CZ20002751A3

CZ20002751A3 - Použití činidla inhibujícího interakci LT-ß a jeho receptoru pro výrobu přípravku k léčení folikulárního lymfomu

Info

Publication number: CZ20002751A3
Application number: CZ20002751A
Authority: CZ
Inventors: Jeffrey Browning; Jeanette Thorbecke; Vincent Tsiagbe
Original assignee: Biogen, Inc.; New York University
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2000-12-13
Also published as: EE200000446A; TR200101693T2; HUP0102363A3; JP2002501902A; DE69912743T2; IL137489A0; HUP0102363A2; PT1051187E; EE05235B1; AU752710B2; ES2211035T3; NO20003848D0; CA2319698A1; EP1051187B9; NO20003848L; IL137489A; HK1029944A1; JP2010235621A; AU2348899A; HU226044B1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutických přípravků, obsahujících inhibitory lymfotoxinové signální dráhy. Tyto přípravky jsou užitečné k léčení lymfomů, které pocházejí z germinálních center (folikulárních lymfomů).

Dosavadní stav techniky

Cytokiny příbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF, Tumor Necrosis Factor) jsou mediátory hostitelské obranné a imunitní regulace. Členy této proteinové rodiny se vyskytují ve formě ukotvené na buněčnou membránu, kdy působí lokálně prostřednictvím vzájemného kontaktu mezi buňkami, nebo se vyskytují jako vylučované proteiny, které jsou schopné difundovat ke vzdálenějším cílům. Paralelní rodina receptorů upozorňuje na výskyt těchto molekul vedoucí k iniciaci buněčné smrti nebo buněčné proliferace a diferenciace v cílové tkáni. V současnosti rodina TNF ligandů a receptorů obsahuje nejméně 11 známých párů receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-a:TNF-R, LT-α/β:LT-p-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L.-CD30, CD27L:CD27, OX40L:OX40 a 4-1BBL:4-1BB.

Členy rodiny.TNF mohou být nejlépe popsány jako hlavní přepínače v imunitním systému pro řízení přežívání buněk a diferenciace. V současnosti jsou známy pouze dva secernované cytokiny, a sice TNF a LTa, na rozdíl od většiny

- 2 ·» *« 9999 • · · · · · •··· φ « · · · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 9 · · ·· · • 4) * ·

9 » 9

9 9 9

99 ostatních členů rodiny TNF zakotvených v membráně. Zatímco membránové formy TNF byly dobře charakterizovány a pravděpodobně mají jedinečnou biologickou funkci, funkcí secernovaných TNF je všeobecná signalizace poplachu buňkám, vzdáleným od místa události, která příslušnou událost vyvolala. Sekrece TNF může znásobit událost vedoucí k dobře známým změnám ve výstelce cév a v buňkách v místě zánětu. Naproti tomu členy TNF rodiny vázané na membránu předávají signál prostřednictvím receptoru typu TNF pouze 'buňkám v přímém kontaktu. Tak např. pomocné T-buňky poskytují pomoc zprostředkovanou CD40 pouze takovým B-buňkám, se kterými se dostanou do přímého kontaktu prostřednictvím interakcí TÓR. Podobná omezeni' na bezprostřední buněčný kontakt se týkají schopnosti indukovat buněčnou smrt u dobře prozkoumaného systému Fas.

Většina komplexů LTa/β asociovaných s membránou (povrchových LT) má stechiometrii ΤΤα1/β2 (Browning a kol., Cell 72: 847-856, 1993, Browning a kol., J. Immunol. 154: 3346, 1995). Povrchové'LT ligandy se nevážou na TNF-R s vysokou afinitou a neaktivují signální dráhu TNF-R. Avšak ΤΤβ receptor (5Τβ -R) váže tyto povrchové lymfotoxinové komplexy s vysokou afinitou (Crowe. a kol., Science 264: 707-710, 1994) .

Signalizace LTβ-R, podobně jako signalizace TNF-R, má antiprpliferativni 'účinek a může mít cytotoxický účinek na nádorově buňky. V současně projednávané patentové -přihlášce původců předkládaného vynálezu (přihláška US 08/378 968) jsou popsány přípravky a způsoby pro selektivní stimulaci ΕΤβ-Κ užitím činidla aktivujícího ύΤβ-Η. Agens aktivující ΕΤβ-Η je užitečné pro inhibici růstu nádorových buněk, aniž by současně vedlo k aktivaci zánětlivé reakce - nebo • r »·»·· • ·

- 3 • 9 Φ* • · · • ·»· • · • · ·»·· ·· • · • · • · • · . *· • 9 9« • · ·

9 9 • · 9 · • 9 · »· imunoregulační dráhy indukované TNF-R.

Současný výzkum genového zaměřování (gene targeting) předpokládá úlohu LTcc/β ve vývoji sekundárních lymfatických orgánů (Banks, et al., J. Immunol. 155/· 16-85-1693, 1995,

DeTogni et al., Science 264, -703-706-, 1994). Skutečně myši •s deficitem LToc postrádají lymfatické uzliny (LN) a Peýerovy ostrůvky (PP). Jejich sleziny mají narušenou architekturu a exprese. funkčních markérů na .buňkách marginální zóny sleziny je pozměněna (Banks et al., 1995, De -Togni et al., 1994, Matsumoto et al. , Science 271, 1289-1291, 1996). Žádná z těchto vlastností nebyla popsána u myší s geneticky /

vyřazenou funkcí (knock out) TNF receptoru. (Erickson et al., Nátuře 372, 560-563, 1994, Pfeffer et al., Cell 73,

457-467, 1993, Rothe et al., Nátuře 364, 798-302, 1993) .

Původce vynálezu nedávno definoval roli membránových komplexů LToc/β ve vývoji sekundárních lymf-atických ¹ orgánů tím, že ukázal, že potomstvo myší, kterým' byla v průběhu gestace injikována rozpustná forma 1ιΤβ-ρ fúzovaného s úsekem Fc lidského IgGl (I^-R-Ig) postrádá většinu lymfatickýcn uzlin a vykazuje narušenou architekturu sleziny (Rennert et al., 1996, Surface lymphotoxin alpha/beťa complex is required for the development of peripheral lymphoid organs, J. Exp. Med. 184, 1999-2006). V jiné studii bylo ukázáno, že transgenní myši s podobným konstruktem ΕΤβ-R-Ig, jehož exprese, začala tři dny po narození, měly lymfatické uzliny. Ale .' měly narušenou architekturu sleziny a několik markérů slezinné marginální - zóny nebylo exprimováno (Ettinger et al., Disrupted splenic architecture, but normál lymph node development in mice expressing a soluble L^-R/IgGl fusion protein, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 13102-7). Tyto údaje společně ukazují, že zde existuje dočasný požadavek na

-4 membránové funkce LT pro zprostředkování účinků na vývoj sekundárních lymfatických orgánů, ale bez účinku na architekturu sleziny. '

Systém TNF se také účastní ve vývoji sleziny. Buňky marginální zóny sleziny myší deficitních na TNF neexprimují makrofágové markéry nebo MAdCAM-l (Alexopoulou et al ., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 228, 1996, Pasparakis et al., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 239, 1996). Myši deficitní v TNF-R55 také postrádají MAdCAM-l (ale nikoliv MOMA-1) v marginální zóně sleziny (Neumann et al., J. Exp. MEd. 184, 259-264, 1996, Matsumoto et al., Science 271, 1289-1291, 1996).

