CZ20031653A3 - Mutant allergens - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových rekombinantních alergenů, které jsou mutanty v přírodě se vyskytujících alergenů. Vynález se také týká prostředku obsahujícího směs nových rekombinantních mutantních alergenů. Vynález se dále týká způsobu přípravy těchto rekombinantních mutantních alergenů a farmaceutických prostředků včetně vakcin obsahujících rekombinantní mutantní alergeny. V dalších provedeních se vynález týká způsobů vytváření imunitních odpovědí u pacienta, vakcinace nebo léčení pacienta a způsobů přípravy prostředků podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Jedinci s genetickou dispozicí se mohou stát citlivými (alergickými) na antigeny pocházející z řady zdrojů okolního prostředí, na alergeny, kterým jsou tito jedinci vystaveni. K alergické reakci dochází, když je dříve senzitizovaný jedinec znovu vystaven působení stejného nebo homologního alergenu. Alergické reakce se mohou projevovat sennou rýmou, rýmou se zánětem slzných kanálků, rýmou a astmatem, až po systémový anafylaktický šok a smrt v důsledku reakce například na včelí nebo sršní bodnutí nebo kousnutí hmyzem. Reakce je okamžitá a může být způsobena řadou atopických alergenů, jako jsou sloučeniny pocházející z trav, stromů, plevelů, hmyzu, potravy, léčiv, chemických látek a parfémů.

K reakcím však nedochází, jestliže je jedinec vystaven alergenu poprvé. Počáteční adaptivní reakce trvá určitou dobu a obvykle nezpůsobí žádné příznaky. Jakmile však byly vytvořeny protilátky a T- 2 buňky schopné reagovat s alergenem, jakákoli následná expozice může vyvolat příznaky. Alergické reakce ukazují, že samotná imunitní odpověď může způsobit významné patologické stavy, které mohou ohrožovat život.

Protilátky, které se účastní atopické alergie, patří primárně do imunoglobulinů třídy IgE. IgE se vážou na specifické receptory na povrchu žírných buněk a bazofilů. Po vytvoření komplexu specifického alergenu s IgE navázaným na žírných buňkách vede přemostění receptoru na buněčném povrchu k přenosu signálů receptory a fyziologické odpovědi cílových buněk. Degranulace vede k uvolnění mj. histaminu, heparinu, chemotaktického faktoru eosinofilních leukocytů, leukotrienů C4, D4 a E4, které způsobí prodloužený stah buněk hladkých svalů průdušek. Výsledné efekty mohou mít systémovou nebo místní povahu.

Hypersenzitivitní reakce zprostředkované protilátkami se mohou rozdělit do čtyř tříd, na reakce typu I, typu II, typu III a typu IV. Alergické reakce typu I jsou klasické okamžité hypersenzitivitní reakce, ke kterým dochází během sekund nebo minut po vystavení antigenu. Tyto příznaky jsou zprostředkovány IgE specifickými pro alergen.

Běžně se alergické reakce pozorují jako důsledek vystavení proteinových alergenů přítomných např. v pylech, roztočích, v domácím prachu, zvířecích chlupech a lupech, hadích jeden a v potravinářských výrobcích.

Pro snížení nebo odstranění alergických reakcí se běžně používá opatrné řízené a opakované podávání alergických vakcin. Vakcinace proti alergiím se tradičně provádí parenterálním, intranazálním nebo sublingválním podáváním stoupajících dávek v poměrně dlouhém časovém období, a vede k desenzitizaci pacienta. Přesný imunologický mechanismus není znám, ale předpokládá se, že

- 3 - ^{; 1} - ,, γzvláště důležité jsou indukované rozdíly ve fenotypů T-buněk specifických pro alergen.

Protialergická vakcinace

Princip vakcinace je založen na dvou základních charakteristikách imunitního systému, totiž specifícitě a paměti. Vakcinace předem připraví imunitní systém příjemce a po opakované expozici podobným proteinům bude imunitní systém ve stavu, ve kterém bude přesněji odpovídat na vystavení např. mikrobiální infekci. Vakciny jsou směsi proteinů určené pro použití při vakcinaci pro účely vytvoření ochranné imunitní reakce u příjemce. Ochrana bude zahrnovat pouze složky přítomné ve vakcině a homologní antigeny.

Ve srovnáni s jinými typy vakcinace je protialergická vakcinace komplikovaná existencí nastupující imunitní reakce u alergických pacientů. Tato imunitní reakce je charakterizovaná přítomností IgE specifických pro alergen, které zprostředkují po vystavení alergenům vyvinutí alergických příznaků. Protialergická vakcinace používající alergeny z přírodních zdrojů je tedy spojena s rizikem vedlejších účinků, které mohou v nejhorším případě vést k ohrožení života pacienta.

Přístupy umožňující obejít tento problém se mohou rozdělit do tří kategorií. V praxi se často kombinují opatření používaná v rámci více než jedné kategorie. První kategorie opatření zahrnuje podávání několika malých dávek v dlouhém časovém období pro dosažení podstatné akumulované dávky. Druhá kategorie opatření zahrnuje fyzikální modifikaci alergenů zavedením alergenů do gelových látek jako je hydroxid hlinitý. Formulace obsahující hydroxid hlinitý má adjuvantní účinek a depotní účinek poskytující pomalé uvolňování alergenu, které snižuje koncentraci aktivních složek alergenu ve tkáni. Třetí kategorie opatření zahrnuje chemickou modifikaci alergenů pro účely snížení alergenicity, např. vazbu IgE.

- 4 Podrobný mechanismus, který stojí za úspěšnou protialergickou vakcinací, zůstává neobjasněný. Všeobecně se však přijímá myšlenka, že klíčovou úlohu při celkové regulaci imunitních reakcí hrají T-buňky. Podle současných znalostí určuje alergický stav jedince vztah mezi dvěma extrémními fenotypy T-buněk, Th1 a Th2. Po stimulaci alergenem vylučují buňky Th1 interleukiny, ve kterých převažuje interferon-γ, což vede k ochranné imunitě, přičemž jedinec je zdravý. Na druhé straně buňky Th2 vylučují převážně interieukin 4 a 5, což vede k syntéze IgE a eosinofilii, takže jedinec je alergický. Studie in vitro ukázaly možnost změny reakcí T-buněk specifických pro alergen podáváním peptidů odvozených od alergenu obsahujících relevantní epitopy T-buněk. Současné přístupy k novým protialergickým vakcinám jsou tedy většinou založeny na adresování T-buněk, přičemž cílem je umlčet T-buňky (indukce anergie) nebo posunout reakcí z fenotypu Th2 na fenotyp Th1.

Epitopy vázající protilátky (epitopy B-buněk)

Rentgenové krystalografické analýzy komplexů F_ab-antigen zvýšily míru porozumění epitopům vázajícím protilátky. Na základě tohoto typu analýz mohou být epitopy vázající protilátky definovány jako část povrchu antigenu obsahující atomy 15 - 25 aminokyselinových zbytků, které jsou v takové vzdálenosti od atomu protilátky, aby byla umožněna přímá interakce. Afinita interakce antigen-protilátka nemůže být předpovězena na základě pouze entalpie připisované van der Waalsovým interakcím, vodíkovým vazbám nebo iontovým vazbám. Podobný energetický příspěvek představuje entropie související s téměř úplným vypuzením molekul vody z meziprostoru. To znamená, že hlavním faktorem, který podmiňuje interakce antigen-protilátka s vysokou afinitou, jsou přesně odpovídající povrchy interagujících molekul.

- 5 V dokumentu WO 97/30150 (Pangenetics Β. V., Molecules for the induction of immunological tolerance) se nárokuje populace proteinových molekul, kde tyto proteinové molekuly mají v aminokyselinové sekvenci rozloženy specifické mutace ve srovnání s rodičovským proteinem. Z popisu je zřejmé, že vynález se týká produkce analogů, které obsahují modifikace ve srovnání s rodičovským proteinem, ale které jsou přebírány, štěpeny a předkládány T-buňkám stejným způsobem jako rodičovský protein (v přírodě se vyskytující alergeny). Tak se získá modifikovaná odpověď T-buněk. Knihovny modifikovaných proteinů se připravují s použitím techniky označované jako PM (Parsimonious Mutagenesis).

Ve WO 92/02621 (Biomay Biotechnik Produktions - und Handelsgesellschaft mbH, Allergens of AIDer pollen and applications thereof) se popisují rekombinantní molekuly DNA, které obsahují DNA kódující polypeptid obsahující alespoň jeden epitop alergenu stromů řádu Fagales, kde tento alergen je zvolen ze skupiny Aln g 1, Cor a 1 a Bet v 1. Zde popisované rekombinantní molekuly mají všechny aminokyselinovou sekvenci části nebo celé aminokyselinové sekvence odpovídající sekvenci v přírodě se vyskytujícího alergenu.

