CZ182399A3 - Enzymatický způsob přípravy 7ß-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny pomocí modifikované oxidázy D-aminokyselin z Trigonopsis variabilis produkované v Escherichia coli - Google Patents

Description

Enzymatický způsob přípravy 7β-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny pomocí modifikované oxidázy Daminokyselin z Trigonopsis variabilis produkované v

Escherichia coli

Oblast vynálezu

Vynález popisuje enzymatický způsob přípravy 7β-(4karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny. Podrobněji řečeno vynález popisuje způsob izolace genu kódujícího enzym s oxidázovou aktivitou na D-aminokyseliny pomocí technik rekombinantní DNA, klonování uvedeného genu do mikroorganismu rodu Escherichia, modifikaci uvedeného enzymu pomocí způsobů proteinového inženýrství, hyperprodukci tohoto upraveného enzymu kultivací uvedených mikroorganismů a extrakci upraveného enzymu pro přípravu 7β-(4-karboxybutanamiido) cefalosporanové kyseliny. Tato kyselina je meziproduktem pro přípravu 7-aminocefalosporanové kyseliny, která slouží dále jako meziprodukt pro přípravu široké škály antibakteriláních látek z rodiny cefalosporinů.

Dosavadní stav techniky .

7β-(4-karboxybutanamido)cefalosporanová kyselina je rovněž nazývána kyselina glutaryl-7-aminocefalosporanová a z tohoto důvodu je v dalším textu zkracována jako GL-7ACA. Pro produkci 7β-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny z cefalosporinů C se používá oxidáza D-aminokyselin (dále zkracovaná jako DAOj z různých mikroorganismů jako například z Trigonopsis variabilis (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1993) 31; strana 709), Rhodotorula gracilis (J. Biol. Chem. (1994) 269; strana 17809) a Fusarium solani (J. Biochem. (1990) 108: strana 1063). Produkce DAO pomocí těchto mikroorganismů má mnohé nevýhody. Zaprvé úroveň vykazované DAO aktivity je velmi nízká, a zadruhé tyto •9 99··

-29099 · • 9 • 900 «

► 91

999

00 » 9 9 9 » 0 0 9

009 009 organismy vykazují spolu s uvedeným enzymem další nežádoucí enzymatické aktivity jako například esterázovou a katalázovou. První jmenované nežádoucí enzymatická aktivita rozkládá kyselinu GL-7ACA, čímž dochází ke snížení výnosu a tím i zvýšení nákladů na purifikaci produktu. Druhá jmenovaná enzymatická aktivita odbourává peroxid vodíku, který je nutný pro katalýzu. Je tudíž nezbytné do fermentační nádoby přidávat peroxid vodíku, čímž dochází k dalšímu zdražování produkce a současně to způsobuje ztráty v aktivitě enzymu, což znemožňuje jeho opakovaného použití.

Uvedenému enzymatickému znečištění se lze vyhnout se pouze purifikaci DAO aktivity, což však výrazně zvyšuje náklady a ztěžuje- enzymatický způsob získávání GL-7ACA z cefalosporinu C.

V poslední době byl popsán způsob izolace genu kódujícího DAO v T. variabilis a jeho exprese v E. coli a v T. variabilis (viz japonská patentová přihláška č. 71180/1988; Evropská patentová přihláška č.93202219.7, Kromě toho byl rovněž klonován a coli a A-Chremonium chrysogenum gen solani (viz japonská patentová publikace č. 0583817A2) exprimován v buňkách E. kódující DAO aktivitu z F.

přihláška č. 2000181/1990; 1063, Bio/Technology (1991)

J. Biochem. (1990) 108: strana

9: strana 188) a teprve nedávno

R.

byl klonován a exprimován E. coli gen kódující DAO z gracilis (viz španělský patent P9600906).

Se zřetelem k velkému průmyslovému významu, který má dostupnost přečištěné DAO aktivity pro produkci GL-7ACA, je cílem vynálezu produkce enzymu s DAO aktivitou, který by byl navíc snadno purifikovatelný. ' V této souvislosti je známo, že jeden z nejúčinnějších způsobů purifikace proteinů je afinitní . chromatografie (Sassenfeld, Η. M, (1990), Trends Biotechnol. 8: strana 88). Pro afinitní chromatografií je nutno najít vhodné chromatografické médium, které umožňuje • · 4 4 4 4 4 4 4 44 44 ···· 444 4444 • 4 4 4 4 4 4 4 44 4 • 444 4 44 444 444

4 4 4 4 4 4

4444 444 44 444 44 44 selektivní vazbu a/nebo eluci požadovaného proteinu. Uvedené médium musí obsahovat nějakou rozpoznávací molekulu nebo ligand ligand pro uvedený protein tak, aby interakce mezi proteinem a jeho ligandem byla dostatečně specifická a silná, aby umožnila selektivní eluci proteinu. Vývoj média pro afinitní chrornatografii není jednoduchý a proto nebyl dodnes popsán žádný způsob ' afinitní purifikace DAO enzymatické aktivity v jednom kroku.

Dále je známo, že některé postupy genového inženýrství dovolují modifikovat proteiny tak, že dojde ke zlepšení určitých vlastností, které pak usnadní purifikaci proteinu. Například byly vyvinuty různé systémy modifikace' struktury proteinu umožňující jeho afinitní purifikaci (viz Sii, D. a Sadana, (1991) J. Biotechnol. 19: strana 83; Narayanan, S.

J. (1990) Trends Biotechnol. 8: strana 12; (1991) Curr. Opinion Biotechnol. 2: strana Η. M. (1990) Trends Biotechnol. É

R. a Crane, L. Scouten, W. H. 37; Sassenfeld, strana

88). V podstatě tyto modifikace spočívají ve fúzi proteinu s polypeptidem, který specifickou interakcí s určitým chromatografickým médiem usnadňuje afinitní purifikaci tohoto fúzního proteinu. Jednou z těchto modifikací je například fúze požadovaného proteinu s polyhist.idinovou .sekvencí. Tuoto modifikací získává fúzní protein schopnost purifikace pomocí afinitní chromatografie na médiu, které obsahuje ionty dvojmocného kovu (Arnols,

Bio/Technology 9: strana 151; Bio/Technology 6: strana 1321).

Hochuli

F. H.

další,

:.1991(

1988' proteinu v principu se zlepšenými j ednoduché a

Ačkoli získání fúzního purifiakčními vlastnostmi je efektivní, hlavní nevýhoda této techniky spočívá ve skutečnosti, že modifikace primární struktury proteinu znamená změny, které mohou výrazným způsobem ovlivnit i jeho sekundární, terciální a kvartérní strukturu. Takové změny struktury mohou ovlivnit protein takovou měrou, že částečně «« ···· ··

-4nebo úplně ztratí funkčnost. Výsledkem je pak protein, který je nepoužitelný pro funkci, pro kterou byl navržen. Proto je získávání fuzních proteinů vždy spojeno se značnou měrou nejistoty, protože vlastnosti konečného produktu jsou velmi nepředvídatelné. Tato nejistota je o to větší, jde-li o první fúzní experiment, tj. v případě kdy není známý výsledek předchozí fúze. Právě v této .nejistotě konečného výsledku při získávání fúzního proteinu spočívá novost vynálezu, protože v současnosti nelze předpovídat s určitostí co bude výsledkem experimentu, při němž dojde k fúznímu spojení proteinů.

I.

Ve vědecké literatuře není popsán žádný způsob přípravy enzymu DAO z T. variabilis geneticky upraveného takovým způsobem, který by umožňoval jeho. purifikaci v jediném kroku, a rovněž umožňoval jeho hyperprodukci v aktivní formě buď v E. coli nebo v libovolném jiném mikroorganismu..

Podstata vynálezu

Výchozím bodem vynálezu je kvasinka T. variabilis ATCC 20931 jakožto zdroj deoxyribonukleové kyseliny (dále označované zkratkou DNA)· Z této' kvasinky byla získána genomová DNA, obsahující gen nesoucí -genetickou informaci související se syntézou DAO (v dalším textu označovaný též jako dáo-gen). Zmiňovaná DNA byla použita k vytvoření DNA knihovny v E. Analýza DNA hybridizačnimi coli za použití fágového vektoru k-GEM12. knihovny byla provedena standardními technikami. Jako sondy byly použity syntetické oligonukleotidy, navržené na základě oblastí podobnosti zjištěných mezi různými DAO. Tímto způsobem byly získány sady rekombinantních klonů E. coli, jež obsahovaly fragment DNA původem z T. variabilis, kódující dao-gen.

• ·

-5• ······ AA ·· • AAA A A · · • A A A A A · · A · • · · · * A A * A AAA

AAAA A A ·· AA AAA AA AA

Takto získaný fragment DNA byl nakloňován do plazmidového vektoru získaného· z kmene E. coli. Rekombinantní vektor byl použit pro získání sekvence fragmentu DNA obsahujícího daogen kvasinky T. variabilis (viz Sekvence id.č.: 1). Analýza zmiňované sekvence umožnila charakterizaci dao-genu, jenž sestává ze dvou exonů a jednoho intronu.

