CZ20002950A3

CZ20002950A3 - Prostředek s profylaktickým protinádorovým účinkem

Info

Publication number: CZ20002950A3
Application number: CZ20002950A
Authority: CZ
Inventors: Eduard Dr. Sardaryan
Original assignee: Eduard Dr. Sardaryan
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2000-08-10
Publication date: 2001-12-12
Also published as: EP1320300A1; SK842003A3; SK285608B6; NO20030629D0; OA12349A; EE200300057A; IS6707A; EA200300252A1; US7214713B2; ATE318084T1; MXPA03001059A; DE60117388T2; KR20030041970A; DE60117388D1; WO2002011563A1; JP2004504861A; WO2002011563A8; BR0113121A; AP1453A; CZ289251B6

Description

Vynález se týká prostředku s profylaktickým protinádorovým účinkem.

Dosavadní stav techniky

Jsou známy různé prostředky, například pro doplnění výživy, zejména výživy lidí, mající blahodárný vliv na zdravotní stav, popřípadě inhibiční účinky na vznik určitých chorob.

V českém patentu č. 285 721 je popsán kmen mikroorganismu Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, produkující červené barvivo, a použití tohoto barviva, mimo jiné jako potravinářského barviva. Kmen byl uložen dne 19.3.1998 v mezinárodním ukládacím místě CCM - Česká sbírka mikroorganismů Masarykovy s

university, Tvrdého 14, 602 00 Brno. Jedná se o přírodní mikroorganismus, získaný z půdy v údolí pod horou Ararat.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že produkt, získaný biosyntézou produkčním mikroorganismem Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, má profylaktické protinádorové účinky.

Předmětem vynálezu je tedy prostředek s profylaktickým protinádorovým účinkem, jehož podstata spočívá vtom, že sestává z 20 až 99,99 % hmotnostních produktu biosyntézy produkčním mikroorganismem Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, získaného fermentací živného média s obsahem uhlohydrátů a amonného dusíku, a 0,01 až 80 % hmotnostních fyziologicky inertního nosiče a popřípadě pomocných látek. Prostředek je s výhodou použitelný jsko potravinový doplněk.

Pro získání produktu biosyntézy je možno provádět pěstování produkčního kmene běžnými fermentační mi postupy. Když bylo červené barvivo, získané izolačními postupy z vykultivovaného vodného média po odstranění biomasy,

r podrobeno spektrální analýze, bylo zjištěno, že při sušině ne méně než 85 % hmotnostních obsahuje ne méně než 52 % hmotnostních barevných látek.

Barevný princip je založen na chromoforu antrachinonového typu. Barvivo je tvořeno směsí látek, které tento chromofor obsahují a liší se od základní struktury navázaným postranním řetězcem oligopeptidu nebo oligosacharidu.

Vlastním chromoforem je pentasubstituovaný antrachinon s třemi izolovanými skeletálními vodíky. Takovou sloučeninu je možno znázornit například obecným vzorcem I

kde Ri je hydroxyl a R₂ je fí ,3-butadienyl a popřípadě jsou tyto substituenty spolu cyklizovány přes kyslík hydroxylu.

Základní variantě tedy odpovídá vzorec la, cyklizované variantě vzorec lb.

H

(la)

- 3 —

(lb)

V případě vzorců la a lb se pak konkrétně jedná o 8-ethyl-3,6-dihydroxy5[(1E)-3-methyl-1,3-butadienyl]-9,10-dioxo-9,10-dihydroantracen-2-karboxylovou kyselinu, resp. 6-ethyl-10-hydroxy-3,3-dimethyl-7,12-dihydro-3H-nafto[2,3-řjchromen9-karboxylovou kyselinu.

V produktu biosyntézy může být barevná látka přítomna ve spojení s amonnými, draselnými či sodnými kationty, které mohou být přítomny v přebytku. V těchto produktech se jako doprovod mohou nacházet látky bílkovinného charakteru (aminokyseliny, peptidy) z původního živného média.