Lymfatické tkáň nebo tkáň podobného typu nevzniká jen v průběhu vývoje, ale také při určitých patologických stavech, jako jsou např. chronické záněty/ v procesu zvaném neolymfoorganogeneze (Picker a Butche-r, Annu. Rev. Immunol. 10, 561-591, 1992, Kratz et al., J. Exp. Med. 183, 1461-1471, 1996). Tyto procesy jsou zjevně ovlivňovány členy rodiny TNF. U transgenních myši s genem LTec . řízeným promotorem genu inzulínu potkana (RIP-LT) se vyvinuly chronické zánětlivé léze s charakterem, organizované lymfatické tkáně (Kratz et al., J. Exp. Med. 1183, 1461-1471, 19965, Picarella et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10036-10040, 1992).

Vyhodnocení funkce LT v průběhu imunitní odpovědi závislé na T buňkách pomocí myší deficitních v LTec ukázalo na nezbytnost LT pro vytváření GC, a zřejmě také pro udržování organizované struktury folikulárních dendritických buněk (FDC)’ a pro imunitní humorální odpověď (Banks et al., J. Immunol. 155, 1685-1693, 1995, Matsumoto et al., Science 271, 1289-1291, 1996, Matsumoto et al., Nátuře 382, 462-466, 1996). Myši deficitní v TNF-R55 také .postrádají FDC, nevyvíjí se u nich GC a nejsou schopny optimální imunitní odpovědi-na • · ovčí červené krvinky (SRBC). To předpokládá, že TNF-R55 může být spouštěn rozpustným signálem LT nebo TNF ve většině takových odpovědí (LeHir et al., J. Exp. Med. 183, 2367-2372, 1996, Alexopoulou. et al., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 228, 1996, Pasparakis et al., 6Oth Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 239, 1996).

Receptor ύΤβ, člen rodiny receptorů TNF, specificky váže povrchové LT ligandy. ΕΤβ-R váže heteřomerické LT komplexy (převážně ΕΤα1/β2 a ΕΤα2/β1),’ ale neváže ani TNF ani LTa (Crowe a kol., Science 264: 707-710, 1994). mRNA proΕΤβ-R byla nalezena v lidské slezině, brzlíku i dalších orgánech spojených s imunitou. Ačkoliv výzkum exprese ΗΤβ-R je teprve v počáteční fázi, profil exprese . Εΐβ-Κ je podobný profilu p55-TNF-R, kromě toho, že ΕΤβ-R chybí na T a B buňkách periferní krve a-na liniích T a B buněk.

Komplexy povrchových lymfotoxinú (LT) byly charakterizovány v hybridomových T buňkách CD4’ (11-23.D7), které exprimují vysokou hladinu LT (Browning et al., J. Immunol.· 147: 1230-1237, 1991, Androlewicz et al.,

J. Biol. Chem. 267: 2542-2547, 1992). Exprese a biologická funkce ΕΤβ-R, LT podjednotek a povrchových LT komplexů jsou popsány v přehledu Ware, C.F.,,The ligands and receptors of the lymphotoxin systém, v: Pathways for Cytolysis. Current Topics Microbiol. Immunol. Springer-Verlag, , s. 17-5-218, 1995, který je zahrnut formou odkazu.

Exprese LTa je indukována a LTa je primárně, secernován aktivovanými Ta B lymfocyty a cytotoxickými žabíječskými buňkami (NK, natural killer). LTa je produkován v rámci pomocných T buněk podskupinou Thl, ale nikoliv podskupinou Th2 buněk. LTa byl také' nalezen v melanocytech. Mikroglie' a T buňky v lézích u pacientů s roztroušenou mozkomíšní.

• · • · ·· sklerózou reagují pozitivně s antisérem anti-LTa (Šelmaj et al., J. Clin. Invest. 87, 949- 954, 1991).

Lymfotoxin β (zvaný také p33) je exprimován na povrchu myších i lidských T lymfocytů, linií T buněk, linií B buněk a žabíječských buněk aktivovaných lymfokinem (LAK). LTp je předmětem současně projednávaných patentových přihlášek stejných původců, a sice PCT/US91/04588, publikované 9. ledna 1992 jako dokument WO 92/00329, a PCT/US93/11669, publikované 23. června 1994 jako WO 94/13808, které jsou zahrnuty formou odkazu.

Povrchové LT komplexy jsou exprimovány primárně aktivovanými T lymfocyty (pomocnými, Thl i zabíječskými buňkami) a B lymfocyty a zabíječskými buňkami, jak se dá ukázat analýzou pomocí FA.CS nebo imunohistologickou analýzou užitím protilátek anti-LT nebo rozpustných fúzních proteinů LTP-R-Fc. V projednávané přihlášce stejného původce US 08/505 606 podané 21. července 1995 jsou popsány přípravky a způsoby užívající rozpustné ΒΤβ receptory a protilátky specifické proti ΕΤβ receptorů a ligandu jako léčivo pro léčení imunitních - chorob zprostředkovaných Thl buňkami. Povrchové LT byly také nalezeny na klonech lidských cytotoxických T lymfocytů (CTL), v aktivovaných periferních mononukleárních lymfocytech (PML), lymfocytech periferní krve aktivovaných IL-2 (LAK), periferních B lymfocytech aktivovaných buď mitogenem z Phytolacca americiana nebo anti-CD40 (PBL), a různých T a B buněk pocházejících z lymfoidních nádorů. Zapojení cílových buněk nesoucích alloantigen specificky indukuje expresi povrchových LT u klonů CD4‘ a CD8⁺ CTL..

Původce vynálezu popsal několik imunologických funkcí povrchového LT a ukázal vliv LTot/β vazebného činidla na ·· ·· • ♦ · · • · · · • · 9 9 9 • · · · • 9 99 ·· ·· ·· ··· • t · · « • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · ···· ·· ·· · vyvolání a charakter imunoglobulinové odpovědi, udržování buněčné organizace sekundární lymfatické tkáně včetně účinku na diferenciační stav folikulárních dendritických buněk a vytváření germinálních center, a také úroveň exprese adresinů, která ovlivňuje buněčný transport. Původce tak definoval terapeutické využití vazebných činidel povrchových LTa/β a LTa receptorů. Studie ukázaly, že B buňky jsou aktivovány v lymfatických uzlinách (LN) a slezině po setkání s různými antigeny. Ve specializovaných strukturách LN a sleziny, které se nazývají germinální centra, kde se tvoří oblasti bohaté na B buňky, B buňky dozrávají a tvoří se paměťové B buňky (¹) .

B buňky jsou schopné nádorové transformace po většinu svého vývoje (²). Transformace B buněk vede k lymfomům,. a lymfomy pocházející z B buněk germinálních- center se nazývají' folikulární lymfomy. Přesné vymezení různých druhů lymfomů se stále provádí, a zpřesňuje, neboť se nachází stále více povrchových markérů, které umožňují přesněji stanovit původ buněk. Folikulární lymfomy lze rozdělit do mnoha podksupin na základě stádia nebo typu B buněk,· které proliferují, a také prognóza je velmi odlišná v závislosti na typu buněk. Konvenční chemoterapeutické režimy jsou schopné jsou schopné pomoci a léčit pacienty s buňkami nízkého stupně. Nicméně někteří z těchto pacientů jsou rezistentní k chemoterapii a mají špatnou prognózu.

Tudíž i přes pokroky v, léčení nádorů stále přetrvává potřeba nových přístupů v léční nádorů, zejména rezistentních k chemoterapii, a také potřeba nových léčebných režimů s menšími vedlejšími účinky, než mají současné terapie.

- '8 Podstata vynálezu'

Předmětem vynálezu je^: použití sloučeniny, která inhibuje interakci ϋΤβ s receptorem pro výrobu léku k léčení nádorů. Předkládaný vynález poskytuje přípravky k léčení nádorů jako jsou folikulárni lymfomy. Tyto nové léky mají značné výhody ve srovnání s dosud známými a nabízejí možnost alternativní terapie v případě nádorů rezistentních k současné chemoterapii.

