CZ2002739A3 - Farmaceutický prostředek pro pouľití k léčení hepatocelulárního karcinomu - Google Patents

Description

Farmaceutický prostředek pro použití k léčení hepatocelulárního karcinomu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká léčení hepatocelulárního karcinomu.

Dosavadní stav techniky

Hepatocelulární karcinom (HCC) je v jihovýchodní Asii a v afrických zemích jedna z nejobvyklejších rakovin. V Taiwanu je hepatocelulární karcinom vůdčí příčinou úmrtí u mužských pacientů trpících rakovinou. Míra přežití pacientů s hepatocelulárním karcinomem je velmi nízká. Toto je způsobeno především nedostatkem účinné léčby. U ozařování a chemoterapie nebylo až dosud prokázáno, že jsou uspokojivé; nejúčinnější léčbou pro hepatocelulární karcinom je léčba chirurgická. Chirurgická léčba je však vhodná pouze pro pacienty s malým resekovatelným nádorem.

Nedávno se obnovil zájem o antimitotická léčiva, jako je paclitaxel. Paclitaxel byl původně izolován z kůry tisu. Protinádorový účinek paclitaxelu je známý od roku 1971. Paclitaxel inhibuje dělení nádorových buněk pomocí svého působení na mikrotubulární aparát. Analýzy in vitro s použitím nádorových buněk ukázaly, že paclitaxel zastavuje buňky hlavně v G2/M fází buněčného cyklu (Schiff PB a Horwitz SB, Proc. Natl. Acad. Sci 77, 1561-1565, 1980). Nedávné studie ukázaly, že paclitaxel je účinný proti rozličným zhoubným nádorovým buňkám, jako jsou buňky mozkových nádorů, rakoviny žaludku a prostaty, rakoviny prsu, melanomu a rakoviny vaječníků.

Nicméně, paclitaxel není účinný proti hepatocelulárnímu karcinomu. V British Journal of Cancer, 78 (1) , 34-39, 1998 je popsána fáze II klinické studie paclitaxelu na pacientech s hepatocelulárnim karcinomem. Závěrem tohoto článku je, že paclitaxel nemá znatelné protinádorové účinky u pacientů s hepatocelulárnim karcinomem.

Jak je vysvětleno výše, bylo zjištěno, že cytotoxický účinek paclitaxelu je závislý na buněčném cyklu, a že k zastavení buněčného cyklu dochází hlavně v G2/M fázi. Nyní však bylo zjištěno, že u docetaxelu lze dosáhnout cytotoxicity u buněk hepatocelulárního karcinomu nezávislé na buněčném cyklu. Toto ukazuje, že cytotoxického účinku docetaxelu na buňky hepatocelulárního karcinomu je dosaženo pomocí jiného mechanismu než u paclitaxelu. Dále je in vitro účinnost docetaxelu na buňky hepatocelulárního karcinomu je znatelně vyšší než účinnost paclitaxelu v koncentracích až do 1 pmol. Vzhledem k vysoce cytotoxické povaze taxoidů, ukazuje zvýšená účinnost při nízké koncentraci, že docetaxel, narozdíl od paclitaxelu, lze použít v praxi ke klinickému léčení hepatocelulárního karcinomu.

Podstata vynálezu

Proto předkládaný vynález pojednává o použití docetaxelu, nebo jeho hydrátu, k přípravě léčiva pro použití k léčení hepatocelulárního karcinomu.

Předkládaný vynález se dále týká také způsobu léčení pacienta trpícího hepatocelulárnim karcinomem, který zahrnuje podávání účinného množství docetaxelu, nebo jeho hydrátu, uvedenému pacientovi. Předkládaný vynález také pojednává o způsobu zlepšování stavu pacienta trpícího hepatocelulárnim karcinomem, který zahrnuje podávání účinného množství docetaxelu, nebo jeho hydrátu, uvedenému pacientovi.

Docetaxel je známá sloučenina. Její vzorec vypadá následovně:

t-Bu znamená terč.butyl

Bz znamená benzoyl

Ac znamená acetyl

Způsoby přípravy docetaxelu jsou popsány v EP-A-253738 a

EP-A-336841.

Docetaxel lze použít například v bezvodé formě nebo jako hydrát. V rámci tohoto vynálezu zmínka o docetaxelu zahrnuje též jeho hydráty.

