SK11302000A3

SK11302000A3 - Použitie činidla inhibujúceho interakciu lt-beta a jeho receptora na výrobu prípravku na liečenie folikulárneho lymfómu

Info

Publication number: SK11302000A3
Application number: SK1130-2000A
Authority: SK
Inventors: Jeffrey Browning; Jeanette Thorbecke; Vincent Tsiagbe
Original assignee: Biogen, Inc.; New York University
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2001-01-18
Also published as: ES2211035T3; PT1051187E; KR100622960B1; IS5570A; DK1051187T3; IL137489A0; CZ20002751A3; AU2348899A; SK285725B6; CN1287853C; JP2010235621A; EP1051187B1; EE05235B1; PL203279B1; DE69912743T2; NO20003848L; WO1999038525A1; CZ301026B6; NZ506529A; EA003862B1

Description

Použitie činidla inhibujúceho interakciu LT-β a jeho receptora na výrobu prípravku na liečenie folikulárneho lymfómu

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutických prípravkov, obsahujúcich inhibítory lymfotoxínovej signálnej dráhy. Tieto prípravky sú užitočné na liečenie lymfómov, ktoré pochádzajú z germinálnych centier (folikulárnych lymfómov).

Doterajší stav techniky

Cytokíny príbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF, „Tumor Necrosis Factor) sú mediátory hostiteľskej obrannej a imunitnej regulácie. Členovia tejto proteínovej rodiny sa vyskytujú vo forme ukotvenej na bunkovú membránu, keď pôsobia lokálne prostredníctvom vzájomného kontaktu medzi bunkami, alebo sa vyskytujú ako vylučované proteíny, ktoré sú schopné difundovať k vzdialenejším cieľom. Paralelná rodina receptorov upozorňuje na výskyt týchto molekúl, ktoré vedú k iniciácii bunkovej smrti alebo bunkovej proliferácie a diferenciácie v cieľovom tkanive. V súčasnosti rodina TNF ligandov a receptorov obsahuje najmenej 11 známych párov receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-oí:TNF-R, LT-α/β: ΣΤ-β-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:CD27, OX40L:OX40 a 4-1BBL:4-1BB.

Členovia TNF rodiny sa môžu najlepšie opísať ako hlavné prepínače v imunitnom systéme na riadenie prežívania buniek a diferenciácie. V súčasnosti sú známe iba dva secernované cytokíny, a síce TNF a LTa, na rozdiel od väčšiny ostatných členov rodiny TNF zakotvených v membráne. Zatiaľ čo membránové formy TNF sa podrobne charakterizovali a pravdepodobne majú jedinečnú biologickú funkciu, funkciou secernovaných TNF je všeobecná signalizácia „poplachu bunkám vzdialeným od miesta, kde bola príslušnú udalosť vyvolaná. Sekrécia TNF môže znásobiť udalosť vedúcu k dobre známym zmenám vo výstelke ciev a v bunkách v mieste zápalu. Naproti tomu členovia TNF rodiny viazané na membránu predávajú signál prostredníctvom receptora typu TNF iba bunkám v priamom kontakte. Tak napr. pomocné T bunky poskytujú „pomoc sprostredkovanú CD40 iba takým B bunkám, s ktorými sa dostanú do priameho kontaktu prostredníctvom interakcií TCR. Podobné obmedzenia na bezprostredný bunkový kontakt sa týkajú schopnosti indukovať bunkovú smrť v dobre preskúmanom systéme Fas.

Väčšina komplexov LTot/β asociovaných s membránou („povrchové LT) má stechiometriu ΣΤα1/β2 (Browning a kol., Celí 72: 847856, 1993, Browning a kol·., J. Immunol. 154: 33- 46, 1995). Povrchové LT ligandy sa neviažu na TNF-R s vysokou afinitou a neaktivujú signálnu dráhu TNF-R. Avšak ΒΤβ receptor (LT6-R) viaže tieto povrchové lymfotoxínové komplexy s vysokou afinitou (Crowe a kol., Science 264: 707-710, 1994).

Signalizácia ΕΤβ-R, podobne ako signalizácia TNF-R, má antiproliferatívny účinok a môže mať cytotoxický účinok na nádorové bunky. V súčasne prejednávanej patentovej prihláške autorov predkladaného vynálezu (prihláška US 08/378 968) sa opisujú prípravky a spôsoby selektívnej stimulácie LTp-R pomocou činidla aktivujúceho υΤβ-R. Agens aktivujúci ΤΤβ-R je užitočný na inhibíciu rastu nádorových buniek bez toho, aby súčasne viedol k aktivácii zápalovej reakcie alebo imunoregulačnej dráhy indukovanej TNF-R.

Súčasný výskum génového zameriavania („gene targeting) predpokladá úlohu LTa/β vo vývoji sekundárnych lymfatických orgánov (Banks a kol., J. Immunol. 155, 1685-1693, 1995, De Togni a kol., Science 264, 703-706, 1994). Myši s deficitom LTot naozaj nemajú lymfatické uzliny (LN) a Peyerove ostrovčeky (PP). Ich sleziny majú narušenú architektúru a expresia funkčných markerov na bunkách marginálnej zóny sleziny je pozmenená (Banks a kol., 1995, De Togni a kol., 1994, Matsumoto a kol., Science 271, 1289-1291, 1996). Žiadna z týchto vlastností sa nepopísala u myší s geneticky vyradenou funkciou („knock out) TNF receptora (Erickson a kol., Náture 372, 560-563, 1994, Pfeffer a kol., Celí 73, 457-467, 1993, Rothe a kol., Náture 364, 798802, 1993). Autor vynálezu nedávno definoval úlohu membránových komplexov LTa/β vo vývoji sekundárnych lymfatických orgánov tým, že ukázal, že potomstvu myší, ktorým sa v priebehu gestácie injekčné podala rozpustná forma ΏΤβ-R fúzovaného s úsekom Fc ľudského IgGl (LTp-R-Ig) chýbala väčšina lymfatických uzlín a mali narušenú architektúru sleziny (Rennert a kol., 1996, Surface lymphotoxin alpha/beta complex is required for the development of peripheral lymphoid organs, J. Exp. Med. 184, 1999-2006). V inej štúdii sa ukázalo, že transgénne myši s podobným konštruktom LTp-R-Ig, ktorého expresia začala tri dni po narodení, mali lymfatické uzliny. Ale mali narušenú architektúru sleziny a niekoľko markerov slezinovej marginálnej zóny sa neexprimovalo (Ettinger a kol., Disrupted splenic architecture, but normál lymph node development in mice expressing a soluble LTp-R/ľgGl fusion proteín, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13102-7). Tieto údaje spoločne ukazujú, že tu existuje dočasná požiadavka na membránové funkcie LT na sprostredkovanie účinkov na vývoj sekundárnych lymfatických orgánov, ale bez účinku na architektúru sleziny.

Systém TNF sa tiež zúčastňuje vývinu sleziny. Bunky marginálnej zóny sleziny myší s deficienciou

TNF neexprimujú makrofágové markery alebo MAdCAM-1 (Alexopoulou a kol., 60th

Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 228, 1996, Pasparakis a kol., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 239, 1996) . Myšiam s deficienciou TNF-R55 taktiež chýba MAdCAM-1 (ale nie MOMA-1) v marginálnej zóne sleziny (Neumann a kol·., J. Exp. Med. 184, 259-264, 1996, Matsumoto a kol., Science 271, 1289

1291, 1996).

Lymfatické tkanivo alebo tkanivo podobného typu nevzniká iba v priebehu vývinu, ale taktiež pri určitých patologických stavoch, ako sú napr. chronické zápaly, v procese nazývanom neolymfoorganogenéza (Picker a Butcher, Annu. Rev. Immunol. 10,

561-591, 1992, Kratz a kol., J. Exp. Med. 183, 1461-1471, 1996). Tieto procesy sú zjavne ovplyvňované členmi rodiny TNF. U transgénnych myši s génom LTa riadeným promótorom génu inzulínu potkana (RIP-LT) sa vyvinuli chronické zápalové lézie s charakterom organizovaného lymfatického tkaniva (Kratz a kol., J. Exp. Med. 1183, 1461-1471, 19965, Picarella a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10036-10040, 1992).