Výhodné provedení předkládaného vynálezu se týká léčení subjektu, který trpí folikulárním lymíomem, kdy se subjektu podává účinné množství přípravku,' který blokuje interakci heteromeru LTa/β s receptorem. Podle výhodných provedení vynálezu· přípravky obsahují, přičemž výčet není omezující,, rozpustné receptory lymfotoxinu β, protilátky namíření proti Ι,Τβ receptorům a protilátky namířené proti povrchovým LT lígandům. Výhodnější jsou rozpustné receptory lymfotoxinu β, které mají vazebnou doménu ligandu, . která může selektivně vázat povrchový LT ligand, jako je např. rozpustná forma ύΤβ-Ρ. fúzovaná s Fc doménou humánního imunoglobulinu. Kromě toho k výhodným přípravkům patří monoklonální protilátky, které jsou namířeny proti ύΤβ ' receptorům, včetně humanizovaných a chimérických protilátek nebo i jinak modifikovaných protilátek.

V jiném provedení se předkládaný vynález týká léčení subjektu trpícího folikulárním lymfomem, kdy se podává blokující činidlo, dokud nedojde k regresi nebo zastavení růstu nádoru. Činidla blokující LT dráhu se mohou podávat v kombinaci s jinými činidly, která jsou užitečná při léčení nádorů, jako jsou např. chemoterapeutika. Kromě toho je možné podávat přípravky podle předkládaného vynálezu společně

0000

- 9 » ·· » ·

000 • Φ 0· s,ozařováním nebo transplantací kostní dřeně.

V ještě dalším provedení předkládaného vynálezu se činidlo blokující LTp-R podává společně s činidlem blokujícím dráhu jiných členů rodiny TNF. Např. činidlo blokující TNF se může podávat současně nebo střídavě s činidlem' podle předkládaného vynálezu.

Podrobný popis' vynálezu'

V. této části je vynález ještě podrobněji popsán, 'aby mohl být zcela vysvětlen a pochopen, a jsou zde definovány použité termíny.

Termín imunoglobulinová odpověď nebo humorální odpověď se v tomto textu užívá k označení imunitní odpovědi zvířete na cizorodý antigen, při které zvíře produkuje protilátky proti uvedenému antigenu. Třída Th2 pomocných T buněk je důležitá pro produkci ^: protilátek s vysokou afinitou.

Termín zárodečné centrum (nebo germinální centrum) označuje folikul B buněk, které se vytvářejí po imunizaci antigenem. Objevení se takového histologického místa souvisí s optimálním ’ vytvářením paměti, přepínáním isotypů, somatickou hypermutací a tedy afinitním zráním imunitní odpovědi.

Termín marginální zóna nebo oblast typu. marginální zóny se týká histologicky popsaného kompartmentu sekundární l.ymfatické tkáně obsahující především makrofágy marginální zóny (MZM), metalofilní makrofágy (MM), B buňky marginální také T buňky a dendritické buňky, krevního řečiště do oblastí marginálních sinusů umožňuje přímý přístup antigenu k buňkám a podporuje buněčné reakce na antigen v těchto místech.

Termín- pomocná T buňka (Th buňka) označuje funkční zóny a retikulocyty, a Vyústění arteriálního φφ φφφφ

- 10 φφ φφ φ φφφφ φ φφφφ φ φ φ φ φ · φ φ φφφ • φφ ·· podtřídu Τ buněk, které pomáhají generovat . cytotoxické T buňky a které spolupracují s B buňkami a stimulují tak tvorbu protilátek. Pomocné T buňky rozpoznávají antigen ve spojení s molekulami MHC II. třídy a poskytují kontaktně závislé a kontaktně nezávislé (cytokiny) signály pro efektorové buňky.

Termín doména Fc protilátky označuje část molekuly obsahující kloubovou oblast, doménu CH2 a CH3, ale neobsahuje místo vážící antigen. Termín je také použit k označení odpovídající oblasti IgM nebo protilátky jiného isotypu.

Termín protilátka anti-LT-|3-receptor popisuje jakoukoliv protilátku, která se specificky váže k alespoň jednomu epitopu na receptorů ίΤβ.

Termín protilátka anti-LT popisuje ‘ jakoukoliv protilátku, která' se specificky váže k alespoň jednomu epitopu na LTa, ϋΤβ, nebo komplexu LTa/β.

Temín signální dráha Ι,Τβ-Κ (signalizace ΤΤβ-Έ.) označuje molekulární reakce spojené s celou metabolickou cestou přenosu signálu τ,Τβ-R a další molekulární reakce, které k ní vedou.

Termín činidlo blokující Ι,Τβ-Κ označuje takové činidlo, které naruší- vazbu ligandu na. Ι,Τβ-R, shlukování ΙΑβ-Ή na buněčném povrchu nebo signalizaci Ι,Τβ-R, nebo které způsobí změnu v tom, jak je signál dráhy Σΐβ-Η interpretován v buňce. Činidlo blokující. Ι,Τβ-R, které působí v kroku vazby ligand-receptor, inhibuje vazbu LT'ligandu na ΕΤβ-R alespoň 0 20 %. Příklady činidla blokujícího ΤΤβ-R zahrnují rozpustné molekuly ΒΤβ-Ρ-Γο a protilátky anti-LTa, ant'i-LTP, anti-LTa/β a 3ηίί-ΕΤβ-Η. Výhodně protilátky nereagují křížově še secernovanou formou LTa.

- 11 ·· ·· « · ·

4 49 ·· ···· ·· .

4 4

4449 49

9 4 4 4

4 4 9 4

4 4 4 4 4

4 4 9 4

94 44

Termín biologická aktivita LTP-R znamená 1) schopnost molekuly LT-p-R· nebo jejích derivátů soutěžit o rozpustný nebo povrchový LT ligand vážící se k rozpustné nebo povrchové molekule LT-p-R, nebo 2) nativní aktivitu LT~P jako je schopnost stimulovat regulační imunitní odpověď nebo obecně cytotoxickou aktivitu.

Termín, LT ligand znamená heteromerický komplex LTa/p nebo jeho derivát, který se specificky váže na receptor LTp.

Termín vazebná doména LTP-R ligandu popisuje část nebo části LTP-R, které se účastní specifického rozpoznání a interakce s ligandem LT.

Termíny povrchový LT a povrchový LT komplex označují komplex, ' skládající se z podjednotky LTcc .a podjednotky LTp vázané na membránu, včetně 'mutovaných,' pozměněných a chimérických forem jedné nebo více podjednotek, kterýžto komplex je prezentován na povrchu buňky. Povrchový ligand LT znamená povrchový LT komplex nebo jeho derivát, který se specificky váže na receptor LTp.

Termín subjekt zde znamená zvíře nebo jednu či několik buněk pocházejících ze zvířete. Výhodně je zvíře savcem. Buňky jsou v jakékoliv formě, včetně, ale ne výlučně, buněk obsažených ve tkáni, shluků . buněk, imortalizovaných, transfekovaných nebo transformovaných buněk, a také buněk pocházejících ze zvířete, které bylo fyzikálně nebo fenotypově změněno.

Jak již bylo zmíněno výše, transformace B buněk vede ke vzniku lymfomů, a transformace B buněk pocházejících z germinálních center, specializovaných ' struktur vyskytujících se v lymfatických uzlinách a. ve slezině v oblastech bohatých na B buňky, .vede ke vzniku lymfomů nazývaných folikulární lymfomy. Germinální centra B buněk ·· ♦ ···

- 12 9 9 99

9 9 9

9 99 ·

9 9 9 9

9 9 9

9999 99 « ·· ··

9 9 ·

9 9 · 9

9 9 9

99 vyžadují specifické prostředí pro dozrávání a proliferaci a folikulární dendritické buňky poskytují jak antigen tak i většinou specifické signály pro B buňky germinálních center, které spouštějí dozrávání, přežívání a proliferaci buněk. Studie na SJL myších, které spontánně vytvářejí sarkomy retikulárních buněk (RCS, původní název tohoto druhu nádorů) poskytly transplantovatelné buněčné linie a také in vitro linie buněk RCS (CRCS), které jsou vhodné jako model pro zkoumání interakce mezi hostitelem a nádorem (

Tyto

RCS vznikají často v LN myší SJL, jsou heterogenní a obsahují různé typy hematopoetických buněk. Významné důkazy ukazují na to, že tyto lymfomv pocházejí z germinálních center a pro své přežívání a proliferaci vyžadují různé signály nebo faktory poskytované hostitelem (^5,s) . Možnost měnit tyto signály nezbytné k přežívání poskytuje prostředek, jak kontrolovat růst těchto nádorů.