WO 90/11293 (Immunologic Pharmaceutical Corporation, The University of North Carolina at Chapel Hill, Allergenic proteins from ragweed and uses thereof) se týká mj. alergenních peptidů pylu ambrózie a modifikovaných peptidů pylu ambrózie. Zde popisované peptidy mají aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá buď sekvenci v přírodě se vyskytujícího alergenu, nebo sekvenci jeho v přírodě se vyskytujících isoforem.

Chemická modifikace alergenů

Dosud bylo používáno několik přístupů k chemické modifikaci alergenů. Postupy z počátku 70. let zahrnují chemickou vazbu alergenů na polymery a chemické zesítění alergenů použitím

- 6 formaldehydu atd., za vytvoření tzv. „alergoidú“. Podstata těchto přístupů spočívala v náhodné destrukci vazebných epitopů IgE navázáním chemického ligandu a tím snížením vazby IgE při zachování imunogenicity zvýšením molekulové hmotnosti komplexů. Nevýhody výroby těchto „alergoidú“ souvisí s obtížností řízení postupu chemického zesítění a s nesnadnou analýzou a standardizací výsledných vysokomolekulárních komplexů. „Alergoidy“ se v současnosti klinicky používají a v důsledku náhodné destrukce vazebných epitopů IgE je možno podávat vyšší dávky ve srovnání s běžnými vakcinami, ale bezpečnost a účinnost se ve srovnání s běžnými vakcinami nezlepší.

Novější přístupy k chemické modifikaci alergenů se snaží o úplné rozbití terciární struktury alergenu a tím o eliminaci vazby IgE za předpokladu, že podstatným terapeutickým cílem je T-buňka specifická pro alergen. Tyto vakciny obsahují syntetické peptidy odvozené od alergenní sekvence reprezentující minimální epitopy Tbuněk, delší peptidy reprezentující navázané epitopy T-buněk, delší syntetické peptidy odvozené od alergenní sekvence reprezentující oblasti imunodominantních epitopů T-buněk nebo alergenní molekuly rozdělené rekombinačními technikami na dvě poloviny. Další přístup založený na tomto principu navrhoval použití rekombinantních isoforem s nízkou vazbou na IgE („low IgE binding“). V posledních letech se stále jasněji ukazuje, že přirozené alergeny jsou heterogenní a obsahují isoalergeny a varianty, ve kterých je substituováno až přibližně 25 % aminokyselin. Bylo zjištěno, že některé rekombinantní isoalergeny jsou méně účinné z hlediska vazby na IgE, což je pravděpodobně způsobeno ireverzibilní denaturací a tím celkovým rozbitím terciární struktury.

Mutageneze in vitro a protialergická vakcinace

Pokusy o snížení alergenicity místně specifickou mutagenezí in

- 7 vitro byly prováděny s několika alergeny, včetně Der f 2, Takai a další (Takai T., Yokota T., Yasue M., Nishiyama C., Yuuki T., Moři A., Okudaira H., Okumura Y.: „Engineering of the major house dust mite allergen Der f 2 for allergen-specific immunotherapy“, Nat. Biotechnol. 15, 754 - 758 (1997)), Der p 2, Smith a další, (Smith A. M., Chapman M. D.: „Localization of antigenic sites on Der p 2 using oligonucleotide - dírected mutagenesís targeted to predicted surface residues“, Clin. Exp. Allergy 27, 593 - 599 (1997)) a alergenu 39 kDa Dermatophagoides farinae, Aki a další (Aki T., Ono K., Hidaka Y., Shimonishi Y., Jyo T., Wada T., Yamashita M., Shigeta S., Murooka Y., Oka S.: „Structure of IgE epitopes on a new 39-kD allergen molecule from the house dust mite, Dermatophagoides farinae, Int. Arch. Allergy Immunol. 103, 357 - 364 (1994)), fosfolipázy A2 včelího jedu, Forster a další (Fórester E., Dudler T., Gmachl M., Aberer W., Urbánek R., Suter M.: „Natural and recombinant enzymatically active or inactive bee venom phospholipase A2 has the same potency to release histamin from basophils in patients with Hymenoptera allergy“, J. Allergy Clin. Immunol. 95, 1229 - 1235 (1995)), Ara h 1, Burks a další (Burks A. W., Shin D., Cockrell G., Stanley J. S., Helm R. M., Bannon G. A.: „Mapping and mutational analysis of the IgE - binding epitopes on Ara h 1, a legume vicilin protein and a major allergen in peanut hypersensitivity“, Eur. J. Biochem. 245, 334 - 339 (1997)), Ara h 2, Stanley a další (Stanley J. S., King N., Burks A. W., Huang S. K., Sampson H., Cockrell G., Helm R. M., West C. M., Bannon G. A.: „Identification and mutational analysis of the immunodominant IgE binding epitopes of the major peanut allergen Ara h 2“, Arch. Biochem. Biophys. 342, 244 - 253 (1997)), Bet v 1, Ferreira a další (Ferreira F., Rohlfs A., Hoffmann-Sommergruber K., Schenk S., Ebner C., Briza P., Jílek A., Kraft D., Breitenbach M., Scheiner O.: „Modulation of IgEbinding properties of tree pollen allergens by site - dírected mutagenesís“, Adv. Exp. Med. Biol. 409, 127 - 135 (1996), Ferreira F., Ebner C., Kramer B., Casari G., Briza P., Kungl A. J., Grimm R., Jah-8- ' Schmid Β., Breiteneder Η., Kraft D., Breitenbach M., Rheinberger H.J., Scheiner O., „Modulation of IgE reactivíty of allergens by sitedirected mutagenesis, Potential use of hypeallergenic variants for immunotherapy“, FASEB Journal for Experimental Biology díl. 12, No. 2, únor 1998, 231 - 242 (1998)), profilinu hrušek Wiedemann a další (Wiedemann P., Giehl K., Almo S. C., Fedorov A. A., Girvin M., Steinberger P., Rudiger M., Ortner M., Sippl M., Doleček C., Kraft D., Jockusch B., Valenta R.: „Molecular and structural analysis of a contínuous birch profilin epitope defined by a monoclonal antibody“, J. Biol. Chem. 271, 29915 - 29921 (1996)), a Ory s 1, Alvarez a další (Alvarez A. M., Fukuhara E., Nakase M., Adachi T., Aoki N., Nakamura R., Matsuda T.: „Four rice seed cDNA clons belonging to the alphaamylase/trypsin inhibitor gene family encode potential rice allergens“, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1304 - 1308 (1995)).

Principem těchto přístupů je opět zaměření na T-buňky specifické pro alergen za současného snížení rizika vedlejších účinků způsobených IgE snížením nebo odstraněním vazby IgE rozbitím terciální struktury rekombinantního mutantního alergenu. Za těmito přístupy nestojí koncept dominantních epitopů vazby IgE a nezahrnují koncept vyvolání nové ochranné imunitní odpovědi, která by také zahrnovala B-buňky a tvorbu protilátek.

Článek Ferreira a další (Ferreira F., Ebner C., Kramer B., Casari G., Bríza P., Kungl A. J., Grimm R., Jah-Schmid B., Breiteneder H., Kraft D., Breitenbach M., Rheinberger H.-J., Scheiner O., „Modulation of IgE reactivíty of allergens by site-directed mutagenesis, Potential use of hypeallergenic variants for immunotherapy“, FASEB Journal for Experimental Biology díl. 12, No. 2, únor 1998, 231 - 242 (1998)) popisuje použití místně specifické mutageneze pro účely snížení vazby IgE. Ačkoli v tomto článku se uvádí trojrozměrná struktury Bet v 1, autoři nepoužívají této struktury pro předpovídání aminokyselinových zbytků exponovaných rozpouštědlu pro účely mutace, a polovina z nich má nízkou míru expozice rozpouštědlu. Autoři používají spíše

- 9 metodu vyvinutou pro předpovídání funkčních zbytků u proteinů odlišnou od zde popisovaného konceptu na struktuře založené identifikace konzervovaných povrchových oblastí. Ačkoli autoři diskutují zakonzervování terciární struktury α-uhlíkaté kostry, tento koncept není součástí terapeutické strategie, ale je pouze zařazen pro hodnocení vazby in vitro IgE. Navíc nejsou předkládané důkazy adekvátní, protože normalizace CD-spekter zabrání vyhodnocení denaturace proproteinu ve vzorku, což je běžný problém. Nepopisuje se ze popisovaná strategie léčení, která se snaží indukovat toleranci T-buněk specifických pro alergen, a vyvolat novou imunitní reakci.