Hydráty docetaxelu lze připravit rozpuštěním bezvodého docetaxelu v organickém rozpouštědle, jak jsou aceton, ethanol, acetonitril, nebo N,N-dimethylformamid, a rekrystalizací hydrátu docetaxelu přidáním takto získaného roztoku k vodě. Hydrátem docetaxelu je typicky dihydrát, trihydrát nebo tetrahydrát. Zejména o trihydrátu bylo zjištěno, že je obzvláště stabilní, a proto je trihydrát docetaxelu výhodný. Trihydrát docetaxelu lze připravit pomocí postupů popsaných v EP-A-770070.

Docetaxel je neočekávaně účinný proti hepatocelulárním karcinomům, z jaterních

Zejména jej lze použít k léčení buněk, fibrolamelárních variant a karcinomů smíšených hepatocelulárních cholangiokarcinomů.

Podle předkládaného vynálezu lze docetaxel podávat libovolnou z obvyklých cest známých pro podávání docetaxelu. Proto jej lze podávat například parenterálně. Typicky je podáván intravenózně, výhodně prostřednictvím intravenózní infúze.

Podle předkládaného vynálezu je docetaxel připravený k podávání ve formě farmaceuticky přijatelné kompozice obsahující docetaxel a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo. Mezi vhodné nosiče a ředidla patří netoxická rozpouštědla a suspenzní prostředky, například sterilní vodný prostředek. Výhodně jsou tyto kompozice ve formě vodných roztoků nebo suspenzí, například roztoků vhodných k injekčnímu nebo infúznímu podávání, které mohou obsahovat emulgátory, barviva, konzervační prostředky nebo stabilizátory.

Mezi farmaceutické kompozice vhodné k parenterálnímu podávání patří sterilní vodné nebo jiné než vodné roztoky nebo suspenze. Vhodné sterilní, jiné než vodné roztoky a suspenze zahrnují roztoky a suspenze v přírodních rostlinných olejích, jako jsou olivový olej, sezamový olej nebo vazelínový olej nebo inj ikovatelné organické estery, jako je ethyl-oleát. Vhodné sterilní vodné roztoky zahrnují roztoky docetaxelu ve vodě. Typicky se pH sterilních vodných roztoků vhodných k parenterálnímu podávání vhodně upravuje. Dále jsou tyto sterilní vodné roztoky obecně upravovány na isotonické, například pomocí dostatečného množství chloridu sodného nebo glukózy. Je obzvláště výhodné, když mají roztoky vhodné k infúznímu podávání podobné pH jako pH krve a když jsou připraveny jako isotonické.

Sterilizaci lze provést pomocí zahřátí nebo libovolným jiným způsobem, který nemá škodlivé účinky na kompozici.'

Farmaceutické kompozice obsahující docetaxel vhodné pro použití podle předkládaného vynálezu mohou dále obsahovat surfaktant. Výhodnými surfaktanty jsou polysorbáty, estery polyoxyethylenglykolu a estery-ethery polyethylenglykolu a ricinových olejů. Příklady vhodných surfaktantů, a farmaceutických kompozic obsahujících surfaktanty, lze nalézt v AU-A-666859.

Docetaxel lze také k použití podle předkládaného vynálezu připravit jako lyofylizovanou kompozici. Tyto lyofylizované kompozice mají dobrou fyzikální a chemickou stabilitu, a lze je proto skladovat po dlouhou dobu. Lyofylizované kompozice obsahující docetaxel lze připravit lyofylizací vodného roztoku docetaxelu standardními postupy. Dále mohou obshovat bobtnavá činidla, jako je laktóza. Také mohou obsahovat činidla upravující tonicitu, jako jsou cukry a polymery. Mezi příklady vhodných činidel upravujících tonicitu patří glukóza, dextróza a mannitol a polymery, například polyvinylpyrrolidon.

Lyofylizované kompozice lze před použitím opětovně rozpustit v libovolném slučitelném a farmaceuticky přijatelném injikovatelném prostředku. Lyofylizát lze výhodně obnovit pomocí dvakrát destilované vody injekčního stupně čistoty, v objemu, který odpovídá počátečnímu objemu roztoku určeného k lyofylizaci.