Jeden typ buněk, které se nazývají folikulární dendritické buňky (FDC), má rozhodující význam pro vytváření, a funkci germinálních center. Má se za to, že na přežívání a udržování germinálních center B buněk se podílejí mnohé faktory. Zejména členy rodiny. ·TMF cytokinů, které jsou signálními ligandy na buněčném povrchu, se na tom podílejí jak ze strany B buněk/ např. CD40, tak ze strany FDC, např. receptory TNF a lymfotoxinu · (LT) . Myši s deficitní LT nebo TNF osou mají také defektní FDC a tudíž postrádají germinální centra (⁷) . Osa TNF je kritická pro vývoj FDC, i když zřejmě existují i downstream funkce. Osa LT se zdá být více kritická pro udržování FDC ve funkčním stavu. Systém LT lymfocytů. pozitivních na receptory, které jsou zahrnuje signalizaci z různých ligandy na buňky pozitivní na pravděpodobně deriváty jiných buněk než kostní dřeně, např. deriváty FDC, aby se FDC udržely v plně funkčním stavu.

9999

9 9

9

9 • · • 9 9· ·· ·· • * ·

9 9

9 ·

9 9

9

Původce vynálezu zjistil, že zablokování této signální dráhy, buďto např. protilátkami k LT ligandům nebo rozpustným fúzním proteinem receptor-imunoglobulin, vede ke ztrátě zralých FDC (Mackay a Browning, 1998, Nátuře V. 395, 26-27). Kromě toho inhibice LT dráhy vede ke ztrátě tvorby germinálních center a k určité desorganizaci sleziny (⁸) .

Původce předkládaného vynálezu poprvé publikoval v této přihlášce, že inhibitory LT dráhy ruší interakci mezi B buňkami folikulárního íymfomu a jejich okolím, tj . FDC, a vedou ke zpomalení nebo· zastavení růstu nádorů. Tudíž takové . inhibitory jsou užitečné k léčení těchto úporných nádorů v primární terapii nebo k doplnění konvenční chemoterapie. Specificky, i když v oboru byla známa domněnka, že aktivace LT dráhy by se mohla využít v nádorové terapii, původce překvapivě zjistil, že přechodné zablokování LT dráhy vede ke zpomalení nebo zastavení růstu nádorů jako jsou např. folikulární lymfomy.

V širším smyslu se předkládaný vynález týká přípravků k léčení nádorů nebo lymfomů, konkrétně folikulárního Íymfomu, tím, že se subjektu podává účinné množství přípravku, který inhibuje LT dráhu. Takový přípravek může obsahovat rozpustný ίΤβ receptor, fúzní protein obsahující ΒΤβ-R, protilátky proti' ίΤβ-R a protilátky proti LT ligandům. Takové inhibující přípravky výhodně obsahují farmaceuticky přijatelný nosič.

Subjektem je výhodně savec, nejvýhodněji člověk.

Přípravek podle vynálezu se podává subjektu, dokud není patrný ústup nebo zastavení růstu nádoru. Doba léčení je tedy velmi proměnlivá a může být od několika týdnů po několik měsíců, v některých případech i značně delší. Odborník je schopen určit, kdy došlo k ústupu nebo zastavení růstu nádoru, a lze k tomu užít jakoukoli v oboru známou metodu.

• · · · · ·· ·· » · · • ··· ·· *··· ···· ·· ·· »« • Φ · 4 • · · · • · · · <

,·..·♦ « ·· ·*

Použití markérů FACS k rozdělení B lymfomů se značně zlepšilo a lze očekávat, že lymofomy jistých subtypů bude možné zvládat terapií pomocí přípravků podle předkládaného vynálezu.

Je pravděpodobné, že také další regulační molekuly imunitního systému, jako jsou např. ostatní členy rodiny TNF, se podílejí na udržování architektury orgánů imunitního systému a tudíž přispívají k vytváření prostředí vhodného k proliferaci· lymfomů. Tudíž kombinování inhibice LT dráhy s dalšími drahami může být účinným prostředkem k léčení některých subjektů. Tak např. je možné užít inhibitorů LT dráhy v kombinaci např. s činidlem blokujícím CD40/ligand CD40 dráhu. Může to být jakékoliv činidlo blokující tuto dráhu, tedy např. protilátky, rozpustné ligandy- nebo receptory. Je výhodné podávat protilátky proti ligandů CD40 ^;v kombinaci s inhibitory LT. dráhy. Pokud se podává více než· jedno činidlo blokující dráhu členů TNF rodiny, přípravky je možné podávat v podstatě současně, nebo střídavě, jedno činidlo po druhém. Odborník snadno určí nejúčinnější způsob pro léčení konkrétního pacienta v závislosti na nádoru, jaký je léčen a stavu pacienta.

Konvenční chemoterapeutické protokoly se mohou - užít k eliminaci zbytků nádoru po léčení přípravky podle předkládaného vynálezu, nebo je lze v některých případech použít- současně nebo také před přípravky podle vynálezu. Inhibitory LT dráhy lze užít k zastavení'růstu lymfomů před tím, než se nastoupí konvenční chemoterapeutický režim. Je pravděpodobné,, že ztráta signálů podporujících růst a/nebo přežívání způsobí, že lymfom se stane citlivější k chemoťerautickým činidlům, a tudíž je výhodné podávat inhibitory LT dráhy před podáváním tradičních chemoterapeutických činidel.

• · ’ ·

0··· • · · · • · ·

• 9 9 9 9

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Léčení nádorů SJL RCS inhibitory LT dráhy redukuje LN/velikost nádoru

- Myši SJL byly léčeny buďto 3 dny před transplantací nádoru (D-3) , nebo v době transplantace (DO) a nebo 3 dny po transplantaci (D3) podáním 0,3 až 0,4' mg fúzního proteinu myší LTBR-hlgGl intraperitoneálním způsobem. Transplantace nádoru byla provedena ’ v podstatě jak bylo popsáno v (⁹) . •5 x 10⁶ buněk RCS zbavených T buněk bylo iv injikováno a ponecháno, aby se usadilo v orgánech a-začalo růst. Po 5 až 7 dnech mesenteriální, brachiální a axilární LN byly vyjmuty a byla stanovena jejich hmotnost a vyjádřena jako procento· celkové tělesné hmotnosti. Tabulka 1 ukazuje, že velikost uzlin byla snížena ve všech pokusech. Velikost sleziny byla také snížena v jednom ze 3 pokusů, ale toto snížení nebylo velké. Snížení hmotnosti LN bylo přibližně 50% s jediným podáním a 80 až 90 % při několikanásobném podání.

V jiném provedení vynálezu je potřeba podávat inhibitory LT dráhy současně s radiační terapií, nebo před a nebo po této terapii. Odborníkovi je přitom zřejmé, že výhodná terapie je založena na posouzení individuálních charakteristik jako je stav pacienta a typ nádoru, který je léčen.

Inhibující protilátky anti-LTP-R a jiná činidla blokující LTp-R lze identifikovat způsobem, který byl již dříve popsán (v současně projednávané přihlášce USA Č. 08/378 968) .