Jelikož součástí takto získaného fragmentu DNA, obsahujícího genomovou sekvenci dao-genu původem z T. variabilis, byl i jeden intron, nemohl být tento fragment DNA přímo použit pro expresi v E. coli. Byly proto podniknuty ^x kroky ke získání dao-genu neobsahujícího zmiňovaný intron. Za tím účelem byl dao-gen amplifikován pomocí PCR za užití dvou syntetických oligonukleotidů. První z nich byl navržen takovým způsobem, aby obsahoval následující prvky: vazebné místo pro ribozóm, iniciační mísLo translace, úplnou sekvenci prvního exonu a počáteční nukleotidy 5'-konce druhého exonu. Druhý oligonukleotid zahrnoval komplementární sekvenci 3'-konce odpovídající druhému exonu dao-genu včetně terminačního kodónu translace. Tyto syntetické oligonukleotidy obsahovaly též různá restrikční místa vhodná ke klonování fragmentů DNA. Tímto způsobem byl získám nový fragment DNA, který byl po izolaci nakloňován do plazmidového vektoru E. coli (viz obrázek 1) . S využitím vytvořených restrikčních míst byl fragment DNA, obsahující úplný dao-gen bez zmiňovaného intronu, dále klonován do různých plazmidových vektorů E. coli. Tyto plazmidové vektory obsahovaly promotory, umožňující' velmi silnou genovou expresi v hostitelské bakterii (hyperprodukci). Aktivita DAO produkované různými klony byla stanovena kolorimetrickými metodami a HPLC chromatografii.

• to • to to • ••to • toto ««toto ·· toto <· · · » · · · · • · · · · · ···· to · · · *· ··· ··· • · · to toto • toto ·· ·« to toto toto

Tak byly získány řekombinantní klony E. coli, produkující velké množství aktivního enzymu DAO.

Poté byl dao-gen modifikován připojením nukleotidové sekvence kódující polyhistidin. Za tím účelem byl plazmid obsahující dao-gen vystaven působení restrikčního enzymu, jenž štěpil v místě iniciačního kodónu translace, a štěpením vzniklé konce DNA byly zarovnány Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I z E. coli. Zarovnané konce byly poté spojeny za přítomnosti syntetického linkeru obsahujícího kodóny polyhistidinu. Tak byl vytvořen plazmid nesoucí modifikovaný dao-gen na 5'-konci své kódující oblasti (Sekvence id.č: 2). Takto vytvořený řekombinantní plazmid byl přenesen do kmene E. coli a selektován hybridizačními metodami za použití oligonukleotidů polyhistidinového linkeru jako sond. Vznik požadovaného fúzního genu byl ověřen sekvenováním modifikovaného dao-genu.

Produkce DAO modifikované polyhistidinovým řetězcem (v dalším textu označované jako hisDAO) byla poté zkoumána s využitím různých kmenů E. coli jakožto hostitelských buněk rekombinantních plazmidů. Tímto způsobem bylo ověřeno, že modifikovaný enzym hisDAO je aktivní.

Předem vyselektované řekombinantní klony E’. coli využité k produkci hisDAO se kultivují na médiu, obsahujícím zdroj uhlíku, zdroj dusíku a anorganické soli. Inkubační teplota by se měla pohybovat od 18°C do 37°C a pH musí být udržováno v rozmezí 5 až 9. Pro kultivaci v malém měřítku lze použít baňky různých objemů -. od 50 až do 1000 ml, přičemž množství kultivačního média by mělo činit 10% až 50% objemu baňky.. Doba kultivace může sahat od 12 do 90 hodin.

·· · «· ···· ·· ·· ·»·· ··· ««·· • · · · ··· 4 · « · * · · · · · · ··· ··· • · · · · · · ···· ««· ·· ··· ·· ·· . Výsledky produkce DAO prostřednictvím rekombinantních mikroorganismů mohou být ještě zlepšeny volbou kultivačních podmínek vhodných pro zachování stability rekombinantních vektorů. Toho je dosaženo přídavkem antibiotik, pro něž rekombinantni vektor s dao-genem obsahuje markér rezistence, jako např. ampicilin, chloramfenikol, kanamycin, tetracyklin apod. Kromě stabilizace produkce se tak předejde i možnému zamoření kultivačního média jinými nežádoucími mikroorganismy a navíc se tím eliminují ty kmeny, jež přestaly produkovat DAO v důsledku ztráty rekombinantního vektoru.

Rekombinantni . buňky produkující hisDAO byly od kultivačního média odděleny centrifugací a poté byly rozrušeny či permeabilizovány působením chemických, enzymatických či mechanických procesů. Pro získání enzymového extraktu o vyšší čistotě byla hisDAO přečištěna v jednom kroku za použití áfinitní chromatografie na koloně Co²⁺-IDA. Za tímto účelem byl hrubý enzymový extrakt nanesen na kolonu naplněnou Co²⁺-IDA pryskyřicí a znečišťující proteiny byly vymyty 20 mM fosfátovým pufrem o pH 7,0 obsahujícím 0,2 M NaCl. Enzym hisDAO byl pak eluován 10 mM roztokem imidazolu.

V případě, že se jako chromatografický sorbent použije Cu²⁺-IDA nebo Zn²⁺-IDA namísto Co^⁺-IDA, enzym hisDAO zůstane pevně navázán na nosič v aktivní formě a není možné jej eluovat ani vysokými koncentracemi imidazolu. Tak lze vhodným výběrem sorbentu po vymytí znečišťujících proteinů vytvořit imobilizovaný enzymový systém.

Za použití enzymu hisDAO získaného a přečištěného z rekombinantních klonů E. coli, jež exprimovaly příslušný chimérický gen, byla z cefalosporinu C získána GL-7ACA.

• ·

Dialvzované a koncentrované enzymové extrakty získané chromatografii na Co“⁺-IDA nosiči mohou být imobilizovány rovněž tak, že se nechají zreagovat s·jinými vhodnými inertními sorbenty, přičemž imobilizovanou hisDAO je možno používat opakovaně.

Novost vynálezu spočívá ve skutečnosti, že byl poprvé ukázán způsob exprese enzymu DAO z kvasinky T. variabilis modifikovaného hisDAO v prokaryotických orgamismech (jako je například E. coli) v aktivní formě a dále' způsob jeho izolace v jediném kroku pomocí afinitní chromatografie. Nadto bylo dosaženo přírůstku v produkci DAO. vzhledem ke množství získanému u T. variabilis, což usnadní použití tohoto enzymu v průmyslovém měřítku. Možnost produkce hisDAO v různých kmenech E. coli, jež nevytvářejí nežádoucí enzymy, jako například katalázu nebo různé esterázy, a též možnost zvyšování její stability a zlepšení katalytických vlastností, docílené dalšími modifikacemi za použití technik proteinového inženýrství, jsou dalšími aspekty umocňujícími novost tohoto vynálezu.

Vynález bude dále 'podrobně ilustrován na příkladech uvedených v dalším textu.

Příklad 1: Stanovení aktivity DAO

Stanovení aktivity DAO bylo provedeno postupem popsaným v literatuře (J. Biol. Chem. (1967) 242: strana 3957). Jako substrát byl použit 25 mM D-fenylglycin. Směs , byla inkubována v 50 mM fosfátovém pufru o pH 8,0 po dobu 15 až 30 minut, poté byla reakce zastavena přídavkem 1/10 objemu čisté kyseliny octové. Aktivita enzymu je dána změnou • · 0 0 0 0 • 0

0 0 0

0 0

-9absorbance při 252 nm. Benzoylmravenčí kyselina, jež při reakci vzniká, přitom vykazuje při vlnové délce 252 nm a množství 89,77 nmol absorbanci 1,0.

2. Příprava DNA vektorů a kompetetních buněk E. coli pro transformaci

Plazmidové vektory pBluescript I KS (+)' (Ap^r) (Stratagene) and pKK233.2 (Ap^r) (Pharmacia) byly připraveny alkalickou lýzou (viz Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Kmeny E. coli nesoucí zmiňované plazmidy inkubovány po dobu 16 hodin v 500 ml LB média s přídavkem ampicilinu (100 pg/ml) při 37°C za současného protřepávání na orbitální třepačce při 250 otáčkách/min. Tato plazmidová DNA byla přečištěna centrifugací na CsCl gradientu.

Kompetentní buňky E. coli TG1 a E. coli DH5a byly získány postupem využívajícím RbCl (viz Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA).

3. Příprava donorové DNA nesoucí genetickou informaci vztahující se, k biosyntéze DAO

Kmen T. variabilis (ATCC 20931) byl kultivován na médiu YPMG (0,3 % sladového výtažku, 0,3 % kvasničného výtažku, 0,5 % peptonu a 1 % glukózy) . Směs byla inkubována po dobu 3 6 hodin (OD₆₆o = 5,0) při teplotě 30°C na orbitální třepačce při 250 min^-1.

4·· ···

-10Buňky byly poté ponechány sedimentovat, promyty a rozrušeny, zymolyázou. Deoxyribonukleová kyselina byla extrahována způsobem popsaným v literatuře (Sherman a kol. (1986): Laboratory Course for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) . Za účelem dosažení vyšší čistoty byla DNA vystavena působení RNA-ázy, několikrát extrahována fenolem a směsí chloroformu s isoamylalkoholem (CIA) v poměru 24:1 a poté vysrážena isopropanolem. Vysr^žená DNA byla promyta nejprve 100% ethanolem, poté 70% ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 10 mM Tris-HCl pufru o pH = 7,5, obsahujícím 1 mM EDTA (dále pufr TE).