' Článek autorů Wiedemann a další (Wiedemann P., Giehl K., Almo S. C., Fedorov A. A., Girvin M., Steinberger P., Rudiger M., Ortner M., Sippl M., Doleček C., Kraft D., Jockusch B., Valenta R.: „Molecular and structural analysis of a continuous birch profilin epitope defined by a monoclonal antibody“, J. Biol. Chem. 271, 29915 - 29921 (1996)) popisuje použití místně specifické mutageneze a syntézy peptidu pro účely charakterizace epitopů monoklonálních protilátek. Znalosti autorů se týkají terciární struktury antigenu a tyto znalosti se používají pro volbu aminokyseliny exponované na povrchu pro mutaci. Použitý algoritmus je možno pokládat za opačný ve srovnání s algoritmem popisovaným autory předkládaného vynálezu, protože se vybírá aminokyselina, která se liší od homologních sekvencí. Tato studie ukazuje, že substituce na povrchu exponované aminokyseliny má schopnost modifikovat vazebné vlastnosti monoklonální protilátky, což není na základě běžných znalostí překvapivé. Popisované experimenty nejsou navržené pro zjišťování modulace vazby polyklonálních protilátek, jako jsou IgE v séru alergických pacientů. Jeden z popisovaných experimentů používá sérový IgE, a i když není tento experiment vhodný pro kvantitativní stanovení, nezdá se, že by byla vazba IgE ovlivněna provedenými mutacemi.

Článek autorů Smith a další (Smith A. M., Chapman M. D.: „Localization of antigenic sites on Der p 2 using oligonucleotide - 10 directed mutagenesis targeted to predicted surface residues“, Clin. Exp. Allergy 27, 593 - 599 (1997)) popisuje použití místně specifické mutageneze pro účely mapování epitopů monoklonálních protilátek a snížení vazby IgE. Autoři nemají žádné znalosti o terciární struktuře a nepokoušejí se zjišťovat zakonzervování terciární struktury auhlíkaté kostry. Použitý algoritmus nezajišťuje, že jsou aminokyseliny vybrané pro mutaci skutečně exponované na povrchu molekuly. Pouze jeden z popisovaných mutantů vedl k podstatnému snížení vazby IgE. Tento mutant se neváže na všechny testované protilátky, což ukazuje, že má rozbitou terciární strukturu. Autoři nedefinují terapeutickou strategii a neuvádí se vyvolání nové imunitní reakce.

článek autorů Colombo a další (Colombo P., Kennedy D., Ramsdale T., Costa M. A., Djro G., Izzo V., Salvadoři S., Guerrini R., Cocchiara R., Mirisola M. G., Wood S., Geraci D., Journal of Immunology díl 160, No. 6, 15. března 1998, 2780 - 2875) popisuje studium vazebného epitopu IgE použitím místně specifické mutageneze a syntézu peptidů. autoři používají trojrozměrné počítačem modelované struktury založené na krystalové struktuře homologního proteinu pro ilustraci přítomnosti epitopu na molekulárním povrchu. Další přítomnost epitopu na odlišném alergenu ukazující primární strukturní homologii se zjišťuje použitím syntetických peptidů reprezentujících epitop. Terapeutická strategie je založena na léčení použitím tohoto syntetického peptidů reprezentujícího monovalentní epitop vázající IgE. Konzervované povrchové oblasti mezi homologními alergeny stejně jako terapeutický koncept vyvolání nové ochranné imunitní odpovědi se neuvádějí.

Článek autorů Spangfort a další (Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., Mortz E., Roepstorff

P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 - 373 (1996a)) popisuje trojrozměrnou strukturu a konzervované oblasti exponované na

- 11 povrchu hlavního alergenu břízy. Tento článek nezmiňuje hlavní vazebné epitopy IgE ani místně specifickou mutagenezi a neuvádí se ani terapeutické použití. V žádné z výše popisovaných studií se nesnižuje vazba IgE substitucí na povrchu exponovaných aminokyselin při zakonzervované terciární struktuře α-uhlíkaté kostry. Podstata výše uvedených přístupů nezahrnuje koncept dominantních epitopů vázajících IgE a nezahrnuje terapeutický koncept vyvolání nové ochranné imunitní odpovědi.

Dokument WO 99/47680 popisuje zavedení substitucí umělých aminokyselin do definovaných kritických poloh při zachování terciární struktury α-uhlíkaté kostry. WO 99/47680 popisuje zvláště rekombinantní alergen, který je mutantem nevyskytujícím se v přírodě a který je odvozený od v přírodě se vyskytujícího alergenu, přičemž alespoň jeden na povrchu exponovaný konzervovaný aminokyselinový zbytek epitopu B-buňky je substituován jiným zbytkem, který se nevyskytuje ve stejné poloze aminokyselinové sekvence kteréhokoli známého homologního proteinu v rámci taxonomického řádu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, a kde uvedený mutantní alergen má v podstatě stejnou terciární strukturu auhlíkaté kostry jako v přírodě se vyskytující alergen, a specifická vazba IgE na mutovaný alergen je snížena ve srovnání s vazbou uvedeného v přírodě se vyskytujícího alergenu.

Rekombinantní alergen popisovaný ve WO 99/47680 se může získat a) identifikací aminokyselinových zbytků v alergenu vyskytujícím se v přírodě, které jsou konzervované s více než 70% identitou ve všech známých homologních proteinech v rámci taxonomického řádu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, b) definováním alespoň jedné oblasti (patch) konzervovaných aminokyselinových zbytků, které jsou koherentně spojeny v ploše alespoň 400 A (1A = 0,1 nm²) (1A = 0,1 nm²) = 0,01nm²) povrchu trojrozměrné struktury molekuly alergenu, který je definovaný

- 12 dostupností rozpouštědlu alespoň 20 %, kde tato alespoň jedna oblast obsahuje alespoň jeden epitop B-buněk, a c) substitucí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku v uvedené alespoň jedné oblasti jinou aminokyselinou, která není v uvedené poloze konzervativní, přičemž je v podstatě zachována celková terciární struktura a-uhlíkaté kostry molekuly alergenu.

Podstata vynálezu

Základem předkládaného vynálezu je zcela jedinečná myšlenka. Mechanismem úspěšné protialergické vakcinace není podle tohoto principu změna nastupující imunitní odpovědi typu Th2, ale spíše paralelní iniciace nové imunitní odpovědi zahrnující rozpoznání terciárního epitopu B-buňkami a tvorbu protilátek. Předpokládá se, že tato nová imunitní odpověď je částečně imunitní odpověď typu Th1. Tento model je podporován pozorováním, že hladiny specifických IgE nejsou ovlivňovány úspěšnou vakcinací, a že úspěšné léčení je často doprovázeno podstatným zvýšením lgG4 specifického pro alergen. Navíc neukazují studie vzorků odebraných z nosu před a po testovacím podání alergenu snížení množství T-buněk fenotypu podobného Th2, ale pozoruje se spíše zvýšení množství T-buněk podobných Th1. Jestliže se vakcina (nebo farmaceutické prostředky) podávají jinou cestou než jsou dýchací cesty, předpokládá se, že nová imunitní odpověď se vyvíjí v místě fyzicky odděleném od nastupující odpovědi Th2, čímž je umožněna paralelní existence těchto dvou odpovědí.

Další důležitý aspekt imunitního systému je uplatnění existence tzv. dominantních epitopů vazby IgE. Předpokládá se, že tyto dominantní epitopy vazby IgE jsou tvořeny koherentními oblastmi povrchu závislými na terciární struktuře, které jsou dostatečně velké, aby umožnily vazbu protilátek, a jsou konzervované mezi isoalergeny,

- 13 variantami a/nebo homologními alergeny z příbuzných druhů. Existence křížově reagujícího IgE schopného vazby na podobné epitopy homologních alergenů je podporována klinickým pozorováním, že u alergických pacientů často dochází k reakci s několika úzce příbuznými druhy, např. olše, bříza a líska, více druhy trav nebo několika druhy rodu roztočů domácího prachu Dermatophagoides. Dále se na základě laboratorních experimentů předpokládá, že existuje zkřížená reaktivita IgE mezi homologními alergeny z příbuzných druhů a schopnost jednoho alergenu inhibovat vazbu IgE na homologní alergeny (Ipsen H., Wihl J.-A., Petersen Β. N., Lowenstein H.: „Specificity mapping of patients IgE response towards the tree pollen major allergens Aln g I, Bet v I and Cor a I“, Clin. Exp. Allergy 22, 391 - 9, (1992)). Je známo, že expozice a imunitní odpovědi spolu úzce souvisí v závislosti na dávce. Na základě kombinace těchto pozorování se předpokládá, že konzervované povrchové oblasti jsou vystaveny imunitnímu systému ve vyšších dávkách než nekonzervované povrchové oblasti, což vede k vytváření protilátek IgE s vyššími afinitami, a proto se používá termínu „dominantní epitopy vazby IgE“ (dominant IgE binding epitopes).

Na základě těchto hypotéz je nutné, aby měl alergen terciární strukturu α-uhlíkaté kostry v podstatě stejnou jako je struktura přirozeného alergenu, čímž se zajistí zakonzervování povrchové topologie oblastí obklopujících konzervovaná místa reprezentující cíle pro mutagenezi za účelem snížení vazby IgE. Splněním těchto kritérií se alergen stane schopným podávání v relativně vyšších dávkách, což zlepšuje jeho účinnost při tvorbě ochranné imunitní odpovědi a není snížena bezpečnost.