44

4*9 ·

4 4 4 • 4 4 4 4

4 4 4

44 • 4

- 16 • 4 9« • 44 • 4 ·· • · • . 4

4444 44

Tabulka 1

Inhibiční účinek LTBR-Ig na růst RCS u normálních myší SJL

Injikování myši (den:dávka v mg)	Hmotnost LN ^a (n)	P '	Hmotnost sleziny ³	P
Experiment 1
kontrolní hulgG' (utraceny D5)	2,70±0,37 (7)		3,18±0,37(7)
mLTpR-Ig^c(DO,+3:0,4, 0,3)	1,42±0,15(4)	< 0,001	3,29±0,18 (4)	NS ^D
Experiment 2
kontrolní hulgG (utraceny D7)	3,35+0,21 (3)		4,04±0,34(3)
mLTpR-Ig (DO,+3:0,3, 0,2)	2,37±0,24 (4)	0,0024	3,04±0,19(4)	0,004Í
Experiment 3
kontrolní hulgG (utraceny D6)	2, 34±0,11 (5)		2, 93±0,57 (5)
mLTpR-Ig (D-3:0,4)	1, 10+0,38 (3)	0,0024	2,27±1, 39(3).	NS
mLTpR-Ig (D-3,0:0,4, 0,3)	0, 78±0,.02 (3)	<0,0001	3, 95±0,53 (3)	0,046Ť
mLTpR-Ig (D0:0,3)	0,92±0,10(3)	<0,0001	3,25+0,1 (3)	NS

^a Hmotnost orgánu je vyjádřena v procentech celkové tělesné hmotnosti. Hmotnost LN bez léčení je typicky .0,5 % tělesné hmotnosti.

^b NS = není. významný' ^c mLTPR-Ig je' fúzní protein extracelulární domény LT3R a úseků CH2 a CH3 hlgGl

Činidlo blokující LTp-R podle jednoho provedení tohoto vynálezu obsahuje rozpustnou molekulu ίΤβ receptoru. Sekvence extracelulárního úseku lidského LT-p-R, uvedená zde jako sekvence id. č. 1, kóduje doménu vážící ligand. Na základě znalosti sekvence id. č. 1 a využitím postupů rekombinantní DNA y oboru dobře známých, je možné klonovat funkční fragment

99 «

•« ** « · · • ·♦· • · · • · . · ··«· ·· <· ·♦·* • 9 · » ·

9 9 9

9 9

9

9 9 9 9 9

99 domény vázající ligand do vektoru a pak exprimovat ve vhodné hostitelské buňce, a tak připravit rozpustnou molekulu Ι,Τβ-R.

Rozpustné LTp receptory obsahující sekvenci aminokyselin uvedenou v sekvenci id. č. 1 se mohou připojit k jedné nebo více heterologní proteinové doméně (fúzní : doméně) , aby se zvýšila in vivo stabilita receptorového fúzního proteinu, nebo aby se modulovala jeho biologická aktivita nebo lokalizace.

Výhodně jsou použity k vytvoření receptorových fúzních proteinů stabilní plazmatické. proteiny, které mají typicky poločas oběhu větší než 20 hodin. Takové plazmatické proteiny jsou např. (ale výčet není omezující) imunoglobuliny, sérový albumin, lipoproteiny, apolipoproteiny a transferrin. Sekvence, které zaměří rozpustnou βΤβ-R molekulu do určitého buněčného nebo tkáňového typu, se mohou také připojit k doméně vázající ligand, aby se vytvořil specificky lokalizovaný rozpustný fúzní protein LTp-R.

Buď celý, nebo funkční úsek z extracelulární oblasti LTp-R obsahující doménu vázající ligand, se může fúzovat s konstantním úsekem imunoglobulinu, např. s Fc doménou těžkého řetězce lidského IgGl (Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46, 1995). Rozpustné'fúzní proteiny receptor-IgG jsou výhodné, jsou obecně užívaným imunologickým reagens a způsoby jejich přípravy jsou v oboru dobře známy, (viz např. patent USA č. 5 225 538, který je zahrnut formou odkazu).

Funkční doména vázající ligand ΙιΤβ-R se může fúzovat s Fc doménou imunoglobulinu (Ig) odvozeného z imunoglobulinu jiné .třídy či podtřídy než IgGl. Fc domény protilátek patřících do odlišných tříd nebo podtříd mohou aktivovat odlišné druhotné efektorové funkce. K aktivaci dojde, když se Fc doména naváže na vhodný receptor. Druhotné efektorové

- 18 funkce zahrnují např. schopnost aktivovat komplement, křížově reagovat s placentou nebo vázat různé proteiny mikroorganismů.

Pokud by bylo výhodné poškodit nebo usmrtit cílové buňky nesoucí LT- ligand, lze vybrat ' zvláště aktivní Fc doménu (IgGl) pro fúzní receptorový protein. Pokud by bylo žádoucí zacílit fúzní protein LTp-R-Fc na buňku, aniž by se aktivoval komplement, vybere se neaktivní Fc doména IgG4.

Mutace v Fc doméně, které redukují nebo zcela eliminují vazbu na Fc receptor a aktivaci komplementu,. byly popsány (Morrison, S., Annu. Rev. Immunol. 10: 239-265, 1992). Těchto mutací, ať už samotných nebo' v kombinaci, lze využít k optimalizaci aktivity Fc domén užitých pro vytvoření fúzního proteinu LTP-R-Fc.

Různé aminokyselinové zbytky tvořící spojovací bod ve fúzním proteinu receptcr-Ig ovlivňují strukturu, . stabilitu a tedy i konečnou biologickou aktivitu rozpustného ύΤβ receptorového fúzního proteinu. Jedna nebo více aminokyselin se může přidat k C-konci vybraného fragmentu LT3-R, a tak lze modifikovat spoj ovací bod ve vybrané fúzní doméně.

Také N-konec .fúzního proteinu ΤΤβ-R se může pozměnit tím, že se mění poloha, ve které je vybraný DNA fragment ύΤβ-R štěpen na svém 5'-konci, aby mohl být vložen do rekoffibinantního expresního vektoru. Stabilita a aktivita každého fúzního proteinu ύΤ-β-R se testuje a optimalizuje užitím, rutinních testů a také pomocí testu pro výběr činidla blokujících LTp-R, tak jak je popsán v této přihlášce.

Na základě sekvence ύΤβ-R domény vázající ligand uvnitř extracelulární domény lze vytvářet různé sekvenční varianty,, aby se modifikovala afinita rozpustného LT-β receptoru nebo fúzního proteinu pro LT ligand. Rozpustné molekuly ύΤβ-R

- 19 • · · · • · · • · ·· • · · · • · · • · · · · ·

• · • « · · • · · · • β. · · · • · · · ·♦ ·· podle vynálezu mohou soutěžit o navázání povrchového LT ligandu s endogenními receptory LTp-R na povrchu buněk. Dá ' se předpokládat, že jakákoliv rozpustná molekula obsahující doménu ύΤβ-R vázající ligand, která soutěží s povrchovými buněčnými receptory LTp o navázání LT ligandů, je blokující činidlo ve smyslu předkládaného vynálezu.

V jiném provedení tohoto vynálezu protilátky namířené proti lidskému ύΤβ receptoru (protilátka anti-LTP-R) působí jako činidlo blokující LTP-R. Protilátky anti-LTp-R podle předkládaného vynálezu jsou buďto polyklonálni nebo monoklonálni protilátky a lze. je modifikovat tak, aby bylo dosaženo optimální schopnosti blokovat signální dráhu LTP~R, jejich in vivo biologickou dostupnost, stabilitu nebo jiné potřebné znaky.

