CZ20024268A3

CZ20024268A3 - Prostředek vytvářející micely

Info

Publication number: CZ20024268A3
Application number: CZ20024268A
Authority: CZ
Inventors: Jean-Christophe Leroux; Amina Souad Benahmed
Original assignee: Labopharm, Inc.
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2003-05-14
Also published as: CZ302369B6; WO2002000194A3; CA2414241C; AU2001270405B2; EP1296647A2; NO20026255D0; RU2308943C2; AU7040501A; KR20030039332A; JP5134179B2; DE60122335T2; MXPA03000065A; IL153655A; CA2414241A1; ATE336229T1; BR0112054A; PT1296647E; DE60122335D1; JP2004501180A; PL360262A1

Description

Prostředek vytvářející micely

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká prostředků, zahrnujících polymerní micely, které jsou vhodné pro předávání léčebných činidel včetně, nikoliv však výlučně, protirakovinných léků.

Dosavadní stav techniky

Hlavním nedostatkem, spojeným s použití chemoterapeutických činidel, je nedostatek selektivity vůči rakovinným buňkám. Tento nedostatek selektivnosti souvisí s toxickými vedlejšími účinky použití takových činidel, způsobenými jejich přístupem jak do normálních, tak i abnormálních buněk. Nedostatek selektivnosti léků vůči cílovým buňkám je problémem i při léčbě množství jiných chorob než jen rakoviny. Mnoho výzkumného úsilí bylo zaměřeno na vývoj nosičů léků, které mohou lék selektivně předávat do cílových buněk. Například pro zlepšení specifického dodávání léků s nízkým léčebným indexem byly studovány různé lékové nosiče jako liposomy, mikročástice, nano-asociáty a konjugáty léku a polymeru.

Ze studovaných přístupů, jak dosáhnout zacílení, si značnou pozornost získaly liposomy (fosfolipidové váčky). Jejich účinnost zacílení je ovšem omezena jejich rychlým odklízením retikuloendoteliálními buňkami (RE buňkami) jater a sleziny, nestálostí v plazmě, omezenou schopností vystřikování (extravazace) vzhledem k jejich velikosti, technickými problémy jejich výroby a snadnou oxidovatelností. Byla nalezena řešení jednotlivých problémů, ovšem řešení více než jednoho problému se jen zřídka spojila v případě jednoho prostředku. Například pokud bylo sníženo rozpoznávání RE

- 2 buňkami a byla zlepšena stálost liposomů, bylo zároveň obtížné získat stálé liposomy, mající průměr menší než 50 nm.

Polymerní micely byly prvotně navrženy jako nosiče léků H. Baderem a spoluautory v roce 1984 (Angew. Makromol. Chem. 123/124, 457 až 485, 1984). Polymerní micely byly objektem rostoucí vědecké pozornosti a byly uvažovány jako možné nosiče léků, majících špatnou rozpustnost ve vodě, neboť mohou tyto léky ve svém vnitřním jádře rozpouštět a nabízejí také přitažlivé charakteristiky, jako je obecně malá velikost (menší než 100 nm) a sklon vyhýbat se odstranění prostřednictvím retikuloendoteliálního systému (RES).

Micely jsou často srovnávány s přirozeně se vyskytujícími nosiči, jako jsou viry nebo lipoproteiny. Všechny tři typy těchto nosičů vykazují podobnou strukturu jádro-obal, která umožňuje ochranu jejich obsahů během transportu k cílové buňce, ať už se jedná o DNA u virů nebo vodou nerozpustné léky u lipoproteinů a micel.

Lipoproteiny byly navrženy jako nosné prostředí pro zacílení protinádorových sloučenin na rakovinné buňky, neboť nádory vykazují zvýšenou potřebu lipoproteinů o nízké hustotě. Účinnost lipoproteinů jako nosičů byla zpochybňována; ovšem zejména proto, že by lipoproteiny, které začlenily léčivo, měly být rozeznatelné také zdravými buňkami a měly by soutěžit s přírodními lipoproteiny o receptorová místa v nádorech. Naproti tomu virové nosiče se používají zejména pro přenos genetického materiálu a mohou být nejlépe použity v takových aplikacích, které nevyžadují opakované podávání nosného prostředí, neboť pravděpodobně vyvolávají imunitní odpověď.

Polymerní micely se zdají být jedním z nejvýhodnějších nosičů k přenosu vodou nerozpustných léků. Polymerní micely jsou charakterizovány strukturou jádra a obalu. Farmaceutický výzkum • · · · polymerních micel byl soustředěn zejména na kopolymery, mající dvojblokovou strukturu A-B, přičemž A je hydrofiliní částice obalu a B je hydrofobní polymerní jádro: Do micel mohou být organizovány také multiblokové kopolymery jako poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) (PEO-PPO-PEO) (A-B-A), které byly popsány jako možné nosiče léků; A. V. Kabanov se spoluautory, FEBS Lett. 258, 343 až 345, 1989. Hydrofobní jádro, které obecně sestává z biologicky odbouratelného polymeru jako je poly(p-benzyl-L-aspartát) (PBLA), poly(DL-mléčná kyselina) (PDLLA) nebo poly(s-kaprolakton) (PCL), slouží jako zásobník nerozpustného léku, který ho chrání před stykem s vodným prostředím. Jádro může sestávat také z vodou rozpustného polymeru, jako je poly(kyselina asparagová) (P(Asp)), který získá hydrofobnost chemickou konjugací s hydrofobním lékem, nebo je vytvořen asociací dvou opačně nabitých polyiontů (polyiontové komplexní micely).

Několik studií popisuje užití biologicky slabě odbourávatelných nebo zcela neodbouratelných polymerů jako je polystyren (Pst) nebo poly(methylmethakrylát) (PMMA) jako složek inertního jádra. Viz například C. L. Shao se spoluautory, Langmuir 6, 514 - 516, 1990, L. Zhang se spoluautory, Science 268, 1728 - 1731, 1995 a T. Inoue se spoluautory, J. Controlled Release 51, 221 - 229, 1998. K tomu, aby byly považovány za klinicky odpovídající nosiče léčiv, musí být biologicky neodbouratelné polymery netoxické a mít molekulovou hmotnost dostatečně nízkou pro možnost vyloučení močovými cestami. Hydrofobní vnitřní jádro může také sestávat z vysoce hydrofobního malého řetězce jako je alkylový řetězec nebo diacyllipid, jak je tomu u distearoylfosfatidylethanolaminu (DSPE). Hydrofobní řetězec může být buď připevněn na jeden konec polymeru, nebo může být v polymerní struktuře náhodně distribuován.