Vynález je dále založen na zjištění, že alergické příznaky jsou spouštěny přemostěním alergenu dvěma specifickými IgE navázanými na povrch efektorových buněk, tj. žírných buněk a bazofiiů, receptorem IgE s vysokou afinitou, FceRI. Pro ilustraci se uvádí obr. 15, který ukazuje teoretický model alergenu s vazebnými epitopy pro IgE.

- 14 Indukce uvolňování mediátoru z žírné buňky a tím alergických symptomů se uskutečňuje přemostěním IgE navázaným na povrchu žírné buňky prostřednictvím alergenu, srovnej obr. 15A. V situaci ukázané na obr. 15B byly dva z těchto epitopů mutovány tak, aby se snížila jejich schopnost vázat IgE, a tím se zabrání přemostění prostřednictvím alergenu. V této souvislosti je třeba upozornit, že alergeny obvykle obsahují více než tři epitopy B-buněk. Z teoretické situace znázorněné na obr. 15 je však možno vyvodit, že čím větší je počet epitopů, které byly mutovány pro odstranění nebo snížení jejich schopnosti vázat IgE, tím nižší je riziko přemostění prostřednictvím alergenu a výsledných alergických příznaků.

Aby však byl mutovaný alergen schopen vyvolat novou imunitní odpověď včetně odpovědi IgG, musí alergen obsahovat alespoň jeden intaktní epitop. Intaktním epitopem je s výhodou dominantní epitop, protože takový mutovaný alergen bude poskytovat zlepšenou ochranu při použití pro vakcinaci.

Vynálezecká myšlenka předkládaného vynálezu je tedy založena na zjištění, že mutovaný alergen obsahující mutace ve větším počtu epitopů B-buněk vedoucí ke snížení vazby IgE, a alespoň jeden intaktní epitop, by na jedné straně snižovaly přemostění prostřednictvím alergenu a na druhé straně umožňovaly vyvolání odpovědi IgG s vazebnou schopností schopnou soutěžit s IgE. Tento mutovaný alergen by tedy tvořil vysoce výhodný alergen v tom, že by se silně omezila možnost vytvoření anafylatických reakcí.

Předkládaný vynález je také založen na zjištění, že vakcina obsahující směs různých takových mutovaných alergenů, kde v ideálním případě mnoho nebo všechny epitopy jsou reprezentovány jako intaktní, by byla stejně účinná z hlediska schopnosti indukovat ochranu proti alergickým příznakům jako v přírodě se vyskytující alergen, ze kterého jsou mutované alergeny odvozeny.

- 15 Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká zavedení substitucí umělými aminokyselinami do určitého počtu definovaných kritických poloh, tj. vazebných epitopu pro IgE, s cílem snížit specifickou vazbu IgE každého mutovaného epitopu.

Vynález poskytuje rekombinantní alergen charakterizovaný tím, že je mutantou v přírodě se vyskytujícího alergenu, přičemž mutantní alergen obsahuje alespoň čtyři primární mutace, z nichž každá snižuje vazebnou schopnost mutovaného alergenu pro specifický IgE ve srovnání s vazebnou schopností pro IgE uvedeného v přírodě se vyskytujícího alergenu, přičemž každá primární mutace je substituce jednoho na povrchu exponovaného aminokyselinového zbytku dalším zbytkem, který se nevyskytuje ve stejné poloze v aminokyselinové sekvenci kteréhokoli známého homologního proteinu v rámci taxonomického druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, a kde každá primární mutace je vzdálena od každé další primární mutace o alespoň 15 A (1A = 0,1 nm), a kde primární mutace jsou umístěny takovým způsobem, že alespoň jedna kruhová oblast povrchu s plochou 800 A² (1Á² = 0,01 nm²) neobsahuje žádnou mutaci.

Aniž by si autoři přáli být vázáni teorií, předpokládá se, že epitopy B-buněk mohou být rozloženy téměř po celém povrchu alergenu. Navíc existují experimentální důkazy, že alespoň některé epitopy tvoří část shluku (clusteru) epitopů obsahujícího velký počet překrývajících se epitopů. Proto teoretický základ pro předkládaný vynález představuje myšlenka, že jakákoli na povrchu exponovaná aminokyselina je potenciálním místem mutace, které může vést ke snížené schopnost vázat specifický IgE.

Primární mutace jsou tedy dále definovány svým vzájemným umístěním, tj. jak jsou od sebe vzdáleny, aby bylo zajištěno, že mutace proběhnou v oddělených shlucích epitopů.

- 16 Předkládaný vynález dále poskytuje kompozici obsahující dvě nebo více variant rekombinantního mutantního alergenu podle nároku 1, přičemž každá varianta je definovaná obsahem alespoň jedné hlavní mutace, která není přítomna v alespoň jedné z dalších variant, kde u každé varianty není sekundární mutace přítomná v rozmezí vzdálenosti 15 A (1A = 0,1 nm) od každé nepřítomné primární mutace. Tato kompozice s výhodou obsahuje 2 až 12, výhodněji 3 až 10, výhodněji 4 až 8 a nejvýhodněji 5 až 7 variant.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby rekombinantního alergenu podle nároku 1, který se vyznačuje tím, že zahrnuje následující kroky:

a) v alergenu vyskytujícím se v přírodě se identifikuje určitý počet aminokyselinových zbytků, které mají dostupnost rozpouštědlu alespoň 20 %;

b) vyberou se alespoň čtyři identifikované aminokyselinové zbytky takovým způsobem, že každá vybraná aminokyselina je ve vzdálenosti od každé další vybrané aminokyseliny alespoň 15 A (1A = 0,1 nm), a vybrané aminokyseliny jsou umístěny takovým způsobem, že alespoň jedna kruhová oblast povrchu s plochou 800 A² (1A² 0,01 nm²) neobsahuje žádnou vybranou aminokyselinu; a

c) pro každou z vybraných aminokyselin se provede primární mutace, která sníží vazebnou schopnost specifického IgE mutovaného alergenu ve srovnání s vazebnou schopností uvedeného v přírodě se vyskytujícího alergenu, přičemž každá primární mutace je substituce vybraného aminokyselinového zbytku jinou aminokyselinou, která se nevyskytuje ve stejné poloze v aminokyselinové sekvenci kteréhokoli známého homologního proteinu v rámci taxonomického druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází.

V alternativním provedení se vynález týká způsobu výroby rekombinantního alergenu podle vynálezu, který se vyznačuje tím, že alergen se vyrábí ze sekvence DNA získané mícháním DNA (DNA

- 17 shuffling) neboli molekulárním křížením (molecular breeding) DNA kódující odpovídající v přírodě se vyskytující alergen.

Vynález se dále týká rekombinantního alergenu podle nároku 1, pro použití jako farmaceutický prostředek.

Vynález se dále týká použití rekombinantního alergenu podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení alergie.

Vynález se dále týká kompozice podle nároku 37, pro použití jako farmaceutický prostředek.

Vynález se dále týká použití kompozice podle nároku 37, pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení alergie.

Vynález se dále týká farmaceutického prostředku, který se vyznačuje tím, že obsahuje rekombinantni alergen podle nároku 1 nebo kompozici podle nároku 37, popřípadě v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem a/nebo pomocnou látkou, a popřípadě adjuvans. Farmaceutický prostředek podle vynálezu může být ve formě vakciny proti alergickým reakcím vyvolaným v přírodě se vyskytujícím alergenem u pacientů trpících alergií.

Vynález se také týká způsobu vyvolání imunitní odpovědi u pacienta, který zahrnuje podávání rekombinantního alergenu podle nároku 1, kompozice podle nároku 37 nebo farmaceutického prostředku podle nároku 41 nebo 42 nebo 46 pacientovi.

Vynález se dále týká vakcinace nebo léčení pacienta, které zahrnuje podávání rekombinantního alergenu podle nároku 1, kompozice podle nároku 37 nebo farmaceutického prostředku podle nároku 41 a 42 nebo 46 pacientovi.

Vynález se dále týká způsobu výroby farmaceutického prostředku podle nároku 41 nebo 42, který zahrnuje míšení rekombinantního alergenu podle nároku 1 nebo kompozice podle

- 18 nároku 37 s farmaceuticky přijatelnými substancemi a/nebo pomocnými látkami.

Vynález se dále týká farmaceutického prostředku získatelného způsobem podle nároku 45.

Vynález se dále týká způsobu léčení, prevence nebo zmírnění alergických reakcí u pacienta, který zahrnuje podávání rekombinantního alergenu podle nároku 1, kompozice podle nároku 37 nebo farmaceutického prostředku podle nároků 41 a 42 nebo 46 pacientovi.

Vynález se dále týká sekvence DNA kódující alergen podle vynálezu, jejího derivátu, její částečné sekvence, její degenerované sekvence nebo sekvence, která s ní za stringentních podmínek hybridizuje, přičemž uvedený derivát, parciální sekvence, degenerovaná sekvence nebo hybridizující sekvence kóduje peptid obsahující alespoň jeden epitop B-buněk.

