CZ20021388A3

CZ20021388A3 - Liposomový prostředek

Info

Publication number: CZ20021388A3
Application number: CZ20021388A
Authority: CZ
Inventors: Carlo Bugatti
Original assignee: Novuspharma S. P. A.
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2000-10-19
Publication date: 2002-08-14
Also published as: PL197412B1; CA2386143A1; WO2001028521A2; HUP0203473A3; AU1514601A; IT1315253B1; JP2003512313A; NO20021867L; ZA200203128B; PL354610A1; HUP0203473A2; EA200200389A1; US20060078607A1; SK5382002A3; US7449197B2; ITMI992219A1; CN1164261C; AU772339B2; DE60029979D1; IL149212A0

Description

Liposomový prostředek

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká liposomového farmaceutického prostředku sloučeniny 6,9-bis-[(2-aminoethyl)amino]benzo[g]isochinolin-5,10-dionu dimaleátu (BBR 2778).

Dosavadní stav techniky

Liposomy jsou vodnými disperzemi přírodních a/nebo syntetických fosfolipidů (biologicky slučitelných a biologicky odbouratelných), uspořádané v jedné nebo více dvouvrstvách. Pokud jsou fosfolipidy hydratovány ve vodném médiu (prostředí), spontáně vytvářejí koloidní mikročástice nebo nosiče, obvykle o průměru 0,05 až 5,0 mikrometrů. Velikost liposomových částic se pohybuje v rozmezí od 0,025 pm do 2,5 pm, v závislosti na jejich struktuře, kterou může být struktura jednoduché nebo vícenásobné dvojvrstvy. Velikost měchýřku je kritickým parametrem pro stanovení poločasu rozpadu měchýřku a ovlivňuje objem opouzdřitelného léčiva.

Liposomy mohou být klasifikovány podle svého složení z přírodních a/nebo syntetických fosfolipidů (fosfo-sfingolipidů) a jejich dvojvrstva může dále obsahovat i jiné složky, jako je cholesterol a s lipidem spojené (konjugované) hydrofilní polymery. V závislosti na velikosti a počtu dvojvrstev mohou být liposomy také rozděleny do následujících kategorií: (a) multilamelární měchýřky (multilamellar vesicles, MLV), (b) velké unilamelární měchýřky (large unilamellar vesicles, LUV), (c) malé unilamelární měchýřky (smáli unilamellar vesicles, SUV), (d) multivesikulární měchýřky (multivesicle vesicles, MVV) a (e) oligolamelární měchýřky (oligoíamellar vesicles, OLV).

00« 00 0 ·· 0· 00 00 00· 0000

000 0004 00 ·

000 00 0 0000 000 0 0 »000 000

000 W0 0 0 « 0 ♦ 0 0 * 0

Fyzikálně chemické vlastnotsi fosfolipidů, které vytvářejí liposomy, jako jsou tekutost membrány, hustota náboje, sterické zábrany a propustnost, ovlivňují vzájemné působení mezi liposomy a složkami krve, tkáněmi a buňkami.

Bylo zjištěno, že liposomy jsou možnými cennými nosiči léčiv. Schopnost liposomů obsahovat, přenášet a uvolňovat léčiva vedla k mnoha klinickým aplikacím. Nejjednodušší použití liposomů ve farmaceutickém oboru je jejich použití jako netoxických nosičů nerozpustných léků. Složitější použití zahrnují použití liposomů jako zásobníků k prodlouženému uvolňování léků nebo k lokalizaci léku, buď pro dosažení nebo k zabránění dosažení specifické tkáně.

Léky v liposomové formě poskytují příznivé výsledky při léčbě i prevenci mnoha onemocnění, jako v antimikrobiální léčbě, protirakovinné léčbě, jako adjuvantní látky ve vakcínách, v hormonálních a enzymových léčbách, v diagnostických postupech a při léčbě kožních a očních chorob. Léky, používané při léčbě takových onemocnění, jako je rakovina, mají obvykle omezený léčebný index (rejstřík) a pro normální tkáně mohou být vysoce toxické. Liposomové prostředky mohou léčebný index zlepšit tím, že pozměňují biologickou distribuci léku. Některé pokusy s anthracykliny opouzdřenými do liposomů, s prodlouženým poločasem v plazmě, prokázaly snížení kardiotoxícity a lepší přežití zvířat ve srovnání s kontrolami, které obdržely volný lék.