Polyklonálni protilátkové · sérum proti lidskému ΤΤβ receptoru se připraví konvenčním způsobem tak, že se zvíře jako např. koza, králík, potkan, křeček nebo myš. subkutánně injikuje lidským fúznim- proteinem ύΤβ receptor-Ig (viz příklad 1) v kompletním Freundově adjuváns, a poté následuje druhá- (spouštěcí) intraperitoneálni nebo subkutánni injekce s neúplným Freundovým adjuvans. Polyklonálni sérum obsahující požadované protilátky se testuje obvyklým imunochemickým způsobem.

Myší monoklonálni protilátky proti lidskému fúznímu proteinu LTβ receptor-Fc se připraví tak, jak bylo popsáno v příkladu 5 (USA přihláška původce č. 08/505 606). Hybridomová buněčná linie BD.A8.AB9, .která produkuje myší monoklonálni protilátku BDA8 namířenou proti lidskému ύΤβ-R byla uložena v American Type Culture Collection (ATCC, Rockvilie, MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 12. ledna 1995' pod přístupovým číslem CRL11964. Všechna omezení • · · · 999999 99 • 9 9 9

9 9.9

- 2.0 dostupnosti pro veřejnost takto uloženého vzorku budou zrušena, jakmile bude udělen patent.

Různé formy protilátek antí-LTP-R mohou být připraveny standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 349: 293-299, 1991). Například lze vytvořit chimérické protilátky, ve kterých jsou domény vázající antigen ze zvířecí protilátky spojeny s lidskou konstantní doménou (Cabilly a kol., US 4,816,567, Morrison a kol., Proč. Nati. Acad.' Sci. U.S.A. 81: 6851-6855, 1984)·. Při klinickém použití bylo pozorováno, že chimérické protilátky redukují imunitní reakci vyvolanou zvířecími .protilátkami použitými u člověka.

Kromě toho se mohou syntetizovat i rekombinantní humanizované protilátky rozpoznávající LTp-R. Humanizované protilátky jsou chimérické molekuly obsahující většinou· sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy úseky, odpovídající za specifickou vazbu s antigenem (např. WO 94/04679). Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, odpovídající protilátka se pak izoluje a odstraní se variabilní úsek zodpovědný za specifickou, vazbu s antigenem. Úsek, odvozený ze zvířecí molekuly, zodpovědný za specifickou vazbu s antigenem, se potom klonuje do vhodného místa v genu lidské protilátky, ze kterého byla odstraněna . oblast specificky vážící antigen. Humanizované protilátky minimalizují užití heterologních (mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách, a tudíž s mnohem menší, pravděpodobností vyvolávají nežádoucí· imunitní' odpověď ošetřovaného.

Různé třídy rekombinantních protilátek proti ύΤβ-R se mohou konstruovat jako chimérické nebo humanizované protilátky obsahující variabilní domény protilátek ant-LTp-R a lidských konstantních domén (CH1, CH2, CH3) izolovaných • · • · · · · ·

- 21 z různých tříd imunoglobulinů. Tak např., protilátky anti-LT3-R-IgM se zvýšenou valencí míst vázajících antigen lze připravit metodami rekombinantní DNA tak, že se klonuje místo vázající antigen do vektoru, který obsahuje konstantní oblast lidského T-řetězce (Arulanandam a kol., J. Exp. Med.. 177: 1439-1450,· 1993, Lané a kol., Eur. J. Immunol. 22: 2573-, 78, 1993, Traunecker'a kol., Nátuře 339: 68-70, 1989).

Navíc lze užít standardní techniky rekombinantní. DNA, aby se změnila afinita vazby rekombinantních protilátek s antigenem, a to tím', že se změní aminokyseliny sousedící s vazebným místem. Afinitu k antigenu u humanizovaných protilátek lze zvýšit mutagenezí založenou na molekulárním modelování (Queen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033, 1989, WO 94/04679).

Může být také třeba zvýšit nebo snížit afinitu protilátek' anti-LTp-R k LTp-R podle typu cílové tkáně nebo v závislosti na předpokládaném léčebném postupu. Tak např. z profylaktických důvodu může být výhodné ošetřovat pacienta tak, že .se použije konstantní .hladina anti-LTp-R se sníženou schopností přenášet signál v signální dráze LTP~R. Inhibiční anti-LTp-R se zvýšenou afinitou k LTP-R mohou být zase výhodné pro krátkodobé ošetřování.

Protilátky anti-LTp-R jako činidlo..blokující LTP~R . Protilátky anti-LTp-R, které působí jako činidlo blokující · LTP-R, se mohou selektovat testováním jejich schopnosti inhibovat LTp-R indukovanou cytotoxicitu pro nádorové buňky. Testování jiných protilátek namířených proti lidskému LTP receptoru rutinními metodami nebo testy zde popsanými lze identifikovat' další anti-LTp-R protilátky, které působí jako činidlo blokující LTp-R u člověka.

• · φ · · φ

ΦΦ ΦΦ • · · · • φ · ·

Φ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ • Φ ΦΦ

- 22 • · · φφφφ φ φ φ φ φ ·

ΦΦΦΦ 9Φ

Κ dalšímu výhodnému provedení předkládaného vynálezu .patří přípravky, které obsahují protilátky namířené proti LT ligand, které působí jako činidlo blokující· ύΤβ-R. Jak bylo již výše popsáno pro protilátky βηΙΐ-ΕΤβ-Η, protilátky anti-LT ligand, které působí -jako činidlo blokující· ΒΤβ-R, mohou být jak monoklonální tak polyklonální protilátky a mohou být rutinními postupy modifikovány, aby se modulovaly jejich vazebné vlastnosti pro antigen a jejich imungeničita.

Protilátky anti-LT podle předkládaného vynálezu mohou být namířeny individuálně proti jedné ze dvou podjednotek LT, a to včetně rozpustných, mutovaných, změněných nebo chimérických forem 3LT podjednotek. Pokud se užije podjednotek LT, je výhodné, když jsou to ΤΤβ podjednotky. Pokud se užijí LT-α podjednotky, je výhodné, když se výsledné anti-LTa protilátky váží s povrchovým LT ligandem a nereagují křížově se secernovaným LTa ani nemodulují aktivitu TNF-R.

Alternativně se mohou připravit protilátky namířené proti homomerickým (ΤΤβ) nebo heteromerickým (LTa/β) komplexům, složeným z jedné nebo více LT podjednotek, a pak testovat na aktivitu blokující LT0-R. Výhodně je jako antigen užit komplex ΤΤα1/β2. Jak bylo již zmíněno výše, je výhodné, když se výsledné anti-LTal^2 protilátky váží s povrchovým LT ligandem a nereagují křížově se secernovaným LTa ani nemodulují aktivitu TNF-R.

Produkce polyklonálních proti-lidských protilátek LTa je popsána v již podané patentové přihlášce původce WO 94/13808. Také. monoklonální protilátky anti-LTa a 3ηίί-ΤΤβ byly publikovány (Browning a kol., J. Immunol. 154·: 33-46, 1995).

« · • φ · ·

ΦΦΦΦ ·Ι

96/23071), fúze , ύΤβ např. WO polypeptidů,

Přípravky podle vynálezu :

Přípravky podle vynálezu obsahují jakékoliv sloučeniny, které blokují interakci ύΤβ s receptorem LT$ a tudíž inhibují signální dráhu LT. Ke sloučeninám anti-LT , patří jak polyklonální protilátky tak monoklonální protilátky (mAb), a také deriváty protilátek jako jsou chimérické molekuly, humanizované molekuly, molekuly s redukovanou efekťorovou funkcí, bispecifické molekuly a konjugáty protilátek.