Vynález se dále týká expresního vektoru, který obsahuje DNA podle vynálezu.

Vynález se dále týká hostitelské buňky, která obsahuje expresní vektor podle vynálezu.

Vynález se dále týká způsobu přípravy rekombinantního mutantního alergenu, který zahrnuje krok kultivace hostitelské buňky podle vynálezu.

Vynález se konečně týká rekombinantního alergenu podle vynálezu nebo kódovaného sekvencí DNA podle vynálezu, který obsahuje alespoň jeden epitop T-buňky schopný stimulovat klon Tbuněk nebo linii T-buněk specifickou pro v přírodě se vyskytující alergen.

Mutanty podle vynálezu by měly být s výhodou schopny stimulovat pro alergen specifické linie T-buněk podobným způsobem nebo v podobném stupni, jak se měří stimulačním indexem T-buněk.

- 19 Ve výhodném provedení vynálezu jsou primární mutace ve vzdálenosti 20 A, s výhodou 25 A a nejvýhodněji 30 A (1A = 0,1 nm).

Předpokládá se, že alergen obsahuje řadu potenciálních vazebných oblastí pro specifické IgE, kde každá oblast má velikost přibližně 800 A² (1A² = 0,01nm²), a každá povrchová oblast obsahuje velký počet překrývajících se epitopů. Počet potenciálních primárních mutací alergenu se tedy získá jako podíl povrchové plochy a 800 A² (1A² = 0,01nm²).

Rekombinantní alergen podle vynálezu s výhodou obsahuje 5 až 20, výhodněji 6 až 15, ještě výhodněji 7 až 12, a nejvýhodněji 8 až 10 primárních mutací.

Ve výhodném provedení vynálezu má oblast povrchu neobsahující žádnou mutaci plochu 700 A², s výhodou 600 A², výhodněji 500 A² a nejvýhodněji 400 A² (1A² = 0,01 nm²).

Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje rekombinantní alergen určitý počet sekundárních mutací, kde každá tato mutace snižuje vazebnou schopnost mutovaného alergenu na specifický IgE ve srovnání s vazebnou schopností v přírodě se vyskytujícího alergenu, přičemž každá sekundární mutace je substituce jednoho na povrchu exponovaného aminokyselinového zbytku jiným zbytkem, který se nevyskytuje ve stejné poloze v aminokyselinové sekvenci kteréhokoli známého homologního proteinu v rámci taxonomického druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, přičemž sekundární mutace jsou umístěny mimo uvedenou kruhovou oblast.

Sekundární mutace mohou být umístěny v blízkosti primární mutace, tj. sekundární mutace může být stejně dobře další mutací stejného epitopu, který je mutován primární mutací. Ve výhodném provedení vynálezu má alespoň jedna z aminokyselin exponovaných na povrchu, které mají být v alergenu vyskytujícím se v přírodě

- 20 substituovány, dostupnost rozpouštědlu více než 20 %, s výhodou více než 30 %, výhodněji více než 40 % a nejvýhodněji více než 50 %.

V dalším výhodném provedení vynálezu je alespoň jedna z aminokyselin exponovaných na povrchu, která má být substituována v alergenu vyskytujícím se v přírodě, konzervována s více než 70%, s výhodou 80% a nejvýhodněji 90% identitou u všech známých homologních proteinů v rámci druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází.

Rekombinantní alergen podle vynálezu má s výhodou v podstatě stejnou terciární strukturu α-uhiíkaté kostry jako uvedený v přírodě se vyskytující alergen.

Jestliže porovnáváme terciární struktury α-uhlíkaté kostry molekuly mutantního a v přírodě se vyskytujícího alergenu, průměrná střední kvadratická odchylka atomových souřadnic je s výhodou nižší než 2 Á (1A = 0,1 nm).

Ve výhodném provedení rekombinantního alergenu podle vynálezu se každý aminokyselinový zbytek, který má být inkorporován do mutantního alergenu, nevyskytuje ve stejné poloze v aminokyselinové sekvenci kteréhokoli známého homologního proteinu v rámci taxonomického rodu, s výhodou podčeledi, výhodněji čeledi, výhodněji nadčeledi, výhodněji legionu, ještě výhodněji podřádu a nejvýhodněji řádu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází.

Ve výhodném provedení vynálezu je rekombinantní mutantní alergen podle vynálezu alergen, který se nevyskytuje v přírodě.

Vazba specifického IgE na mutovaný alergen je s výhodou snížena o alespoň 5 %, s výhodou o alespoň 10 %, v porovnání s isoalergeny vyskytujícími se v přírodě nebo podobnými rekombinantními proteiny, při použití imunologického testu se séry

- 21 alergických pacientů reaktivními s IgE specifickými pro zdroj, nebo směsného séra.

Další způsob hodnocení snížené vazby IgE a snížené schopnosti zprostředkovat přemostění u mutantů je schopnost mutanty vyvolat uvolňování histaminu (Histamine Release, HR). Uvolňování histaminu se může měřit několika testy pro zjišťování uvolňování histaminu. Snížené uvolňování histaminu u mutant je důsledkem snížené afinity vůči specifickému IgE navázanému na buněčném povrchu stejně jako snížené schopnosti vyvolávat přemostění. HR se s výhodou sníží o 5 až 100 %, výhodněji o 25 až 100 %, ještě výhodněji o 50 až 100 % a nejvýhodněji o 75 až 100 % u mutantů podle vynálezu ve srovnání s alergeny vyskytujícími se v přírodě.

Typicky obsahuje kruhová oblast povrchu s plochou 800 Á² (1A² = 0,01 nm²), ve které není přítomná žádná mutace, atomy 15-25 aminokyselinových zbytků.

Výhodný rekombinantní alergen podle vynálezu je charakterizován tím, že na povrchu exponované aminokyselinové zbytky se roztřídí z hlediska dostupnosti rozpouštědlu, a provede se substituce jedné nebo více aminokyselin mezi aminokyselinami více dostupnými rozpouštědlu.

Další výhodný rekombinantní alergen podle vynálezu je charakterizován tím, že aminokyselinové zbytky exponované na povrchu se roztřídí z hlediska stupně konzervace u všech známých homologních proteinů v rámci druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, a provede se substituce jedné nebo více aminokyselin mezi více konzervovanými aminokyselinami.

Rekombinantní alergen podle vynálezu s výhodou obsahuje 1 až 4 sekundární mutace na primární mutaci.

- 22 ' ; ?

Výhodné provedení vynálezu je charakterizováno tím, že jedna nebo více substitucí se provádí metodou místně specifické (sitedirected) mutageneze.

Další výhodné provedení vynálezu je charakterizováno tím, že jedna nebo více substitucí se provádí náhodnou mutagenezi.

Další výhodné provedení vynálezu je charakterizováno tím, že jedna nebo více substitucí se provádí metodou míchání DNA (DNA shuffling).

Rekombinantní alergeny podle vynálezu mohou být vhodně mutantou inhalačního alergenu pocházejícího mj. ze stromů, trav, bylin, hub, roztočů domácího prachu, švábů, zvířecích chlupů a lupů. Důležité pylové alergeny ze stromů, trav a bylin jsou alergeny pocházející z taxonomických řádů Fagales, Oleales a Pinales, včetně např. břízy (Betula), olše (Alnus), lísky (Corylus), habru (Carpinus) a olivy (O/ea), řádu Poales včetně mj. trav rodu Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis a Secale, řádů Astrales a Urticales včetně mj. bylin rodu Ambrosia a Artemisia. Důležité inhalační alergeny z hub jsou mj. alergeny pocházející z rodu Alternaria a Cladosporium. Další důležité inhalační alergeny jsou alergeny z roztočů domácího prachu rodu Dermatophagoides, alergeny švábů a alergeny ze savců jako jsou kočky, psi a koně. Rekombinantní alergeny podle vynálezu mohou být mutanty alergenů jedů včetně alergenů pocházejících z bodavého nebo kousavého hmyzu, jako jsou alergeny z taxonomického řádu Hymenoptera včetně včel (nadčeleď Apidae), vos (nadčeleď Vespidea), a mravenců (nadčeleď Formicoidae).

Specifické složky alergenů zahrnují například Bet v 1 (S. verrucosa, bříza), Aln g 1 (Alnus glutinosa, olše), Cor a 1 (Corylus avelana, líska) a Car b 1 (Carpinus betulus, habr) řádu Fagales. Další jsou Cry j 1 (Pinales), Amb a 1 a 2, Art v 1 (Asterales), Par j 1 (Urticales), Ole e 1 (Oleales), Ave e 1, Cyn d 1, Dac g 1, Fes p 1, Hol I 1, Lol p 1 a 5, Pas n 1, Phl p 1 a 5, Poa p 1, 2 a 5, Sec c 1 a 5, a Sor ) -3 >

- 23 ) > ) h 1 (různé pyly trav), Alt a 1 a Cla h 1 (houby), Der f 1 a 2, Der p 1 a 2 (roztoči domácího prachu, D. farinae, popř. D. pteronyssinus), Lep d 1 a 2 (Lepidoglyphus destructor, roztoč ničivý), Bia g 1 a 2, Per a 1 (švábi, Blatella germanica a Periplaneta americana), Fel d 1 (kočka), Can f 1 (pes), Equ c 1, 2 a 3 (kůň), Apis m 1 a ,2 (včela), Ves v 1, 2 a 5, Pol a 1, 2 a 5 (všechno vosy) a Sol i 1, 2, 3 a 4 (mravenec, fire ant).