Farmaceutická kompozice obsahující docetaxel, vhodná k použití podle předkládaného vynálezu obsahuje typicky alespoň 0,01 % hmotn. terapeuticky účinného produktu. Obecně obsahuje farmaceutická kompozice od 0,01 do 1000 mg, výhodně od 0,1 do 500 mg, terapeuticky účinného produktu.

Roztok vhodný k intravenózni injekci výhodně obsahuje od 38 do 42, výhodněji okolo 40 mg/ml účinného produktu. Typicky jsou tyto roztoky poskytovány v ampulkách obsahujících 20 mg nebo 80 mg účinného produktu.

Roztok vhodný pro infúzi výhodně obsahuje od 0,1 do 11, výhodně od 0,1 do 10, výhodněji od 0,3 do 0,9 mg/ml účinného produktu.

Terapeutická léčba pomoci docetaxelu podle předkládaného vynálezu může být prováděna současně s dalšími terapeutickými léčbami, které zahrnují léčby jinými antineoplastickými léčivy, monoklonálními protilátkami, imunoterapii nebo radioterapii nebo léčby modifikátory biologické odezvy. Mezi vhodné modifikátory biologické odezvy patří lymfokiny a cytokiny, jako jsou interleukiny, interferony, (α, β nebo δ) a TNF. Další chemoterapeutická činidla, která jsou použitelná k léčení poruch způsobených abnormální buněčnou proliferací, zahrnují alkylační činidla, jako jsou mechlorethamin, cyklofosfamid, melfalan a chlorambucil, alkyl-sulfonáty, jako je busulfan, nitrosomočoviny, jako jsou carmustin, lomustin, semustin a streptozocin, triazeny, jako je dacarbazin, antimetabolity, jako jsou analoga kyseliny listové, například methotrexát, pyrimidinová analoga, jako jsou fluoruracil a cytarabin, purinová analoga, jako jsou merkaptopurin a thioguanin, přírodní produkty, například vinca alkaloidy, jako jsou vinblastin, vincristin a vindesin, epipodophyllotoxiny, jako jsou etoposid a teniposid, antibiotika, jako jsou dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, bleomycin, plicamycin a mitomycin, enzymy, jako je L-asparagináza, rozličná činidla, jako jsou koordinační komplexy platiny, například cisplatina, substituované močoviny, jako je hydroxymočovina, methylhydrazinové deriváty, jako je procarbazin, adrenokortikální supresanty, jako jsou hydrazin a aminoglutethimid, hormony a antagonisté jako jsou adrenokortikosteroidy, jako je prednison, progestiny, jako jsou hydroxyprogesteron-caproát, methoxyprogesteron-acetát a meges-trol-acetát, estrogeny, jako jsou diethylstilbestrol a ethynylestradiol, antiestrogeny, jako je tamoxifen, a androgeny, jako jsou testosteronpropionát a fluoxymesteron.

Výhodná je současná léčba cyklofosfamidem, 5-fluoruracilem, etoposidem, vinorelbinem nebo methotrxátem, neboť lze dosáhnout synergického účinku mezi těmito sloučeninami a docetaxelem. Další účinnou látkou proti hepatocelulárnímu karcinomu je 2-methoxyestradiol, o němž se zjistilo, že byl u myši dobře snášen po dobu jednoho měsíce denní léčby (Klauber a kol., Cancer Research, 57, 81-86, 1997). Proto je také výhodná současná léčba 2-methoxyestradiolem, zejména pokud je žádoucí chronická léčba.

Podle předkládaného vynálezu se docetaxel podává v dávce, která dovoluje léčení hepatocelulárního karcinomu. Dávka se liší v závslosti na cestě podávání a fyzikálních vlastnostech pacienta. Mezi vhodné dávky patří dávky, které jsou terapeuticky účinné pro léčbu poruch způsobených abnormální buněčnou proliferací. Docetaxel lze podávat tak často, jak je nutné k dosažení požadovaného terapeutického účinku.

Typická dávka docetaxelu k léčení lidí se pohybuje od 50 do 150, výhodně od 60 do 100, výhodněji okolo 100 mg docetaxelu na m² povrchu kůže pacienta. Pokud se docetaxel podává infúzně, pohybuje se rychlost infúze typicky od 1 do 200, výhodně okolo 100 mg/m² docetaxelu za hodinu.