V případě doxorubicinu, anthrachinonového protinádorového léku, bylo potvrzeno, že použití liposomových prostředků bylo účinné ke snížení toxicity. Nejnebezpečnější vedlejší účinek doxorubicinu je progresivní, nevratné poškození srdce. V liposomech opouzdřený doxorubicin vykázal nižší toxicitu při zachování svého léčebného účinku. Patenty US 4 797 285, US 4 898 735 a US 5 043 166 předkládají doxorubicin/liposomové prostředky a jejich použití při léčbě rakoviny.

9« ·* 9 99 99 ·· 9 · 999 9999

999 99«· «9 9 « 999 99 « 9999 999 «

9999 « 99

999 99 9· 9 9 9 ·« 9 9

Sloučenina BBR 2278 je antrachinonovým protinádorovým lékem s protinádorovou aktivitou a se sníženou kardiotoxicitou, mající následující vzorec:

.COOH

ΌΟΟΗ

Úplný popis sloučeniny BBR 2778 je poskytnut v patentech US 5 587 382, US 5 717 099, US 5 506 232, US 5 616 709 a v J. Med. Chem. 37, 828-837, 1994.

Po nitrožilním (intravenózním) podání dávek od 40 do 60 mg/kg BBR 2778 jako jednotky, obsahující větší dávku (bolus), myším CD1, byl během léčby nebo bezprostředně po jejím zkončení pozorován úhyn některých zvířat.

Takové náhlé úhyny jsou pravděpodobně způsobeny jedním z následujících faktorů, vztahujících se k použití BBR 2778: trombogenní aktivitou; změnou parametrů srážlivosti krve, s následným vytvářením roztroušených nitrožilních sraženin: indukcí anafylaktického šoku; přímým toxickým účinkem na centrální nervový systém; arithmogenní aktivitou; elektrolytickou nerovnováhou. Tento dávkově závislý jev se zmenšuje s poklesem rychlosti injikace (0,1 ml/minutu, 7-8 minut na injikaci) a rovněž prostřednictvím intraperitoneálního podání (do břišní dutiny).

Problémem, v němž spočívá předkládaný vynález, tedy bylo nalézt vhodný prostředek s obsahem sloučeniny BBR 2778 k překonání výše zmíněných nedostatků, zejména náhlých úhynů, pozorovaných po • toto ·· 9 ·· toto ·· « · · · · · · · « ··· · · · · ·· t ··· · e · ···» ··· t » to··· ··· ··· ·· ·· * *· ···· podání jednotek, obsahujících větší dávku aktivní přísady. Překvapivě bylo zjištěno, že liposomový prostředek s BBR 2778, charakterizovaný konkrétním složením, výše uvedený problém řeší.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje liposomový prostředek sloučeniny BBR 2778, sestávající z liposomů, obsahujících fosfatidylcholin, cholesterol a BBR 2778 v hmotnostním poměru cholesterolu a fosfolipidu 1:2 až 1:7 a BBR2778 a fosfolipid v hmotnostním poměru 1:4 až 1:25. Fosfatidylcholin s výhodou zahrnuje zbytky mastných kyselin, zvolené z palmitové kyseliny, olejové kyseliny, linolové kyseliny, γ-linolové kyseliny, linolenové kyseliny a kyseliny stearové a liposomy jsou formovány směsí hydrogenovaných a nehydrogenovaných fosfatidylcholinů, majících zmíněné složení mastných kyselin, v poměru 1:2 až 2:1.