V jednom provedení je rekombinantní alergen mutanta Bet v 1. Aminokyseliny vhodné pro substituci zahrnují aminokyseliny V2, D72, E87, K-129, E60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153,1-44, E-138, G-61, A-130, R-70, N28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 a E-73. Jedna nebo více z primárních a sekundárních substitucí může být zvolena ze skupiny V2F, V2L, V2I, V2M, Y5V, T10P, T1OA, K20N, D25E, N28T, K32Q, Q36A, Q36K, E42S, E45S, N47S, K55N, K65N, D72H, D72Q, D72N, T77A, N78K, E87G, E96L, K97S, K103V, P108G, D109N, K123I, D125Y, K129N, K134E, R145E, S149R, S149T, D156H a +160N, kde + znamená, že je zavedena další aminokyselina.

Příklady mutant Bet v 1 podle předkládaného vynálezu jsou následující (pokud se používají závorky, označují primární a sekundární mutace):

Mutanta A (Asn28Thr, Lys32Gln), (Asn78Lys, Lys103Val), Arg145Glu, (Asp156His, + 160Asn).

Mutanta B

Tyr5Val, Glu42Ser, Glu45Ser, Asn78Lys, Lys103Val, Lys123lle, Lys134Glu, Asp156His.

- 24 Mutanta 2595 (příklad 2)

N28T, K32Q, E45S, P108G Mutanta 2628 (příklad 4)

Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu.

Mutanta 2637 (příklad 4)

Ala16Pro, (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys103Thr, Pro108Gly, (Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro).

Mutanta 2724

N28T, K32Q, N78K, K103V, P108G, R145E, D156H,+160N. Mutanta 2733 (příklad 4) (Tyr5Val, Lys134Glu), (Asn28Thr, Lys32Gln), Glu45Ser, Lys65Asn, (Asn78Lys, Lys103Val), Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, (Asp156His, +160Asn).

Mutanta 2744 (Tyr5Val, Lys134Glu), (Glu42Ser, Glu45Ser), (Asn78Lys, Lys103Val), Lys123l1e (Asp156His, +160Asn).

Mutanta 2753 (příklad 4) (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys65Asn, (Glu96Leu, Lys97Ser), (Pro108Gly, Asp109Asn), (Asp125Tyr, Glu127Ser), Arg145Glu.

Mutanta 2744 + 2595

Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, N78K, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N.

Mutanta 2744 + 2628

Y5V, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, K123I, K134E, D156H,+160N.

- 25 Mutanta 2744 + 2595 + 2628

Y5V, N28T, K32Q, E42S, E45S, K65N, N78K, K97S, K103V, P108G, K123I, K134E, D156H, +160N.

Dále obsahují všechny z výše uvedených mutant jednu nebo více náseldujících substitucí: V2F, V2L, V2I, V2M, T10A, K20N, Q36A nebo Q36K, D72H, D72Q, D72N, E87G, K129N a S149R nebo S149T.

V dalším provedení je rekombinantní alergen odvozený z alergenu jedu z taxonomického řádu Vespidae, Apidae a Formicoidae.

V dalším provedení je rekombinantní alergen odvozen od Ves v 5. Aminokyseliny potenciálně vhodné pro substituci zahrnují aminokyseliny K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6, K149, K-128, E-184, K-112, F-157, E-3, K-29, N-203, N-34, K-78, K151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, K-52, T-67, T-125, K150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M138, T-209, V-84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 a 1-182. Jedna nebo více z primárních a sekundárních substitucí může být zvolena ze skupiny K29A, T67A, K78A, V84S, Y102A, K112S, K144A, K202M a N203G.

V dalším provedení je rekombinantní alergen odvozen od Der p 2. Aminokyseliny R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, 1-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, 1-28, K-14, K-100, E-62, 1-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109 a R128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, 1-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P26, N-93, D-64, 1-28, K-14, K-100, E-62, 1-127, E-102, E-25, P-66, L17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87,

- 26 Ν-10, Μ-111, C-8, Η-124, 1-68, Ρ-79, Κ-109, Κ-15. Jedna nebo více z primárních a sekundárních substitucí může být zvolena ze skupiny K6A, N10S, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N a R128Q.

Příklady mutant Bet v 1 podle předkládaného vynálezu jsou následující:

Mutanta A

K6A, K15E, H30N, E62S.

Mutanta B

K6A, K15E, H30N, E62S, H74N, K82N.

Mutanta C

K6A, N10S, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N a R128Q.

Vakciny

Výroba vakcin je obecně v oboru dobře známá. Vakciny se typicky připravují jako injekční preparáty buď ve formě kapalných roztoků nebo suspenzí. Tyto vakciny mohou být také emulgovány nebo formulovány tak, aby umožňovaly podání nosem stejně jako podání orální, včetně bukáiního a sublingválního. Příslušná imunogenní složka (rekombinantní alergen jak je zde definován) se může vhodně míchat s pomocnými látkami, které jsou farmaceuticky přijatelné a dále kompatibilní s účinnou složkou. Příklady vhodných pomocných látek jsou voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol apod., stejně jako jejich kombinace. Vakcina může dále obsahovat další látky jako jsou smáčedla, emulgátory, pufry nebo adjuvans zvyšující účinnost vakciny. Vakciny se nejčastěji podávají parenterálně subkutánní nebo intramuskulární injekcí. Mezi formulace, které jsou vhodné pro

- 27 podávání jiným způsobem, zahrnují orální formulace a čípky. Vakciny pro orální podávání mohou být vhodně formulovány s pomocnými látkami, které se normálně pro tyto formulace používají, např. mannitol, laktóza, škrob, stearan hořečnatý, sodná sůl sacharinu, celulóza, uhličitan hořečnatý apod., farmaceutické čistoty. Prostředky mohou být formulovány jako roztoky, suspenze, emulze, tablety, pilulky, kapsle, formulace s prodlouženým uvolňováním, aerosoly, prášky nebo granuláty.

Vakciny se podávají takovým způsobem, aby byly kompatibilní s dávkovou formou a v takovém množství, aby byly terapeuticky účinné a imunogenní. Množství účinné složky obsažené ve vakcině závisí na léčeném subjektu, mj. schopnosti imunitního systému pacienta reagovat na léčení, způsobu podávání a věku a hmotnosti pacienta. Vhodné rozmezí dávek se může měnit v rozmezí od přibližně 0,0001 pg do 1000 pg.

Jak bylo uvedeno výše, zesíleného účinku se může dosáhnout přidáním adjuvantních látek do formulace. Příklady takových adjuvans jsou hydroxid a fosforečnan hlinitý (alum) nebo fosforečnan vápenatý, jako 0,05 až 0,1% roztok ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem, syntetické polymery cukrů nebo polylaktidglykolid (PLG) používaný jako 0,25% roztok. Mohou se také používat směsi s bakteriálními buňkami jako je C. parvum, endotoxiny nebo lipopolysacharidovými složkami gramnegativních bakterií, emulze ve fyziologicky přijatelných olejových vehikulech jako je mannidmonoaleát (Aracel A) nebo emulze s 20% roztokem perfluorovaného uhlovodíku (např. Fluosol-DA) používaná jako bloková náhrada. Mohou být také použity olejové emulze jako je MF-59. Lze také použít další adjuvans jako je Freundovou kompletní a nekompletní adjuvans, stejně jako saponiny, jako je QuilA, Qs-21 a ISCOM a RIBI.

Nejčastěji bude pro zajištění účinku nutné vícenásobné podání. Často se vakcina podává jako zahajující podání a potom následuje

- 28 další očkování nebo jiné způsoby podávání. Počet vakcinací bude typicky v rozmezí od 1 do 50, přičemž obvykle se nepřekročí 35 vakcinací. Vakcinace se normálně provádějí 2 x týdně až 2 x měsíčně po dobu 3 měsíců až 5 let. Takovým způsobem se dosáhne požadované hladiny preventivního nebo léčebného účinku.

Rekombinantní alergen se může použít jako farmaceutický prostředek, který je vhodný pro poskytnutí určitého stupně ochrany proti alergickým reakcím v průběhu období roku, kdy se projevují příznaky (prevence). Obvykle se léčení musí pro dosažení ochranného účinku opakovat každý rok. K tomuto účelu jsou zvláště vhodné preparáty formulované pro podání nosem, ústy a pod jazyk.