Vyhodnotenie funkcie LT v priebehu imunitnej odpovede závislej na T bunkách pomocou myší s deficienciou LTa ukázalo na nutnosť LT na vytváranie GC, a zrejme taktiež na udržovanie organizovanej štruktúry folikulárnych dendritických buniek (FDC) a na imunitnú humorálnu odpoveď (Banks a kol., J. Immunol. 155, 1685-1693, 1995, Matsumoto a kol., Science 271, 1289-1291, 1996, Matsumoto a kol., Náture 382, 462-466, 1996). Myšiam s deficienciou v TNF-R55 taktiež chýbal FDC, nevyvíja sa u nich GC a nie sú schopné optimálnej imunitnej odpovede na ovčie červené krvinky (SRBC). To naznačuje, že TNF-R55 sa môže spustiť rozpustným signálom LT alebo TNF vo väčšine takýchto odpovedí (LeHir a kol., J. Exp. Med. 183, 2367-2372, 1996, Alexopoulou a kol., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 228, 1996, Pasparakis a kol., 60th Int. TNF Congress, Eur. Cytokine Network, 239, 1996).

Receptor LT£, člen rodiny receptorov TNF, špecificky viaže povrchové LT ligandy. LTp-R viaže heteromerické LT komplexy (prevažne LTal/p2 a LTa2/pi), ale neviaže ani TNF ani LTa (Crowe a kol., Science 264: 707-710, 1994). mRNA pre LTp-R sa našla v ľudskej slezine, brzlíku i v ďalších orgánoch spojených s imunitou. Hoci výskum expresie LT£-R je iba v počiatočnej fáze, profil expresie ΣΤβ-R je podobný profilu p55-TNF-R, s tým rozdielom, že ΕΤβ-R chýba na T a B bunkách periférnej krvi a na líniách T a B buniek.

Komplexy povrchových lymfotoxínov (LT) sa charakterizovali v hybridómových T bunkách CD4⁺ (11-23.D7), ktoré exprimujú vysokú hladinu LT (Browning a kol., J. Immunol. 147: 1230-1237, 1991,

Androlewicz a kol., J. Biol. Chem. 267: 2542-2547, 1992). Expresia a biologická funkcia LTp-R, LT podjednotiek a povrchových LT komplexov sa opísala v prehľade Ware, C.F., „The ligands and receptors of the lymphotoxin systém, v: Pathways for Cytolysis. Current Topics Microbiol. Immunol. SpringerVerlag, str. 175-218, 1995, ktorý je zahrnutý vo forme odkazu.

Expresia LTa sa indukuje a LTa sa primárne secernuje aktivovanými T a B lymfocytmi a cytotoxickými „zabijačskými bunkami (NK, „natural killer). LTa sa produkuje v rámci pomocných T buniek podskupinou Thl, ale v žiadnom prípade nie podskupinou Th2 buniek. LTa sa taktiež našiel v melanocytoch. Mikroglie a T bunky v léziách pacientov so sklerózou multiplex reagujú pozitívne s antisérom anti-LTa (Selmaj a kol., J. Clin. Invest. 87, 949-954, 1991).

Lymfotoxín β (nazývaný taktiež p33) sa exprimuje na povrchu myších i ľudských T lymfocytov, línií T buniek, línií B buniek a „zabijačských buniek aktivovaných lymfokínom (LAK). ίΤβ je predmetom súčasne prejednávaných patentových prihlášok rovnakých autorov, a síce PCT/US91/04588, publikované 9. januára 1992 ako dokument WO 92/00329, a PCT/US93/11669, publikované 23. júna 1994 ako WO 94/13808, ktoré sú zahrnuté vo forme odkazu.

Povrchové LT komplexy sa exprimujú primárne aktivovanými T lymfocytmi (pomocnými, Thl i zabijačskými bunkami) a B lymfocytmi a zabijačskými bunkami, ako sa dá ukázať analýzou pomocou FACS alebo imunohistologickou analýzou pomocou protilátok anti-LT alebo rozpustných fúznych proteinov ΕΤβ-Κ-Εο. V prejednávanej prihláške rovnakého autora US 08/505 606 podanej

21. júla 1995 sa opísali prípravky a spôsoby používajúce rozpustné ΕΤβ receptory a protilátky špecifické proti ΕΤβ receptoru a ligandu ako liečivo na liečenie imunitných chorôb sprostredkovaných Thl bunkami. Povrchové LT sa taktiež našli na klonoch ľudských cytotoxických T lymfocytov (CTL), v aktivovaných periférnych mononukleárnych lymfocytoch (PML), lymfocytoch periférnej krvi aktivovaných IL-2 (LAK), periférnych

B lymfocytoch aktivovaných buď mitogénom z Phytolacca americiana alebo anti-CD40 (PBL), a na rôznych T a B bunkách pochádzajúcich z lymfoidných nádorov. Zapojenie cieľových buniek nesúcich aloantigén špecificky indukuje expresiu povrchových LT u klonov CD4⁺ a CD8⁺ CTL.

Autori vynálezu opísali niekoľko imunologických funkcií povrchového LT a ukázal sa vplyv LTa/β väzobného činidla na vyvolanie a charakter imunoglobulínovej odpovede, udržovanie bunkovej organizácie sekundárneho lymfatického tkaniva vrátane účinku na diferenciačný stav folikulárnych dendritických buniek a vytváranie germinálnych centier, a taktiež na úroveň expresie adresínov, ktorá ovplyvňuje bunkový transport. Autor tak definoval terapeutické využitie väzobných činidiel povrchových LTa/β a LTa receptorov.

Štúdie ukázali, že B bunky sú aktivované v lymfatických uzlinách (LN) a v slezine po stretnutí s rôznymi antigénmi. V špecializovaných štruktúrach LN a sleziny, ktoré sa nazývajú germinálne centrá, kde sa tvoria oblasti bohaté na B bunky, B bunky dozrievajú a tvoria sa pamäťové B bunky (¹) . B bunky sú schopné nádorovej transformácie počas väčšiny svojho vývinu (²) . Transformácia B buniek vedie k lymfómom, a lymfómy pochádzajúce z B buniek germinálnych centier sa nazývajú folikulárne lymfómy. Presné vymedzenie rôznych druhov lymfómov sa stále vykonáva a spresňuje, pretože sa nachádza stále viac povrchových markerov, ktoré umožňujú presnejšie stanovenie pôvodu buniek. Folikulárne lymfómy je možné rozdeliť do mnohých podskupín na základe štádia alebo typu B buniek, ktoré sa delia, a taktiež prognóza sa veľmi líši v závislosti od typu buniek. Konvenčné chemoterapeutické režimy sú schopné pomôcť a liečiť pacientov s bunkami nízkeho stupňa. Napriek tomu sú niektorí z týchto pacientov rezistentní k chemoterapii a majú zlú prognózu.

Napriek pokrokom v liečení nádorov stále pretrváva potreba nových prístupov v liečení nádorov, najmä rezistentných k chemoterapii a taktiež potreba nových liečebných režimov s menšími vedľajšími účinkami, než majú súčasné terapie.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je použitie zlúčeniny, ktorá inhibuje interakciu ύΤβ s receptorom, na výrobu lieku na liečbu nádorov. Predkladaný vynález poskytuje prípravky na liečbu nádorov ako sú folikulárne lymfómy. Tieto nové lieky majú značné výhody v porovnaní s doteraz známymi liekmi a ponúkajú možnosť alternatívnej terapie v prípade nádorov rezistentných k súčasnej chemoterapii.