Příklad 2:

1. Vytvoření DNA knihovny kvasinky T. variabilis

Celková DNA T. variabilis kmene ATCC 20931 byla získána postupem popsaným ve třetí části příkladu 1. 300 pg ž celkové DNA bylo částečně rozštěpeno 20 jednotkami restrikčního enzymu .Sau3AI v reakčním objemu 600 μΐ při teplotě 37°C. Ze směsí byly odebrány tři vzorky po 200 μΐ, a to 45 s, 1 minutu a 2 minuty od zahájení reakce. Štěpení bylo zastaveno přidáním vychlazené 20mM EDTA. Výsledek štěpení byl ověřen elektroforézou na 0,7% agarózovém gelu. Vzorky byly poté spojeny a po dobu 10 minut zahřívány při teplotě 68°C. Směs byla ponechána zvolna vychladnout na pokojovou teplotu a následně navrstvena na 38 ml sacharózového gradientu o koncentraci 10 až 40 %. Gradient byl centrifugován při 26000 min'¹ po dobu 24 hodin při teplotě 15°C. Směs byla poté rozdělena na vzorky o objemu 0,5 ml a 10 μΐ z každého vzorku bylo analyzováno na 0,4% • · · · • · • · · · · · • · ·· ··

-11agarózovém gelu. Vzorky, v nichž velikost fragmentů DNA dosahovala velikosti 18 až 22 kb, byly spojeny a zředěny destilovanou vodou tak, aby výsledná koncentrace sacharózy byla asi 10%. Poté, byla DNA vysrážena ethanolem a suspendována v 50 μΐ TE pufru, přičemž 3 μΐ roztoku byly analyzovány na 0,4% agarózovém gelu. Tim bylo ověřeno, že fragmenty- DNA dosahují požadované velikosti a že jejich koncentrace činí přibližně 50 ng/μΐ.'

Souběžně byla způsobem podle Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, s mírnýni úpravami připravena DNA bakteriofága. λ-ΘΕΜ12 (Promega). Za tím účelem byly pěstovány bakterie E. coli kmene NM538 po dobu 10 hodin na médiu NZCYM s přídavkem 0,2 % maltózy. Byla měřena optická denzita suspenze při 600 nm. Objem kultury odpovídající 3 χ 10⁹ buněk byl 10 minut centrifugován rychlostí 4000 min^-1 při 4°C na stolní centrifuze a následně byly buňky suspendovány v 1,2 ml SM - pufru. K těmto buňkám bylo přidáno 3 χ 10' PFU (plak formujících jednotek) fága λ-ΘΕΜ12 a směs byla bez protřepávání inkubována při 37°C po dobu 30 min. Do připravených 500 ml baněk obsahujících 100 ml NZCYM-0,2% maltózového média a temperovaných na 37°C bylo naočkováno po 200 μΐ suspenze infikovaných buněk. Baňky byly inkubovány při 37°C, dokud nedošlo k lýze kultivovaných buněk (po 5 až 6 hodinách). K lyzátu byla přidána DNA-áza (1 pg/ml) a RNA-áza (2 pg/ml) a enzymy byly ponechány působit 45 minut při pokojové teplotě. Poté bylo k.lyzátu přidáno 5,8 g NaCl na každých 100 ml objemu a směs byla ponechána 60 min. v ledové lázni. Po uplynutí uvedené doby byl lyzá,t filtrací zbaven buněčných zbytků a po přídavku 20 ml 50% PEG-6000 na 100 ml lyzátu byla směs chlazena 60 min v ledové • ·

-12lázni a následně odstřeďována po dobu 20 min při 10000 x g a 4°C. Precipitát byl poté suspendován v 1 ml TE - pufru a dvakrát extrahován CIA za účelem odstranění zbytků PEG-6O00, aniž by se přitom, porušil vlastní ,fág. Následovala dvojnásobná extrakce neutrálním fenolem, jednou směsí fenol - CIA a jednou samotným CIA. K vodné fázi bylo přidáno tolik 4M roztoku NaCl, až jeho koncentrace dosáhla -0,5 M, a DNA byla vysrážena dvojnásobným objemem ethanoiu při teplotě -20°C. Po 20 min odstřelování v minicentrifuze při 12000 min“¹ a teplotě 4°C byla precipitovaná DNA promyta 70% ethanolem, vysušena a suspendována v 50 μΐ TE - pufru.

Padesát pg bakteriofágové DNA bylo po dobu 2 hodin štěpeno endonukleázami BamHI a Xbal při teplotě ' 37°C. Rozštěpená DNA byla extrahována směsí fenol - CIA a samotným CIA, vysrážena ethanolem a suspendována v 50 μΐ TE - pufru. Po odebrání 2 μΐ vzorku byl ke zbylé směsi přidáván MgCl₂ až do dosažení 10 mM koncentrace a směs byla inkubována hodinu při 42°C, aby bylo podpořeno spojování kohezních konců vektoru do cyklické struktury. Znovu byly odebrány μΐ směsi, jež byly společně s dříve odebraným vzorkem analyzovány na 0,5% agarózovém gelu. Poté co byla ověřena recirkularizace vektoru spojením kohezních konců, byla směs navrstvena na 38 ml 10-ti až 40% sacharózového gradientu, v tomto- případě nebyla DNA před navrstvením na gradient zahřívána na 68°C, neboť by to vedlo k separaci kohezních konců. Gradient byl centrifugován při 26000 min“¹ a 15°C. po dobu 24 hodin a následně byl beze zbytku rozdělen na frakce po 0,5 ml, přičemž z každé bylo 15 μΐ analyzováno na 0,5% agarózovém gelu. Ty frakce, jež neobsahovaly postradatelný centrální fragment (neboli vycpávku), byly spojeny a zředěny destilovanou vodou tak, aby koncentrace sacharózy • Β ·· ·· ♦ · · « • ·

Β

-13činila zhruba 10 %. Poté byla DNA vysrážena ethanolem a suspendována v 50 μΐ TE - pufru, přičemž 2 μΐ vzniklého roztoku byly použity pro elektroforézu na 0,5% agarózovém gelu, aby se ověřila nepřítomnost centrálního fragmentu a aby bylo možno' odhadnout přibližnou koncentraci DNA, jež činila asi 100 ng/μΐ.

Dále byla provedena série ligací za použití 0,25 pg inzertu a množství vektoru v rozmezí od 0,25 do 0,75 pg, tj. při proměnlivém poměru inzert/vektor. Reakční směsi byly inkubovány při teplotě 12 až 14°C po dobu 16 hodin. Poté, co bylo na 0,4% agarózovém gelu ověřeno, že ligační reakcí vznikly fragmenty DNA o větších rozměrech než byla velikost vektoru či inzertu, byly všechny reakční směsi spojeny, vysráženy ethanolem a suspendovány ve 4 μΐ ligačního pufru.

Pakážování rekombinantní fágové DNA, vzniklé předchozí ligační reakcí, bylo provedeno za pomoci in vitro sady pakážovacích extraktů Packagene (Promega). Produkt pakážovací reakce, suspendovaný v 500 μΐ SM - pufru, byl použit k infikování E. coii kmene NM538. Tato infekce posloužila k titraci množství vzniklých fágů. Dále byly infikovány buňky E. coii kmene NM539 (Promega) s cílem určit procentní zastoupení rekombinantních fágů. Bakterie E. coii kmene NM539 jsou lysogenní vzhledem .k fágu P2 a produkují lytické plaky pouze . pokud fág, jenž je napadl, nenese postradatelný centrální fragment. Vytvořená DNA - knihovna obsahovala asi 200 000 PFU a okolo 85% fágů neslo exogenní fragment DNA.

Po provedení těchto výpočtů byly infikovány E. coii NM539 a vzniklá úplná genetická knihovna byla kultivována na Petriho miskách o průměru 150 mm.

«* • · 0 · • 0 ·

-142. Identifikace klonů obsahujících dao-gen

Úplná DNA knihovna byla přenesena na nitrocelulózové filtry a proces výběru pozitivních fágů byl proveden v literatuře popsaným, hybridi začním postupem (Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Proces začal prehybridizací nitrocelulózových filtrů'. Ty byly· inkubovány po 3 hodiny při 42°C v hybridizačnim pufru. Hybridizace byla provedena po odstranění pufru použitého při' prehybridizaci, a to přidáním nového hybridizačního pufru spolu s 10 pmol oligonukleotidů OA (5'-TCTTGTCCTCGACACC-3') a OB (5'GACGTGGATTGTCAACTG-3'). Oligonukleotidy byly předtím standardním postupem (Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) označeny na 5'- koncích izotopem ³²P za použití T4 polynukleotid-kinázy a [γ-³²Ρ]ΑΤΡ (ICN Biochemicals) . Filtry byly inkubovány 16 h při' 42°C, dvakrát promývány po dobu 20 minut při pokojové teplotě 2 X SSC-0,1% SDS pufrem a následně dvakrát 0,1 X SSC-0,1% SDS pufrem po dobu dalších 20 minut při hybridizační teplotě. Nakonec byly nitrocelulózové filtry exponovány s rentgenovým filmem Hyperfilm-MP (Amersham) mezi reflexními deskami. Expozice trvala 48 hodin a probíhala při -70°C.