Pro získání červeného barviva je možno provádět pěstování produkčního kmene v tekutém živném prostředí běžným způsobem, například povrchovou metodou na miskách či plotnách nebo hlubinnou metodou ve fermentorech. Množství naočkovaného materiálu je 3 až 7 % obj. Pro očkování se využívají pracovní houfý s pětidenní kulturou inkubovanou- například v zelném odvaru, v kukuřičném nebo kvasničném extraktu nebo v kvasničném autolyzátu.

Optimální podmínky pro vedení procesu mikrobiologické syntézy jsou teplota pěstování 27 až 29 °C, kontinuální promíchávání obvodovou rychlostí 160 až 280 min'¹, přívod vzduchu v poměru 1,2 objemu vzduchu na 1,0 objemu živného prostředí, přetlak v pracovním fermentoru 50 až 80 kPa.

Už po 24 až 35 h fermentace produkčního mikroorganismu se kapalina nad kulturou zbarvuje do červené barvy, jejíž intenzita dosahuje svého maxima - tmavě višňové barvy - po době inkubace 64 až 72 h.

Jako komponenty živného prostředí se používají uhlohydráty, různé cukry, vícemocné alkoholy a uhlovodíky a také odpady při výrobě cukru - melasa v množství 10 až 20 g naTI vody. - .

- 4Pro zásobování dusíkem se využívá například kukuřičný extrakt, kvasničný autolyzát nebo extrakt a také sloučeniny obsahující dusík v různých podobách (například aminokyseliny) v množství dusíku 0,5 až 0,7 % hmotn.

Odborníkovi je zřejmé, že vynález není omezen na použití výše popsaného zvláště výhodného kmene Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, ale zahrnuje i použití jiných kmenů nebo mutantů uvedeného mikroorganismu, produkujících červené barvivo, získaných běžným způsobem, například ozářením RTG paprsky, ultrafialovým světlem, působením fága apod.

Po ukončení biosyntézy je možno získané červené barvivo ze živného prostředí izolovat běžnými izolačními postupy. Fermentační prostředí je možno po oddělení biomasy nebo bez oddělování biomasy podrobit ultrafiltraci a pak zahustit nanofíltrací na koncentrát s obsahem 80 až 100 g/l barviva. Alternativně se kapalina z živného prostředí odfiltruje nebo odstředí z důvodu oddělení od biomasy. Aby se barvivo vysráželo, okyselí se kapalina na pH 3,0 až 2,5. Okyselení je možno provést jakoukoli organickou nebo anorganickou kyselinou, přijatelnou z potravinářského hlediska. Vysrážení je možno provádět síranem hlinitodraselným AIK₂(SO4)3. Po vysrážení se barvivo od kapaliny oddělí, například odstředěním nebo filtrací.

Při analytickém hodnocení vykazuje takto izolovaný produkt tyto vlastnosti.

Barvivo je tmavě červený až černý prášek a je rozpustné v alkalické vodě při pH 8 až 9 (NH3), v ledové kyselině octové, ve vaječném bílku, v ethanolu, v methanolu, v butanolu, částečně v acetonu a nerozpustné v hexanu, v etheru, v benzenu, v tetrachlormethanu a s kovy poskytuje cheláty nerozpustné ve vodě.

Připravené roztoky jsou malinově až temně červené a jsou stabilní při pH 9 až 4 a jejich odstín se téměř nemění v závislosti na pH. Zabarvení neutrálního roztoku se nemění (na rozdíl od karmínu, betaninu, anthokyanu), ani při povaření roztoku po dobu 30 min. Rozpustnost ve vodě je přibližně 100 g/l.

Při stanovení chemické čistoty byly u získaného produktu zjištěny tyto hodnoty (vé hmotnostních procentech):

Chemická čistota:	Metoda stanovení
Sušina	ne méně než 85 %	gravimetrie
Obsah barevných látek	-ne méně než 52 %	spektrometrie
Popel — -	ne více než 12 %	gravimetrie ~
a-aminodusík	ne více než 2,7 %	formolová titrace