Výše uvedené dávky lze opakovat podle potřeby. Typicky se opakují denně nebo týdně. Výhodně se opakují každé tři týdny. Docetaxel lze například podávat v dávce okolo 100 mg/m² prostřednictvím intravenózní infúze po dobu 1 hodiny každé tři týdny.

Následující příklad provedení vynálezu slouží k ilustraci předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Látky a metody

Pokud není uvedeno jinak, jsou použitými metodami standardní biochemické postupy. Všechny použité buněčné linie jsou komerčně dostupné.

Buněčné kultury

V pokusech podrobně popsaných níže byly použity lidské hepatomové buněčné linie Hep3B (ATCC označení HB 8064), HepG2 (ATCC označeni HB 8065) a HA22T/VGH, a myší hepatomové buněčné linie Hepa 1-6. Tyto buňky byly kultivovány v Dulbeccem modifikovaném Eaglově mediu (GIBCO, BRL), obsahujícím 10% fetální telecí sérum (Hyclone), 0,01 mg/ml gentamycinu a 0,1 mmol neesenciální aminokyseliny. Buňky byly kultivovány v CO₂ inkubátoru při 37 °C, s 5 % CO₂ a 95 % filtrovaného vzduchu.

Působení léčiv

V rámci pokusu podrobně popsaného níže byly výše uvedené hepatomové buňky podrobeny různým koncentracím paclitaxelu (0,001-10 μπιοί) a docetaxelu (0,001-10 pmol) na 24 hodin a 72 hodin. Paclitaxel byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO) a docetaxel byl rozpuštěn v ethanolu v podobě zásobních roztoků. Konečná koncentrace vehikula činila méně než 0,1 %.

Studie životaschopnosti buněk: MTT analýza

Buňky byly kultivovány na 96ti jamkové desce pro buněčnou kultivaci (COSTAR) v hustotě činící 4xl0⁴ buněk/ml. Po působení léčiv po dobu 24 hodin nebo 72 hodin bylo medium odstraněno a nahrazeno odpovídajícím objemem (100 μΐ) čerstvého media obsahujícího MTT (0,456 mg/ml; 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) a následovně inkubováno po dobu 1,5 hodiny při 37 °C. Poté bylo odstraněno čerstvé medium a bylo přidáno 100 μΐ DMSO. Životaschopnost buněk byla stanovena pomocí kolorimetrického srovnávání odečítáním hodnot optické denzity (OD) z mikrodeskového čtecího zařízení (SPECTRA MAX 250) při absorbční vlnové délce činící 570 nm.

Výsledky jsou znázorněny na obrázku 1, na kterém plné kruhy představují data následující po léčbě po dobu 24 hodin a prázdné kruhy představuji data následující po léčbě po dobu 72 hodin. Data jsou průměry ± standardní odchylka průměru ze zdvojených vzorků tří nezávislých pokusů.

Propidiumiodidová (PI) vylučovací analýza

Buňky byly kultivovány na 5-cm² miskách (CORNING) a podrobeny paclitaxelu a docetaxelu, jak je popsáno výše. Poté byl přidán propidiumiodid (10 μς/ιηΐ) a buňky byly inkubovány po dobu 15 minut při 37 °C. Poté bylo ještě před sebráním spojených buněk odstraněno medium. Pak byly odebrány jak suspendované tak i spojené buňky a poté byly resuspendovány 500 μΐ fosfátem pufrovaného roztoku chloridu sodného (PBS) pro průtokovou cytometrickou analýzu, jak je popsáno níže. Zbytkové signály byly odstraněny pomocí FSC-SSC.

Průtoková cytometrická analýza obsahu DNA

Lytický pufr (0,5 % Triton X-100, 0,2 μς/ιηΐ Na₂EDTA. 2H₂O, a 1 % bovinního sérového albuminu v PBS) byl přidán k buněčným peletám, které byly poté ponechány na ledu na 15 minut. Poté byl ke směsi přidán 100% methanol předchlazený na -20 °C, která byla poté odstřeďována při 300 x g po dobu 5 minut. Supernatant byl odstraněn a buněčné pelety byly promyty pomocí PBS. Promyté pelety byly poté barveny roztokem barvícím DNA (50 μg/ml propidiumiodidu, a 5 kunitz/ml RNázy A) po dobu 30 minut při 4 °C v temnu. Obsah DNA v každé z buněk byl stanoven pomocí průtokového cytometru Becton Dickinson FACSCalibur, jak je popsáno níže.