Poté, co byl dokončen proces prehybridizace, hybridizace, promývání. a autoradiografie, bylo vybráno ' 63 klonů dávajících pozitivní signál s oligonukleotidovými sondami OA a OB. Pasteurovou pipetou bylo jednotlivě odebráno pouze devět pozitivních lytických plaků a každý z nich byl suspendován v 1 ml SM - pufru s přídavkem 50 μΐ chloroformu. Fágy přítomné v roztoku byly ztitrovány. Za tím účelem bylo třeba zmiňovaný roztok 5000-krát zředit, tak aby .

9 9 • 9 9

9 9' • · · ·« 99··

9 9 9 9·

-1520 μΐ tohoto roztoku po infekci dalo vniknout 500 až 1000 lytických plaků na jednu Petriho misku. Poté, co byl obsah každé Petriho misky přenesen na odpovídající nitrocelulózový filtr, bylo znovu přikročeno k hybridizaci s týmiž sondami OA a OB. Autoradiografii bylo zjištěno, že 20 až 50% fágů z každé Petriho misky dává pozitivní hybridizační signál. Proto bylo nutné přečistit každý z pozitivních.fágů v třetím hybridizačním cyklu. Za tím účelem byly Pasteurovou pipetou odebrány ty lytické plaky, jež byly znatelně izolovány od sousedních nebo byly obklopeny jinými rovněž pozitivními lytickými plaky. Následně byly suspendovány v 1 ml SM pufru s přídavkem 50 μΐ chloroformu. Po zředění takto připraveného fágového roztoku na stonásobný objem byly 15 μΐ alikvoty použity pro infekci bakteriální kultury. Titry fágového roztoku odpovídaly cca 300 lytickým plakům na Petriho misku. Zpracováním lytických plaků stejným postupem jako v předchozích dvou cyklech bylo dosaženo toho, že 100% fágů na každé Petriho misce bylo pozitivních. Takto bylo přečištěno 9 samostatných lytických plaků. Každý z nich byl suspendován ve 100 μΐ SM -' pufru s přídavkem 10 μΐ chloroformu. Ze 2 μΐ tohoto roztoku byly získány souvislé lytické plaky s cílem namnožit zmiňované pozitivní fágy na pevném nosiči. Povrchová vrstva agarózy byla odebrána a jejím suspendováním v 5 ' ml SM - pufru byly pro každý z pozitivních fágů získán roztok o-přibližné koncentraci. 10^? PFU/μΙ.

Výše zmiňované oligonukleotidy OA a OB byly využity v Southernově blotu (Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York', USA) též jako sondy k určení fragmentů genomové DNA nesoucích dao-gen T. variabilis. Za

4

4 • 44

-16-.

4444 • 4

444 • 4 4

4

444 tím účelem byla za dále popsaných podmínek provedena hybridizace s D.NA rozštěpenou restrikčními endonukleázami (Pharmacia) BamHI, EcoRI, HindlII, Knpl, Pstl,· PvuII, Xbal a Xhol a rozdělenou na agarózovém gelu. Gel, použitý k rozdělení fragmentů DNA na základě rozdílné velikosti molekul, byl následně inkubován 15 min v 0,25 M HCI za mírného protřepávání a při pokojové teplotě, dále 1 hodinu v denaturujícím a 1 hodinu v neutralizujícím roztoku. Gel byl poté položen na sloupec filtračních papírů Whatman 3 MM navlhčených 10 x SSC pufrem. Na něj byl přiložen nitrocelulózový filtr BA85 (.0, 45 pm, Schleicher & Schuell) týchž rozměrů, navlhčený 2 x SSC,. přičemž bylo třeba se vyvarovat tvorby bublin. Nitrocelulózový filtr byl dále překryt dvěma listy papíru Whatman 3 MM navlčenýmí 2 x SSC pufrem a vrstvou suchých filtračních papírů stejného rozměru, přičemž tloušťka této vrstvy činila 8 až 10 cm. Takto vytvořený balík byl nahoře zatížen závažím o hmotnosti zhruba 500 g. Přenos byl ponechán probíhat 16 hodin. Jakmile byla DNA přenesena, nitrocelulózový filtr byl opatrně ponořen na 5 minut do 6 x SSC, poté 1 hodinu vysoušen při pokojové teplotě. Poté byl filtr zapékán ve vakuu mezi dvěma listy papíru Whatman 3 MM při teplotě 80°C po dobu 3 hodin tak, aby DNA pevně přilnula k filtru. Poté byla provedena prehybridizace a hybridizace za podmínek popsaných při screeningu DNA knihovny. Výsledky autoradiografie poukázaly na výskyt specifických hybridizačních pásů pro každý ze štěpů. Velikost těchto pásů byla konkrétně následující: 10,2 kb pro EcoRI štěp, 3,7 kb pro BamHI, 3,5 kb pro HindlII, 11,6 kb pro KpnI, 11,3 kb pro Pstl, 4,8 kb pro PvuII, 2,8 kb pro Xbal a 4,7 kb pro Xhol.

-17·· ···· ·« ·* ϊ · · » · · · • ♦ ··· · · · « • · · · ··· ··· • · » , .

·· »·· »· .«

3. Klonování fragmentu DNA kódujícího dao-gen

Po přečištění fágové DNA, v podstatě stejným způsobem, jako bylo popsáno v části 1 příkladu 2 pro bakteriofág' X-GEM12, bylo provedeno její štěpení endonukleázou Sáli, zjištěný proužek o velikosti 9 kb byl překlonován do plazmidů pBluescript I KS ( + ) (Stratagene) rozštěpeného Sáli. K tomu byly použity DNA ligáza fágu T4 (Amersham) , ATP a pufr doporučený dodavatelem enzymu. Výsledná ligační směs byla inkubována po dobu 5 hodin při 12°C a poté byla použita k transformaci vhodných buněk E. coli TG1 (Amersham). Transformanti byli selektováni na plotnách s LB médiem s přídavkem ampicilinu (100 pg/ml), X-gal (40 μς/ιαΐ) a 0,2mM IPTG. Z klonů s bílým selekčním fenotypem byl izolován plazmid pALTl. S použitím Southernova postupu a sondy.OB byl dao-gen lokalizován v 3,7 kb BamHI fragmentu obsaženém v plazmidů pALTl. Tento BamHI fragment byl překlonován do plazmidů pBluescript I KS (+) (Stratagene) rozštěpeného endonukleázou BamHI. Tak byly izolovány plazmidy pALT2 a pALT3, nesoucí 3,7 kb BamHI fragment v obou orientacích (obr. 1) .

4. Sekvenování fragmentu nesoucího dao-gen

Nukleotidová sekvence fragmentu neseného plazmidem pALT2 byla určena s použitím téhož plazmidů postupem popsaným v literatuře (Sanger a kol. (1977) Proč. Nati. Aca. Sci. USA 74, strana 5463 až 5464) s použitím sekvenační sady s T7 DNA polymerázou (Pharmacia) a [³⁵S]dATP. Určená sekvence je zobrazena v Sekv.id. č. : . 1. Analýzy této sekvence a její porovnání s ostatními známými sekvencemi z mezinárodních

444(

I · 4 » 4 4 4 4 » 4 « » 4 (

4 4 · 4 • 4

4»

-18*4 44 ► 4 4 4 * 4 4 4

444 444 databází (GeneBank/EMBL) ukázaly, že klonovaný fragment kóduje dao-gen T. variabilis.

Příklad 3:

1. - Eliminace intronu z dao-genu pomocí PCR

Vzorek DNA z plazmidů pALT2 o hmotnosti 0,15 pg byl smíchán s 10 μΐ (25 μΜ) každého z těchto oligonukleotidů: DAO1 (5'CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGGGCCGGTGTTGCCGGTTTAAC-3') , j enž kóduje úplnou sekvenci prvního exonu a první nukleotidy na 5'- konci druhého exonu a obsahuje jedno restrikční místo pro Ncol, a DAO2 (5'-CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAG-3'), obsahující restrikční místo pro HindlII a sekvenci 3'-konce, odpovídající druhému exonu dao-genu, včetně terminačního kodónu translace. K této směsi byly přidány 2,5 jednotky Taq-polymerázy (Perkin - Elmer) spolu s vhodným, dodavateli doporučeným, pufrem a preparát byl podroben amplifikačnímu procesu v PCR cykleru Gene-ATA.Q (Pharmacia) ve 30 cyklech. Každý cyklus se skládal z fáze při 95°C (1 min) , 50°C (2 min) a 72°C (2,5 min). Výsledek amplifikace byl po provedení elektroforézy na 1% agarózovém gelu zviditelněn barvením ethidiumbromidem.

DNA

Fragment o velikosti cca 9 kb získaný prostřednictvím PCR byl přečištěn extrakcí z agarózového gelu s použitím β-agarázy (Biolabs) v souladu s doporučeními výrobce. Množství 0,2 pg přečištěného fragmentu bylo spojeno s 1 μg vektoru M13tgl30 (Amersham), rozštěpeného enzymem HincII (Pharmacia). K ligací byla použita T4-DNA ligáza (Amersham), ATP a pufr doporučený výrobcem. Tímto způsobem byl vytvořen fág M13DA0 (obr. 1), jenž byl' poté sekvenován, • · • · ·

-19aby se ověřilo, zda byl intron skutečně odstraněn. Nukleotidová- sekvence fragmentu obsaženého ve fágu M13DA0 byla určena na tomtéž rekombinantním fágu postupem popsaným v literatuře (Sanger a kol. (1977) Proč. Nati. Aca. Sci. USA 74, strana 5463 až 5464) s využitím sekvenační sady s T7 DNA polymerázou (Pharmacia) a [³⁵S]dATP. Nukleotidová sekvence ukázala, že klonovaný fragment má velikost 0,9 kb a obsahuje sekverici dao-genu z T. variabilis bez zmiňovaného intronu.