• · • · · ·

- 4 Obal zodpovídá za stabilizaci micely a za její interakce s plasmatickými bílkovinami a s buněčnými membránami. Obvykle sestává z řetězců hydrofilních biologicky neodbouratelných a biologicky slučitelných polymerů jako je PEO. Biologická distribuce nosiče je určována hlavně povahou hydrofilního obalu. Jiné polymery, jako poly(N-isopropylakrylamid) (PNIPA) a poly(kyselina alkylakrylová), poskytují micelám citlivost vůči teplotě nebo pH a mohou být případně použity k poskytnutí vlastností biologické přilnavosti. Známé jsou také micely, vykazující na svém povrchu funkční skupiny pro spojení s cílovou částicí, viz například C. Scholz se spoluautory, Macromolecules 28, 7295 - 7297, 1995.

Dobře známým vodou rozpustným, biologicky slučitelným amfifilním polymerem je poly(N-vinyl-2-pyrrolidon) (PVP), mající vysoce polární laktamovou skupinu obklopenu nepolárními methylenovými skupinami v kostře a methynovou skupinou v kruhu. PVP se běžně používá jako sterický stabilizátor pro syntézy polystyrénových latexů. Viz například L. I. Gabaston se spoluautory, Macromolecules 31, 2883 2888, 1998; J. S. Rutt se spoluautory, J. Polym. Sci.: díl A: Polym. Chem. 32, 2505 - 2515, 1994, PVP lze použít také jako kryo-ochrannou látku a lyo-ochrannou látku. Viz například Η. B. Skaer se spoluautory, J. Microsc. 110, 257 - 270, 1977; M. W. Townsend se spoluautory, J. Parenter. Sci. Technol. 42, 190 - 199, 1988.

Ve srovnání s PEG je PVP významný rozdílností interakcí, které vykazuje vzhledem k neiontovým i iontovým, společně rozpuštěným látkám. Viz P. Molyneux, Proč. Int. Symp. Povidone, 1 - 19, 1983. Vazba se uskutečňuje nejvýrazněji s molekulami, majícími dlouhé alkylové řetězce nebo aromatické částice. Podobně jako PEG, může také PVP zvýšit in vivo dobu oběhu koloidních nosičů a peptidů/bílkovin. Viz například H. Kamada se spoluautory, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257, 448 - 453, 1999; V. P. Torchilin, J. Microencapsulation ·· · · • · · ·

15, 1 - 19, 1998. Dále bylo prokázáno, že nanočástice, obsahující diblokové kopolymery poly(D,L-mléčné kyseliny) a poly(ethylenglykolu) (PEG), agregují po lyofilizaci. Viz F. De Jaeghere se spoluautory, Pharm. Res. 16, 859 - 866, 1999. Tento problém se podařilo obejít použitím lyo-protektivní látky. Tuto obtíž by bylo možné řešit i použitím PVP, neboť samotný PVP je lyo-protktivní látkou.

N-vinylpyrrolidon (VP) může být kopolymerizován velkým množstvím různých vinylových monomerů. S elektronegativními monomery vytváří střídavé (alternující) kopolymery, zatímco s akryláty vytváří náhodné kopolymery. Připraven byl například roubovaný kopolymer (graft copolymer), který tvoří poly(L-laktid) (PLLA) a polyvinylpyrrolidon (PVP). Viz například J. L. Eguiburu se spoluautory, J. San Roman, Polymer 37, 3615-3622, 1996. V této studii byl makromonomer PLLA kopolymerizován s VP, ovšem vytvoření polymerních micel nebylo hodnoceno.

Až do současnosti se většina studií, týkajících se přípravy biologicky odbouratelných polymerních micel, soustředila na využití PEG (polyethylenglykolu) k vytvoření hydrofilního obalu. Viz například X. Zhang se spoluautory, Inter. J. Pharm. 132, 195-206, 1996; M.

Yokoyama se spoluautory, J. Control, Release 55, 219-229, 1998 a C. Allen se spoluautory, J. Control. Release 63, 275-286, 2000.

Stále tedy přetrvává potřeba nových, biologicky slučitelných a biologicky odbouratelných polymerních micelárních systémů bez obsahu PEG, které by však vykazovaly dobré solubilizační vlastnosti a poskytovaly několik vazných míst pro různé léky. Měly by být také snadno opět dispergovatelné nebo opět rozpustné po přidání vody ke své lyofilizované formě. Předkládaný vynález takový systém vytvořil z dvojbloku obsahujícího PVP-poly(D,L-laktid), tj. PDLLA.

- 6 Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje prostředek vytvářející micely, který obsahuje:

hydrofobní jádro, obklopené hydrofilním obalem, přičemž uvedeným hydrofilním obalem je polyvinylpyrrolidon, PVP.

Předkládaný vynález dále poskytuje prostředek vytvářející micely, který obsahuje:

léčebné činidlo; a hydrofobní jádro, obklopené hydrofilním obalem, přičemž uvedeným hydrofilním obalem je PVP a léčebné činidlo je obsaženo ve zmíněné micele.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob plnění polymerních micel alespoň jedním vhodným léčebným činidlem.

Předkládaný vynález také poskytuje polymerní micelární prostředek, obsahující léčebné činidlo, kde léčebné činidlo může být chráněno proti chemickým interakcím, jako je hydrolýza, tak, že je obsaženo uvnitř hydrofobního jádra nebo hydrofilního obalu zmíněné micely.

Tyto a další rysy a výhody předkládaného vynálezu budou odborníkovi s běžnými znalostmi oboru srozumitelnější z následujícího podrobnějšího popisu vynálezu.