Ještě lépe uvedená směs sestává z hydrogenovaného fosfatidylcholinů, majícího teplotu tání 120 °C a teplotu krystalizace 90 °C a z nehydrogenovaného fosfatidylcholinů, majícího termogram, uvedený na obrázku 5. Hydrogenované a nehydrogenované fosfatidyIchoIiny, mající výše uvedené složení, jsou komerčně dostupné pod názvem Phospholipon® 90 H a Phospholipon® 90.

Prostředek podle vynálezu s výhodou obsahuje, kromě výše zmíněných složek, nabité částice, jako stearylamín a dicetylfosfát. Přídavek takových složek poskytuje liposomům povrchový náboj, který indukuje jejich vzájemnou odpudivost a tím předchází jejich zborcení. Fosfolipidová směs může také obsahovat dodecylsulfát sodný, kremofor RH60, α-tokoferolfosfát a acetát vápenatý. Nadto mohou být do membránové dvojvrstvy zahrnuty malé podíly (5 až 19 molárních

procent) sloučenin s hydrofilními skupinami, jako jsou monosialogangliosid, hydrogenovaný fosfatidylinositol a s lipidem konjugované polyethylenglykoly (PEG-DSPE) ke snížení vzájemného působení liposomů a buněk a složek krve.

Liposomové prostředky podle vynálezu byly testovány in vivo vzhledem k protinádorové aktivitě a toxicitě. Jako model nádoru byla použita myší leukemie P388. Konkrétně byla Inhibiční aktivita náhlých úhynů hodnocena ve srovnání s kontrolní skupinou, které byl podáván prostředek, obsahující volný lék. Podrobnosti jsou uvedeny v Příkladech. Výsledky testů potvrdily, že liposomové prostředky podle vynálezu působí značné zlepšení střední doby přežití a výrazné snížení toxicity. Nadto již nebyly pozorovány náhlé úhyny.

Jako závěr lze konstatovat, že prostředky podle vynálezu si uchovávají protinádorovou aktivitu, aniž by indukovaly náhlý úhyn, který je pozorován v případě podání volného léku nebo jiných běžných prostředků s obsahem aktivní přísady.

Následující příklady podrobněji ozřejmují vynález.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Vyčištění lecitinu na fosfatidylcholin

Hlavním zdrojem lecitinu jsou rostlinné oleje ze sojových bobů, bavlníkových, slunečnicových a řepkových semen, nebo živočičná tkáň (vejce). Sojové a vaječné lecitiny jsou, pokud se týká vyráběných množství, nejdůležitější. Sojové boby jsou podrobeny extrakci hexanem k získání surového lecitinu o polopevné tuhosti, který obsahuje:

t» • ·

% fosolipidů, 35 % olejů a tuků. 10 % glykolipidů a cukrů, 2 % nezmýdelnitelných složek a 1 % vody.

Ze surového lecitinu se extrahují mastné kyseliny k zisku jemného nebo granulárního lecitinového prášku, který se dále extrahuje ethanolem a frakcionuje se k získání čistších lecitinů s vyšším obsahem fosfatidylcholínu.

Surový lecitin byl také čištěn za použití jediného postupu pro průmyslovou výrobu fosfatidylcholínu extrakcí acetonem, jak je uvedeno v patentu US 5 442 267.

Čištění surového lecitinu

SUROVÝ LECITIN

EXTRAKCE (ethanol)

CHROMATOGRAFIE (silikagel)

PHOSPHOLIPON 80

CHROMATOGRAFIE (oxid hlinitý)

PHOSPHOLIN 90 hydrogenace

PHOSPHOLIN 90H

Phospholipon® 90H (PHO 90H) byl získán hydrogenaci Phospholiponu® 90 (PHO 90).