2. Nakloňování dáo-genu bez intronu do plazmidů pKK233.2 Vzorek DNA o hmotnosti 0,1 pg z plazmidů pKK233.2 byl štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a HindlII (Pharmacia) při 37°C v pufru doporučovaném dodavateli po dobu 1 hodiny a poté byl zahříván na 65°C po dobu 10 min, aby se reakce ukončila. Rozštěpený plazmid byl smíšen s 0,2 pg fágu M13DA0 štěpeného týmiž, výše zmíněnými, restrikčními endonukleázami, a obě DNA byly spojeny prostřednictvím T4 DNA-ligázy (Amersham) za přítomnosti ATP a v pufru doporučeném výrobcem.

Výsledná ligační směs byla použita k transformaci kompetetních buněk E. coli kmene TG1. Transformantů byli izolováni na LB médiu s přídavkem ampicilinu (100 pg/ml). Tímto postupem byl získán klon obsahující rekombinantní plazmid pKDAO3 (obr. 1), jenž nesl fragment DNA o velikosti 0,9 kb vytvořený amplifikací s využitím PCR. Tento fragment se nacházel mezi restrikčními místy Ncol a HindlII plazmidů pKK233.2, tj. byl exprimován pod kontrolou trc promotoru.

·· ·· • · • · ··

-20• ·

4 44 ··

Příklad 4

1. Vytvoření chimérického DAO enzymu obsahujícího navíc histidinových zbytků

Za účelem připojení polyhistidinové sekvence na N-konec enzymu DAO z T. variabi.lis bylo 0,1 pg plazmidu pKDA03 štěpeno restrikční endonukleázou Ncol (Pharmacia) po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C a za podmínek doporučených dodavatelem. Reakce byla zastavena zahřátím směsi na 65°C a udržováním této teploty po dobu 10 minut. Takto rozštěpený plazmid byl zarovnán Klenowovým fragmentem DNA-polymerázy I z E. coli (Pharmacia) v souladu s doporučeními dodavatele a reakce byla opět ukončena zahříváním směsi při 65°C podobu 10 minut. Výsledný linearizovaný plazmid byl spojen s fragmentem DNA, obsahujícím nukleotidovou sekvenci kódující 6 histidinových zbytků. Reakce byla katalyzována T4 DNA ligázou (Amersham) za přítomnosti ATP a s použitím pufru doporučeného výrobcem. Fragment kódující 6 histidinových zbytků byl získán smíšením' 1,5 pg dvou komplementárních oligonukleotidů, nazvaných HIS1 (5'CATCATCACCACCATCACTT-3') a HIS2 (5'-AAGTGATGGTGGTGATGATG-3'), jež byly zahřívány při 100°C po dobu 5 minut a poté ochlazeny na pokojovou teplotu, čímž došlo k hybridizaci a zformování dvouvláknového fragmentu DNA.

Výsledná ligační směs byla použita k transformaci kompetetních buněk E. coli kmene TG1. Transformanti byli izolováni na LB médiu s přídavkem ampicilinu (100 pg/ml). Tímto postupem byl získán klon obsahující rekombinantni plazmid pKDAOHIS, jenž nesl dao-gen spojený na 5'-konci se sekvencí 18 nukleotidů kódujících 6 histidinových zbytků. Aby se ověřilo, zda plazmid pKDAOHIS (viz obrázek 1) obsahuje očekávanou chimérickou konstrukci, byla postupem

9

999 • 9 9 9

9 9 9

··

9 9

219

9999 9 popsaným v literatuře (Sanger a kol. (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, strana 5463 až 5464) zjištěna sekvence tohoto rekombinantního plazmidů. Přitom bylo využito sekvenační sady s T7 DNA polymerázou (Pharmacia) a [^:'3]dATP. Zjištěná sekvence je uvedena v Sekv. id.č.: 2.

Kmen E. coli TG1 transformovaný plazmidem pKDAOHIS byl 20 hodin kultivován na médiu LB při teplotě 25°C a při 250 min“¹. Buňky byly poté odděleny 10 minutovou centrifugaci při 5000 g a rozrušeny ultrazvukem. Aktivita DAO byla stanovena způsobem popsaným v části 1 příkladu 1. Pro takto získanou DAO byla naměřena aktivita 350 U/mg proteinu. Tím bylo potvrzeno, že získaný chimérický enzym DAO s histidinovým řetězcem (hisDAO) je aktivní. Dále bylo za použití SDS - elektroforézy na polyakrylamidovém gelu ověřeno, že v souladu s očekáváním jsou molekuly enzymu hisDAO poněkud větší než molekuly nativní DAO. Kmen E. coli TG1 transformovaný plazmidem pKDAOHIS byl dne 10. VI. 1997 uložen ve· Španělské sbírce typových kultur (CECT) na oddělení mikrobiologie fakulty biologických věd. University Valencia,. 46100 Burjasot (Valencia) pod katalogovým číslem CECT4888.

Příklad 5

I. - Příprava afinitního nosiče agaróza - kovový chelát Směs 5,7 ml epichlorhydrinu (3-chlor-l,2-propenoxidu) a

II, 4 ml ethylenglykoldimethyléteru byla zvolna přidána k suspenzi 7 g agarózy CL6B v 57 ml 0,1 M NaOH obsahujícího 340 mg NaBH₄ a při 25°C byla ponechána za stálého mírného • · · · • 9 9 9

999 999

• 9

99 promíchávání po dobu 4 hodin. Takto získaný agaróza-epoxid byl promyt dostatečným množstvím destilované vody a přidán k roztoku, připravenému smícháním 2,5 ml 2 M iminodiacetátu sodného, 19 ml 0,1 M NaHCO₃ pufru o pH 11. Tato suspenze byla za neustálého mírného míchání ponechána 12 hodin při 25°C. Nakonec byl nosič promyt destilovanou vodou a suspendován ve vodném roztoku soli požadovaného kovu (.5 mg/ml). Takto vytvořený nosič agaróza - kovový chelát byl promyt dostatečným množstvím vody .a připraven pro následné použití. Při použití C0CI2 jako soli kovu byl uvedeným způsobem získán nosič agaróza - kobaltový chelát.

2. Přečištění chimérického enzymu hisDAO na nosiči agaróza - kobaltový chelát

Kolona naplněná nosičem agaróza - kobaltový chelát byla ekvilibrována 20 mM fosfátovým pufrem (pH 7,0) a 0,2 M NaCl. Na kolonu byl nanesen rozpustný buněčný extrakt, získaný způsobem popsaným v předchozím příkladě z buněk E. coli kmene TG1 transformovaných plazmidem pKDAOHIS. Po nanesení extraktu byla- kolona promyta dostatečným množstvím téhož ekvilibračního pufru, čímž byly eliminovány všechny ostatní proteiny s výjimkou hisDAO, který zůstal zadržen na koloně. Enzym hisDAO byl poté eluován za použití 20 mM fosfátového pufru o pH '7,0 obsahujícího 10 mM imidazol. Frakce obsahující enzym hisDAO byly jímány a posléze dialyzovány proti 20 mM fosfátovému pufru (pH 7,0). Takto připravený enzym o aktivitě 9000 U/mg vykazuje více než 90% stupeň čistoty a je bezprostředně použitelný k přeměně cefalosporinu C na GL-7ACA.

• · · · · · · · · · · 9 9 9 · ··· · · · · • · · · 9 99 999999

9 9 9 9 9 9

9999 999 99 999 99 99

Popis obrázků

Obrázek 1 - konstrukce plazmidú pKDAOHIS

Dao-gen, neobsahující žádný intron a s restrikčním místem Ncol sekvenci kodónu ATG kódujícího první methionin proteinu, byl získán pomocí PCR z plazmidú pALT2. Fragment amplifikovaný prostřednictvím PCR byl poté překlonován do restrikčního místa HincII vektoru M13tgl30, čímž vznikl plazmid M13DA0. Fragment NcoI-HindlII získaný z M13DA0 byl překlonován do NcoI-HindlII . restrikčních míst plazmidú pKK233.2 za vzniku pKDA03. Tento plazmid nesl dao-gen, jehož exprese je řízena promotorem trc z E. coli. V posledním kroku byl vřazen na 5'-konec dao-genu fragment DNA, kódující polyhistidinový řetězec, čímž vznikl plazmid pKDAOHIS.

·· · ·« « · · ···· · · • · · · · · · · · ·

-9/1- ·· ····· · · ·

Yt · ···· ·»···

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1: ..........