Výhodné uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka liečenia subjektu, ktorý trpí folikulárnym lymfómom, keď sa subjektu podáva účinné množstvo prípravku, ktorý blokuje interakciu heteroméru LTa/β s receptorom. Podľa výhodných uskutočnení vynálezu prípravky obsahujú, pričom výpočet nie je obmedzujúci, rozpustné receptory lymfotoxínu β, protilátky namierené proti ΣΤβ receptorom a protilátky namierené proti povrchovým LT ligandom. Výhodnejšími sú rozpustné receptory lymfotoxínu β, ktoré majú väzobnú doménu ligandu, ktorá môže selektívne viazať povrchový LT ligand, ako je napr. rozpustná forma ΤΤβ-R fuzovaná s Fc doménou humánneho imunoglobulínu. Okrem toho k výhodným prípravkom patria monoklonálne protilátky, ktoré sú namierené proti LT3 receptorom, vrátane humanizovaných a chimérických protilátok alebo i inak modifikovaných protilátok.

V inom uskutočnení sa predkladaný vynález týka liečenia subjektu trpiaceho folikulárnym lymfómom, pri ktorom sa podáva blokujúce činidlo dovtedy, pokiaľ nedôjde k regresii alebo zastaveniu rastu nádorov. Činidlá blokujúce LT dráhu sa môžu podávať v kombinácii s inými činidlami, ktoré sú užitočné pri liečení nádorov, ako sú napr. chemoterapeutiká. Okrem toho je možné podávať prípravky podľa predkladaného vynálezu spoločne s ožarovaním alebo transplantáciou kostnej drene.

V ešte ďalšom uskutočnení predkladaného vynálezu sa činidlo blokujúce LTp-R podáva spoločne s činidlom blokujúcim dráhu iných členov rodiny TNF. Napr. činidlo blokujúce TNF sa môže podávať súčasne alebo striedavo s činidlom podľa predkladaného vynálezu.

Podrobný opis vynálezu

V tejto časti sa vynález opisuje ešte podrobnejšie, aby sa mohol úplne vysvetliť a pochopiť, a sú tu definované použité pojmy.

Pojem „imunoglobulinová odpoveď alebo „humorálna odpoveď sa v tomto texte používa na označenie imunitnej odpovede zvieraťa na cudzorodý antigén, pri ktorej zviera produkuje protilátky proti uvedenému antigénu. Trieda Th2 pomocných T buniek je dôležitá na produkciu protilátok s vysokou afinitou.

Pojem „zárodočné centrum (alebo „germinálne centrum) označuje folikul B buniek, ktoré sa vytvárajú po imunizácii antigénom. Objavenie sa takéhoto histologického miesta súvisí s optimálnym vytváraním pamäti, prepínaním izotypov, somatickou hypermutáciou a teda afinitným zretím imunitnej odpovede.

Pojem „marginálna zóna alebo „oblasť typu marginálnej zóny sa týka histologický popísaného kompartmentu sekundárneho lymfatického tkaniva obsahujúceho predovšetkým makrofágy marginálnej zóny (MZM), metalofilné makrofágy (MM), B bunky marginálnej zóny a retikulocyty, a taktiež T bunky a dendritické bunky. Vyústenie arteriálneho krvného riečišťa do oblastí marginálnych sínusov umožňuje priamy prístup antigénu k bunkám a podporuje bunkové reakcie na antigén v týchto miestach.

Pojem „pomocná T bunka (Th bunka) označuje funkčnú podtriedu T buniek, ktoré pomáhajú generovať cytotoxické T bunky, a ktoré spolupracujú s B bunkami a stimulujú tak tvorbu protilátok. Pomocné T bunky rozpoznávajú antigén v spojení s molekulami MHC II. triedy a poskytujú kontaktne závislé a kontaktne nezávislé (cytokíny) signály pre efektorové bunky.

Pojem „doména Fc protilátky označuje časť molekuly obsahujúcu kĺbovú oblasť, doménu CH2 a CH3, ale neobsahuje miesto viažuce antigén. Pojem sa taktiež používa na označenie zodpovedajúcej oblasti IgM alebo protilátky iného izotypu.

Pojem „protilátka anti-LT-p-receptor popisuje akúkoľvek protilátku, ktorá sa špecificky viaže k aspoň jednému epitopu na receptore ΣΤβ.

Pojem „protilátka anti-LT popisuje akúkoľvek protilátku, ktorá sa špecificky viaže k aspoň jednému epitopu na LTa, ΣΤβ, alebo na komplexe LTa/β.

Pojem „signálna dráha ΣΤβ-Ρ („signalizácia ΣΤβ-Ρ) označuje molekulovú reakciu spojenú s celou metabolickou cestou prenosu signálu ΤΤβ-R a ďalšie molekulové reakcie, ktoré k nej vedú.

Pojem „činidlo blokujúce ΣΤβ-Ρ označuje také činidlo, ktoré naruší väzbu ligandu na ΣΤβ-Ρ, zhlukovanie ΣΤβ-Κ na bunkovom povrchu alebo signalizáciu ΣΤβ-R, alebo ktoré spôsobia zmenu v tom, ako sa signál dráhy Ι,Τβ-R interpretuje v bunke. Činidlo blokujúce ΣΤβ-R, ktoré pôsobí v kroku väzby ligand-receptor, inhibuje väzbu LT ligandu na ΤΤβ-R aspoň o 20%. Príklady činidla blokujúceho LTβ-R zahrnujú rozpustné molekuly LTβ-R-Fc a protilátky anti-LTa, 3ηίί-1Τβ, anti-LTa/β a θηίι^Τβ-Η. Je výhodné, ak protilátky nereagujú krížovo so secernovanou formou LTa.

Pojem „biologická aktivita ΕΤβ-Ρ znamená 1) schopnosť molekuly LT-β-Ρ alebo jej derivátov súťažiť o rozpustný alebo povrchový LT ligand viažuci sa k rozpustnej alebo k povrchovej molekule LT-β-Ρ, alebo 2) natívnu aktivitu LT-β ako je schopnosť stimulovať regulačnú imunitnú odpoveď alebo všeobecne cytotoxickú aktivitu.

Pojem „LT ligand” znamená heteromerický komplex LTa/β alebo jeho derivát, ktorý sa špecificky viaže na receptor ΤΤβ.

Pojem „väzobná doména LTβ-R ligandu popisuje časť alebo časti ύΤβ-R, ktoré sa zúčastňujú špecifického rozpoznania a interakcie s ligandom LT.

Pojmy „povrchový LT a „povrchový LT komplex označujú komplex, skladajúci sa z podjednotky LTa a podjednotky ΕΤβ viazanej na membránu, vrátane mutovaných, pozmenených a chimerických foriem jednej alebo viacerých podjednotiek, pričom je tento komplex prezentovaný na povrchu bunky. „Povrchový ligand LT znamená povrchový LT komplex alebo jeho derivát, ktorý sa špecificky viaže na receptor ΤΤβ.

Pojem „subjekt tu znamená zviera alebo jednu či niekoľko buniek pochádzajúcich zo zvieraťa. Je výhodné, ak je zvieraťom cicavec. Bunky sú v akejkoľvek forme, vrátane, ale nie výlučne, buniek nachádzajúcich sa v tkanive, zhlukov buniek, imortalizovaných, transfekovaných alebo transformovaných buniek, a taktiež buniek pochádzajúcich zo zvieraťa, ktoré bolo fyzikálne alebo fenotypovo zmenené.

Ako sa už spomínalo, transformácia B buniek vedie k vzniku lymfómov a transformácia B buniek pochádzajúcich z germinálnych centier, špecializovaných štruktúr vyskytujúcich sa v lymfatických uzlinách a v slezine v oblastiach bohatých na B bunky, vedie k vzniku lymfómov nazývaných folikulárne lymfómy. Germinálne centrá B buniek vyžadujú špecifické prostredie na dozrievanie a proliferáciu, a folikulárne dendritické bunky poskytujú tak antigén, ako i väčšinou špecifické signály pre B bunky germinálnych centier, ktoré spúšťajú dozrievanie, prežívanie a proliferáciu buniek. Štúdie na SJL myšiach, ktoré spontánne vytvárajú sarkómy retikulárnych buniek (RCS, pôvodný názov tohto typu nádorov) poskytli transplantovateľné bunkové línie a taktiež in vitro línie buniek RCS (CRCS), ktoré sú vhodné ako model na skúmanie interakcie medzi hostiteľom a nádorom (^3,4) . Tieto RCS vznikajú často v LN SJL myší, sú heterogénne a obsahujú rôzne typy hematopoetických buniek. Významné dôkazy poukazujú na to, že tieto lymfómy pochádzajú z germinálnych centier a na svoje prežívanie a proliferáciu vyžadujú rôzne signály alebo faktory poskytované hostiteľom (^5,s) . Možnosť meniť tieto signály nutné k prežívaniu poskytuje prostriedok ako kontrolovať rast týchto nádorov.