·· 4

- 7 4· · ·4

Dva komerční fosfolipidy (Rhone - Pouleno Rorer) mají následující charakteristiky:

Phospholipon® 90:

- index peroxidů : nejvýše 5

- číslo kyselosti: nejvýše 0,5

- ethanol: nejvýše 0,5 %

- voda: nejvýše 1,5 %

- forma: žlutá pastovitě pevná látka

- přídavek D,L α-tokoferolu: nejméně 0,1 %

Phospholipon® 90H:

- jodové číslo: nejvýše 1

- voda: nejvýše 2,0 %

- teplota fázového přechodu 20% disperze v H₂O přibližně 54 °C

- forma: bílá krystalická pevná látka

Glycerol v molekule fosfatidylcholinu je v polohách 1 a 2 esterifikován mastnými kyselinami, jako jsou kyselina palmitová, kyselina olejová, kyselina iinolová, kyselina linolenová a kyselina stearová.

Příklad 2:

Chromatografická analýza fosfolipidů

Složení mastných kyselin ve vzorcích fosfatidylcholinu bylo jak kvantitativně, tak i kvalitativně stanoveno GLC analýzou (plynovou chromatografií). Mastné kyseliny byly ve vzorcích fosfolipidů detegovány a kvantifikovány jak za použití methylesterů čistých mastných kyselin (Carlo Erba), tak i standardního olivového oleje.

Zmýdelnění vzorku:

mg produktu bylo umístěno do testovací zkumavky, do níž byly přidány 3 ml 0,1 N roztoku hydroxidu sodného (Baker). Testovací zkumavka byla pevně utěsněna a umístěna do vhodné pícky na dobu 1 hodiny při teplotě 110 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti byl vzorek okyselen 2 N roztokem kyseliny chlorovodíkové (Baker) a extrahován 10 ml směsi n-hexan/ethyiacetát v poměru 90/10 (Merck). Rozpouštědlo bylo odstraněno pod slabým proudem dusíku.

Esterifikace vzorků:

Z testovací zkumavky byla odstraněna organická fáze a přidán byl 1 ml BF₃ v methanolu. Poté byla testovací zkumavka pevně utěsněna a uchovávána 1 hodinu při teplotě 100 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti bylo ke vzorku přidáno 5 ml destilované vody a vzorek byl dvakrát extrahován, vždy 5 ml směsi n-hexan/ethylacetát v poměru 90/10 (Merck). 1 μΙ organické fáze byl vysušen nad síranem sodným a poté injikován do zařízení plynové chromatografie.

Pracovní podmínky:

plynový chromatograf: Mega 5300 Carlo Erba kolona: Megawax, délka 30 m, vnitřní průměr 0,32 mm, vel. zrna náplně 0,25 μιη nosič: helium, 45 cm/sec injektor: štěrbina 1/100 při 250 °C detektor: plamenový ionizační (FID) při 280 °C termostat: 120 °C po 1 minutu konečná teplota: 250 °C, s teplotním nárůstem 5 °C/min

- 9 • · ·

Obr. 1 až 3 znázorňují chromatogramy, získané plynovou chromatografíí standardu, PHO 90 a PHO 90H.

Tabulka 1 udává procentní množství kyselin v analyzovaných lipidech.

Tabulka 1

mastné kyseliny	Phospholipon 90	Phospholipon 90H
stearová	4,13	85
palmitová	14,21	14
olejová	9,84	-
linolová	64,44	-
γ-linolová	1,50	-
linolenová	5,88	-

Příklad 3:

Termální analýza fosfolipidů

Komerčně dostupné fosfolipidy Phospholipon 90 a Phospholipon 90H, obě látky jak samotné, tak ve směsi, byly analyzovány pomocí DSC (srovnávací skanovací kalorimetrie, differential scanning calorimetry).

Vzorky byly připraveny následovně: 500 mg PHO 90 bylo rozpuštěno v 10 ml dichlormethanu + 1 ml methylalkoholu (SJ; 500 mg PHO 90H bylo rozpuštěno v 10 ml dichlormethanu + 1 ml methylalkoholu (S₂).

Vzorek 1: 2 ml S₁Vzorek 2: 2 ml S₂

- 10 Vzorek 3: 0,5 ml S₁ + 1,5 ml S₂Vzorek 4: 1 ml S₁ + 1 ml S₂Vzorek 5: 1,5 ml S₁ + 0,5 ml S₂

Vzorky byly vysušeny pod proudem dusíku a slabě zahřátý. Poté byly analyzovány srovnávací skanovací kalorimetrií, DSC. Analýza probíhala na zařízení Mettler DSC 20, zahřívaném na 200 °C s gradientem 3 °C/min. Poté byl vzorek ponechán se zchladit.