Způsob přípravy rekombinantního alergenu podle vynálezu

Jak bylo uvedeno výše, předkládaný vynález se také týká způsobu přípravy rekombinantního mutantního alergenu podle vynálezu, srovnej nárok 48. Na povrchu exponované aminokyseliny vhodné pro substituci předkládaného vynálezu mohou být identifikovány na základě informací o jejich dostupnosti rozpouštědlu (vodě), která vyjadřuje míru expozice na povrchu. Výhodné provedení způsobu podle vynálezu se vyznačuje seřazením uvedených identifikovaných aminokyselinových zbytků z hlediska dostupnosti rozpouštědlu a substitucí jedné nebo více aminokyselin vybraných z aminokyselin s vyšší dostupností rozpouštědlu.

Druhý parametr, který může přispívat k identifikaci aminokyselin exponovaných na povrchu, vhodných pro substituci podle předkládaného vynálezu je rozsah, ve kterém jsou aminokyseliny konzervovány u všech známých homologních proteinů v rámci druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází. Alternativně se jako druhý parametr používá rozsah, ve kterém jsou konzervovány všechny známé homologní proteiny v rámci taxonomického rodu, podčeledi, čeledi, nadčeledi, legionu, podřádu

- 29 nebo řádu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází.

Výhodné provedení způsobu podle vynálezu je tedy charakterizováno volbou identifikovaných aminokyselinových zbytků, které jsou konzervované s více než 70%, s výhodou více než 80% a nejvýhodněji více než 90% identitou u všech známých homologních proteinů v rámci druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází.

Další zvláště výhodné provedení způsobu podle vynálezu je charakterizováno zařazením uvedených identifikovaných aminokyselinových zbytků z hlediska stupně konzervace ve všech známých homologních proteinech v rámci druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, a substitucí jedné nebo více aminokyselin z více konzervovaných zbytků.

Další výhodné provedení vynálezu zahrnuje volbu identifikovaných aminokyselin tak, aby tvořily mutantní alergen, který má v podstatě stejnou terciární strukturu α-uhlíkaté kostry, jako uvedený v přírodě se vyskytující alergen.

Další výhodné provedení způsobu podle vynálezu je charakterizováno tím, že substituce aminokyselinových zbytků se provádí místně specifickou mutagenezi.

Alternativní výhodné provedení způsobu podle vynálezu je charakterizováno tím, že substituce aminokyselinových zbytků se provádí metodou míchání DNA.

Kritéria pro substituci

Pro molekuly, pro které byla určena terciární struktura (např. rentgenovou krystalografií nebo NMR elektronovou mikroskopií) by měla mutanta nesoucí substituovanou aminokyselinu nebo aminokyseliny s výhodou splňovat následující kritéria:

- 30 1. Celková terciární struktura α-uhlíkaté kostry molekuly je s výhodou konzervovaná. Konzervace je definována jako průměrná kvadratická odchylka atomových souřadnic při porovnání struktur nižší než 2 A (1A = 0,1 nm). To je důležité ze dvou důvodů: a) předpokládá se, že celý povrch přírodního alergenu tvoří překrývající se kontinuum potenciálních epitopů vázajících protilátku. Většina povrchu molekuly není substitucí nebo substitucemi ovlivněna a tak si zachovává svou schopnost indukovat vazbu protilátky, která je důležitá pro vytváření nových specifit ochranných protilátek, které jsou zaměřené na epitopy přítomné také na přírodním alergenu, b) Stabilita z hlediska délky skladování a stability po injekci do tělesných tekutin.

2. Aminokyseliny vhodné pro substituci jsou s výhodou umístěné na povrchu, a jsou tedy dostupné pro vazbu protilátek. Aminokyseliny umístěné na povrchu ve trojrozměrné struktuře mají obvykle dostupnost rozpouštědlu (vodě) alespoň 20 %, vhodně 20 až 80 %, výhodněji 30 až 80 %. Dostupnost rozpouštědlu je definovaná jako plocha molekuly dostupná kulovité oblasti s poloměrem srovnatelným s molekulou rozpouštědla (voda, r = 1,4 A (1A = 0,1 nm)).

3. Každá ze substituovaných aminokyselin je s výhodou umístěná v konzervovaných oblastech s plochou větší než 400 A² (1A² = 0,01 nm²). Konzervované oblasti jsou definovány jako koherentně spojené oblasti na povrchu exponovaných konzervovaných aminokyselinových zbytků a kostry. Konzervované aminokyselinové zbytky jsou definovány jako uspořádání sekvence všech známých (dedukovaných) aminokyselinových sekvencí homologních proteinů v rámci stejného taxonomického druhu, rodu, podčeledi, čeledi, nadčeledi, podřádu nebo řádu. Za konzervované se považují polohy aminokyselin, které obsahují identické aminokyselinové zbytky u více než 70 % sekvencí. Očekává se, že konzervované oblasti obsahují epitopy, proti kterým jsou zaměřeny IgE většiny pacientů.

- 31 Konzervace terciární struktury α-uhlíkaté kostry se nejlépe zjišťuje získáním identických struktur rentgenovou krystalografií nebo NMR před a po mutagenezi. Při nedostupnosti strukturních dat popisujících mutantu se mohou jako měřítko pravděpodobného zakonzervování terciární struktury α-uhlíkaté kostry použít nerozlišitelná CD spektra nebo imunochemické údaje, např. reaktivity protilátek, při porovnání s údaji získanými analýzou molekuly, u které byla zjištěna struktura.

4. V rámci konzervovaných oblastí by měly být aminokyseliny pro mutagenezi přednostně vybrány z aminokyselin s nejvyšší dostupností rozpouštědlu (vodě), umístěné s výhodou v blízkosti středu konzervované oblasti.

5. S výhodou se zbytek polární aminokyseliny substituuje jiným polárním zbytkem a zbytek nepolární aminokyseliny se substituuje jiným nepolárním zbytkem.

Protože cílem je v podstatě zachovat trojrozměrnou strukturu alergenu, aminokyselina určená pro zavedení do struktury alergenu se může volit na základě porovnání s proteinem, který je strukturně homologický vzhledem k alergenu, např. proteinem, který náleží do stejného taxonomického řádu jako alergen, a u kterého nedochází ke zkřížené reaktivitě s alergenem.

DNA podle vynálezu

Ve výhodném provedení je sekvence DNA podle vynálezu derivátem sekvence DNA kódující v přírodě se vyskytující alergen.

Derivát DNA se s výhodou získá místně specifickou nebo náhodnou mutagenezi DNA kódující v přírodě se vyskytující alergen.

V prvním zvláště výhodném provedení je sekvence DNA derivát sekvence ukázané na obr. 3, kde tato sekvence DNA je mutovaná tak, aby kódovala alergen obsahující alespoň čtyři mutace zvolené ze

- 32 skupiny K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153,1-44, E-138, G-61, A-130, R70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P14, Y-5, K-137, E-141, E-87, E-73.

Ve druhém zvláště výhodném provedení je sekvence DNA derivát sekvence ukázané na obr. 13, kde tato sekvence DNA je mutovaná tak, aby kódovala alergen obsahující alespoň čtyři mutace zvolené ze skupiny K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6, K-149, K-128, E-184, K-112, F-157, E-3, K-29, N-203, N-34, K-78, K151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, K-52, T-67, T-125, K150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M138, T-209, V-84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 a 1-182.

Ve třetím zvláště výhodném provedení je sekvence DNA derivát sekvence ukázané na obr. 16, kde tato sekvence DNA je mutovaná tak, aby kódovala alergen obsahující alespoň čtyři mutace zvolené ze skupiny R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K126, L-61, P-26, N-93, D-64, I-28, K-14, K-100, E-62, 1-127, E-102, E25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109 a R-128, D129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N93, D-64, I-28, K-14, K-100, E-62, 1-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, 1-68, P-79, K-109, K-15.

- 33 Míchání DNA

Rekombinantní mutantní alergen podle předkládaného vynálezu může být vytvořen s použitím sekvence DNA získané mícháním DNA (molekulárním křížením) (DNA shuffling, molecular breeding) odpovídající v přírodě se vyskytující DNA. Metoda míchání DNA se může provádět způsoby popsanými v článku autorů Punnonnen J.: „Molecular Breeding of Allergy Vaccines and Antiallergic Cytokines“, Int. Arch. Allergy Immunol. 2000, 121, 173 - 182 a způsoby popsanými v tam uvedených článcích, které jsou všechny zařazeny odkazem.

Diagnosticky test

Rekombinantní mutantní alergeny podle vynálezu mají dále diagnostické možnosti a výhody. Protialergické vakciny podle dosavadního stavu techniky jsou založeny na extraktech v přírodě se vyskytujících zdrojů alergenů, a představují tedy širokou řadu isoforem. Alergický jedinec byl na počátku senzitizován a má IgE proti jedné nebo některým z přítomných isoforem. Některé z těchto isoforem mohou být relevantní co se týče alergických reakcí alergického jednotlivce v důsledku homologie a následné zkřížené reaktivity s isoformou, na kterou je jedinec alergický, zatímco jiné isoformy mohou být irelevantní, protože nenesou žádný z vazebných epitopů IgE, proti kterému má alergický jedinec vytvořený specifický IgE. V důsledku této heterogenity specifit populace IgE může být proto podávání některých isoforem bezpečné, tj. nevede k alergické reakci prostřednictvím IgE, zatímco jiné isoformy mohou být škodlivé a způsobovat nežádoucí vedlejší účinky.