Jeden typ buniek, ktoré sa nazývajú folikulárne dendritické bunky (FDC), má rozhodujúci význam na vytváranie a funkciu germinálnych centier. Predpokladá sa, že na prežívaní a udržovaní germinálnych centier B buniek sa podieľajú mnohé faktory. Najmä členovia rodiny TNF cytokínov, ktoré sú signálnymi ligandami na bunkovom povrchu, sa na tom podieľajú tak zo strany B buniek, napr. CD40, ako aj zo strany FDC, napr. receptory TNF a lymfotoxínu (LT) . Myši s deficienciou LT alebo TNF osou majú taktiež defektný FDC a preto im chýbajú germinálne centrá (⁷). TNF os je dôležitá na vývoj FDC, hoci zrejme existujú i „downstream funkcie. LT os sa zdá byť dôležitejšia na udržovanie FDC vo funkčnom stave. Systém LT zahrnuje signalizáciu z rôznych lymfocytov pozitívnych k ligandom na bunky pozitívne k receptorom, ktoré sú pravdepodobne derivátmi iných buniek než buniek kostnej drene, napr. derivátmi FDC, aby sa FDC udržali v plne funkčnom stave. Autor vynálezu zistil, že zablokovanie tejto signálnej dráhy, buďto napr. protilátkami k LT ligandom alebo rozpustným fúznym proteínom receptorimunoglobulín, vedie k strate zrelých FDC (Mackay a Browning, 1998, Náture, V.395, 26-27). Okrem toho inhibícia LT dráhy vedie k strate tvorby germinálnych centier a k určitej dezorganizácii sleziny (⁸) .

Autor predkladaného vynálezu po prihláške, že inhibítory LT bunkami folikulárneho lymfómu k spomaleniu prvýkrát publikoval v tejto alebo zastaveniu dráhy a ich rastu rušia interakciu medzi B okolím, nádorov.

t.j. FDC,

Preto sú a vedú takéto inhibítory v primárnej Špecificky, aktivácia LT užitočné pri terapii alebo hoci dráhy liečení týchto úporných nádorov k doplneniu konvenčnej danej oblasti známa by sa mohla využiť v nádorovej že prechodné zablokovanie LT dráhy vedie chemoterapie.

bola v domnienka, že terapii, autor prekvapivo zistil, k spomaleniu alebo k zastaveniu rastu nádorov, ako sú napr.

folikulárne lymfómy.

V širšom zmysle sa predkladaný vynález týka prípravkov na liečenie nádorov alebo lymfómov, konkrétne folikulárneho lymfómu, tým, že sa subjektu podáva účinné množstvo prípravku, ktorý inhibuje LT dráhu. Takýto prípravok môže obsahovať rozpustný ΣΤβ receptor, fúzny proteín obsahujúci LTp-R, protilátky proti Ι/Γβ-R a protilátky proti LT ligandom. Takéto inhibujúce prípravky výhodne obsahujú farmaceutický prijateľný nosič.

Výhodným subjektom je cicavec, a najvýhodnejším je človek.

Prípravok podľa tohto vynálezu sa podáva subjektu dovtedy, pokiaľ nie je zjavný ústup alebo zastavenie rastu nádorov. Čas liečenia je teda velmi premenlivý a môže trvať od niekoľkých týždňov po niekoľko mesiacov, v niektorých prípadoch i značne dlhšie. Odborník je schopný určiť, kedy došlo k ústupu alebo k zastaveniu rastu nádorov, a k tomu je možné použiť akúkoľvek metódu známu v danom odbore. Použitie markerov FACS k rozdeleniu B lymfómov sa značne zlepšilo a je možné očakávať, že lymfómy istých subtypov bude možné zvládať terapiou pomocou prípravkov podľa predkladaného vynálezu.

Je pravdepodobné, že na udržovaní architektúry orgánov imunitného systému sa podieľajú taktiež ďalšie regulačné molekuly imunitného systému, ako sú napr. ostatní členovia rodiny TNF, a preto prispievajú k vytváraniu prostredia vhodného k proliferácii lymfómov. Preto kombinovanie inhibície LT dráhy s ďalšími dráhami môže byť účinným prostriedkom na liečenie niektorých subjektov. Tak napr. je možné užiť inhibítory LT dráhy v kombinácii napr. s činidlom blokujúcim dráhu CD40/ ligand CD40. Môže to byť akékoľvek činidlo blokujúce túto dráhu, teda napr. protilátky, rozpustné ligandy alebo receptory. Je výhodné podávať protilátky proti ligandu CD40 v kombinácii s inhibítormi LT dráhy. Pokiaľ sa podáva viac než jedno činidlo blokujúce dráhu členov TNF rodiny, prípravky je možné podávať v podstate súčasne, alebo striedavo, jedno činidlo po druhom. Odborník ľahko určí najúčinnejší spôsob na liečenie konkrétneho pacienta v závislosti od nádoru, aký sa lieči a od stavu pacienta.

Konvenčné chemoterapeutické protokoly sa môžu použiť k eliminácii zbytkov nádoru po liečení prípravkami podľa predkladaného vynálezu, alebo je ich možné v niektorých prípadoch použiť súčasne alebo taktiež pred prípravkami podľa tohto vynálezu. Inhibitory LT dráhy je možné užiť na zastavenie rastu lymfómov pred tým, než sa započne s konvenčným chemoterapeutickým režimom. Je pravdepodobné, že strata signálov podporujúcich rast a/alebo prežívanie spôsobí, že lymfóm sa stane citlivejším k chemoterapeutickým činidlám, a preto je výhodné podávať inhibitory LT dráhy pred podávaním tradičných chemoterapeutických činidiel.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Liečenie nádorov SJL RCS inhibítormi LT dráhy redukuje LN/veľkosť nádorov

Myši SJL sa liečili buď 3 dni pred transplantáciou nádorov (D—3) , alebo v čase transplantácie (DO) alebo 3 dni po transplantácii (D3) podaním 0,3 až 0,4 mg fúzneho proteínu myší LTBR-hlgGl intraperitoneálnym spôsobom. Transplantácia nádorov sa vykonala v podstate tak, ako sa to popísalo v (⁹) . 5 x 10⁶ RCS buniek zbavených T buniek sa podalo i.v. a ponechali sa, aby sa usadili v orgánoch a začali rásť. Po 5 až 7 dňoch sa odstránili mezenteriálne, brachiálne a axilárne LN a stanovila sa ich hmotnosť a vyjadrila sa ako percento celkovej telesnej hmotnosti. Tabuľka 1 ukazuje, že veľkosť uzlín sa znížila vo všetkých pokusoch. Veľkosť sleziny sa taktiež znížila v jednom z 3 pokusov, ale toto zníženie nebolo veľké. Zníženie hmotnosti LN bolo približne 50% pri jedinom podaní a 80 až 90% pri niekoľkonásobnom podaní.

V inom uskutočnení vynálezu je potrebné podávať inhibítory LT dráhy súčasne s radiačnou terapiou, alebo buď pred alebo po tejto, terapii. Odborníkovi je pritom zrejmé, že výhodná terapia je založená na posúdení individuálnych charakteristík, ako je stav pacienta a typ nádoru, ktorý sa lieči.

Inhibujúce protilátky anti-LT3~R a iné činidlá blokujúce Ι,Τβ-R je možné identifikovať spôsobom, ktorý sa popísal už predtým (v súčasne prejednávanej prihláške USA č. 08/378 968).