Předkládaný· vynález . zahrnuje i molekuly anti-L^ a βηίί-ΣΤβ receptor jiných typů, jako jsou úplné -protilátkové fragmenty Fab, F(ab')₂ fragmenty, úseky V_H nebo úseky F_v, jednořetšzcové protilátky (viz polypeptidy, fúzní' konstrukty receptoru, malé molekuly jako např. malé semi-peptidové sloučeniny nebo sloučeniny jiné než peptidy, které jsou schopné blokovat LT dráhu. ,

Různé formy protilátek je možné připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 349: 293-299, 1991). Např. je možné konstruovat takové chimérické protilátky, kde vazebná doména pro antigen z protilátky zvířete je spojena s lidskou konstantní . doménou (Cabilly et al., patentová přihláška USA . č. 4 816 567) . Chimérické protilátky redukují pozorovanou imunitní odpověď vyvolanou zvířecím protilátkami, když jsou použity v klinických aplikacích pro lidské pacienty.

Kromě toho se mohou syntetizovat rekombinantní humanizované protilátky. Takovéto humanizované protilátky jsou protilátky, původně získané ze savce jiného než člověka, kde byly metody genové inženýrství využity k nahrazení některých nebo všech aminokyselin, které nejsou nutné pro vazbu antigenu aminokyselinami z odpovídajících úseků lehkého nebo těžkého řetězce lidského imunoglobulinu (chiméry • 9

9

- 24 obsahují hlavně sekvence IgG, do nichž byly vloženy úseky zodpovědných za specifickou vazbu antigenu, viz např. mezinárodní . patentová přihláška WO 94/04679) . Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, pak se izoluje příslušná' protilátka zodpovědná a odstraní se z ní část variabilního úseku za specifickou vazbu . antigenu. Úsek vázající antigen ze zvířete se pak klonuje do vhodného místa genu lidské protilátky, ze kterého byl odstraněn úsek vázající antigen. Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (tj . mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách, které pak s menší pravděpodobností vyvolají imunitní odpověď u léčeného pacienta.

Podle předkládaného vynálezu jsou také užitečné protilátky primátů nebo tzv. primatizované protilátky.

V přípravcích podle předkládaného vynálezu se mohou také užít protilátkové fragmenty nebo univalentní protilátky. Univalentní protilátky obsahují dimer těžký řetězce/lehký řetězec vázaný k úseku Fc (tzv. stonku) druhého těžkého řetězce. Úseky Fab jsou takové úseky obou řetězců, které jsou přibližně shodné nebo analogické se sekvencemi obsahujícími větvící se úsek tvaru Y těžkého řetězce a celé lehké řetězce, a které dohromady (jako agregáty) vykazují .protilátkovou aktivitu. Protein Fab. obsahuje agregáty jednoho těžkého a jednoho lehkého řetězce (všeobecně známé jako Fab') a také tetramery, které odpovídají dvouramenným segmentům protilátky tvaru Y (všeobecně známé jako F(ab)₂), ať už jsou kovalentně či nekovalentně agregovány, pokud jsou agregáty schopny selektivní reakce s konkrétním, antigenem nebo rodinou antigenu.

Kromě toho. lze použít standardní techniky rekombinantní DNA pro změnu vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny tím, že se změní zbytky aminokyselin ·

- 25 « «

0

0 0· • 000 0 1 v blízkosti vazebného místa pro antigen.

Subjekty

I

Subjekty, pro které je určen přípravek podle předkládaného vynálezu, trpí folikulárním lymfomem.

Způsoby podávání

Přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být podávány jakýmkoliv způsobem, který je lékařsky přijatelný.. K takovým · způsobům podávání patří injekční parenterální podávání, a sice intravenózní, intravaskulární, intraarteriální, subkutánní, intramuskulární, intraperitoneální, intratumorové, intreperitoneální, intraventrikulární, intraepidurální. Jsou také vhodné další způsoby jako je perorální, nazální, oftalmický, rektální nebo topický. Lékové formy s prodlouženým uvolňováním léčiva jsou zvláště výhodné, - např. depotní injekce. Některé formy činidel blokujících LT mohou být vhodné pro perorální podává a mohou být formulovány do suspenzí nebo pilulek.

Dávkování a frekvence podávání

Velikost dávky a frekvence dávek konkrétní sloučeniny podávané pacientovi k léčení určité nemoci posoudí ošetřující lékař na základě celé řady faktorů. Obecné dávkování je stanoveno v klinických testech, které zahrnují extenzivní experimenty ke stanovení prospěšného účinku a vedlejších nežádoucích účinků při různých dávkách pacientovi. Ale i když takovéto doporučení existuje, ošetřující lékař často mění takové dávkování na základě úvahy týkající se pacientova věku, zdravotního stavu, hmotnosti, pohlaví a případné současné léčby jinými přípravky. Stanovení optimální dávky konkrétního přípravku blokujícího LT k léčení folikulárního flfl flfl ·· « fl fl fl « fl · ·· · » * · flflfl · • fl fl flfl • flflfl flfl · · • flflfl <· flfl • * 9 · · * ♦ · · fl • · · . · · · • · · · fl • flfl flfl

- 2 6 lymfomu je tedy v kompetenci, odborníka v oboru medicíny a farmacie.

Obecně je frekvence dávek stanovena ošetřujícím lékařem, a může jít o jednotlivou dávku nebo opakované dávky, buďto, denně nebo v intervalech 2 až 6 dnů, týdne, dvou týdnů nebo měsíce.

Při kombinované terapii podle předkládaného, vynálezu se užívají k léčení folikulárního lymfomu jiné přípravky nebo prostředky zaměřené na takový lymfom, jako je ozařování, chemoterapie a jiné způsoby léčení odborníkům známé.

Sloučenina blokující LT podle předkládaného vynálezu se pacientovi podává jako farmaceutický přípravek, který obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič. Tento nosič je pro pacienta netoxický a inertní v koncentracích nutných pro účinek blokující sloučeniny nebo jiné účinné látky, takže vedlejší účinky nosiče nijak neoslabují působení účinné látky. Přípravek může obsahovat- i další kompatibilní látky, což znamená takové složky, které jsou schopny míšení se sloučeninou blokující LT, aniž by došlo k podstatnému snížení terapeutickou účinnost léčiva. Přípravky podle předkládaného vynálezu vhodné pro perorální podávání mohou být v podobě oddělených jednotek jako jsou tobolky, tablety, pilulky pastilky a papírové sáčky, obsahující předem stanovené účinné látky v podobě prášku nebo granulátu, nebo jako liposomy, suspense ve vodné nebo jiné kapalině jakožto sirup, nebo elixír, emulze nebo výtažek.

Přípravek podle předkládaného vynálezu může být v nádobce, která zajišťuje sterilitu a ochraňuje aktivitu účinné látky po dobu distribuce a skladování a současně umožňuje pohodlný a účinný způsob . podání přípravku pacientovi. Sloučeniny blokující LT formulované pro injekční podávání mohou být dodávány v uzavřené lahvičce vhodné pro *♦ ··· • · • · · • · · · · 9 4 • · · · · 4

4994 49 44 ·

- 27 ··· ♦ 4 9 4

9 9 4

9 4 4

4 4 9 • 4 49 odebrání obsahu pomocí injekční stříkačky s jehlou. Taková lahvička je buďto pro jedno nebo pro opakované použití. Přípravek se může dodávat také ve formě předem naplněné injekční stříkačky. V některých , případech je přípravek formulován jako kapalný, jindy je v suchém nebo lyofilizovaném stavu a vyžaduje rekonstituci standardním nebo současně, dodávaným ředidlem. Pokud se přípravek dodává jako kapalný přípravek pro intravenózní podávání, může. být v sterilním vaku nebo kontejneru . vhodném k napojení na soupravu pro intravenózní podávání nebo katetr. V případě, že se blokující sloučenina podává v perorální formě jako tablety nebo pilulky, je ve skleněné lahvi/kontejneru s odnímatelným uzávěrem. Kontejner je označen údaji jako je jméno sloučeniny, o kterou se jedná, jméno výrobce nebo distributora, indikace, dávkování a další instrukce pro vhodné skladování nebo podávání.