Těžké kovy: 2 ar^en	ne více než 3 mg/kg	AAS
olovo	ne více než 10 mg/kg	AAS
rtuť	ne více než 1 mg/kg	AAS
kadmium Mykotoxiny:	ne více než 1 mg/kg	AAS
aflatoxiny (suma Bi, Gi, G₂)	B₂, ne více než 10 pg/kg	HPLC-FLD
ochratoxin A	ne více než 20 pg/kg	HPLC-FLD
sterigmatocystin	ne více než 10 pg/kg	TLC-fluoresc.
T-2 toxin	ne více než 50 pg/kg	GLC-ECD
sekalonová kyselina	ne více než 12,5 pg/kg	HPTLC
Antibiotická aktivita: Mikrobiální čistota:	nepřítomna	Codex Alimentarius
celkový počet bakterií	ne více než 5000/g
celkový počet plísní	ne více než 100/g
Salmonella	nepřítomna ve 25 g vzorku
Escherichia coli	nepřítomna v 10 g vzorku

Červené barvivo, izolované za výše popsaných podmínek a mající výše uvedené vlastnosti, bylo podrobeno testům akutní orální toxicity, 90denní subchronické toxicity, akutní kožní a oční dráždivosti, antibiotické aktivity, cytotoxicity, mutagenity a protinádorové účinnosti.

Akutní orální toxicita:

Při testu akutní orální toxicity na myších, provedeném podle směrnice OEČD pro testování chemikálií, nebyly po podání jednorázové dávky 2 g/kg tělesné hmotnosti pozorovány žádné toxické účinky ani úhyn zvířat.

Subchronická toxicita:

Při 90dennt subchronické toxikologičké studii na krysách ~podle směrnice OECD č. 408 bylo testované barvivo podáváno v dávkách 0,5,-10,0 a 25,0 mg/kg denně po dobu 90 dní celkem 120 krysám kmene SPF Han:Wistar. Aplikace byla

- 6 —· prováděna per os žaludeční sondou. Následně provedené histopatologické vyšetření neprokázalo změny, které by bylo možno spojovat s aplikovanou látkou; nebyly zjištěny hepatotoxické ani nefrotoxické účinky. Hematologickým vyšetřením nebyl prokázán hematotoxický účinek testované sloučeniny a biochemickým rozborem nebyl prokázán významný vliv na sledované biochemické parametry.

Kožní a oční dráždivost:

Test akutní kožní dráždivosti/koroze byl prováděn podle směrnice OECD č. 404 a nebyly zjištěny žádné akutní dráždivě účinky. Do 48 h po aplikaci nebyly pozorovány žádné známky dráždivosti nebo koroze. Test akutní oční dráždivosti/koroze byl prováděn podle směrnice OECD č. 405. Červené barvivo vykazovalo v testu akutní oční dráždivosti/koroze mírné účinky (pouze ve spojivce); po 72 h po aplikaci nebyly žádné známky pozorovány.

Antibiotická aktivita:

Zkoumaná látka byla testována na bakteriálních kmenech Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Streptococcus pyogenes a Serratia marcescens ve třech paralelních pokusech pro každý kmen (celkem 18 Petriho misek). Kolem nanesených kotoučů nebyla zjištěna inhibice růstu v žádné z misek, ani v těch, které byly před vlastní 24hodinovou kultivací uchovávány 16 h při snížené teplotě (což by mělo zlepšit manifestaci látek pomalu migrujících do agaru).

Cytotoxicita:

Cytotoxicita byla zjišťována standardním testem mikronukleí na myších. Červené barvivo, podané v jednorázové dávce per os o velikosti 2, 15 a 50 mg/kg, nevykázalo cytotoxický účinek. Počet mikronukleí v erytrocytech se po aplikaci testované látky nezvýšil. Testovaná látka nevykázala mutagenní účinky.

Mutagenita:

Test mutagenity (Ames reverse mutation test) byl proveden v hístidinově auxotrofních kmenech Salmonella typhimurium podle směrnice OECD č. 471. Za daných podmínek nebyl pozorován žádný vliv produktu na mutagenitu bakterií.

Protinádorová účinnost:

Červené barvivo, izolované -za výše popsaných podmínek a-mající výše uvedené vlastností? bylo podrobeno screeningové studii na protinádorové vlastnosti.

