skupiny tvořené proteinem CS a povrchovým proteinem 2 sporozoitu.

    -SO-
17. 17. Způsob léčby pacienta trpícího chřipkou vyznačující se tím, že zahrnuje podání kompozice obsahující antigen spojený s chřipkou smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem, který obsahuj e:

    a) stabilizující detergent

    b) činidlo podporující tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelný a biokompatibilní olej přičemž tento antigenní přípravek neobsahuje žádnou složku tvořenou imunostimulující peptidy a je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, přičemž je tato příměs pacientovi- podána v množství dostatečném pro vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
18. 18. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že antigen spojený s chřipkou je vybrán ze skupiny tvořené proteiny HA, NP a NA.
19. 19. Způsob léčby pacienta trpícího hepatitidou vyznačující se tím, že zahrnuje podání kompozice obsahující antigen spojený s hepatitidou smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem, který obsahuje:

    a) stabilizující detergent

    b) činidlo podporující tvorbu micel ' c) biologicky degradovatelný a biokompatibilní Olej ' přičemž tento antigenní přípravek neobsahuje žádnou složku tvořenou imunostimulující peptidy a je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, přičemž je tato příměs pacientovi podána v množství dostatečném pro vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
20. 20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že antigen spojený s hepatitidou je vybrán ze skupiny tvořené povrchovým antigenem hepatitidy A, Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a antigenem HBe.
21. 21. Způsob léčby pacienta trpícího rakovinou vyznačující se tím, že zahrnuje podání kompozice obsahující antigen spojený s rakovinou smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem, který obsahuje:

    a) stabilizující detergent

    b) činidlo podporující tvorbu micel

    c) biologicky.degradovatelný a biokompatibilní olej přičemž tento antigenní přípravek neobsahuje žádnou složku tvořenou imunostimulující peptidy a je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, přičemž je tato příměs pacientovi podána v množství dostatečném pro vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
22. 22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se·, tím, že antigen spojený s rakovinou je vybrán ze skupiny tvořené produktem CEA karcinomu, mucinem spojeným s karcinomy, produktem P21 karcinomu, produktem P53 karcinomu, produktem MPG melanomu, produktem p97 melanomu a produktem onkogenu Neu karcinomu, produktem genu p53 karcinomu· a mutovaným proteinem p21 ras.
23. 23. Způsob léčby pacienta infikovaného herpetickým virem vyznačující se tím, že zahrnuje podání kompozice obsahující antigen herpes viru smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem, který obsahuje:

    a) stabilizující detergent

    b) činidlo podporující tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelný a biokompatibilní olej přičemž tento antigenní přípravek neobsahuje žádnou složku tvořenou imunostimulující peptidy a je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, přičemž je tato příměs pacientovi podána v množství dostatečném pro vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
24. 24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že antigen herpetického viru je vybrán ze skupiny tvořené antigeny EBV gp340, -EBV gp85, HSV gb, HSV gD, HSV gH, časným proteinovým produktem HSV, cytomegalovirem gB, cytomegalovirem gH a proteinem gP72.
25. 25. Způsob léčby pacienta infikovaného syncyciálním virem napadajícím respirační systém vyznačuj ící se tím, že zahrnuje podání kompozice obsahující antigen syncyciálního viru napadajícího respirační systém smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem, který obsahuje:

    a) stabilizující detergent

    b) činidlo podporující tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelný a biokompatibilní olej přičemž tento antigenní přípravek neobsahuje žádnou složku tvořenou imunostimulující peptidy a je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, přičemž je tato příměs pacientovi podána v množství dostatečném pro' vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
26. 26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že antigen syncyciálního viru napadajícího respirační systém je vybrán ze skupiny tvořené proteinem F, G a N.

    -5327.

    28 .

    29.

    30.

    Způsob indukce odpovědi cytotoxických T-lymfocytú v člověku nebo v domácím či zemědělském zvířeti vyznačující se tím, že obsahuje podání směsi, která obsahuje antigen a mikrofluidizovaný antigenní přípravek sestávající v podstatě ze dvou z následujících složek:

    a) stabilizujícího detergentu

    b) činidla podporujícího tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelného a biokompatibilního olej e přičemž tento antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, a přičemž je tato směs zvířeti podána v množství dostatečném k vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytú.

    Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že člověk nebo domácí či zemědělské zvíře je infikováno virem a trpí jedním nebo více příznaky infekce tímto virem.

    Způsob podle nároku 27 vyznačující se.' tím, že antigenní přípravek není pro člověka nebo domácí či zemědělské zvíře toxický.

    Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že antigen je vybrán ze skupiny tvořené antigenními oblastmi antigenů viru HIV: gpl60, gag, pol, Nef, Tat a Rev; antigeny malárie: proteinu CS a povrchovému proteinu 2 sporozoitu; antigenními oblastmi povrchových antigenů viru hepatitidy B: Pre-Sl, Pre-S2, HBc Ag a HBe Ag; antigeny viru chřipky: HA, NP a NA; antigeny viru hepatitidy A; antigeny herpetického viru: EBV gp340, EBV gp85, HSV gb, HSV gD, Časným proteinovým produktem HSV,

    -54cytomegalovirem gB, cytomegalovirem gH a proteinem gP72 IE; antigeny syncyciálního viru napadajícího respirační systém: proteinem F, proteinem G a proteinem N; a antigeny spojenými s rakovinou: produktem CEA karcinomu, mucinem spojeným s karcinomy, produktem P21 karcinomu, produktem P53 karcinomu, produktem MPG melanomu, produktem p97 melanomu a produktem onkogenu Neu karcinomu, produktem genu p53 karcinomu a mutovaným proteinem p21 ras.
27. 31. Způsob léčby pacienta infikovaného virem HIV vyznačující se tím,že obsahuje podání směsi, která obsahuje antigen viru HIV smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem sestávajícím v podstatě ze dvou z následujících složek:

    a) stabilizujícího detergentu

    b) činidla podporujícího tvorbu micel

    c) biologicky, degradovatelného a biokompatibilního oleje přičemž tento antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, a přičemž je tato kompozice pacientovi podána v množství dostatečném k vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytú.
28. 32. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že antigen viru HIV je vybrán z antigenů gpl60, gag,' pol, Nef, Tat a Rv.
29. 33. Způsob léčby pacienta trpícího malárií vyznačující se tím, že obsahuje podání směsi, která obsahuje antigen spojený s malárií smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem sestávajícím v podstatě ze dvou z následujících složek: a) stabilizujícího detergentu

    b) činidla podporujícího tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelného a biokompatibilního oleje přičemž tento antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, a přičemž je tato kompozice pacientovi podána v množství dostatečném k vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
30. 34. Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že antigen spojený s malárií je vybrán z proteinu CS a povrchového proteinu 2 sporozoitu.
31. 35. Způsob léčby pacienta trpícího chřipkou vyznačující se tím,že obsahuje podání směsi, která obsahuje antigen spojený s chřipkou smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem sestávajícím v podstatě ze dvou z následujících složek: a) stabilizujícího detergentu b) činidla podporujícího tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelného a biokompatibilního oleje přičemž tento antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, a přičemž je tato kompozice pacientovi podána v množství dostatečném k vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
32. 36. Způsob podle nároku 35 vyznačující se tím, že antigen spojený s virem chřipky je vybrán z antigenů HA, NP a NA.
33. 37. Způsob léčby pacienta trpícího hepatitidou vyznačující se tím, že obsahuje podání směsi, která obsahuje antigen spojený s hepatitidou

    -56smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem sestávajícím v podstatě ze dvou z následujících složek: a) stabilizujícího detergentu

    b) činidla podporujícího tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelného a biokompatibilního oleje přičemž tento antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, a přičemž je tato kompozice pacientovi podána v množství dostatečném k vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
34. 38. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že antigen spojený s virem hepatitidy je vybrán z povrchových antigenů viru hepatitidy A, Pre.Sl, Pre-S2, HBc-Ag a HBe Ag.
35. 39. Způsob léčby pacienta trpícího rakovinou vyznačující se tím, že obsahuje podání směsi, která obsahuje antigen spojený s rakovinou smísený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem sestávajícím v podstatě ze dvou z následujících složek: a) stabilizujícího detergentu b) činidla podporujícího tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelného a biokompatibilního oleje přičemž tento antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, a přičemž je tato kompozice pacientovi podána v množství dostatečném k vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
36. 40. Způsob podle nároku 39 vyznačující se tím, že s rakovinou spojený antigen je vybrán ze skupiny tvořené produktem CEA karcinomu, mucinem