Průtoková cytometrie

Buňky (10000) byly analyzovány pomocí průtokového cytometru Becton Dickinson FACSCalibur použitím argonového-ionového laseru (15 mW) s dopadajícím paprskem 488 nm. Pro PI vylučovací analýzu byla shromážďována červená fluorescence

- 10 pomocí 585 nm filtru a zbytkové buněčné signály byly odstraněny pomoci FSC—SSC. Data byla získána a analyzována použitím softwaru FACS/CELLQuest na počítači Power Macintosh 7600/120. Apoptotické buňky a buňky ve specifických fázích cyklu byly stanoveny pomocí softwaru ModFit LT.

Výsledky průtokové cytometrie jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2 a na obrázku 2. Tabulka 1 uvádí hodnoty permeability buněčné membrány hepatomových buněk, následující po působení paclitaxelu a docetaxelu. Tabulka 2 uvádí procentuální podíly apoptotických (sub-GO/Gl) buněk zjištěné po působení paclitaxelu a docetaxelu. Obrázek 2 zobrazuje histogramy DNA analýzy popisující účinek paclitaxelu a docetaxelu na progresi buněčného cyklu.

Tabulka 1

Permeabilita buněčné membrány hepatomových buněk po působení paclitaxelu a docetaxelu

	Paclitaxel (A-mol)	Docetaxel (<umol)
0.01	0.1	1	0.01	0.1	1
Hep G2
24 k	93.6311.1	85.7116.8	66.7117.2	94.8611.3	85.4911.2	81.2413.2
72 h	56.58128.7	43.79111.7	13.2714.3	61.0619.6	40.0319.0	27.4218.8
Hep 3B
24 h	77.35111.7	63.5014.0	52.2814.1	93.80110.7	57.4116.8	57.3914.3
72 h.	57.0017.9	8.0912.3	1.9010.3	36.81114.7	36.25113.5	20.25114.4
HA22T/VGH
24 h	94.08118.6	40.0317.8	34.2418.3	98.6619.0	38.71111.2	40.7915.0
72 h	92.58121.3	93.38132.5	49.3218.3	55.4415.6	21.2410.4	22.0313.1
Hepa 1-6
24 h	93.1713.8	67.2014.4	62.6517.6	94.4511.9	83.3517.2	81.8818.7
72 h	62.9515.6	27.7911.3	15.5111.0	77.1811.4	43.9413.4	38.9014.2

Data jsou průměry ± standardní odchylka průměru ze zdvojených vzorků alespoň tří nezávislých pokusů. Buňky byly podrobeny působení léčiv po dobu 24-72 hodin, a permeabilita membrány byla měřena pomocí průtokové cytometrické analýzy propidiové exkluze u životaschopných buněk. Data představují procentuální podíl buněk s neporušenou buněčnou membránou vztažený ke kontrole.

Tabulka 2

Paclitaxelem a Docetaxelem indukovaná apoptóza

	Paclitaxel (mmol) 0.01 0.1 1	Docetaxel (mmol) 0.01 0.1 1
Hep G2	24 h				45.24	38.77	28.33
	72 h				42.45	42.44	56.66
Hep 3B	24 h				59.14	58.67	65.74
	72 h		38.37	47.01	64.12	81.66	79.33
HA22T/	24 h				41.75	18.61	22.94
VGH	72 h		0	0	56.64	58.61	60.98
Hepa 1-6	24 h	24.02	55.64	64.38	52.81	50.76	53.80
	72 h		N/A	N/A	31.25	53.95	62.49

N/A znamená nezjištěno

Údaje představují procentuální podíl apoptotických (subG0/G1) buněk, jak bylo stanoveno průtokovou cytometrií.

Elektroforetická analýza fragmentace DNA

Odhad fragmentace DNA byl proveden podle metody popsané v Herrmann a kol.,

Nucleic Acids Res., 22, 5506-5507, 1994.