Předkládaný vynález poskytuje koloidní prostředek, sestávající z polymerních micel, které mohou být použity k dodávání léčebných činidel, majících špatnou rozpustnost ve vodě a/nebo specifickou afinitu k hydrofilnímu obalu. Polymerní micely jsou chrakterizovány strukturou • · · · • ·

- 7 • · · · • · · · jádra a obalu, přičemž hydrofobní jádro je obklopeno hydrofilním obalem. Hydrofilní obal obsahuje hydrofilní polymer nebo kopolymer.

Hydrofilním polymerem podle předkládaného vynálezu je polymer nebo kopolymer poly(N-vinyl-2-pyrrolidonu), PVP.

Hydrofobní částice vytváří jádro micely. Hydrofobní částice může být zvolena z polyesterů, jako poly(glykolové kyseliny), poly(mléčné kyseliny), poly(D-mléčné kyseliny), poly(D,L-mléčné kyseliny), z laktidových/glykolidových kopolymerů, polykaprolaktonu a jeho derivátů; z polyorthoesterů a jejich derivátů; z polyanhydridů a jejich derivátů; z pseudo-poly(aminokyselin) odvozených od tyrosinu a jejich derivátů; z polyfosfazenů a jejich derivátů; z poly(alkylakrylátu) a jeho derivátů; z poly(P-benzyl-L-aspartátu) a jeho derivátů a z kombinací takových látek. Upřednostňovanou hydrofobní částicí je poly(L, D-laktid), PDLLA. Sloučenina PDLLA je přítomna v koncentraci přibližně od 10 % do 50 % (hmotnost/hmotnost).

Vytváření micei

K vytváření micei dochází v důsledku dvou sil. Jednou je přitažlivá síla, která vede ke sdružování (asociaci) molekul, zatímco druhou silou je odpudivá síla, která v určité makroskopické fázi zamezuje neomezenému růstu micei. Amfifilní kopolymery se samy sdružují (typ self-associate), pokud jsou umístěny do rozpouštědla, které je selektivní, výběrové, buď pro hydrofilní, nebo pro hydrofobní polymer.

Proces micelizace amfifilních kopolymerů je podobný tomuto ději u povrchově aktivních látek o malých molekulových hmotnostech. Při velmi malých koncentracích existují polymery pouze jako jednotlivé řetězce. Jak se koncentrace zvyšuje k dosažení kritické hodnoty, nazývané

kritická koncentrace asociace, CAC, začnou se řetězce polymerů sdružovat, spojovat, k vytvoření micel takovým způsobem, že hydrofobní část kopolymeru se bude vyhýbat styku s vodným médiem, v němž je polymer rozpuštěn. Při dosažení CAC se může podstatné množství rozpouštědla nacházet uvnitř micelárního jádra a micely jsou popisovány jako volné, nespojité agregáty, vykazující větší velikost než micely, vytvořené při vyšších koncentracích. Při takových koncentracích bude rovnovážný stav upřednostňovat tvorbu micel, micely přijmou uspořádání nízkoenergetického stavu a zbývající rozpouštědlo bude z hydrofobního jádra rostoucím způsobem uvolňováno, výsledkem čehož bude zmenšení velikosti micel.

Amfifilní kopolymery obvykle vykazují CAC mnohem nižší, než je tomu u povrchově aktivních látek o malé molekulové hmotnosti. Například CAC pro PEO-PBLA a PNIPA-PSt jsou mezi 0,0005 a 0,002 %. Některé amfifilní kopolymery však vykazují mnohem vyšší CAC, dosahující až 0,01 až 10 % v případě poloxamerů. Amfifilní kopolymery s vysokou CAC nemusí být vhodné jako nástroj k zacílení léčiv, neboť jsou nestálé ve vodném prostředí a během zředění jsou snadno disociovány (děleny).

Micelizace amfifilních kopolymerů může poskytnout dva odlišné typy micel v závislosti na tom, zda je hydrofobní řetězec náhodně vázán na hydrofilní polymer, nebo zda je naroubován na jeden konec hydrofilního řetězce. Micely, vytvářené z náhodně modifikovaných, pozměněných polymerů, jsou obecně menší než koncově modifikované polymery. Micelární velikost je určena zejména hydrofobními silami, které oddělují (sekvestrují) hydrofobní řetězce v jádře, a odpuzováním vyloučeného objemu mezi řetězci, které limituje jejich velikost. Rozdíl v rovnováze těchto dvou sil může u náhodných a u koncově modifikovaných kopolymerů vyvolávat jejich odlišnou velikost. Když se koncové hydrofobní skupiny sdružují k vytvoření micel, jsou vodné

- 9 shluky, znehybněné kolem hydrofobních segmentů, vyloučeny z jádra a neexistuje přímá interakce mezi jádrem a hydrofilním obalem, který v micelární struktuře zůstává ve formě pohyblivých rovných řetězců. Ovšem náhodně modifikované polymery se sdružují takovým způsobem, že se hydrofilní a hydrofobní části polymeru smotají dohromady, což umožňuje případný styk jádra s vodným médiem. To je důležitým bodem, neboť vystavená hydrofobní jádra mohou vyvolávat druhotné sdružování polymerních micel. Druhotné sdružování (agregace) bylo také navrženo jako hypotéza k vysvětlení přítomnosti větších částic (> 100 nm) v micelárních systémech PEO-P(Asp), nesoucího konjugovaný doxorubicin (DOX).

Stanovení kritické asociační koncentrace (CAC)

Ke stanovení molekulové hmotnosti a agregačního čísla micel se široce používá rozptyl světla. Nástup micelizace však může být detegován pouze tehdy, pokud velikost CAC spadá do rozmezí citlivosti metody měření rozptylu. V případě polymerů ve vodě k tomu dochází jen zřídka. Použita může být gelová permeační chromatografie (GPC) ve vodných podmínkách, neboť jednotlivé řetězce a micelární podíly kopolymerů vykazují odlišné eluční objemy. Pomocí GPC je možné také souběžné stanovení molekulové hmotnosti micel a jejich agregačního čísla. Je důležité, aby integrita, neporušenost, polymerních micel byla uchována během jejich eluce sloupcem, rozdělujícím látky podle jejich molekulové velikosti. Problém může vyvolat také adsorpce polymeru na sloupec a to zvláště při koncentracích blížících se CAC, kdy micely sestávají z větších uvolněných agregátů.