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3668 párů basí (B) TYP: deoxyribonukleová kyselina (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: dao-gen (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:'

(A)	JMÉNO/KLÍČ:	CDS	1481.	.1503, 1543..2506
(A)	JMÉNO/KLÍČ:	CDS	2952.	.3668
(D)	ORGANISMUS:	- Trigonopsis variabilis

(xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 1:

GGATCCTTAC GAGGAAGATC TGATAATGGA GAATTCTCTC GCTTTATGCC ATGACTTGCA 60

GGTTCCTCGG GTAATGGAAC CACTGACAAA TCGGCTGCTT GAGGTTTTGT TCCCTTCAAC 120

ACTTCATCTT CCAAGGTTCT AATTCGTAGT TTCTTCTCAT TCAATAAAGC TGCAAACCGC 130

TCCAACATTT GTAGATCATT ATTCTTTGTC TTCACGGCAA CTGTATCTAG TTCCTTCTGA 240

AGGTCCTTCG TTTCTTTGGT TAGTAGATCT ACCATGCCAG TTAAGCGATC AATCTCCTCT 300

TGGACCTCCT’TCTTGAGCGA TAGCTCTCAC CAGAACCAAT CAAAAAGAAC ACCAGGATCG ' 360 GTACATGTTC CTTGTCGGGA TAGGGACAGT GATCCCAAAG TAATTGATAG ATCCTGAACT 420

TTCTGGGTAA TCGAGATAAT AACCGAACTC AAATCTTGTG ATGGCTTGGC GTTCAATTGA 480

ATGTTTTCGC TAGAAAGCCT CGGACTCTTA CGTTGGTCTT CATCTGTAAG CGACCGCGTG 540

AACACTTGTT GGAATAAGTC ATTCCATTCA CTTTCACTTT GAGGACTTCT ATTTGACCGT 600

AGATCTTTAA TTGACTCATT TCCAGTTACT GAAAGTTAGC TGGAAGCTTT CAACATGTCC 660

TCACCAGAGG TTTGATAGAG GTCTAACGAT GGCTTCATAC AGGČTGTGAA TGTGATTGTT. 720

TCGCCAGTCT CAACTCTGAC GATCAAACGC TTAGATCCAC CAATCTCAAT ACCGAACGAG· 730

TTAATTCGAC TCATTGCTCA ATATGATTGA TCGCGCGGGA TGACATCGAA GGTGACAACC 840

GTACGCGAAA GATGCGTGAC GATAAGGACA ACGACTAAGG GAGTAGATGG ACTGGGGAGT 900

GAAGGAAATG TGAGACTAGA GAAAAGCCAC TGACTGAGAG TAAAACAGCC ATGATTAGAC 960

AATCAGCCAT GACAGCACTA TAACGTGATA TGATAAGTAA GGCTCTGTTG CCCGCTGACG 102 0

GCCAACGGCT GACGGCCAAC TTGATGATTC TACCACAAAA AATCATACGA GAAGTCAACG 1080

AAAAGTCCTT AGTTTGGAAT TCCAGACATG GCAGAATTTA ACGGCCACTA CAGTTGGCCG 1140

TTCGTAAACG AGACAAGTGA CTCATGGCAG CACCGTCTCA GTCCACCGGT CTAAAGCACT 1200

TGGTGCCAGA TGAATTTGGA AACTGTCACC TTATAGAATT ACTTTTGGAT AGTTTTTGTA 1260

AGGCTGGAGA CTTGTAAGCC TGACTCAGTT GACTCATCGG CGAAAGCTTC CTATCTTGGA 1320

GCTAAGATCG CCTGATCGTT TTGCCCTACT TATCTTGGTT GCATGAGTTG GCCGGTCAGA 1330

GCCGCATTCT AGCCAAAGGG TTATAGCGTT ACACTCTTGA TAGGCAAATC CGTGCTCGGA 1440

TTATATATAA GGCAAAAGTC GATTCAACGG’ ATCAATAAAA ATG GCT AAA ATC GTT 1495 . Met Ala Lys Ile Val 1 5

GTT ATT GG . GTAAGTGCCT TGATACCAGA CGGCTGACAT TTGTTTAG T GCC GGT 154 8 val rie Gly Ala Gly

GTT

GCC

GGT

TTA

ACT

ACA

GCT

CTT

CAA

CTT

CTT

, CGT

AAA

GGA

CAT

GAG

1596

Val

Ala

Gly

Leu

Thr

Thr

A i a

Leu

Gin

Leu

Leu

Ard

S

Gly

His

Glu

15

20

25

GTT

ACA

ATT

GTG

TCC

gag'

m m rp . 1 x

ACG

CCC

GGT

GAT

CTT

AGT

ATC

GGA

TAT

164 4

v a 1

Thr

Ile

Val

Ser

Glu

Phe

Thr

Pro

G1 ν-

Asp

Leu

Ser

Ile

Gly

Tyr

30

3 5

40

ACC

TCG

CCT

-TGG

GCA

GGT

Gcc

AAC

TGG

ότα

ACA

TT”

TAC

GAT

GGA

GGC

i -

Thr

Ser

Pro

Trp

Ala

Gly

Ala

Asn

Trp

Leu

Thr

Fhe

T y r

Asp

Gly

Gly

45

50

55

AAG

TTA

GCC

GAC

TAC

GAT

GCC

C-TC

TCT

TAT

CCT

ATC

TTG

CGA

GAG

CTG

1740

I.ys,

Leu

Ala

Asp

Tyr

Asp

Ala

Val

Ser

Tyr

Pro

Ile

Leu

Arg

Glu

Leu

60

65

70

GCT

CGA

AGC

AGC

CCC

GAG

GCT

GGA

ATT

CGA

CTC

ATC

AAC

CAA

CGC

TCC

Γ7 88

Ala

Arg

Ser

Ser

Pro

Glu

Ala

Gly

Ile

Arg

Leu

Ile

Asn

Gin

Arg

Ser

75

80

85

90

• · • · • • to

to • to • • to to

• to • · • to • · • ·

···· • • toto • · •

• · ·· • ·· β · · • « · toto •

CAT

GTT

CTC

AAG

CGT

GAT

CTT

CCT

AAA

CTG

GAA

GGT

**GCC

*ÁTG

TCG

to · · GCC

to · toto 1836

His

Val

Leu

Lys

Arg

Asp

Leu

Pro

Lys

Leu

Glu

cly

?λ 1 a

Met

Ser

Ala

95

100

105

ATC

TGT

CAA

CGC

AAC

CCC

TGG

TTC

AAA

AAC

ACA

Ul-

..•A 1

TCT

TTC

GAG

1384

ile

Cys

Gin

Arg

Asn

Pro

Trp

Phe

Lys

Asn

Thr

Va.

Asp

Ser

Phe

Glu

110

115

120

ATT

ATC

GAG

GAC

AGG

TCC

AGG

ATT

GTC

CAC

GAT

GAI

,j . o

GCT

TAT

CTA

1932

Ile

Ilc

Glu

Asp

Arg

Ser

Arg

Ile

Val

His

Asp

Asc

V a i

Aid

Tyr

Leu

125

130

1 3 5

GTC

GAA

rprprp

GCT

TCC

GTT

TGT

ATC

CAC

ACC

GGA

GTC

AC

TTG

AAC

TGG

1980

Val

Glu

Phe

Ala

Ser

Val

Cys

Ile

His

Thr

Gly

Val

Tyr

Leu

Asn

Trp

i an

i a s

1 5 ~

CTG

ATG

TCC

CAA

TGC

TTA

TCG

CTC

GGC

GCC

ACG

GTG

GTT

AAA

CGT

CGA

2028

Leu

Met

Ser

Gin

Cys

Leu

Ser

Leu

Gly.

Ala

Thr

Val

Val

Lys

Arg

Arg

155

160

165

170

GTG

AAC

CAT

ATC

AAG

GAT

GCC

AAT

TTA

CTA

CAC

TCC

TCA

GGA

TCA

CGC

2076

Val

Asn

His

Ile

Lys

Asp

Ala

Asn

Leu

Leu

His

Ser

Ser

Gly

Ser

Arg

175

180

185

CCC

GAC

GTG

ATT

GTC

AAC

TGT

AGT

GGT

CTC

TTT

GCC

CGG

TTC

TTG

GGA

212-4

Pro

Asp

Val

Ile

Val

Asn

Cys

Ser

Gly

Leu

Phe

Ala

Arg

Phe

Leu

Gly

190

195

200

GGC

GTC

GAG

GAC

AAG

AAG

ATG

TAC

CCT

ATT

CGA

GGA

CAA

GTC

GTC

CTT

2172

Gly

Val

Glu

Asp

Lys

Lys

Met

Tyr

Pro

Ile

Arg

Gly

Gin

Val

Val

Leu

205

210

215

GTT

CGA

AAC

TCT

GTT

CCT

TTT

ATG

GCC

TCC

TTT

TCC

AGC

ACT

CCT

GAA

2220

Val

Arg

Asn

Ser

Leu

Pro

Phe

Met

Ala

Ser

Phe

Ser

Ser

Thr

Pro

Glu

220

225

230

AAA

GAA

AAT

GAA

GAC

GAA

GCT

CTA

TAT

ATC

ATG

ACC

CGA

TTC

GAT

GGT

2268

Lys

Glu

Asn

Glu

Asp

Glu

Ala

Leu

Tyr

Ile

Met

Thr

Arg

Phe

Asp

Gly

235

240

245

250

ACT

TCT

ATC

ATT

GGC

GGT

TGT

TTC

CAA

CCC

AAC

AAC

TGG

TCA

TCC

GAA

2 316

Thr

Ser

Ile

Ile.