Stručně byly buňky HEP G2 (2xl0⁷) podrobeny po dobu 72 hodin působeni paclitaxelu a docetaxelu, jak je popsáno výše a poté odstřeďovány. Takto získané buněčné pelety byly

- 12 resuspendovány lytickým pufrem NP-40 (1 % NP-40 ve 20 mmol EDTA, 50 mmol Tris-HCl, pH 7,5). Po proběhnutí lýzy buněk během několika málo sekund byly shromážděny supernatanty (5 minut při 1600 x g). Extrakce byla opakována se stejným lytickým pufrem. Poté byly k supernatantům přidány SDS (konečná koncentrace 1 %) a RNáza (konečná koncentrace 2,5 μς/μΐ) a vše inkubováno po dobu 2 hodin při 56 °C, což bylo následováno trávením pomocí proteinázy K (2,5 μς/μΐ) po dobu 2 hodin při 37 °C. Poté byly směsi přidány k 10 M ammoniumacetátu, a to před precipitací pomocí 100% ethanolu po dobu 30 minut při -20 °C. DNA byla shromážděna pomocí odstřeďování (10 minut při 12000 x g) , následovaného elektroforézou na 1,5% agarosovém gelu.

Výsledky jsou zobrazeny na obrázku 3. Na obrázku 3 znamená M marker obsahující 100 párů bází. Dráha 1 ukazuje mediovou kontrolu. Dráhy 2 a 3 ukazují průměr skupin podrobených působení paclitaxelu (0,1 a 1 μτηοΐ) . Dráhy 4 a 5 ukazují průměr skupin podrobených působení docetaxelu (0,1 a 1 μιηοΐ) .

Výsledky

Studie životaschopnosti buněk

Obrázek 1 ukazuje na dávce závislý účinek paclitaxelu a docetaxelu na životaschopnost buněk u hepatomových buněčných linií (Hep G2, Hep 3B, HA22T/VGH a Hepa 1-6) . Jak je patrno z obrázku 1, docetaxel dosáhl v téměř každém případě poklesu životaschopnosti při 0,01 a 0,1 μπιοί.

U buněk Hep G2 vykazovala životaschopnost buněk po působení paclitaxelu nebo docetaxelu klesající trend. Životaschopnost buněk Hep G2 činila 61,81 % a 39,45 % kontroly u skupin podrobených působení paclitaxelu (10 μιηοΐ) po dobu 2 4 resp. 72 hodin. U buněk Hep G2 podrobených působení docetaxelu byl pozorován maximální pokles životaschopnosti u 1 μτηοΐ docetaxelu, u 10 μπιοί docetaxelu nebyl již zaznamenán další pokles životaschopnosti. Životaschopnost činila 65,03 % a 48, 99 % u buněk podrobených působení 1 μπιοί docetaxelu po dobu 24 resp. 72 hodin.

U buněk Hep 3B stojí z;a zmínku to, že znatelný pokles životaschopnosti (37,06%) byl pozorován po působení 1 μπιοί docetaxelu po dobu 72 hodin.

U buněk Hepa 1-6 podrobených působení docetaxelu byla pozorována maximální cytotoxicita (65,34 % a 30,71 %) u skupin podrobených působení 1 μπιοί docetaxelu po dobu 24 resp. 72 hodin.

Propidíumiodidová vylučovací analýza

Tabulka 1 ukazuje, že permeabilita membrány buněk Hep G2 a buněk Hep 3B, následující po působení paclitaxelu a docetaxelu, byla závislá na dávce a času.

U buněk HA22T/VGH byl pozorován menší vzestup permeability membrány po působení paclitaxelu (0,01-1 μπιοί) po dobu 72 hodin, ve srovnání se skupinami podrobenými působení docetaxelu. Za zmínku stojí, že pouze u 55,44 % buněk byly membrány po působení 0,01 μπιοί docetaxelu po dobu 72 hodin neporušené, kdežto po působení stejné dávky paclitaxelu byly membrány neporušené u 92,58 % buněk.

Analýza buněčného cyklu

Obrázek 2 ukazuje, že výsledkem působení 1 μπιοί paclitaxelu na buňky Hep G2 po dobu 24 hodin je zřejmé zastavení ve fázi G2/M. Podobné DNA histogramy byly pozorovány po 72hodinové expozici.