Obr. 4 až 5 představují termogramy dvou uvedených fosfolipidů. Jak je zřejmé z obr. 4, PHO 90H má zřetelnou, dobře definovanou teplotu tání při 120 °C a teplotu krystalizace při 90 °C.

Pokud se týká PHO 90, obr. 5 ukazuje, že se nejedná o krystalický prášek, ale pastovitou hmotu, a tedy stejně jako v případě všech tuků, nemá žádnou dobře definovanou teplotu tání, ale teplotu měknutí, což je teplota, při níž tuk začíná téci a teplotu čirosti, což je teplota, při níž je tuk zcela čirý.

To je potvrzeno termogramem PHO 90, na němž je pozorován široký pás, odpovídající teplotě měknutí místo definovaného maxima (píku), jak je tomu v případě termogramu PHO 90H.

Pokud se týká termogramů směsí, při nižších teplotách je pozorováno snížení teploty krystalizace, která dále klesá od směsi PHO 90H:PHO 90 v poměru 2:1 ke směsi v poměru 1:1 a nakonec se zcela ztrácí u směsi PHO 90H:PHO 90 v poměru 1:2, u níž převládá chování složky PHO 90.

Příklad 4:

Příprava liposomového prostředku * · • · ·· · • ·· • · · ·

Do banky s kulatým dnem o objemu 500 ml bylo vloženo 3,6 g PHO 90, 1,8 g PHO 90H (poměr 2:1) a 0,52 g cholesterolu a poté bylo přidáno 50 ml dichlormethanu. Směs byla dezintegrována ultrazvukem (sonikována) po dobu přibližně 10 minut k podpoře rozpouštění. Vzniklý roztok byl odpařen do sucha v rotační odparce (Rotavapor) při 40 °C pod vakuem a za mírného otáčení, dokud nebyl získán homogenní film fosfo I ipidu.

Výsledný fosfolipidový film byl ochlazen, doplněn roztokem BBR 2778, připraveným rozpuštěním 300 mg BBR 2778 v 60 ml směsi vody a propylenglykolu (v poměru 60:40) a zfiltrován přes filtr o průměru pórů 0,22 pm a přes 10 ml skleněných perel o středním průměru 2 mm. Baňka s plochým dnem, připojená na rotační odparku, byla ponechána za mírného otáčení přes noc (15 hodin, 300 otáček za minutu) při teplotě a tlaku místnosti až do úplné rehydratace. Tabulka 2 předkládá analýzu výsledného prostředku s obsahem2778.

Tabulka 2

Prostředek s obsahem BBR 2778
% opouzdření v liposomech	85,82
celková koncentrace BBR 2778 ( v mg/ml)	4,76
% liposomů o velikosti < 0,22 pm	63,53

Příklad 5:

Stanovení protinádorové aktivity liposomů s BBR2778

Zvířata:

myši byly poskytnuty laboratořemi Charles River Breeding Laboratories, Calco, Como, Itálie. Jednalo se o samce ve stáří šest až • · ·

0 0 0 0

- 12 osm týdnů, chovaných za standardních podmínek.

Prostředky:

Jako srovnávací vzorek byla použita sloučenina BBR 2778, rozpuštěná ve sterilní vodě a rovněž jí naředěná bezprostředně před podáním myším v množství 10 mg/kg hmotnosti. Dále byl použit liposomový prostředek podle Příkladu 4.

Model nádoru:

Myší leukemie P388, poskytnuta z NCI Frederick Cancer Facility (USA) se udržuje sériemi intraperitoneálních transplantací u myší DBA2. Myši byly přeočkovány leukémií P388 v množstvím 10⁶ buněk/myš. Liposomové sloučenina a srovnávací standard byly podávány intravenózně 1., 4. a 7. den po transplantaci nádoru.