Tabuľka 1

Inhibičný účinok LTBR-Ig na rast RCS u normálnych SJL myší

Injekčné podanie myši (deň:dávka v mg)	Hmotnosť LN^a (n)	P	Hmotnosť sleziny	P
Experiment 1
kontrolné hulgG (usmrtené D5)	2,70±0,37 (7)		3,18±0,37 (7)
mLT3R-Ig^c (DO, +3:0,4, 0,3)	l,42±0,15 (4)	<0,001	3,29±0,18 (4)	NS^b
Experiment 2
kontrolné hulgG (usmrtené D7)	3,35±0,21 (3)		4,04±0,34 (3)
mLTpR-Ig (DO, +3:0,3, 0,2)	2,37±0,24 (4)	0,0024	3,04±0,19 (4)	0,004 i
Experiment 3
kontrolné hulgG (usmrtené D6)	2,34±0,ll (5)		2,93±0,57 (5)
ml^R-Ig (D-3:0,4)	1,10+0,38 (3)	0,0024	2,27±1,39 (3)	NS
mLTpR-Ig (D-3,0:0,4, 0,3)	0,78±0,02 (3)	<0,000 1	3,95±0,53 (3)	0,046 t
mL^R-Ig (D0:0,3)	0,92±0,10 (3)	<0,000 1	3,25±0,l (3)	NS

^a Hmotnosť orgánu je vyjadrená v percentách celkovej telesnej hmotnosti. Hmotnosť LN bez liečenia je typicky 0,5% telesnej hmotnosti.

^b NS = nie je významný ^c ml^R-Ig je fúzny proteín extracelulárnej domény LTPR a úsekov CH2 a CH3 hlgGl

Činidlo blokujúce ΙιΤβ-R podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu obsahuje rozpustnú molekulu ΣΤβ receptoru. Sekvencia extracelulárneho úseku ľudského ΣΤ-β-Η, ktorá je tu uvedená ako sekvencia id. č. 1, kóduje doménu viažucu ligand. Na základe poznania sekvencie id. č. 1 a pomocou využitia postupov rekombinantnej DNA, ktoré sú v danom odbore dobre známe, je možné klonovať funkčný fragment domény viažucej ligand do vektoru a potom ho exprimovať vo vhodnej hostiteľskej bunke, a tak pripraviť rozpustnú molekulu ΣΤβ-R.

Rozpustné ΣΤβ receptory obsahujúce sekvenciu aminokyselín uvedenú v sekvencií id. č. 1 sa môžu pripojiť k jednej alebo viacerým heterológnym proteínovým doménam („fúzna doména), aby sa zvýšila in vivo stabilita receptorového fúzneho proteínu, alebo aby sa modulovala jeho biologická aktivita alebo lokalizácia.

Výhodne sa na vytvorenie receptorových fúznych proteínov použijú stabilné plazmatické proteíny, ktoré majú typicky polčas obehu väčší než 20 hodín. Takéto plazmatické proteíny sú napr. (ale výpočet nie je obmedzujúci) imunoglobulíny, sérový albumín, lipoproteíny, apolipoproteiny a transferín. Sekvencie, ktoré nasmerujú rozpustnú ΣΤβ-R molekulu do určitého bunkového alebo tkanivového typu, sa môžu taktiež pripojiť k doméne viažucej ligand, aby sa vytvoril špecificky lokalizovaný rozpustný fúzny proteín ΣΤβ-R.

Buď celý, alebo funkčný úsek z extracelulárnej oblasti ΣΤβ-R obsahujúci doménu viažucu ligand, sa môže fúzovať s konštantným úsekom imunoglobulínu, napr. s Fc doménou ťažkého reťazca ľudského IgGl (Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46, 1995). Rozpustné fúzne proteíny receptor-IgG sú výhodné, sú všeobecne používaným imunologickým reagens a spôsoby ich prípravy sú v odbore dobre známe (pozri napr. patent USA č. 5 225 538, ktorý je zahrnutý vo forme odkazu).

Funkčná doména viažuca ligand LTp-R sa môže fúzovať s Fc doménou imunoglobulínu (Ig) odvodeného z imunoglobulínu inej triedy či podtriedy než IgGl. Fc domény protilátok patriacich do odlišných tried alebo podtried môžu aktivovať odlišné druhotné efektorové funkcie. K aktivácii dôjde, keď sa Fc doména naviaže na vhodný receptor. Druhotné efektorové funkcie zahrnujú napr. schopnosť aktivovať komplement, krížovo reagovať s placentou alebo viazať rôzne proteíny mikroorganizmov.

Pokiaľ by bolo výhodné poškodiť alebo usmrtiť cieľové bunky nesúce LT ligand, je možné vybrať obzvlášť aktívnu Fc doménu (IgGl) pre fúzny receptorový proteín. Pokiaľ by bolo žiaduce zacieliť fúzny proteín LT3-p-Fc na bunku, bez toho, aby sa aktivoval komplement, vyberie sa neaktívna Fc doména IgG4.

Popísali sa mutácie v Fc doméne, ktoré redukujú alebo úplne eliminujú väzbu na Fc receptor a aktiváciu komplementu (Morrison, S., Annu. Rev. Immunol. 10: 239-265, 1992). Tieto mutácie, či už samotné alebo v kombinácii, je možné využiť na optimalizáciu aktivity Fc domén použitých na vytvorenie fúzneho proteínu LTp-R-Fc.

Rôzne aminokyselinové zvyšky tvoriace spojovací bod vo fúznom proteíne receptor-Ig ovplyvňujú štruktúru, stabilitu a teda aj konečnú biologickú aktivitu rozpustného Ι.Τβ receptorového fúzneho proteínu. Jedna alebo viac aminokyselín sa môže pridať k C-koncu vybraného fragmentu LTg-R, a tak je možné modifikovať spojovací bod vo vybranej fúznej doméne.

Taktiež N-koniec fúzneho proteínu LT3-R sa môže pozmeniť tým, že sa mení poloha, v ktorej sa vybraný DNA fragment LT3-R štiepi na svojom 5'-konci, aby sa mohol vložiť do rekombinantného expresného vektora. Stabilita a aktivita každého fúzneho proteínu ΙιΤβ-R sa testuje a optimalizuje pomocou rutinných testov a taktiež pomocou testu na výber činidla blokujúceho ΤΤβ-R, tak ako sa to popísalo v tejto prihláške.

Na základe sekvencie ΕΤβ-R domény viažucej ligand vnútri extracelulárnej domény je možné vytvárať rôzne sekvenčné varianty, aby sa modifikovala afinita rozpustného LT-β receptoru alebo fúzneho proteínu pre LT ligand. Rozpustné molekuly ΤΤβ-R podía tohto vynálezu môžu súťažiť o naviazanie povrchového LT ligandu s endogénnymi receptormi ΤΤβ-R na povrchu buniek. Dá sa predpokladať, že akákoľvek rozpustná molekula, ktorá obsahuje ligand viažuci ΤΤβ-R doménu, a ktorá súťaží s povrchovými bunkovými receptormi ίΤβ o naviazanie LT ligandu, je blokujúcim činidlom v zmysle predkladaného vynálezu.

V inom uskutočnení tohto vynálezu protilátky namierené proti ľudskému LTβ receptoru (protilátka anti-U^-R) pôsobia ako činidlo blokujúce ΤΤβ-R. Protilátky anti-LTp-R podľa predkladaného vynálezu sú buďto polyklonálnymi alebo monoklonálnymi protilátkami a je možné ich modifikovať tak, aby sa dosiahla optimálna schopnosť blokovania signálnej dráhy ΤΤβR, ich in vivo biologická dostupnosť, stabilita alebo iné potrebné znaky.

Polyklonálne protilátkové sérum proti ľudskému ΤΤβ receptoru sa pripraví konvenčným spôsobom tak, že sa zvieraťu, ako je napr. koza, králik, potkan, škrečok alebo myš, subkutánne injekčné podá ľudský fúzny proteín ,ΛΤβ receptor-Ig (pozri príklad 1) v kompletnom Freundovom adjuvans, a potom nasleduje druhá (spúšťacia) intraperitoneálna alebo subkutánna injekcia s neúplným požadované spôsobom.