Upřednostňovaná metoda ke stanovení CAC zahrnuje použití fluorescenčních sond, z nichž se nejvíce používá pyren. Pyren je kondenzovaný aromatický uhlovodík, který je vysoce hydrofobní a citlivý vůči polaritě okolního prostředí. Při koncentraci menší než CAC je pyren • · « ·

- 10 • · · · rozpuštěný ve vodě, médiu o velké polaritě. Když se vytvářejí micely, pyren se odděluje především směrem k hydrofobní oblasti vytvářené micelárním jádrem a je tak v nepolárním prostředí. Následkem toho jsou pozorovány početné změny, jako zvýšení intenzity fluorescence, změna jemné vibrační struktury emisního (vyzařovaného) spektra a rudý posuv pruhu (0,0) v excitačních spektrech. Zdánlivá hodnota CAC může být získána ze závislosti fluorescence pyrenu, poměru l/lg z emisních spekter nebo poměru l₃₃₈/l₃₃₃ z excitačních spekter vůči koncentraci. Hlavní změna sklonu ukazuje nástup micelizace. Poměr je poměr intenzity prvního a třetího nejvyššího energetického emisního maxima (píku) a měří se při konstantní vlnové délce excitace a proměnných emisních vlnových délkách, odpovídajících l_d a l₃. Hodnota CAC, získaná fluorescenčními postupy, musí být opatrně interpretována a to ze dvou důvodů. Jednak musí být koncentarce pyrenu udržována na extrémně nízké hodnotě (10‘⁷ mol.l'¹), neboť změna sklonu může být přesně zachycena jen při nástupu micelizace. Za druhé může být postupná změna fluorescenčního spektra někdy vyvolána přítomností hydrofobních nečistot nebo asociací, sdružováním, sondy s jednotlivými polymerními řetězci či předmicelárními agregáty. S nástupem micelizace bývaly rovněž spojovány změny anizotropie fluorescenčních sond.

Polymerní micely, jako jsou micely z prostředků podle tohoto vynálezu, jsou charakterizovány svou malou velikostí (10 až 100 nm). Kromě toho, že je potřebná pro vystřikování (extravazaci) nosičových materiálů, tato malá velikost umožňuje sterilizaci prostředků pouhou filtrací a minimalizuje riziko embolie kapilár (vlásečnic). To není situace, k níž dochází u nosičů objemnějších léčiv.

Micelární velikost závisí na několika faktorech včetně molekulové hmotnosti kopolymeru, relativním poměru hydrofilních a hydrofobních řetězců a na agregačním čísle. Velikost micel, připravených dialýzou, • Λ

může být narušena organickým rozpouštědlem, použitým k rozpuštění polymeru.

Micelární průměr a rozdělení velikostí (size polydispersity) mohou být získány přímo ve vodě nebo v isotonickém pufru dynamickým rozptylem světla (DLS, dynamic light scattering). DLS může také poskytovat informace o kulovitosti polymerních micel.

Micelární velikost je možné určit také metodami, jako je mikroskopie na bázi atomových sil (atomic force microscopy, AFM), transmisní elektronová mikroskopie (transmission electron microscopy, TEM), a srovnávací elektronové mikroskopie (scanning electron microscopy, SEM). Tyto metody umožňují charakterizaci tvaru micel a rozdělení jejich velikostí. Někdy se pro stanovení polydisperzity polymerních micel provádějí studie rychlosti ultracentrifugace.

Inkorporace léčebných činidel do polymerních micel

Naplnění léčebného činidla do micel může být prováděno postupy, které jsou dobře známé odborníkovi v oboru. Plnění se může provádět například rozpuštěním sloučeniny v roztoku obsahujícím předem vytvořené micely, postupem olej ve vodě nebo dialytickou metodou.

Léčebnými činidly, která lze použít, jsou jakékoli sloučeniny, včetně těch, které jsou uvedeny níže, které mohou být zachyceny, a to stálým způsobem, v polymerních micelách a podávány v léčebně účinné dávce. S výhodou jsou léčebná činidla, používaná i podle tohoto vynálezu, hydrofilní, aby je bylo možné účinně plnit do micel. Avšak může být použito i vytváření stálých komplexů mezi iontovými micelami a opačně nabitými hydrofilními sloučeninami, jako jsou protisměrně čtené nukleotidy. Vhodné léky zahrnují protinádorové sloučeniny jako ftalocyaniny (například ftalocyanin chloridu hlinitého), antracykliny

- 12 ·· ·« « ·

(například doxorubicin, DOX), špatně rozpustné antimetabolíty (například methotrexát, mitomycin, 5-fluoruracil) a alkylační činidla (například karmustin). Micely mohou obsahovat také taxany, jako paclitaxel.

Přídavné léky, které mohou být obsaženy v micelách, jsou běžná hydrofobní antibiotika a fungicidy jako amfotericin B, vodou špatně rozpustné imunomodulátory jako cyklosporin, vodou špatně rozpustné protivirově léky jako inhibitory HlV-proteázy a vodou špatně rozpustné steroidní (jako dexamethasin), nesteoidní (jako indomethacin) a protizánětlivé látky a genomové fragmenty.

Léky mohou být do polymerních micelárních prostředků podle tohoto vynálezu začleněny pomocí chemické konjugace (spojení) nebo fyzikálním zachycením prostřednictvím dialýzy, emulgačních postupů, jednoduchým uvedením léku a micel ve vodném prostředí do rovnovážného stavu, nebo rozpuštěním (solubilizací) pevné disperze léku/polymeru ve vodě.

Do polymerních micelárních prostředků podle tohoto vynálezu mohou být začleněny také hydrofilní sloučeniny, jako jsou bílkoviny. Začlenění takových hydrofilních látek může ovšem vyžadovat chemickou hydrofobizaci molekuly nebo částečnou afinitu k hydrofilnímu obalu. Polyiontové sloučeniny mohou být začleněny vytvořením polyiontových komplexních micel.