- 7Tato testovaná látka byla podána myším s ascitickou formou Gardnerova lymfosarkomu (IP-LsG). Jako referenční látka byl použit 6-(2-(2hydroxyethyl)aminoethyl)-5,11-dioxo-5,6-dihydro-11 H-indeno[1,2-c]i0ochinolin sumárního vzorce C20H18N2O3.HCI (VÚFB).

Byly použity myši C₃H, samice 26,1 až 27,3 g. Zvířata byla ustájena v nádobách z umělé hmoty a krmena dietou NOE, výrobce RATIO, s.r.o., Břeclav, a pitnou vodou ad libitum. V místnosti byla udržována teplota, relativní vlhkost dosahovala 60 %, světelný režim nebyl regulován.

Gardnerův lymfosarkom se udržuje v ascitické formě na myších C₃H inokulací ascitických buněk odebraných týden po předchozí inokulací punkcí z dutiny břišní.

Myším se podá intraperitoneáíně 0,2 ml ascitu ředěného i^otonickým roztokem chloridu sodného pro inj. 10 až 20x. Buněčný materiál pro pokusy se získává punkcí břišní dutiny 7. den po inokulací. Pro terapeutický pokus se inokulovalo ascitem 2 _ ředěným iáotonickým roztokem chloridu sodného pro inj. tak, že se podalo 10 buněk každému zvířeti i.p. v objemu 0,2 ml.

Myši C₃H byly starší než 6 týdnů, hmotností 26,1 až 27,3 g, ve skupinách po 10 zvířatech, kontrola společná. Byly použity dvě dávkové skupiny pro každou cestu podání a jednu testovanou látku.

Dávkové hladiny: 200 a 100 mg/kg x 5 p.o. a 100 a 50 mg/kg x 5 s.c. v objemu 0,2 až 0,4 ml, resp. 0,2 až 0,4 ml p.o. (referenční látka), na 20 g tělesné hmotnosti. Frekvence aplikace: 1x denně počínaje 1. dnem. Testovaná látka byla podána v kontinuálním režimu 1. až 5. den v dávkách uvedených v tabulce 1, referenční látka 1x1. den p.o.

Po ukončení aplikace byla zvířata ponechána pro sledování doby přežití. Závislost hodnoty doby přežití na dávce byla hodnocena ve srovnání s neaplikovanou kontrolou. Čas jako biologická odpověď byl hodnocen průběžně neparametrickým testem podle Hájka (Fabián V.: Základní statistické metody, _ NČSAV, Praha 1963).

Po ukončení pokusu byl čas v případě bodových odhadů hodnocen testem shody dvou průměrů (Studentův t-test) za předpokladu logaritmickonormálního rozložení hodnot časových, a za předpokladu různých neznámých_rozptylů (Roth Z., Josífko M., Malý V., Trčka V.: Statistické metody v experimentální medicíně, str. 278r-SZNPraha 1962). Z jednotlivých hodnot doby hynutí byl počítán geometrický průměr.

-, 8 — . t

Rozdíly průměrných hodnot, u nichž hodnota testového kriteria překročila kritickou hodnotu pro hladinu významnosti 5 %, byly označeny jako statisticky významné.

Výsledky jsou shrnuty v tabulkách:

Tabulka 1.

Tabulka uvádí medián doby přežití, statistickou významnost hodnocenou neparametrickým testem podle Hájka na hladině významnosti a = 0,05 a hodnotu počtu přežívajících zvířat vztaženou k výchozí hodnotě v závislosti na dávkách látek.

látka	dávka mg/kg/den	n 0)	medián doby hynutí (dny)	přežití LTS	pozn.
kontrola	0	¹⁰	14,0	0/10
červené barvivo	200 p.o.	10	15,0	1/10
šarže 290698	100 p.o.	10	14,0	0/10
	100 s.c.	10	13,0	0/10	1)
	50 s.c.	10	13,0	0/10
referenční	200 p.o. 100 p.o.	10 10	>65,0 >48,5	10/10 5/10	1) 1)

n - počet zvířat ve skupině ¹⁾ statisticky významný rozdíl proti kontrole na hladině významnosti a = 0,05 LTS - počet zvířat přežívajících 65. den

9Tabulka 2.