Freundovým adjuvans. Polyklonálne sérum protilátky sa testuje obsahujúce obvyklým imunochemickým monoklonálne

Myšie proteínu LTβ receptor-Fc protilátky sa pripravia proti ľudskému fúznemu tak, ako sa to popísalo v príklade 5 (USA prihláška autora č. 08/505 606). Hybridómová bunková línia BD.A8.AB9, ktorá produkuje myšiu monoklonálnu protilátku BDA8 namierenú proti ľudskému Ι,Τβ-R sa uložila v Američan Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) v súlade s Budapeštianskou dohodou zo dňa 12. januára 1995 pod prístupovým číslom CRL11964. Všetky obmedzenia dostupnosti pre verejnosť takto uloženej vzorky sa zrušia, akonáhle sa udelí patent.

Štandardnými technikami rekombinantnej DNA (Winter a Milstein, Náture 349: 293-299, 1991) sa môžu pripraviť rôzne formy anti-LTp-R protilátok. Napríklad je možné vytvoriť „chimérické protilátky, v ktorých sú domény viažuce antigén zo zvieracej protilátky spojené s ľudskou konštantnou doménou (Cabilly a kol., US 4 816 567, Morrison a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855, 1984). Pri klinickom použití sa pozorovalo, že chimérické protilátky redukujú imunitnú reakciu vyvolanú zvieracími protilátkami použitými u človeka.

Okrem toho sa môžu syntetizovať aj rekombinantné „humanizované protilátky rozpoznávajúce LT3-R. Humanizované protilátky sú chimérické molekuly obsahujúce väčšinou sekvencie ľudského IgG, do ktorých sa vložili úseky, zodpovedajúce za špecifickú väzbu s antigénom (napr. WO 94/04679). Zvieratá sa imunizujú požadovaným antigénom, zodpovedajúca protilátka sa potom izoluje a odstráni sa variabilný úsek špecifickú väzbu s antigénom. Úsek, odvodený zodpovedný za zo živočíšnej molekuly, zodpovedný za špecifickú väzbu s antigénom, sa potom klonuje do vhodného miesta v géne ľudskej protilátky, z ktorého sa odstránila oblasť špecificky viažuca antigén. Humanizované protilátky minimalizujú použitie heterológnych (medzidruhových) sekvencii v ľudských protilátkach, a preto s oveľa menšou pravdepodobnosťou vyvolávajú nežiaducu imunitnú odpoveď ošetrovaného.

Rôzne triedy rekombinantných protilátok proti ΣΤβ-R sa môžu skonštruovať ako chimérické alebo humanizované protilátky obsahujúce variabilné domény protilátok anti-LTp-R a ľudských konštantných domén (CH1, CH2, CH3) izolovaných z rôznych tried imunoglobulinov. Tak napr. protilátky anti-I^-R-IgM so zvýšenou valenciou miest viažucich antigén je možné pripraviť metódami rekombinantnej DNA tak, že sa klonuje miesto viažuce antigén do vektoru, ktorý obsahuje konštantnú oblasť ľudského T-reťazca (Arulanandam a kol., J. Exp. Med. 177: 1439-1450, 1993, Lane a kol., Eur. J. Immunol. 22: 2573-78, 1993, Traunecker a kol., Náture 339: 68-70, 1989).

Okrem toho sa môžu použiť štandardné techniky rekombinantnej DNA, aby sa zmenila afinita väzby rekombinantných protilátok s antigénom, a to tým, že sa zmenia aminokyseliny susediace s väzobným miestom. Afinitu k antigénu u humanizovaných protilátok je možné zvýšiť mutagenézou založenou na molekulovom modelovaní (Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033, 1989, WO 94/04679).

Môže byť taktiež potrebné zvýšiť alebo znížiť afinitu protilátok 3ηίί-ΤΤβ-Ρ k ΕΤβ-R podľa typu cieľového tkaniva alebo v závislosti na predpokladanom liečebnom postupe. Tak napr. z profylaktických dôvodov môže byť výhodné ošetrovať pacienta tak, že sa použije konštantná hladina anti-LTp-R so zníženou schopnosťou prenášať signál v signálnej dráhe ΕΤβ-R. Inhibičné 3η^-ΕΤβ-Ρ so zvýšenou afinitou k ΕΤβ-R môžu byť zase výhodné na krátkodobé ošetrovanie.

Protilátky 3ηίί-ΕΤβ-Ρ ako činidlo blokujúce ΕΤβ-R

Protilátky θηίί-ΕΤβ-Ρ, ktoré pôsobia ako činidlo blokujúce ΕΤβ-R, sa môžu selektovať testovaním ich schopnosti inhibovať ίΤβ-Ρ indukovanú cytotoxicitu proti nádorovým bunkám. Testovaním iných protilátok namierených proti ľudskému ίΤβ receptoru rutinnými metódami alebo testmi, ktoré sa tu popísali, je možné identifikovať ďalšie 3ηίί-1Τβ-Ρ protilátky, ktoré pôsobia ako činidlo blokujúce ΕΤβ-R u človeka.

K ďalšiemu výhodnému uskutočneniu predkladaného vynálezu patria prípravky, ktoré obsahujú protilátky namierené proti LT Ugandu, ktoré pôsobia ako činidlo blokujúce LTp-R. Ako sa už opísalo pre protilátky anti-LT3-R, protilátky anti-LT ligand, ktoré pôsobia ako činidlo blokujúce ΣΤβ-R, môžu byť tak monoklonálne ako aj polyklonálne protilátky a môžu byť rutinnými postupmi modifikované tak, aby sa modulovali ich väzobné vlastnosti pre antigén a ich imunogenicita.

Protilátky anti-LT podlá predkladaného vynálezu môžu byť namierené individuálne proti jednej z dvoch podjednotiek LT, a to vrátane rozpustných, mutovaných, zmenených alebo chimérických foriem LT podjednotiek. V prípade, že sa použijú podjednotky LT, je výhodné, keď sú to LTp podjednotky. V prípade, že sa užijú LT-α podjednotky, je výhodné, keď sa výsledné anti-LTa protilátky viažu s povrchovým LT ligandom a nereagujú krížovo so secernovanými LTa a ani nemodulujú aktivitu TNF-R.

Alternatívne sa môžu pripraviť protilátky namierené proti homomerickým (ΕΤβ) alebo heteromerickým (LTa/β) komplexom, zloženým z jednej alebo viacerých LT podjednotiek, a potom sa testuje aktivita blokujúca ΤΤβ-R. Ako antigén je výhodné použiť komplex ΤΤα1/β2. Ako sa už uviedlo, je výhodné, keď sa výsledné anti-LTal/^2 protilátky viažu s povrchovým LT ligandom a nereagujú krížovo so secernovanými LTa ani nemodulujú aktivitu TNF-R.

Produkcia polyklonálnych proti-ludských protilátok LTa sa opisuje v už podanej patentovej prihláške autora WO 94/13808. Taktiež sa publikovali monoklonálne protilátky anti-LTa a antiίΤβ (Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46, 1995).

Prípravky podía vynálezu

Prípravky podľa vynálezu obsahujú akékoľvek zlúčeniny, ktoré blokujú interakciu ΕΤβ s receptorom ΣΤβ a preto inhibujú signálnu dráhu LT. K zlúčeninám anti-LT patria tak polyklonálne protilátky ako aj monoklonálne protilátky (mAb), a taktiež deriváty protilátok, ako sú chimerické molekuly, humanizované molekuly, molekuly s redukovanou efektorovou funkciou, dvoj špecifické molekuly a konjugáty protilátok.