Fyzikální zachycení léků se obecně provádí dialýzou nebo postupem k vytvoření emulze oleje ve vodě. Dialytická metoda sestává z přenesení léku a kopolymeru z rozpouštědla, v němž jsou obě tyto látky rozpustné, jakým je ethanol nebo Ν,Ν-dimethylformamid, do rozpouštědla, které je selektivní pouze pro hydrofilní část polymeru, jakým je voda. Jakmile je první rozpouštědlo nahraženo druhým,

A · · · · * • A selektivním rozpouštědlem, hydrofobní část polymeru se sdružuje k vytvoření micelárního jádra, začleňujícího během tohoto procesu nerozpustný lék. Úplného nahrazení organického rozpouštědla může být dosaženo prodloužením dialýzy po dobu několika dnů.

Při metodě poskytující emulzi oleje ve vodě se roztok léku ve vodou nerozpustném těkavém rozpouštědle, jako je chloroform, přidá k vodnému roztoku kopolymerů k vytvoření emulze typu oleje ve vodě. S odpařováním rozpouštědla se vytváří konjugát micel a léku. Hlavní výhodou dialyzačního postupu oproti způsobu dříve popsanému je to, že se lze vyhnout používání případně toxických rozpouštědel, jako jsou chlorovaná rozpouštědla.

Postup, jakým je lék plněn, může ovlivnit rozdělování léku do micel. Například Cao se spoluautory (Macromolecules 24, 6300 - 6305, 1991) prokázal, že pyren, začleněný do micel v době jejich vytváření, nebyl chráněn před vodným prostředím tak dobře jako pyren, začleněný až po vytvoření micel, i když první způsob poskytoval trojnásobně vyšší naplnění lékem než druhý způsob.

Účinnost zachycování polymerními micelami podle vynálezu záleží na počátečním množství přidaného léku. Překročení nejvyšší kapacity plnění má za následek srážení léčebného činidla a následně i nižší výtěžek. Účinnost plnění léčebného činidla dále závisí na agregačním čísle kopolymerů. Micely vykazující vyšší agregační číslo umožňují rozpuštění většího množství léku ve svém vnitřím jádru.

Příklady polymerních micel, naplněných léčebným činidlem

V Tabulce 1 jsou uvedeny příklady sloučenin, plněných do polymerních micel a odpovídající plnící postupy. Polymerní micelární prostředky podle tohoto vynálezu se považují za vhodné pro použití jako

- 14 •44* dodávací systémy pro širokou škálu léčebných činidel, včetně, nikoli však výlučně, protirakovinných léků, plasmidové DNA, protisměrně čtených nukleotidů, nebo pro dodávání diagnostických činidel do konkrétného tělního orgánu.

Tabulka 1

Příklady léků a značených látek, plněných do polymerních micel
lék	polymer	typ začlenění	velikost micely s lékem (nm)
amfotericin B	PEO-PBLA	P	26
protisměrně čtený nukleotid	PEO-P(Lys)	EA	50
cisplatin	PEO-P(Asp)	C	16
cyklofosfamíd	PEO-P(Lys)	C	n. a.
dequalinium	PEO-PE	P	15
doxirubicin (DOX)	PEO-P(Asp)	C	50
DOX	PEO-P(Asp)	C	14 - 131
DOX	PEO-P(Asp)	C	17-42
DOX	PEO-PBLA	P	30
DOX	PEO-PDLLA	P	n. a.
DOX	PEO-PBLA	P	37
DOX	PEO-P(Asp)	P+C	n. a.
DOX	PNIPA-PBMA	P	n. a.
DOX	PAA-PMMA	P	n. a.
Gd-DTPA-PE ¹²²ln-DTPA-SA	PEO-PE	P	20
haloperidol	PEO-PPO-PEO	P	n. a.

·· ··*« * 9· ·

- 15 • 4

4 «

• 4 ·

4 1 * · 4 » · ·

4 4 • *4 » • · * ·

haloperidol	PEO-PPO-PEO	P	15
indomethacin	PEO-PBLA	P	25 - 29
indomethacin	PEO-PCL	P	145-165
indomethacin	PEO-PCL	P	14-156
jod. deivát kys. benzoové	PEO-P(Lys)	c	80
KRN - 5500	PEO-PBLA	P
	PEO-(C₁₆, BLA)		71*
	PEO-P(Asp, BLA)
paclitaxel	PEO-PDLLA	P	n. a.
paxlitactel	LCC	P	<100
plasmidová DNA	PEO-P(Lys)	EA	140-150
sojový inhibitor trypsinu	PEO-PE	P	15
testosteron	PEO-PDLLA	P	n. a.
ellipticinový inhibitor topoizomerázy II	PEO-PE	P	n. a.

n.a. = nejsou k sispzici údaje; P = fyz. zachycení; C = chemická vazba; EA = elektrostatické sdružování (asociace) * po rozrušení ultrazvukem (sonikaci) agregátů PEO(C₁₆, BLA)

Důkaz o začlenění léku je možné získat metodami GPC nebo DLS, neboť obě tyto metody detegují změny velikosti micel. Umístění léku dovnitř micelárního jádra může být prokázáno zhášecími pokusy. Například jod (I), který je vodou rozpustný zhášeč DOX, neovlivňuje fluorescenci do micel začleněného léku, ale zháší fluorescenci volného léku. Takové pokusy prokázaly, že DOX byl byl zachycen v PEO-PBLA po lyofylizaci a opětném rozpuštění ve vodě. V případě DOX má samospojování (self-association) léku v micelárním jádře za následek • · ♦♦ *··· * · · « · • · · *

- 16 • · · · · * ······· ·« · · snížení intenzity fluorescence léku. Nedávno bylo nepřímo zjištěno zachycování a pomalé uvolňování amfotericinu B z polymerních micel měřením snížení jeho hemolytické aktivity po začlenění do micel typu PEO-PBLA.

Farmaceutické použití

Polymerní micelární prostředky podle tohoto vynálezu jsou vhodné pro použití v mnoha různých farmaceutických oblastech, jako je orální podávání, prodloužené uvolňování a místně specifické zacílení léku. S výhodou se micely podle předkládaného vynálezu používají k přenosu vodou nerozpustných léků.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklad je ilustrativní a není zamýšlen jako omezení rozsahu předkládaného vynálezu.