    -57spojeným s karcinomy, produktem P21 karcinomu, produktem P53 karcinomu, produktem MPG melanomu, produktem p97 melanomu a produktem onkogenu Neu karcinomu, produktem genu p53 karcinomu a mutovaným proteinem p21 ras.
37. 41. Způsob léčby pacienta trpícího herpetickým virem vyznačující se tím, že obsahuje podání směsi, která obsahuje antigen herpetického viru smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem sestávajícím v podstatě ze dvou z následujících složek: a) stabilizujícího detergentu b) činidla podporujícího tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelného a biokompatibilního oleje přičemž tento antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, a přičemž je tato kompozice pacientovi podána v množství dostatečném k vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
38. 42. Způsob podle nároku 41 vyznačující se tím, že antigen herpetického viru je antigeny EBV gp340, EBV gp8S, HSV gb, HSV gD, časným proteinovým produktem HSV, proteinem gB cytomegaloviru, proteinem gH cytomegaloviru a proteinem gP72 IE.'.
39. 43. Způsob léčby pacienta trpícího syncyciálním virem napadajícím respirační systém vyznačuj ící se tím, že obsahuje podání směsi, která obsahuje antigen syncyciálního viru napadajícího respirační systém smíšený s mikrofluidizovaným antigenním přípravkem sestávajícím v podstatě ze dvou z následujících složek:

    a) stabilizujícího detergentu

    b) Činidla podporujícího tvorbu micel

    c) biologicky degradovatelného a biokompatibilního oleje přičemž tento antigenní přípravek je tvořen stabilní emulzí olej ve vodě, a přičemž je tato kompozice pacientovi podána v množství dostatečném k vyvolání specifické odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.·
40. 44. Způsob podle nároku 43 vyznačující se tím, že antigen syncyciálního’ viru napadajícího respirační systém je vybrán ze skupiny tvořené proteinem F, proteinem G a proteinem N.

    Způsob podle libovolného z nároků 25 až 44 vyznačující se tím, že antigenní přípravek se téměř výhradně skládá z uvedeného detergentu a z uvedeného činidla podporujícího tvorbu micel.
41. 46. Způsob podle libovolného z nároků 25 až 44 vyznačující se tím, že antigenní přípravek se téměř výhradně skládá z uvedeného detergentu a z uvedeného oleje.
42. 47. Způsob podle libovolného z nároků 25 až 44 vyznačující se t, í m , že antigenní přípravek se téměř výhradně skládá z uvedeného oleje a z uvedeného činidla podporujícího tvorbu micel.
43. 48. Kompozice podle nároku 6 vyznačující se tím, že antigen papilomaviru je vybrán ze skupiny tvořené antigeny HPV16 E6, HPV16 E7, HPV18 E6, HPV18 E7, HPV6 E4, HPV6 LI, HPV11 E4 a HPV11 LI.

    -5949 .

    50.

    51.

    52.

    53 .

    54 .

    55 .

    56.

    Způsob léčby cervikálního nádoru vyznačuj í c í se tím, že zahrnuje podání účinného množství antigeního přípravku z lidského papilomaviru podle nároku 48.

    Způsob léčby Špičatého vyznačující se tí účinného množství antigeního papilomaviru podle nároku 48.

    kondylomu m , že zahrnuje podání přípravku z lidského

    Způsob léčby rakoviny vyznačující se tím, že zahrnuje podání kompozice podle nároku 6, přičemž antigenem je specifický antigen prostaty.

    Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že stabilizující detergent je vybrán ze skupiny polysorbát 80, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Zwittergent 3-12, Teepol HB7 a Span 85.

    Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že detergent je přítomen v množtsví od přibližně 0,05 do 0,5 %.

    Kompozice podle nároku 53 vyznačuj ící se t í m , že množství detergentu je přibližně 0,2

    Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje činidlo podporující tvorbu micel jehož rovnováha na rozhraní hydrofilní-lipofilní látka se pohybuje v rozmezí 0 až 2.

    Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že činidlo podporující tvorbu micel je vybráno z těchto činidel: poloxamer, Pluronic L62LF, Pluronic

    -60L101, Pluronic L64, PEG1000, Tetronic 1501, Tetronic 150R1, Tetronic 701, Tetronic 901, Tetronic 1301 a Tetronic 130R1.

    Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že činidlo podporující tvorbu micel je přítomno v množtsví od 0,5 do 10 %.

    58. Kompozice podle nároku 57 vyznačující se tím, že činidlo podporující tvorbu micel je přítomno v množtsví od 1,25 do 5 %.

    59. Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že teplota tání oleje je nižší než 60°C.

    60. Kompozice podle nároku 59 vyznačující se tím, že olej je vybrán ze skupiny tvořené skvalenem, skvalanem, eikosanem, tetratetrakontanem, přistáném, glycerolem a rostlinnými oleji.

    61. Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že množství oleje je v rozsahu 1 až 10 %.

    62. Kompozice podle nároku 61 vyznačující se tím, že množství oleje je v rozsahu 2,5 až 5

    63. Kompozice podle nároku 1 vyznačující se t i m , že obsahuje méně než 20 μg muramyl dipeptidu.

    64. Kompozice podle nároku 63 vyznačující se tím, že neobsahuje muramyl dipeptid.

    65. Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že detergent je polysorbát 80 a činidlo podporující tvorbu micel je poloxamer 4 01. ...

    66. Kompozice podle nároku 65 vyznačující se tím, že olej je skvalan.

    67. Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že detergent je vybrán z deteregentů Tween 20, Tween 40 a Tweeen 80, olej je vybrán ze skupiny tvořené skvalanem, eikosanem a přistáném a činidlo podporující tvorbu micel je vybráno ze skupiny tvořené Pluronicem

    L62LF a poloxamerem 401.

    68. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že detergent je vybrán z detergentů: polysorbát 80, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Zwittergent 3-12, Teepol HB7 a Span 85.

    69. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že detergent přítomen v množtsví od přibližně 0,05 do 0,5 %.

    Způsob podle nároku 69 vyznačující tím, že množství detergentů je přibližně 0,2

    71. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že obsahuje činidlo podporující tvorbu micel, jehož rovnováha na rozhraní hydrofilní-lipofilní látka se pohybuje v rozmezí 0 až 2.

    72. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že činidlo podporující tvorbu micel je vybráno z těchto činidel: poloxamer, Pluronic L62LF, Pluronic

    -62L101, Pluronic L64, PEG1000, Tetronic 1501, Tetronic 150R1, Tetronic 701, Tetronic 901, Tetronic 1301 a Tetronic 130R1.

    73. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že množtsví činidla podporujícího tvorbu micel je od 0,5 do 10 %.

    74. Způsob podle nároku 71 vyznačující se tím, že množtsví činidla podporujícího tvorbu micel je od 1,25 do 5 %.

    75. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že teplota tání oleje·je nižší než 60°C.

    76. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že olej je vybrán ze skupiny tvořené: skvalenem, eikosanem, tetratetrakontanem, přistáném, glycerolem a rostlinnými oleji.

    77. Způsob podle nároku 7 vyznačující se' tím, že množství oleje je v rozsahu 1 až 10 %.

    78, Způsob podle nároku 77 vyznačující se tím, že množství oleje-je v rozsahu 2,5 až 5 %.

    79. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že příměs obsahuje méně než 20 /xg muramyl dipeptidu.

    80. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že příměs neobsahuje muramyl dipeptid.

    81. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, ze detergent je polysorbát 80 a činidlo podporující tvorbu micel je poloxamer 401.

    82. Způsob podle nároku 81 vyznačující se tím, že olej je skvalan.

    83. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že detergent je vybrán z deteregentú Tween 20, Tween 40 a Tweeen 80, olej je vybrán ze skupiny tvořené skvalanem, eikosanem, olivovým olejem a přistáném a činidlo podporující tvorbu micel je vybráno ze skupiny tvořené Pluronicem L62LF a poloxamerem 401.

    84. Způsob podle nároku 7 vyznačující se t i m , že částice v příměsi mají velikost od 250 do 300 nm.

    85. Kompozice podle nároku 1 vyznačující se tím, že částice v kompozici mají velikost od 250 do 300 nm.