Gly

Gly

Cys

Phe

Gin

Pro

Asn

Asn

Trp

Ser

Ser

Glu

255

260

265

CCC

GAT

CCT

TCT

CTC

ACC

CAT

CGA

ATC

CTG

TCT

AGA

GCC

CTC

GAC

CGA

2364

Pro

Asp

Pro

Ser

Leu

Thr

His

Arg

Ile

Leu

Ser

Arg

Ala

Leu

Asp

Arg

270

275

280

TTC

CCG

GAA

CTG

ACC

AAA

GAT

GGC

CCT

CTT

GAC

ATT

GTG

CGC

GAA

TGC

2412

Phe

Pro

Glu

Leu

Thr

Lys

Asp

Giv

Pro

Leu

Asp

Ile

V a 1

Arg

Glu

Cys

285

290

2 95

GTT

GGC

CAC

CGT

CCT

GGT

AGA

GAG

GGC

GGT

CCC

CGA

GTA

GAA

TTA

GAG

2 460

Val

Gly

His

Arg

Pro

Gly

Arg

Glu

Gly

Gly

Pro

Arg

Val

Glu

Leu

Giu

300

305

310

AAG

ATC

CCC

GGC

GTT

GGC

TTT

GTT

GTC

CAT

AAC

TAT

G GT

GCC

GCC

GGT

2508

Lys

Tle

Pro

Gly

Val

Gly

Phe

Val

Val

His

Asn

Tyr

Gly

Ala

Ala

Gly

315

320

325

330

GCT

GGT

TAC

CAG

TCC

TCT

TAC

GGC

ATG

GCT

GAT

GAA

GCT

GTT

TCT

TAC

2 3 56

Ala

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

Ala

Asp

Glu

Ala

Val

Ser

Tyr

335

340

345

GTC

GAA

AGA

GCT

CTT

ACT

CGT

CCA

AAC

CTT

TAGAAATCAT GTATACAATT

J c 'J 6

Val

Glu

Arg

Ala

Leu

Thr

Arg.

Pro

Asn

Leu

350

355

ATTCTCTCTC TATAAATCTA ATTTTTTTGT GTGGTCTAAT ATTCGTAAAC ACGTCGCAGT 2666 CGTCTATGTC GCCCTCGTCA CCGTGTCCAA AGTCGTAAAG TGACTGATTG CAATTGCGAC 2726 AACACGTGAC TCGACCTGCC TCCTTACCTC CCATCAACAA CAAAA.GAAGC TGGCTAAGAT 2786 AGAGGTCTGT TGACGAGCAC TCGTAAGAAC GGCAAACATA GAAAGGAGGC T.CTATAATTA 284 6 CCTGGAAACT GTGTTATATA CTATCACTAG TGAGGGTGAG TGATTAGAAG CAAGGGGACT 2906 AGAATACTGA CATGGATAGA GATCCAGGAG CCTTATAAAT AATCA ATG AAT ACA ATT 2963

Met Asn Thr Ile

GAT

TTG

GAA

TCT

TGG

GAT

GAT

GAT

CCA

GAT

TTC

GCA

GAT

GAC

TTT

GAG

Asp

Leu

Glu

Ser

Trp

Asp

Asp

Asp

Pro

Asp

Phe

Ala

Asp

Asp

Phe

Glu

360

365

370

375

AAT

TTA

AAG

ACT

CCA

GCT

CCT

ACG

TTT

TAT

GAA

GCC

AAC

GAT

GAG

ATT

Asn

Leu

Lys

Thr

Pro

Ala

Pro

Thr

Phe

Tyr

Glu

Ala

Asn

Asp

Glu

Ile

380

385

390'

···· • · · · Β ···· ΒΒΒ ΒΒ ΒΒΒ

AGG

GAT

GGA

GAA

GAA

GAG

GAT

GAT

ΓΠφΓΠ i 1 i

TTC

TCT

CAA

GAT

TTC

GAG

TTG

Arg

Asp

Gly

Glu

Glu

Glu

Asp

Asp

Phe

Phe

Ser

Gin

Asp

Phe

Glu

Leu

395

400

405

GAT

GAT

AAG

AAT

ACA

CTC

GGA

CGA

CAG

AAC

AAG

ATT

TCG

ACT

AGT

CAC·

Asp

Asp

Lys

Asn

Thr

Leu

Gly

Arg

Gin

As n

Lys

Ile

Ser

Τ’Ηγ

Ser

His

410

415

4 2

n o

CTA

AAG

TCC

GCG

AGT

CAG

GAA

CAA

GCA

GAG

ACC

TCC

TTT

CGT

GAC

TCG

Leu

Lys

Ser

Ala

Ser

Gin,

Glu

Glh

Ala

Glu

Thr

Ser

Phe

Arg

Asp

Ser

425

430

435

AAC

GCT

GGC

GTC

AAT

GCT

TTC

AGC

TGG

GGG

ACT

ATA

AAA

GCC

TTA

GGA

Asn

Ala

Gly

Val

Asn

Ala

Phe

Ser

Cys

Gly

Thr

Ile

Lys

Ala

Leu

Gly

440

445

450

455

AAG

AAT

AGG

ATG

ACG

ACG

GTG

GAA

GAG

AAG

TGG

GAA

AAG

GAA

GTT

AGA

Lys

Asn

Arg

Met

Thr

Thr

Val

Glu

Glu

Lys

Trp

Glu

Lys

Glu

Val

Arg

460

465

470

CGC

GAT

CAA

ATT

GGG

TTC

AAT

GAA

GCT

ACT

CTT

AGA

GCT

CAT

GAG

ACT

Arg

Asp

Gin

iie

Gly

Phe

Asn

Glu

Ala

Thr

Leu

Arg

Ala

His

Glu

Thr

475

480

485

ACC

AGA

GAA

TGG

TTA

AAA

TCC

CAG

ACT

GGC

GAA

GCT

GGG

ACT

AAA

AGC

Thr

Arg

Glu

Trp

Leu

Lys

Ser

Gin

Thr

Gly

Glu

Ala

Gly

Thr

Lys

Ser

490

495

500

AAG

GTC

TTT

AGC

CCA

ATT

CTC

GAC

GGA

TCA

TTC

TTC

GAA

CCG

CCT

TTG

Lys

Val

Phe

Ser

Pro

Ile

Leu

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Glu

Pro

Pro

Leu

505

510

515

GAA

TCT

AAA

GTC

AGG

CGT

TAT

CAT

TCA

CCC

CGG

AAA

CAG

GCA

CCT

CCT

Clu

Ser

Lys

Val

Arg

Arg

Tyr

His

Ser

Pro

Arg

Lys

Gin

Ala

Pro

Pro

520

525

530

CCT

CCT

CCT

GAC

GAT

TTT

TCA

GAT

GCA

TTT

GAA

CTA

TCT

ACA

GAA

GAG

Pro

Pro

Pro

Asp

Asp

Phe

Ser

Asp

Aia

Phe

Glu

Leu

Ser

Thr

Glu

Glu

535

540

545

550

CCA

GTG

AAA

TTA

AAA-

GTC

CAA

CCA

GTT

CAA

CCT

CAT

ATG

ACG

CCT

GCT

Pro

L ř U

Lys

Leu

Lys

Val

Gin

Pro

Val

Gin

Pro

His

Met,

Thr

Pro

Al a

555

560

565

CTG

AGT

GAT

AAT

GAT

CTA

TGG

GGT

GAG

GAA

TCT

ATT

GGT

GTG

CGA

CGA

Leu

Ser

Asp

Asn

Asp

Leu

Trp

Gly

Glu

Glu

Ser

Ile

Gly

Val

Arg

Arg

570

575

580

GGA

GGC

AGG

GAC

TCG

TCA

AGT

ATG

GGA

GGA

TCC

Cly

Gly

Arg

Asp

Ser

Ser

Ser

Met

Gly

Gly

Ser

585 590 ·· CB β· Β Β Β

ΒΒΒ ··' Β « Β · ·

3107

315 5

3203

3251

3299

3347

3395

3443

91

3539

3537

3635

3668

INFORMACE Ο SEKVENCI ID.' Č. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1128 párů basí (B) TYP: deoxyribonukleová kyselina (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: dao-gen s přídamou sekvencí kódující histidinovou kotvu na 5'konci (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS 16..1107 (D) ORGANISMUS: Trigonopsis variabilis (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 2:

• · · · • « i

- 27 • · · · • · • · • · • · · · · · A • A A A • A A AAA • A • A A A

CACAGGAAAC AGACC ATG CAT CAT CAC CAC CAT CAC TTC ATG GCT AAA ATC 51

Met His His His His His His Phe Met Ala Lys Ile 1 5 10

GTT

GTT

ATT

GGG

GCC

GGT

GTT

GCC

GGT

TTA

ACT

ACA

GCT

CTT

CAA

CTT

99

va-i

Val

Ile

Gly

Ala

Gly

Val

Ala

Gly

Leu

Thr

Thr

Ala

Leu

Gin

Leu

15

20

25

CTT

CGT

AAA

GGA

CAT

GAG

GTT

ACA

ATT

GTG

TCC

GAG

TTT

ACG

CCC

GGT

147

Leu

Arg

Lys

Gly

His

Glu

Val

Thr

Ile

Val

Ser

Glu

Phe

Thr

Pro

Gly

.30

35

40

GAT

CTT

AGT

ATC

GGA

TAT

ACC

TCG

CCT

TGG

GCA

GGT

GCC

AAC

TGG

CTC

195

Asp

Leu

Ser

Ile

Gly

Tyr

Thr

Ser

Pro

Trp

Ala

Gly

Ala

Asn

Trp

Leu

4 5

50

55

60

ACA

TTT

TAC

GAT

GGA

GGC

AAG

TTA

GCC

GAC

TAC

GAT

GCC

GTC

TCT

TAT

243

Thr

Phe

Tyr

Asp

Gly

Gly

Lys

Leu

Ala

Asp

Tyr

Asp

Ala

Val

Ser

Tyr

65

70

75

CCT

ATC

TTG

CGA

GAG

CTG

GCT

CGA

AGC

AGC

CCC

GAG

GCT

GGA

ATT

CGA

291

Pro

Ile

Leu

Arg

Glu

Leu

Ala

Arg

Ser

Ser

Pro

Glu

Ala

Gly

Ile

Arg

80

85

90

CTC

ATC

AAC

CAA

CGC

TCC

CAT

GTT

CTC

AAG

CGT

GAT

CTT

CCT

AAA

CTG

339

Leu

Ile

Asn

Gin

Arg

Ser

His

Val

Leu

Lys

Arg

Asp

Leu

Pro

Lys

Leu

95

100

105

GAA

GGT

GCC

ATG

TCG

GCC

ATC

TGT

CAA

CGC

AAC

CCC

TGG

TTC

AAA

AAC

387

Glu

Gly

Ala

Met

Ser

Ala

Ile

Cys

Gin

Arg

Asn

Pro

Trp

Phe

Lys

Asn

110

115

120

ACA

GTC

GAT

TCT

TTC

GAG

ATT

ATC

GAG

GAC

AGG

TCC

AGG

ATT

GTC

CAC

435

Thr

Val

Asp

Ser

Phe

Glu

Ile

Ile

Glu

Asp

Arg

Ser

Arg

Ile

Val

His

L25

130

135

140

GAT

GAT

GTG

GCT

TAT

CTA

GTC

GAA

TTT

GCT

TCC

/•'mm ϋϋ

TGT

ATC

CAC

ACC

483

Asp

Asp

Val

Ala

Tyr

Leu

Va l

Glu

Phe

Ala

Ser

Val

Cys

Ile

His

Thr

145.

150

155

GGA

GTC

TAC

TTG

AAC

TGG

CTG

ATG

TCC

CAA

TGC.

TTA

TCG

CTC

GGC

GCC

531

Giy

Val

Tyr

Leu

Asn

Trp

Leu

Met

Ser

Gin

Cys

Leu

Ser

Leu

Gly

Ala

160

165

170

ACG

GTG

GTT

AAA

CGT

CGA

Gí G

AAC

CAT

ATC

AAG

GAT

GCC

AAT

TTA

CTA

5 7 9

Thr

V a 1

Val

Lys

Arg

Arg

r - i v m

Asn

His

Ile

Lys

Asp

Ala

Asn

Leu

Leu'·

17 5

180

185

CAC

TCC

TCA

GGA

TCA

CGC

CCC

GAC

GTG

ATT

GTC

AAC

TGT

AGT

GGT

CTC

62'

His

Ser

Ser

Gly

Ser

Arg

Pro

Asp

Val

Ile'

Val

Asn

Cys

Ser

Gly

Leu

1 90

195

200

TTT

GCC

CGG

TTC

TTG

GGA

GGC

GTC

GAG

GAC

AAG

AAG

ATG

TAC

CCT

ATT

67 5

phe

Ala

Arg

Phe

Leu

Gly

Gly

Val

Glu

Asp

Lys

Lys

Met

Tyr

Pro

Ile .

205

210

215

220

CGA

GGA

CAA'

GTC

GTC

CTT

GTT

CGA

AAC

TCT

CTT

CCT

TTT

ATG

GCC

TCC

723

Arg

Gly

Gin

Val

Val

Leu

Val

Arg

Asn

Ser

Leu

Pro

Phe

Met

Ala

Ser

225

230

235

TTT

TCC

AGC

ACT

CCT

GAA

AAA

GAA

AAT

GAA

GAC

GAA

GCT

CTA

TAT

ATC

771

Phe

Ser

Ser

Thr

Pro

Glu

Lys

Glu

Asn

Glu

Asp

Glu

Ala

Leu

Tyr

Ile

240

245

250

ATG

ACC

CGA

TTC

GAT

GGT

ACT

TCT

ATC

ATT

GGC

GGT

TGT

TTC

CAA

CCC

819

Met

Thr

Arg

Phe

Asp

Gly

Thr

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

Cys

Phe

Gin

Pro

255

260

265

AAC

AAC

TGG

TCA

TCC

GAA

CCC

GAT

CCT

TCT

CTC

ACC

CAT

CGA

ATC

CTG

867

Asn

Asn

Trp

Ser

Ser

Glu

Pro

Asp

Pro

Ser

Leu

Thr

His

Arg

Ile

Leu

270

275

280

TCT

AGA

GCC

CTC

GAC

CGA

TTC

CCG

GAA

CTG

ACC

AAA

GAT

GGC

CCT

CTT

915

Ger

Arg

Ala

Leu

Asp

Arg

Phe

Pro

Glu

Leu

Thr

Lys

Asp

Gly

Pro

Leu

285

290

295

300

• · ·* »· 4 4 · 4 4 4 4 • · · 4··· 4 44 · * · >4 4 »4 444 444 • 4 4 4 4 4 4

4444 444 44 444 «4 44

GAC

ATT

GTG

GGC

GAA

TGC

GTT

GGC

CAC

CGT

CCT

GGT

AGA

GAG

GGC

GGT

963

Asp

Tle

Val

Arg

Glu.

Cys

Val

Gly

His

Arg

Pro

Gly

Arg

Glu

Gly

Gly

305

310

315

ccc

CGA

GTA

GAA

TTA

GAG

AA.G

ATC

CCC

GGC

GTT

GGC

TTT

GTT

GTC

CAT

1011

Pro

Arg

Val··

Glu

Leu

Glu

Lys

Ile

Pro

Gly

Val

Gly

Phe

Val

Val

His

320

325

330

AAC

TAT

GGT

GCC

GCC

GGT

GCT

GGT

TAC

CAG

TCC

TCT

TAC

GGC

ATG

GCT

1059

Asn

Tyr

Gly

Ala

Ala

Gly

Ala

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Tyr

Gly

Met

Ala

335

340

345

GAT

GAA

GCT

GTT

TCT

TAC

GTC

GAA

AGA

GCT

CTT

ACT

CGT

CCA

AAC

CTT

1107

Asp

Glu

Ala

Val

Ser

Tyr

Val

Glu

Arg

Ala

Leu

Thr

Arg

Pro

Asn

Leu

350

355

360

364

TÁGAAGCTTG GCTGTTTTGG C 1128

Claims (8)

1. PATENTOVE NÁROKY

   1. Způsob produkce modifikované oxidázy D-aminokyselin z Trigonopsis variabilis v libovolném hostitelském organismu vyjma člověka, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

   a) izolaci DNA genu kódujícího enzym s oxidázovou aktivitou k D-aminokyselinám z libovolného kmenu mikroorganismu, který takový enzym produkuje;

   b) eliminaci intronů, které uvedený gen obsahuje pomocí způsobů založených na použití syntetických oligonukleotidů a polymerázové řetězové reakce PCR;

   c) vložení fragmentu DNA získaného v bodu (b) do plazmidu, který je schopen replikace v hostitelském organismu;

   d) fúzi syntetické sekvence oligonukleotidů kódující šest histidinových zbytků s 5'koncem strukturního regionu genu kódujícího oxidázovou aktivitu k D-aminokyselinám a zbaveného intronů;

   e) transformacihostitelského organismu rekombinantním plazmidem získaným v bodu (d)

   f) kultivaci tras formovaných buněk hostitelského organismu podle bodu (e) ve vhodném kultivačním médiu za podmínek, které umožňují produkci oxidázy D-aminokyselin;

   g) získání oxidázy D-aminokyselin z kultury podle bodu (f) pomocí afinitní chrornatografie

   30·· 9 · * 99 9 9 9 9 99

   9 9 99 . 9 9 9 9 9 9 9

   9 ' 9 9 9 999 9 9 9 9 • · · · · · ♦ · · · 99 9 • · * · · · · • ··· · · a 9 9 9 9 9 9 9 9 9
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že gen kódující oxidázu D-aminokyselin je genem Trigonopsis variabilis.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že hostitelským organismem je Escherichia coli.
4. 4. Způsob podle libovolného z předchozích nároků vyznačující se t í m ·, že afinitní chromatografie použitá k izolaci modifikovaného enzymu je založena na na médiu obsahujícím divalentní kationty.
5. 5. Oxidáza D-aminokyselin modifikovaná, ..produkovaná a izolovaná způsobem podle libovolného z předchozích nároků.
6. 6. Způsob využívající oxidázu D-aminokyselin podle nároku 5 v enzymatické syntéze 7β-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny.
7. 7. Způsob podle nároku 6 vyznačující se tím, že se cefalosporin C podrobí reakci s oxidázou D-aminokyselin ve vodném médiu.

   ' (
8. 8. Způsob podle nároku 6 a 7 v y z n a č u j i c í se tím, že pří enzymatické reakci je oxidáza D-aminokyselin imobilizována.