Materiály

Komerční rozpouštědla byla získána od firmy Moquin Scientific (Terrebonne, Quebec) a reagencie od firmy Aldrich (Milwaukee, Wi). N-vinyl-2-pyrrolidon (VP), 2-isopropoxyethanol, 35% (procenta hmotnostní) hydrid draselný (KH) v minerálním oleji a 18-crown-6 byly použity bez dalšího čištění. D,L-laktid byl trojnásobně rekrystalizován z bezvodého ethylacetátu při teplotě 60 °C a poté byl při teplotě místnosti sušen 24 hodin za sníženého tlaku a nad P₂O₅. Tetrahydrofuran (THF) byl refluxován (udržován za varu pod zpětným chladičem) a těsně před použitím byl destilován nad sodíkem a benzofenonem pod vysušenou argonovou atmosférou. 1,1 '-azobis(cyklohexankarbonitril) (ACCN) byl čištěn vysrážením z ethanolového roztoku do vody a sušen po dobu 4 dnů pod vakuem. Sepharose 2B byla získána od firmy Sigma (Saint *· «♦»·

Louis, MO) a před použitím byla uvedena do rovnovážného stavu přidáním vody. Dialyzační vaky, použité při přípravě micel, byly typu Spectra/Por Membranes od firmy Raného Dominguez, CA, MWCO 6000-8000. Veškeré reakce byly prováděny v baňkách s kulatým dnem, které byly předem sterilizovány plamenem a opatřeny gumovou přepážkou pod atmosférou vysušeného argonu.

Molekulové hmotnosti byly určovány gelovou permeační chromatografií (GPC, Waters Model 600, Milford, MA) za použití programu Millenium software. Použity byly tři sloupce Styragelu (Waters, HR1, HR3, HR4, 4,6 x 300 mm) a rozlišovací refraktometrický detektor (Waters 2410). Mobilní fází byl CHCI₃ (30 °C a 1 ml/min). Kalibrace sloupce byla uprovedena polystyrénovými standardy (Aldrich, Milwaukee, Wl). ¹H a ¹³C NMR spektra byla zaznamenána na spektrometrech Varian 300 a Brucker AMX 600 v deuterovaném chloroformu.

Kritická asociační konstanta (CAC) byla stanovena metodou fluorescence pyrenu v ustáleném (rovnovážném) stavu. Již dříve bylo prokázáno, že se vzrůstajícími koncentracemi amfifilních polymerů ve vodném roztoku pyrenu dochází v excitačním spektru pyrenu k posunu pruhu (0,0) z 333 nm na 338,5 nm. Tato změna, měřená jako poměr intenzity l₃₃₈/l₃₃₃, doprovází přechod pyrenových moleku z vodného prostředí do hydrofobních micelárních jader a je možné ji použít k předběžnému výpočtu zřejmé CAC.

Připraveno bylo několik roztoků polymeru ve vodě, lišících se koncentrací polymeru, ale obsahujících vždy 10'⁷ mol.l'¹ pyrenu a tyto roztoky byly ponechány míchat přes noc ve tmě a při teplotě 4 °C. Fluorescenční spektra v ustáleném stavu byla měřena (λ_βΓη = 390 nm) po 5 minutách za míchání při 20 °C a za použití fluorimetru Serie 2 Aminco ·· >··· *

ι «

«

- 18 • · 9

9 «

9 9

9 · · ·· ··

Bowman (Spectronics Instruments lne., Rochester, NY). Velikost micel byla stanovována ve vodě a v PBS (fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku) při 20 °C rozptylem dynamického laseru (DLS) za použití analýzy typu Unimodal and differential size distribution processor intensity analysis, SDP (N4Plus, Coulter Electronics, Hialeah, FL).

Příprava PVP-OH

Hydroxyskupinou zakončený polyvinylpyrrolidon (PVP-OH) byl připraven radikálovou polymerizací za použití 2-isopropoxyethanolu jako přenašeče řetězce. Sloučeniny VP (5 ml, 47 mmol) a ACCN (0,11 g, 0,45 mmol) byly rozpuštěny v 60 až 300 ml 2-isopropoxyethanolu. Tyto roztoky byly odplyněny argonem. Polymerizace probíhala při 80 °C za míchání a pod atmosférou suchého argonu po dobu 24 hodin. Po odpaření 2-isopropoxyethanolu byl polymer vysrážen v přebytku diethyletheru. Takto získaný bílý prášek byl trojnásobně čištěn rozpuštěním v minimálním množství CH₂CI₂ a vysrážením z dietyletheru. Nakonec byl vysušen pod vakuem.

Charakterizace PVP-OH ¹H NMR 5(ppm): 1,15 (m, CH₃), 3,5-4 (široký signál, CH PVP) ¹³C NMR 5(ppm): 175 (C=O PVP), 63,05 (CH₂OH)

Tabulka 1: průměrné molekulové hmotnosti PVP

PVP-OH č. šarže	rozpouštědlo/VP (objemový poměr)	M_w	M_n	M7M_n
1	12	8 516	4 731	1,8
2	30	5 726	4 090	1,4

φ φ Φφφφ • φ

- 19 ΦΦ φ φ φ

« φ

• φφφφ

Φ 1 » Φ Φ 1 φφ φφ

3	30	7 163	3 964	1,8
4	40	5 900	3 278	1,8
5	60	4 585	2 413	1,9

Průměrné molekulové hmotnosti PVP-OH jsou uvedeny v Tabulce

1. Je zřejmé, že molekulová hmotnost klesá s tím, jak se zvyšuje objemový poměr rozpouštědla vůči VP.

Příprava blokového kopolymerů PVP-PDLLA

Blokový kopolymer byl získán aniontovou polymerizací za otevření kruhu.