Jak ukazuje tabulka 2, byly apoptotické buňky (sub-GO/Gl) pozorovány po působeni 0,001 pmol, 0,01 μπιοί, 0, 1 pmol a μιηοΐ docetaxelu po dobu 24 hodin s procentuálními podíly apoptotických buněk činícími 31,02 %, 45,24 %, 38,77 % resp. 28,33 %. Po 72 hodinách působení docetaxelu (0,001-1 μπιοί) činily procentuální podíly 21,92 %, 42,45 %, 42,44 % resp. 56,66 %.

Výsledkem působení 0,1 μπιοί nebo 1 μιηοΐ paclitaxelu po dobu 24 hodin byla u buněk Hep 3B zástava ve fázi G2/M a výsledkem inkubace s 0,1 μπιοί nebo 1 μπιοί paclitaxelu po dobu 72 hodin bylo zvýšení procentuálních podílů buněk v sub-GO/Gl na 38,37 % resp. 47,01. Naproti tomu působení 0,01 μπιοί, 0,1 μπιοί nebo 1 μπιοί docetaxelu na buňky Hep 3B po dobu 24 hodin nebo 72 hodin vedlo k vysokým podílům populací subGO/Gl, a to ve výši 59,14 %, 58,69 % a 65,74 % po 24 hodinách a 64,12 %, 81,66 % a 79,33 % po 72 hodinách.

U buněk HA22T/VGH byly zvyšující se koncentrace paclitaxelu (0,001 μπιοί až 1 μπιοί) v souladu se zvýšenými procentuálními podíly buněk ve fázi G2/M po 24 hodinách. Po 72 hodinách působení 0,1 μπιοί nebo 1 μπιοί paclitaxelu nebyla u skupin těchto buněk pozorována znatelná populace sub-GO/Gl. Oproti tomu je zřetelné, že u buněk HA22T/VGH podrobených působení 0,01 μπιοί docetaxelu po dobu 24 hodin je výsledkem vyšší procentuální podíl sub-GO/Gl (41,75 %) než u skupin podrobených působení 0,1 μπιοί (18,61 %) nebo 1 μπιοί (22,94 %) docetaxelu. V pčípadě, že byly buňky podrobeny působení docetaxelu po dobu 72 hodin, byly zjištěny znatelné procentuální podíly sub-GO/Gl u buněk HA22T/VGH podrobených působení 0,01 μπιοί (56, 64 %), 0,1 μπιοί (58,61 %) a 1 μιηοΐ (60,98 %) docetaxelu.

U buněk Hepa 1-6 vedlo působení paclitaxelu (0,01, 0,1 nebo 1 μπιοί) po dobu 24 hodin ke zvýšené tvorbě populací sub-GO/Gl (24,02 %, 55,64 % resp. 64,38), přičemž zástava ve ·*· fázi G2/M byla pozorována u skupin podrobených působení 0,1 μπιοί a 1 μπιοί paclitaxelu. Pokud byly buňky Hepa 1-6 podrobeny působení 0,1 μπιοί a 1 μπιοί paclitaxelu po dobu 72 hodin, byla většina buněk mrtvá a nebyl zřejmý stupeň buněčného cyklu. Působení docetaxelu (0,01, 0,1 a 1 μπιοί) na buňky Hepa 1-6 vedlo k tvorbě buněk sub-G0/Gl (52,81 %, 50,76 % a 53,8 % po 24 hodinách resp. 31,25 %, 53,95 % a 62,49 % po 72 hodinách).

Analýza fragmentace DNA

Obrázek 3 ukazuje, že působení paclitaxelu (0,1 a 1 μπιοί) a docetaxelu (0,1 a 1 μπιοί) indukuje u buněk Hep G2 fragmentaci DNA.

Claims (5)

1. Kompozice pro použití k léčení hepatocelulárního karcinomu, vyznačující se tím, že obsahuje, jako účinnou složku, docetaxel nebo jeho hydrát.

2. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedeným hydrátem je trihydrát.

3. Kompozice podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že je určena k parenterálnímu podávání.

4. Kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že je vhodná k intraperitoneálnímu, subkutánnímu, intravenóznímu, intramuskulárnímu nebo intrasternálnímu podávání, a obsahuje od 38 do 42 mg/ml účinné látky.

5. Kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že je vhodná k podávání pomocí infúze, a obsahuje od 0,1 do 11 mg/ml účinné látky.