- 2.8 • 9 99 • 99 · 9

999 99

9 9 9 9 9

9-9 9 9

9999 99 99 • ·

9 9

9 ·

9 9

Citovaná literatura

1. Tsiagbe, V.K., Inghirami, G. & Thorbecke, G.J. The physiology of germinal centers. Crit Rev Immunol 16, 381-421 (1996).

2. Freedman, A.S. & Nadler, L.M. in Cancer Medicine 3rdEd. (ed. Holland, J.F.e.a.) 2028-2068 (Lea&Febiger, London, 1994).

3. Lásky, J.L., Ponzio, N.M. & Thorbecke, G.J. Characterization and growth factor requirements of SJL lymphomas. I. Development of a B cell growth factor-dependent in vitro cell line, cRCS-X (published erratum appears in J Immunol 1988 Apr 1 ;140(7):2478], J Immunol 140, 679-87 (1988).

4. Lásky; J.L. & Thorbecke, G.J. Characterization and growth factor requirements of SJL lymphomas. II. Interleukin 5 dependence of the in vitro cell line, cRCS-X, and influence of other cytokines. Eur J Immunol 19, 365-71 (1989).

5. Ponzio, N.M., Brown, P.H. & Thorbecke, G.J. Host-tumor Interactions in the SJL lymphoma model. Iniem. Rev. immunol. 1, 273-301 (1986).

6. Tsiagbe, V.K., et al. Syngeneic response to SJL follicular center B cell lymphoma (reticular cel! sarcoma) cells is primarily in V beta 16+ CD4+ T cells. J Immunol 150, 5519-28 (1993).

7. Matsumoto, M., et al. Distinct roles of lymphotoxin alpha and the type I tumor necrosis factor (TNF) receptor in the establishment of follicular dendritic cells from nonbone marrow-derived cells. J Exp Med 186, 1997-2004(1997).

8. Mackay, F., Majeau, G.R., Lawton, P„ Hochman, P.S. & Browning, J.L. Lymphotoxin but not tumor necrosis factor functions to maintain splenic architecture and humoral responsiveness in adult mice. Eur J Immunol 27, 2033-42 (1997).

9. Katz, I.R., Chapman-AIexander, J., Jacobson, E.B., Lerman, S.P. & Thorbecke, G.J. Growth of SJIVJ derived transplantable reticulum cell sarcóma as related to its ability to induce T-cell proliferation in the host. III. Studies on thymectomized and congenitally athymic SJL mice. Cellular Immunol. 65, 84-92 (1981).

• * · · fe · • ·

- 29 • · • · · • fefefe • fe fefe • fefe •fefefe ·· • fe • fe • · « fe • · « fe fe fe • fe • fe fe · • fe • · • fe fe · • fe • · fefe

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM' 1:

(i) . CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 197 aminokyselin.

(B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi)- POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Čil:

Ser Gin Pro Gin Ala Val Pro Pro 1 5

Arg Asp Gin Glu Lys Glu Tyr Tyr 20 .

Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr 35 40

Arg Asp Thr Val Cys Ala Thr Cys 50 55

Trp. Asn Tyr Leu Thr Ile Cys Gin 65 70

Met Gly Leu Glu Glu Ile Ala Pro 85

Cys Arg Cys Gin Pro Gly Met Phe 100

Thr His Cys Glu Leu Leu Ser Asp 115 120

Tyr Ala Ser Glu Asn Gin Thr Cys 10 15

Glu Pro Gin His Arg Ile Cys Cys 25 30

Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg Ι,ΐβ: 45 .

Ala Glu Asn Ser Τ'/r Asn Glu His 60

Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Val 75 80

Cys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gin 9 0 9 5

Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys 105 ' 110

Cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu

125 ·· • 9

9

- 30 ·· • ··· · « • · 9 9 9 9

9 9 9 9

9999 9.9 99

9

9 «

··

Leu Lys Asp Glu Val Gly Lys Gly Asn Asn His Cys Val Pro Cys Lys 130 135 140

Ala Gly His Phe Gin Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ala Arg Cys Gin Pro

145 150 155 X,

His Thr Arg Cys Glu Asn Gin Gly Leu Val Glu Ala Ala Pro Gly Thr

165 170 175

Ala Gin Ser Asp Thr Thr Cys Lys Asn Pro Leu Glu Pro Leu Pro Pro ISO 185 190

Glu Met Ser Gly Thr 195 *·' φφφφ ?/ ΙθΜ>- MS7 φφ φφ φφφ φ φφφ φφφ φφφφ φ φ φφφ φφ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

φ φ φ φ φφ φφ

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití sloučeniny, která inhibuje interakci mezi LT0 a jeho receptorem, pro výrobu farmaceutického přípravku k zastavení nebo zpomalení rozvoje, závažnosti nebo vlivu nádoru, přičemž subjektu se podává přípravek v účinném množství.
2. Použití podle nároku 1, kdy nádor je folikulární lymfom.
3. Použití podle nároku 2, kdy sloučenina je vybrána ze skupiny obsahující .rozpustný Ι,Τβ ' receptor, protilátky anti-LTcc, protilátky anti-LTP a protilátky anti-LTp-R.

Použití podle nároku 3 receptor.

Použití podle nároku 1,

Použití podle nároku 5, kdy sloučenina kdy subjektem je kdy subjektem je je rozpustný ΙιΤβ savec.

člověk.
7. Použití podle nároku 4, kdy rozpustný Γ,Τβ receptor obsahuje- doménu vázající ligand, která se selektivně váže k povrchovému LT ligandů.'
8. Použití podle nároku 7, kdy rozpustný ΕΤβ receptor obsahuje FC doménu lidského, imunoglobulinu.
9. Použití podle nároku 3,' kdy přípravek obsahuje monoklonální protilátku namířenou proti ΕΤβ receptoru.

»0 0000

- 32 0 0 0 0 0 • 000 0 0 • · 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0000 00 ·«

0 0 0 *

00 ' 0 0 0

0 0 0 • 0 0 • 00
10. Použití podle nároku 9, kdy monoklonální protilátka je humanizovaná nebo chimérická protilátka.
11. Farmaceutický přípravek k léčení subjektu trpícího folikulárním lymfomem vyznačuj ící s .e t í m, že obsahuje sloučeninu, která blokuje interakci LT3 s jeho receptorem.
12. Použití podle nároku 1, kdy se subjektu podává alespoň jeden chemoterapeutický přípravek.
13. Použití podle nároku 1, kdy se subjektu podává inhibitor další TNF signální dráhy.
14. Použití podle nároku 13, kdy se podává přípravek inhibujíci dráhu CD40/CD40 ligand.
15. Použití podle nároku 14, kdy se podává protilátka anti-CD40 ligand.
16. Použití podle nároku 1, kdy je subjekt.léčen ozařováním.
17. Použití podle nároku 1, kdy je subjekt léčen ještě ozařováním nebo transplantací kostní dřeně.'

IS. Použití sloučeniny, která je inhibitorem interakce mezi LTp a jeho receptorem, pro 7 výrobu farmaceutického přípravku k pozměnění přežívání nebo udržování folikulárních dendritických buněk.

φφ φφ • · · • ··· • · φ • · φ • ΦΦΦ 99 ·» ΦΦ·Φ * · · ♦ * Φ • · · Φ • · · ·· β ·· ΦΦ • ·» · • Φ Φ Φ • Φ « » • · · Φ ·· ΦΦ

- 33 19. Použití sloučeniny, která inhibuje interakci mezi LTp a jeho receptdrem, pro výrobu farmaceutického přípravku k pozměnění architektury orgánů . imunitního systému, přičemž se současně podává inhibitor signální dráhy dalšího členu rodiny TNF ligandů a receptorů.