Sloučenina KH (0,567 g, 14 mmol) byla umístěna do baňky s kulatým dnem pod proudem argonu. Dvouhrotou pipetou (jehlou) byl přidán bezvodý tetrahydrofuran, výsledná disperze byla rychle míchána a poté byl THF opět odstraněn. Do baňky bylo přidáno 30 ml THF a disperze byla ochlazena na 0 °C. PVP-OH, předem 24 hodin sušený pod vakuem při 60 °C a nad P₂O₅, byl rozpuštěn v 30 ml THF při 60 °C. Tento roztok byl přidán k míchané disperzi za použití dvouhroté pipety a výsledný roztok byl udržován 1 hodinu při teplotě 0 °C. Po ohřátí na teplotu místnosti pokračovalo míchání po dobu dalších 4 hodin. Následně byla disperze převedena do jiné baňky a při teplotě místnosti byl přidán 18-crown-6 (0,085 g, 0,32 mmol) a míchán 30 minut. Polymerizace D,L-laktidu byla iniciována rychlým přídavkem D,L-laktidu (1,5 g, 10 mmol), rozpuštěného v 20 ml THF. Po 16 hodinách byla polymerizace ukončena přídavkem 1 ml kyseliny octové a 5 ml vody. Roztok polymeru byl k vytvoření micel dialyzován proti vodě po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C. Po dialýze byl roztok odstřeďován 30 minut při 40 790 x g k odstranění jakéhokoliv homopolymeru poly(D,L-laktid)u (PDLLA). Supernatant byl zmražen a lyofilizován v lyofilizačním přístroji

- 20 9 99

9 9 «

9 • 9

999 9999 •9 9999

9999

9 9 9 9 φ • 9 9 9 9 9 9 • ·9 9 9 99 9

99 99 99 firmy Labconco, modelu 77 535 (Kansas City, Missouri). Lyofilizovaný prášek byl opět rozpuštěn ve vodě a volný PVP-OH byl odstraněn průchodem přes sloupec Sepharose 2B (Pharmacia, 1 x 40 cm). Micelární roztok byl zmražen, v průběhu dvou dnů lyofilizován a skladován při teplotě -20 °C až do svého použití.

Charakterizace PVP-PDLLA ¹H NMR ó(ppm): 5,2 (m, CH PDLLA), 3,5-4 (široký signál, CH PVP) ¹³C NMR 5(ppm): 175 (C=O PVP), 169 (C=O PDLLA) 69,8 (CH-CH₃

PDLLA), 17,2 (CH-CH₃ PDLLA)

Tabulka 2: Charakterizace PVP-PDLLA a polymerních micel

PVP-OH šarže č.	PVP-PLA šarže č.	PVP:PLA (% hm.)^a	M_w	M_n	MJM_n	velikost micel^b ve vodě (nm)	velikost micel^b v PBS (nm)	CAC (mg/l)
1	1a	59:41	15151	7955	1,9	56±24	44±21	10,2
2	2a	74:26	8500	5500	1,5	54±24	59±25	3,4
3	3a	60:40	8985	6576	1,3	106±45	95±37	2
3	3b	33:67	14 500	12 084	1,2	168±71	160±64	2,6
3	3c	88:12	6700	4500	1,4	74±31	92±41	22,4
4	4a	60:40	7134	5488	1,3	51 ±22	48±19	1,9
4	4b	64:36	7920	5100	1,5	50±22	68±31	2,5
5	5a	65:35	5737	3685	1,5	48±21	58±23	4,3

a) stanoveno pomocí GPC

b) z unimodální analýzy

Syntetizováno bylo několik blokových kopolymerů PVP-PDLLA o různých složeních. Jak je znázorněno v Tabulce 2, průměrná velikost

- 21 ·· •4 ··*· » · 1 ► · · micel se pohybovala od 44 do 168 nm a CAC byla nízká. Vzorek 3a, s nejkratším segmentem PLA, měl nejvyšší hodnotu CAC. Ovšem rozdělení velikostí nebylo unimodální, jak vyplývá z analýzy SDP (viz Tabulka 3).

Tabulka 3: rozdělení velikostí micel PVP-PDLLA a SDP analýza intenzity

PVP-PDLLA č. šarže SDP maximum množství	voda	PBS
SDP maximum průměr (nm)	SDP maximum množství	SDP maximum průměr (nm)	SDP maximum množství
1a	85 %	62 ± 29	63 %	41 ± 13
15 %	419 ± 133	34 %	290 ± 60
2a	50 %	29 ± 6	56 %	124 ± 51
50 %	199 ± 54	44 %	36 ± 12
3a	60 %	106 ± 22	82 %	154 + 69
30 %	328 + 111	18 %	38 ± 12
3b	63 %	319 ± 46	96 %	243 ± 138
37 %	100 ± 15	4 %	40 ± 13
3c	69 %	129 ± 44	59 %	326 ± 59
31 %	34 ± 7	41 %	78 ± 28
4a	72 %	48 ± 26	52 %	37 ± 11
28 %	158 ± 51	48 %	89 ± 21
4b	64 %	39 ± 23	86 %	119 ± 37
36 %	248 ± 88	14 %	26 ± 8
5a	55 %	36 + 10	62 %	106 ± 36
45 %	109 ± 46	38 %	36 ± 11

• 0 • *

- 22 ·> «·«,« • 0 0 ·

0 0 0 0 0 · 0·0 0 0 00 0 00 00 00 ·0

Jak je z Tabulky 3 zřejmé, všechny vzorky poskytly micely s bimodální distribucí, přičemž velikost malých částic se pohybovala od 26 do 124 nm a velikost větších agregátů se pohybovala od 106 do 419 nm.

Ke stanovení účinnosti zachycení léku byl indomethacin zachycen do micel PV-PDLLA a PEG-PDLLA, jak je znázorněno v Tabulce 4.

Tabulka 4: Začlenění indomethacinu do polymerních micel

počáteční naplnění lékem (%)	PEG-PDLA (63:37 % hmotn.)	PEG-PDLLA (60:40 % hmotn.)
konečné naplnění lékem (%)	účinnost zachycení (%)	konečné naplnění lékem (%)	účinnost zachycení (%)
10	3 ± 1,0	30 ± 10	2 ± 0,5	20 ± 5
20	5 ± 1,2	25 ± 6	7 ± 3,1	35 ± 16
30	10 ± 0,9	33 + 3	12 ± 1,8	40 ± 6
40	12 ± 1,2	30 ± 3	18 ± 1,2	45 ± 3
50	12 + 1,0	24 ± 2	22 ± 2,0	44 ± 4

PEG-PDLLA (63:37 % hmotn.) Mn = 7 900, střední průměr (unimodální analýza) = 110 ± 42 nm

PEG-PDLLA (60:40 % hmotn.) Mn = 6 600, střední průměr (unimodální analýza) = 106 ± 45 nm

Uvedené údaje jsou průměrem 3 měření ± směrodatná odchylka.