Tabulka uvádí průměrné hodnoty doby přežití, meze spolehlivosti geometrického průměru pro P = 1 = a = 0,95 a relativní hodnoty průměrné doby přežití v % kontroly v závislosti na dávkách látek.

látka	dávka mg/kg/den	n 0)	geom. průměr (dny)	meze spolehlivosti (dny)	přežití (% kontroly)	pozn.
kontrola	0	10	14,05	/12,6:15,7/	100
červené	200 p.o.	10	>17,50	/12,5:24,6/	>125
barvivo	100 p.o.	10	14,33	/13,3:15,4/	102
šarže 290698	100 s.c.	10	12,87	/12,3:13,5/	92
	50 s.c.	10	13,86	/11,9:16,2/	99

n - počet zvířat ve skupině

Tabulka 3.

Tabulka uvádí průměrné hodnoty hmotnosti zvířat na začátku pokusu a hodnoty koeficientu hmotnostního úbytku v porovnání s kontrolní skupinou v závislosti na dávkách látek za týden od zahájení terapie.

látka	dávka mg/kg/den	n (j)	aritm. průměr hmotnosti (g)	hmotnostní koeficient (%)	pozn.
kontrola	0	10	26,1	0,00
červené	200 p.o.	10	27,2	-5,00
barvivo	100 p.o.	10	27,2	-5,00
šarže 290698	100 s.c.	10	_27,3	-5,99
	50 s.c.	10	26,7	-1,60
referenční	200 p.o.	10 -	26,7	-14,63
-	100 p.o.	10	26,1	-6,67

n - počet hodnocených zvířat ve skupině

Na základě výsledků uvedených v tabulkách lze usuzovat, že optimální dávku lze hledat v okolí nejvyšší testované dávky 200 mg/kg p.o. x5, tj. v okolí kumulativní dávky 1 g/kg p.o. Z rozdílu průběhu účinnostních křivek při orálním a podkožním podání lze soudit na metabolickou přeměnu látky v játrech. Za předpokladu intenzivní metabolizace lze odhadnout opakovanou dávku 600 mg/m² p.o. jako tolerovanou pro člověka. Této dávce odpovídá 16,2 mg/kg p.o., což odpovídá opakované denní dávce 1135 mg p.o. x 5, tj. kumulativní dávce 5,67 g p.o. u člověka o tělesné hmotnosti 70 kg. Testovaná látka se nejeví jako toxická, protože její podání je spojeno s nižšími hmotnostními úbytky než 10 %, a to zejména vé srovnání s referenční látkou.

Přehled obrázků na výkresech

Ůčinnostní křivka na obr. 1 představuje závislost přirozeného logaritmu indexu relativního rizika R na dávce látky při různých cestách podání.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Živné prostředí, obsahující 12 g/l krystalového cukru, 5 g/l kukuřičného extraktu, 0,002 g/l síranu zinečnatého a 0,001 g/l síranu hořečnatého, se očkuje dvoudenní kulturou Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, vypěstovanou v očkovacím přístroji, v množství 4 %~obj., vztaženo na objem živného prostředí. Po ukončení biosyntézy červeného barviva se z živného prostředí odstředí kapalina z důvodu oddělení od biomasy. Kapalina se okyselí na pH 3,0 až 2,5 kyselinou octovou. Vysrážení se provede síranem hlinitodraselným AIK₂(SO4)₃. Po vysrážení se barvivo od kapaliny oddělí odstředěním.

Příklad 2

Živné prostředí, obsahující 16 g/l krystalového cukru, 7 g/l kvasničného extraktu, 0,002 g/l síranu zinečnatého a 0,001 g/l síranu hořečnatého, se očkuje dvoudenní kulturou Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, vypěstovanou v očkovacím přístroji, v množství 6 % obj., vztaženo na objem živného prostředí. Po ukončení biosyntézy červeného barviva se z živného prostředí odfiltruje kapalina z důvodu oddělení od biomasy. Kapalina se okyselí na pH 3,0 až 2,5 kyselinou citrónovou. Vysrážení se provede síranem hlinitodraselným AH^SO^. Po vysrážení se barvivo od kapaliny oddělí odstředěním a překrystaluje.