Protinádorová aktivita byla stanovována jako procentní zvýšení doby přežití myší, vyjádřené T/C procentním poměrem střední doby přežití (TMS) léčené skupiny (T) a střední doby přežití kontrolní skupiny (C):

TMS léčených zvířat

T/C % = --------------------------------- x 100

TMS kontrol, zvířat

Tabulka 3 předkládá výsledky, týkající se protinádorové aktivity BBR2778 v testovaném prostředku.

«· • · · • · ·

- 13 β ·

• 9 ·

9» »

Tabulka 3

sloučenina	dávka (mg/kg/den)	T/C %	TOX*	náhlý úhyn
kontroly		100	0/9	-
roztok	18	199**	1/56	-
BBR 2778	27	226**	9/71	-
	40	159**	32/53	2/53
	60	36**	23/32	2/32
prostředek	nosič	100	0/8
dle Příkladu 4	18	187; 194	0/17
	27	225; 244	0/17
	40	287; 250	2/16
	60	87; 44	17/17

* počet toxických úhynů/celkové množství myší ** střední hodnota z více testů

Srovnání prostředku z Příkladu 4 a roztoku BBR2778 jasně dokládá zmizení náhlých úhynů u myší, jimž byl podáván liposomový prostředek. Analýza každé jednotlivé podávané dávky ukazuje rozdíly týkající se jak T/C %, tak i toxicity, mezi liposomovým prostředkem a prostředkem ve formě roztoku. V dávkách 18 mg/kg a 27 mg/kg nejsou pozorovány žádné podstatné rozdíly v T/C %, zatímco pokud se jedná o toxicitu, je u těchto dávek pozorována pouze po léčbě neopouzdřeným BBR2778.

Prostředek podle vynálezu ve srovnání s BBR2778 v roztoku indukuje v dávce 40 mg/kg výrazné zlepšení střední doby přežití: 287, 250 oproti 159; a výrazné snížení toxicity (12 % oproti 60,4 %). Dávka 60 mg/kg je toxická u obou prostředků.

• · *

- 14 Může tedy být uvedeno, že podávání liposomového prostředku s BBR 2778 podle vynálezu neindukuje náhlé úhyny a rovněž snižuje toxicitu.

Pokud se týká protinádorové aktivity, výsledky z testů, prováděných s BBR2778 v roztoku, jsou potvrzeny, dokonce za výrazného zvýšení T/C % při některých dávkách.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Liposomový prostředek sloučeniny 6,9-bis-[(2-aminoethyl)aminojbenzo[g]isochinolin-5,10-dionu dimaleátu (BBR 2778) o vzorci:

COOH

COOH vyznačující se tím, že zmíněné liposomy zahrnují fosfatidylcholin, cholesterol a sloučeninu BBR 2778 v hmotnostním poměru cholesterolu a fosfoiipidu 1:2 až 1:7 a v hmotnostním poměru BBR 2778 a fosfoiipidu 1:4 až 1:25.
2. Liposomový prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m , že zmíněný fosfatidylcholin obsahuje zbytky mastných kyselin, zvolené z palmitové kyseliny, olejové kyseliny, linolové kyseliny, γ-linolové kyseliny, linolenové kyseliny a kyseliny stearové.
3. Liposomový prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m , že zmíněný fosfatidylcholin je směsí hydrogenovaných a něhydrogenováných forem v hmotnostním poměru 1:2 až 2:1.
4. Liposomový prostředek podle nároku 3, vyznačující se t í m , že zmíněná hydrogenovaná forma má teplotu tání 120 °C a teplotu krystalizace 90 °C a zmíněná nehydrogenovaná forma má termogram, v podstatě odpovídající tomu, který je uveden na obr. 5.
5. Liposomový prostředek podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že liposomy dále obsahují stearylamin a/nebo dicetylfosfát.

• *

- 16 6. Použití liposomového prostředku podle nároků výrobu protinádorového léčiva.