Lék a kopolymer byly rozpuštěny v Ν,Ν-dimethylformamidu (DMF) a dialyzovány 24 hodin, ve tmě, proti vodě. Roztoky byly filtrovány přes filtro velikosti pórů 0,22 μπι a lyofilizovány. Naplnění indomethacinem bylo stanoveno měřením absorbance UV záření micelárního roztoku v

- 23 9» 9 99 9 •99999 9 9 · 9 • 9 9 9 9 9 9« • 9 9 9 9 9 9 9 « f ><· · · 9 · 9999

999 9999 99 99 99 ·«

DMF při 320 nm za použití spektrofotometru Hewlett Packard 8452A s detekcí diodě array (Boise, ID).

Účinnost zachycení indomethacinu v micelách PVD-PDLLA a PEG-PDLLA bylo při nízké hladině léku podobné. S rostoucím naplněním lékem byla účinnost zachycení micelami PVP-PDLLA lepší než účinnost zachycení micelami PEG-PDLLA (uvažované kopolymery měly stejnou molekulovou hmotnost). Aniž by bylo žádoucí vázat se teorií, předpokládá se, že při nízkých poměrech léku se lék nejprve začleňuje do jádra a poté, až při vyšších poměrech, se začíná začleňovat do hydrofilního obalu, tvořeného PVP.

Claims

1. Prostředek vytvářející micely, vyznačující se tím, že zahrnuje:

hydrofobní jádro, obklopené hydrofilním obalem, přičemž uvedeným hydrofilním obalem je poly(N-vinyl-2-pyrrolidon).

2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že tento prostředek vytvářející micely dále obsahuje léčebné činidlo; a uvedené léčebné činidlo je obsaženo uvnitř zmíněné micely.

3. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že hydrofobním jádrem je poly(D,L-mléčná kyselina).

4. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že hydrofobní jádro je zvoleno ze skupiny, sestávající z polyesteru, polyorthoesteru, polyanhydridu, od tyrosinu odvozené pseudo-poly(aminokyseliny), polyfosfazenu, poly(alkylakrylátu), poly(P-benzyl-L-aspartátu) a kombinací těchto sloučenin.

5. Prostředek podle nároku 4, v y z n a č u j í c í se t í m, že polyester je zvolen z poly(glykolové kyseliny), poly(mléčné kyseliny), poly(D-mléčné kyseliny), poly(D,l_-mléčné kyseliny), z laktidových/glykolidových kopolymerů, polykaprolaktonu a derivátů takových sloučenin.

6. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že hydrofobním jádrem je poly(D,L-mléčná kyselina).

7. Prostředek podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t í m, že hydrofobní jádro je zvoleno ze skupiny, sestávající z z polyesteru, φφ φφφφ • φ · · φ β··· · ο c ·· «·····«* “ Z □ “ ·«····· < · · · tt Φ φ polyorthoesterů, polyanhydridů, od tyrosinu odvozené pseudo-poly(aminokyseliny), polyfosfazenů, poly(alkylakrylátu), poly(P-benzyl-L-aspartátu) a kombinací těchto sloučenin.

8. Prostředek podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m, že polyester je zvolen z poly(glykolové kyseliny), poly(mléčné kyseliny), poly(D-mléčné kyseliny), poly(D,L~mléčné kyseliny), z laktidových/glykolidových kopolymerů, polykaprolaktonu a derivátů takových sloučenin.

9. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že léčebným činidlem je protinádorově působící sloučenina.

10. Prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že protinádorově působící sloučenina je zvolena z alespoň jedné ftalocyaninové sloučeniny, anthracyklínové sloučeniny, antimetabolitu, alkylačního činidla a taxanu.

11. Prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že ftalocyaninovou sloučeninou je chlorid ftalocyaninu.

12. Prostředek podle nároku 10, v y z n a č u j í c í se t í m, že anthracyklinovou sloučeninou je doxorubicin.

13. Prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že antimetabolit je zvolen z metatrexátu, mitomycinu a 5-fluoruracilu.

14. Prostředek podle nároku 10, v y z n a č u j í c í se t í m, že alkylačním činidlem je karmustin.

15. Prostředek podle nároku 10, v y z n a č u j í c í se t í m, že taxanem je paclitaxel.

- 26 • ·♦ ·· « · • ·

9 · · • · ··· · ···

9· ·#··

9» »#·· • 9 • · · «9 9 • · · · • 9 ··

16. Prostředek podle nároku 10, vyznačující se t í m, že antimetabolit je zvolen z metatrexátu, mitomycinu a 5-fluoruracilu.

17. Prostředek podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t í m, že léčebné činidlo je zvoleno z hydrofobního antibiotika, hydrofobního fungicidu, imunomodulátoru, protivirového léku a steroidního či nesteroidního protizánětlivého léku.

18. Prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že léčebné činidlo zahrnuje genomový fragment.

19. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že účinné množství léčebného činidla je zachyceno uvnitř polymerní micely.

20. Prostředek podle nároku 19, vyznačující se t í m, že léčebné činidlo je zachyceno uvnitř polymerní micely prostřednictvím dialýzy, postupem typu oleje ve vodě, rozpuštěním pevné disperze léku/polymeru ve vodě nebo jednoduchým uvedením léku a micel do rovnovážného stavu.

£ d

Ir' ’

21. Způsob podávání léčebného činidla, vyznačující se t í m, že zahrnuje kroky, v nichž:

se poskytne prostředek vytvářející micely podle nároku 2, a tento prostředek vytvářející micely se podává subjektu, který to protřebuje.

22. Způsob ochrany léčebného činidla, vyznačující se t í m, že se zmíněné léčebné činidlo zapouzdří do prostředku, vytvářejícího micely.