Predkladaný vynález zahrnuje i molekuly anti-LT3 a anti-LTP receptor iných typov, ako sú úplné protilátkové fragmenty Fab, F(ab')² fragmenty, úseky V^H alebo úseky F^v, jednoreťazcové protilátky (pozri napr. WO 96/23071), polypeptidy, fúzne konštrukty polypeptidov, fúzie ΣΤβ receptora, malé molekuly ako napr. malé semi-peptidové zlúčeniny alebo zlúčeniny iné než peptidy, ktoré sú schopné blokovať LT dráhu.

Rôzne formy protilátok je možné pripraviť štandardnými technikami rekombinantnej DNA (Winter a Milstein, Náture 349: 293-299, 1991). Napr. je možné skonštruovať také chimérické protilátky, kde väzobná doména pre antigén z protilátky zvieraťa je spojená s ľudskou konštantnou doménou (Cabilly a kol., patentová prihláška USA č. 4 816 567). Chimérické protilátky redukujú pozorovanú imunitnú odpoveď vyvolanú zvieracími protilátkami, keď sa použijú v klinických aplikáciách pre humánnych pacientov.

Okrem toho sa môžu syntetizovať rekombinantné „humanizované protilátky. Takéto humanizované protilátky sú protilátky, pôvodne získané z cicavca iného než z človeka, kde sa metódy génového inžinierstva využili na nahradenie niektorých alebo všetkých aminokyselín, ktoré nie sú nutné pre väzbu antigénu aminokyselinami zo zodpovedajúcich úsekov ľahkého alebo ťažkého reťazca ľudského imunoglobulínu (chiméry obsahujú hlavne sekvencie IgG, do ktorých sa vložili úseky zodpovedné za špecifickú väzbu antigénu, pozri napr. medzinárodná patentová prihláška WO 94/04679). Zvieratá sa imunizujú požadovaným antigénom, potom sa izoluje príslušná protilátka a odstráni sa z nej časť variabilného úseku zodpovedná za špecifickú väzbu antigénu. Úsek viažuci antigén zo zvieraťa sa potom klonuje do vhodného miesta génu ľudskej protilátky, z ktorého sa odstránil úsek viažuci antigén. Humanizované protilátky minimalizujú použitie heterológnych (t.j. medzidruhových) sekvencií v ľudských protilátkach, ktoré potom s menšou pravdepodobnosťou vyvolajú imunitnú odpoveď u liečeného pacienta.

Podľa predkladaného vynálezu sú taktiež užitočné protilátky primátov alebo tzv. „primatizované protilátky.

V prípravkoch podľa predkladaného vynálezu sa môžu taktiež použiť fragmenty protilátok alebo univalentné protilátky. Univalentné protilátky obsahujú dimér „ťažký reťazec/ľahký reťazec viazaný k úseku Fc (tzv. stonku) druhého ťažkého reťazca. Úseky Fab sú také úseky oboch reťazcov, ktoré sú približne zhodné alebo analogické so sekvenciami obsahujúcimi vetviaci sa úsek tvaru Y ťažkého reťazca a celé ľahké reťazce, a ktoré dohromady (ako agregáty) vykazujú protilátkovú aktivitu. Protein Fab obsahuje agregáty jedného ťažkého a jedného ľahkého reťazca (všeobecne známe ako Fab) a taktiež tetraméry, ktoré zodpovedajú dvojramenným segmentom protilátky tvaru Y (všeobecne známe ako F(ab)²), nech už sú spojené kovalentne alebo nekovalentne, pokiaľ sú agregáty schopné selektívnej reakcie s konkrétnym antigénom alebo rodinou antigénov.

Okrem toho je možné použiť štandardné techniky rekombinantnej DNA na zmenu väzobnej afinity rekombinantných protilátok s ich antigénmi tým, že sa zmenia zvyšky aminokyselín v blízkosti väzobného miesta pre antigén.

Subjekty

Subjekty, pre ktoré je určený prípravok podľa predkladaného vynálezu trpia folikulárnym lymfómom.

Spôsoby podávania

Prípravky podľa predkladaného vynálezu sa môžu podávať akýmkoľvek spôsobom, ktorý je lekársky prijateľný. K takýmto spôsobom podávania patrí injekčné parenterálne podávanie, a to intravenózne, intravaskulárne, intraarteriálne, subkutánne, intramuskulárne, intratumorové, intreperitoneálne, intraventrikulárne, intraepidurálne a iné. Vhodné sú taktiež ďalšie spôsoby ako je perorálny, nazálny, oftalmický, rektálny alebo topický. Liekové formy s protrahovaným uvoľňovaním liečiva sú obzvlášť výhodné, napr. depotné injekcie. Niektoré formy činidiel blokujúcich LT môžu byť vhodné na perorálne podávania a môžu byť formulované do suspenzií alebo piluliek.

Dávkovanie a frekvencie podávania

Veľkosť dávky a pacientovi lekár na podávanej ošetrujúci dávkovanie frekvencie dávok konkrétnej zlúčeniny určitej choroby posúdi radu faktorov. Všeobecné na liečenie základe celého extenzívne a vedľajších pacientovi. lekár často je stanovené experimenty i nežiaducich testoch, ktoré pacientovho v klinických na stanovenie prospešného účinkov pri rôznych dávkach

Ale i keď existuje takéto doporučenie, zahrnujú účinku podaných ošetrujúci mení takéto dávkovanie na základe úvahy týkajúcej sa veku, zdravotného stavu, hmotnosti, pohlavia a prípadnej súčasnej liečby optimálnej dávky konkrétneho liečenie folikulárneho lymfómu inými prípravkami. Stanovenie prípravku blokujúceho LT na je teda v kompetencii odborníka v odbore medicíny a farmácie.

Všeobecne je frekvencia dávok stanovená ošetrujúcim lekárom, a môže ísť o jednotlivú dávku alebo o opakované dávky, buďto denne alebo v intervaloch 2 až 6 dní, týždňa, dvoch týždňov alebo mesiacov.

Pri kombinovanej terapii podľa predkladaného vynálezu sa na liečenie folikulárneho lymfómu užívajú iné prípravky alebo prostriedky zamerané na takýto lymfóm, ako je ožarovanie, chemoterapia a iné spôsoby liečenia známe odborníkom.

Zlúčenina blokujúca LT podľa predkladaného vynálezu sa pacientovi podáva ako farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje farmaceutický prijateľný nosič. Tento nosič je pre pacienta netoxický a inertný v koncentráciách nutných pre účinok blokujúcej zlúčeniny alebo inej účinnej látky, takže vedľajšie účinky nosiča nijako neoslabujú pôsobenie účinnej látky.

Prípravok môže obsahovať i ďalšie kompatibilné látky, to znamená také zložky, ktoré sú schopné miešania sa so zlúčeninou blokujúcou LT, bez toho, aby došlo k podstatnému zníženiu terapeutickej účinnosti liečiva. Prípravky podľa predkladaného vynálezu vhodné na perorálne podávanie môžu byť v podobe oddelených jednotiek ako sú tobolky, tablety, pilulky, pastilky a papierové sáčky, obsahujúce dopredu stanovené účinné látky v podobe prášku alebo granulátu, alebo ako lipozómy, suspenzie vo vodnej alebo inej kvapaline ako je sirup alebo elixír, emulzia alebo výťažok.

Prípravok podľa predkladaného vynálezu môže byť v nádobke, ktorá zaisťuje sterilitu a ochraňuje aktivitu účinnej látky počas distribúcie a skladovania a súčasne umožňuje pohodlný a účinný spôsob podávania prípravku pacientovi. Zlúčeniny blokujúce LT formulované na injekčné podávanie sa môžu dodávať v uzavretej fľaštičke vhodnej na odobratie obsahu pomocou injekčnej striekačky s ihlou. Takáto fľaštička je buď na jedno alebo na opakované použitie. Prípravok sa môže dodávať taktiež vo forme dopredu naplnenej injekčnej striekačky. V niektorých prípadoch je prípravok formulovaný ako kvapalný, inokedy je v suchom alebo lyofilizovanom stave a vyžaduje rekonštitúciu štandardným alebo súčasne dodávaným riedidlom. Pokiaľ sa prípravok dodáva ako kvapalný prípravok na intravenózne podávanie, môže byť v sterilnom vaku alebo v kontajneri vhodnom na napojenie na súpravu na intravenózne podávanie alebo katéter. V prípade, že sa blokujúca zlúčenina podáva v perorálnej forme ako tablety alebo pilulky, je v sklenenej fľaške/kontajneri s odnímateľným uzáverom. Kontajner je označený údajmi ako je meno zlúčeniny, o ktorú ide, meno výrobcu alebo distributéra, indikácie, dávkovanie a ďalšie inštrukcie na vhodné skladovanie alebo podávanie.