Příklad 3

Živné prostředí, obsahující 20 g/1 krystalového cukru, 10 g/l kvasničného autolyzátu, 0,002 g/l síranu zinečnatého a 0,001 g/l síranu hořečnatého, se očkuje dvoudenní kulturou Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, vypěstovanou v očkovacím přístroji, v množství 8 % obj., vztaženo na objem živného prostředí. Po ukončení biosyntézy červeného barviva se živné prostředí podrobí ultrafiltraci s použitím membrán 10000 až 20000 μιτι a pak se zahustí nanofiltrací na membránách 200 až 500 μιτι na koncentrát s obsahem 100 g/l barviva.

Příklad 4

Živné prostředí, obsahující 18 g/l krystalového cukru, 19 g/l kvasničného extraktu, 0,002 g/l síranu zinečnatého a 0,001 g/l síranu hořečnatého, se očkuje dvoudenní kulturou Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, vypěstovanou v očkovacím přístroji, v množství 8 % obj., vztaženo na objem živného prostředí. Po ukončení biosyntézy červeného barviva se z živného prostředí odstředí biomasa a kapalina se podrobí ultrafiltraci s použitím membrán 10000 až 20000 μιτι a pak se zahustí nanofiltrací na membránách 200 až 500 μιτι na koncentrát s obsahem 80 g/l barviva.

Příklad 5 _ g koncentrátu, získaného postupem podle příkladu 3, se zhomogenizuje se 75 g maltodextrinu a vysuší na sprejové sušárně při teplotě 180 až 220 °C.

Příklad 6 g koncentrátu, získaného postupem podle příkladu 3, se zhomogenizuje se 35 g škrobu a vysuší na sprejové sušárně při teplotě 180 až 220 °C.

I —

Produkty podle příkladů 1 až 6 je možno v množství 50 až 400 mg/kg produktu přidávat do potravinářských výrobků, například uzenin, cukrovinek, jogurtů, nealkoholických a alkoholických nápojů apod. Dále je možno z nich připravovat vodné, lihové nebo vodolihové roztoky o koncentraci účinné látky 2 až 10 % obj.

Příklad 7

Krystalický produkt, získaný podle příkladu 2 se zhomogenizuje s farmaceutickým excipientem ve formě emulze, zhomogenizuje s laktózou a lisuje na tablety s obsahem účinné látky 350 a 450 mg. Tablety je možno připravovat i s glukózou a jinými farmaceuticky přijatelnými nosiči.

Claims

1.

Prostředek s profýlaktickým protinádorovým účinkem, vyznačující se tím, že sestává z 20 až 99,99 % hmotnostních produktu biosyntézy produkčním mikroorganismem Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, získaným fermentací živného média s obsahem uhlohydrátú a amonného dusíku, a 0,01 až 80 % hmotnostních fyziologicky inertního nosiče a popřípadě pomocných látek.

2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že produkt biosyntézy tvoří červené barvivo, jehož chromoforem je antrachinonový derivát obecného vzorce

R

O, kde Ri je hydroxyl a R₂ je ,3-butadienyl a tyto substituenty jsou popřípadě spolu cyklizovány přes kyslík hydroxylů.

3. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že chromoforem je 8ethyl-3,6-dihydroxy-5[(1 H)-3-methyl-1,3-butadienyl]-9,10-dioxo-9,10-dihydroantracen2-karboxylová kyselina.

4. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že chromoforem je 6ethyl-10-hydroxy-3,3-dimethyl-7,12-dihydro-3H-nafto[2,3-/]chromen-9-karboxylová kyselina.

— 145. Prostředek podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje 11 až 75 % hmotnostních maltodextrinu jako fyziologicky inertního nosiče.

6. Prostředek podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje 30 až 40 % hmotnostních škrobu jako fyziologicky inertního nosiče.

7. Prostředek podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že je ve formě tablety, kapsle nebo pilulky.

8. Prostředek podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje fyziologicky přijatelnou kapalinu.

9. Použití prostředku podle některého z nároků 1 až 8 jako potravinového doplňku.