Citovaná literatúra

1. Tsiasbe, V.K., Inghirami. G. & Thorbecke, G.J. The phvsiology of germinal centers. Crit Rev Immunol 16. 381-421 í 1996).

2. Freedman, A.S. & Ňadier. L..VÍ. in Cancer Mediáne 3rd Ed. (ed. Holland. J.F.e.a.) 2028-2068 (Lea&Febiger, London. 1994).

3. Lásky, J.L., Ponzio. N.M. & Thorbecke, G.J. Characterization and growth factor requirements of SJL lymphomas. I. Deveiopment of a tí celí growth factor-dependent in vitro celí line, cRCS-X [published erratum appears in J Immunol 1988 Apr 1:140(7):2478]. J Immunol 140,679-87 (1988).

4. Lásky, J.L. & Thorbecke. G.J. Characterization and growth factor requirements of SJL lymphomas. Π. Interleukin 5 dependence of the in vitro celí line, cRCS-X, and influence of other cytokines. Eur J Immunol 19. 365-71 (1989).

5. Ponzio, N.M., Brown, P.H. & Thorbecke, G.J. Host-tumor Interactions in the SJL lymphoma model. Intem. Rev. immunol. 1, 273-301 (1986).

6. Tsiagbe, V.K., et al. Syngeneic response to SJL follicular center B celí lymphoma (reticular celí sarcoma) cells is primarily in V beta 16+ CD4+ T cells. J Immunol 150, 5519-28 (1993).

7. Matsumoto, M., et al. Distinct roles of lymphotoxin alpha and the type I tumor necrosis factor (TNF) receptor in the establishment of follicular dendritic cells from nonbone mairow-derived cells. J Exp Med 186, 1997-2004 (1997).

8. Mackay, F., Majeau. G.R., Lawton. P.. Hochman. P.S. & Browning. J.L. Lymphotoxin but not tumor necrosis factor functions to maintain splenic architecture and humoral responsiveness in adult mice. Eur J Immunol 27, 2033-42 (1997).

9. Katz. I.R., Chapman-Alexander, J., Jacobson, E.B., Lerman. S.P. & Thorbecke.

G.J. Growth of SJL/J derived transpiantable reticulum celí sarcoma as related to its ability to induce T-cell proliferation in the host. ΙΠ. Studies on thymectomized and congenitally athymic SJL mice. Cellular Immunol. 65, 84-92 (1981).

Zoznam sekvencii (2) INFORMÁCIE 0 SEKVENCII S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 197 aminokyselín (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKUKY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S ID. Č. 1:

Ser 1

Gin Pro

Gin

Val

Pro Pro

Tyr

Ala Ser 10

Glu

Asn

Gin

Thr 15

cys

Arg

Asp

Gin

Glu

Lys

Glu

Tyr Tyr

Glu

Pro

Gin

His

Arg

íle

Cys

cys

20

25

30

Ser

Arg

Cys

Pro

Gly

Thr Tyr

Val

Ser

Ala

Lys

cys

Ser

Arg

íle

T e

40

45

Arg

Asp

mUv-

Val

Cys

Ala

Thr Cys

Ala

Glu

Asn

Ser

Tyr

Asn

Glu

His

50

55

60

*xp

Asn

Tyr

Leu

Thr

íle

Cys Gin

Leu

Cys

Arg

Pro

cys

Asp

Pro

Val

65

70

75

80

Mgr

Gly

Leu

Glu

íle

Ala Pro

Cys

Thr

Ser

Lys

Arg

Lys

Thr

Glr.

= 5

90

95

Cys

Arg

Cys

Glr.

Pro

Gly

Met P r. e

cys

Ala

. * gi

Ala

Leu

Glu

Cys

1CC

105

110

Thr

His

Cys

Glu

Leu

Ser Asp

Cys

Pro

Gly

Thr

Glu

Ala

Glu

115

120

125

Leu Lys Asp . 130

Glu Val Gly Lys Gly Asn Asn His Cys Val Pro Cys

Lys

135

140

Ala

Gly

His

Phe

Gin

Asn

Thr

Ser

Pro

Ser

Ala

Arg

cys

Gin

Pro

145

150

155

160

His

Thr

Arg

Cys

Glu

Asn

Gin

Gly

Leu

Val

Glu

Ala

Pro

Gly

Thr

165

170

175

«

Ala

Gin

Ser

Asp

Thr

cys

Lys

Asn

Pro

Leu

Glu

Pro

Leu

Pro

180

185

190

Glu

Met

Ser

Gly

Thr

195

Claims

1. Použitie zlúčeniny, ktorá inhibuje interakciu medzi ΣΤβ a jeho receptorom, na výrobu farmaceutického prípravku na zastavenie alebo spomalenie rozvoja, závažnosti alebo vplyvu nádoru, pričom subjektu sa podáva prípravok v účinnom množstve.

2. Použitie podlá nároku 1, pričom nádorom je folikulárny lymfóm.

3. Použitie podlá nároku 2, pričom zlúčenina sa vyberá zo skupiny obsahujúcej rozpustný ΏΤβ receptor, protilátky anti-LTa, protilátky anti-ΕΤβ a protilátky anti-I^-R.

4. Použitie podľa nároku 3, pričom zlúčeninou'je rozpustný ΣΤβ receptor.

5. Použitie podľa nároku 1, pričom subjektom je cicavec.

6. Použitie podľa nároku 5, pričom subjektom je človek.

7. Použitie podľa nároku 4, pričom rozpustný ΣΤβ receptor obsahuje doménu viažucu ligand, ktorá sa selektívne viaže k povrchovému LT ligandu.

8. Použitie podľa nároku 7, pričom rozpustný ΣΤβ receptor obsahuje FC doménu ľudského imunoglobulínu.

9. Použitie podľa nároku 3, pričom prípravok obsahuje monoklonálnu protilátku namierenú proti ΣΤβ receptoru.

10. Použitie podlá nároku 9, pričom monoklonálnou protilátkou je humanizovaná alebo chimérická protilátka.

11. Farmaceutický prípravok na liečenie subjektu trpiaceho folikulárnym lymfómom, vyznačujúci sa tým, že obsahuje zlúčeninu, ktorá blokuje interakciu ΣΤβ s jeho receptorom.

12. Použitie podľa nároku 1, pričom subjektu sa podáva aspoň jeden chemoterapeutický prípravok.

13. Použitie podľa nároku 1, pričom subjektu sa podáva inhibítor ďalšej TNF signálnej dráhy.

14. Použitie podľa nároku 13, pričom sa podáva prípravok inhibujúci dráhu CD40/CD40 ligand.

15. Použitie podľa nároku 14, pričom sa podáva protilátka antiCD40 ligand.

16. Použitie podľa nároku 1, pričom subjekt je liečený ožarovaním.

17. Použitie podľa nároku 1, pričom subjekt je liečený ešte ožarovaním alebo transplantáciou kostnej drene.

18. Použitie zlúčeniny, ktorá je inhibitorom interakcie medzi ΣΤβ a jeho receptorom, na výrobu farmaceutického prípravku na pozmenenie prežívania alebo udržovania folikulárnych dendritických buniek.

19. Použitie zlúčeniny, ktorá inhibuje interakciu medzi ΣΤβ a jeho receptorom, na výrobu farmaceutického prípravku na pozmenenie architektúry orgánov imunitného systému, pričom sa súčasne podáva inhibitor signálnej dráhy ďalšieho člena rodiny TNF ligandov a receptorov.