Mutanty podle vynálezu a kompozice podle vynálezu určené pro terapeutické podávání mohou být tedy také používány pro in vivo nebo in vitro diagnostiku pro monitorování relevance, bezpečnosti nebo

- 34 vyhlídek léčení těmito mutanty nebo kompozicemi. Použitelné diagnostické vzorky jsou tělesné tekutiny jako např. séra.

Vynález se tedy také týká diagnostického testu pro zjišťování relevance, bezpečnosti nebo vyhlídek léčení pacienta, s použitím rekombinantního mutantního alergenu podle vynálezu nebo prostředku podle vynálezu, kde vzorek pacienta obsahující IgE se smísí s uvedenou mutantou nebo uvedenou kompozicí, a testuje se na hladinu reaktivity mezi IgE v uvedeném vzorku a uvedenou mutantou. Testování míry reaktivity mezí IgE ve vzorku a mutantou se může provádět použitím kteréhokoli známého imunologického testu.

Definice

V rámci předkládaného vynálezu znamená výraz „snížit vazebnou schopnost specifického IgE ve srovnání s vazebnou schopností IgE uvedeného v přírodě se vyskytujícího alergenu“, že snížení je měřitelné statisticky významným způsobem (p < 0,05) u alespoň jednoho imunologického testu s použitím séra od pacienta alergického na v přírodě se vyskytující alergen. S výhodou se vazebná schopnost IgE snižuje o alespoň 5 %, výhodněji o alespoň 10 %.

Výraz „na povrchu exponovaná aminokyselina“ znamená, že aminokyselinový zbytek je umístěn na povrchu trojrozměrné struktury takovým způsobem, že jestliže je alergen v roztoku, alespoň část alespoň jednoho atomu aminokyselinového zbytku je dostupná pro styk s okolním rozpouštědlem. Aminokyselinový zbytek v trojrozměrné struktuře má s výhodou dostupnost rozpouštědlu (vodě) alespoň 20 %, vhodně alespoň 30 %, výhodněji alespoň 40 % a nejvýhodněji alespoň 50 %.

Výraz „dostupnost rozpouštědlu“ je definován jako plocha molekuly dostupná kouli s poloměrem srovnatelným s rozpouštědlem (pro vodu, r = 1,4 A (1Á = 0,1 nm)).

- 35 Výrazy „na povrchu exponovaný“ a „vystavený rozpouštědlu“ se používají zaměnitelně.

Výraz „taxonomický druh, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází“, znamená druh v taxonomickém systému.

Dále výraz „uvedený mutantní alergen, který má v podstatě stejnou terciární strukturu α-uhlíkaté kostry jako v přírodě se vyskytující alergen“ znamená, že při porovnání struktur je průměrná kvadratická odchylka atomových souřadnic nižší než 2 A (1Á = 0,1 nm).

V souvislosti s předkládaným vynálezem znamená výraz „substituce“ deleci, substituci nebo adici aminokyseliny ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí v přírodě se vyskytujícího alergenu.

Předkládaný vynález je dále ilustrován následujícími neomezujícími příklady.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje oligonukleotidové primery specifické pro mutantu použité pro Bet v 1 mutantu č. 1. Mutované nukleotidy jsou podtržené.

Obr. 2 ukazuje dva obecně použitelné primery (označené „všechny pozitivní“ a „všechny negativní“), které byly syntetizovány a použity pro všechny mutanty.

Obr. 3 ukazuje DNA a aminokyselinovou sekvenci v přírodě se vyskytujícího alergenu Bet v 1 a počet mutací Bet v 1.

Obr. 4 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE souhrnu alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 Glu45Ser.

- 36 Obr. 5 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE souhrnu alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln.

Obr. 6 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE souhrnu alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 Pro108Gly.

Obr. 7 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE souhrnu alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 Glu60Ser.

Obr. 8 ukazuje spektra CD rekombinantní mutanty a mutanty triplepatch zaznamenaná v blízkosti stejných koncentrací.

Obr. 9 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE souhrnu alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 Triple-patch.

Obr. 10 ukazuje dostupnost rozpouštědlu individuálně uspořádaných zbytků antigenů 5 a uspořádání sekvencí antigenů 5 Vespula (levá část). V pravé Části obr. 10 je ukázán povrch molekuly antigenů 5 s konzervovanými oblastmi mezi antigenem 5:s Vespula.

Obr. 11 ukazuje sekvenci primeru odpovídající aminovému konci Ves v 5 odvozeného od pozitivního řetězce. Sekvence primeru ve směru transkripce je odvozena z negativního řetězce.

Obr. 12 ukazuje dva obecně použitelné primery (označené „všechny pozitivní“ a „všechny negativní“), které byly syntetizovány a použity pro všechny mutanty.

Obr. 13 ukazuje DNA a aminokyselinovou sekvenci v přírodě se vyskytujícího alergenu Ves v 5 a dvě mutace Ves v 5.

Obr. 14 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Ves v 5 na sérový IgE ze souhrnu alergických pacientů nebiotinylovaným Ves v 5 a mutantou Ves v 5 Lys72Ala.

- 37 Obr. 15 ukazuje teoretický model reakce mezi alergenem a žírnými buňkami přemostěním IgE.

Obr. 16 ukazuje DNA a aminokyselinovou sekvenci v přírodě se vyskytujícího alergenu Der p 2.

Obr. 17 ukazuje schematicky primery použité pro vytvoření mutací. Část (I) ukazuje pozitivní a negativní primery. Část (II) ukazuje konečný rekombinantní protein nesoucí mutace v uvedených polohách.

Obr. 18 ukazuje schéma konstrukce mutant Bet v 1 a výpis použitých primerů. Mutanty obsahují od 5 do 9 aminokyselin.

Obr. 19 ukazuje bodové mutace zavedené na povrchu Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637). U mutanty Bet v 1 (2628) bylo zavedeno v jedné polovině Bet v 1 pět primárních mutací, přičemž druhá polovina zůstala nezměněná. U mutanty Bet v 1 (2637) bylo zavedeno ve druhé polovině Bet v 1 pět primárních a tři sekundární mutace, přičemž první polovina zůstala nezměněná.

Obr. 20 ukazuje spektra cirkulárního dichroismu (CD) rekombinantního Bet v 1.2801 (standardní typ) a mutanty Bet v 1 (2637) zaznamenaná při téměř identických koncentracích.

Obr, 21 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1.2801 (standardní typ) na IgE směsného séra alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1.2801 a Bet v 1 (2628), Bet v 1 (2637), a směsí 1 : 1 Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637).

Obr. 22 ukazuje uvolňování histaminu lidskými bazofily z Bet v 1.2801 (standardní typ), Bet v 1 (2628), a Bet v 1 (2637).

Obr. 23 ukazuje uvolňování histaminu lidskými bazofily z Bet v 1.2801 (standardní typ), Bet v 1 (2628), a Bet v 1 (2637).

Obr. 24 ukazuje bodové mutace na povrchu Bet v 1 (2744).

Obr. 25 ukazuje bodové mutace na povrchu Bet v 1 (2753).

- 38 Obr. 26 ukazuje bodové mutace na povrchu Bet v 1 (2744) a Bet v 1 (2753).

Obr. 27 ukazuje spektra cirkulárního dichroismu (CD) Bet v 1.2801 (standardní typ) a Bet v 1 (2744) zaznamenaná při téměř stejných koncentracích.

Obr. 28 ukazuje uvolňování histaminu lidskými bazofily z Bet v 1.2801 (standardní typ) a mutantního Bet v 1 (2744).

Obr. 29 ukazuje uvolňování histaminu lidskými bazofily z Bet v 1.2801 (standardní typ) a mutantního Bet v 1 (2744).

Obr. 30 ukazuje bodové mutace na povrchu Bet v 1 (2733).

Obr. 31 ukazuje primery použité pro místně specifickou mutagenezi Der p 2.

Obr. 32 ukazuje porovnání sekvence Der p 2 s jinou skupinou dvou alergenů roztočů domácího prachu.

Obr. 33 obrysy povrchu Der p 2 ze čtyř různých úhlů.

Obr. 34 ukazuje obrysy povrchu mutanty Derp 2 ze čtyř různých úhlů.

Obr. 35A a B ukazují porovnání sekvencí Der p 1 s jinou skupinou 1 alergenů roztočů domácího prachu.

Obr. 36 ukazuje obrysy povrchu Derp 1 ze čtyř různých úhlů.

Obr. 37 ukazuje obrysy povrchu mutanty Der p 1 ze čtyř různých úhlů.

Obr. 38A-D ukazují porovnání sekvencí Phl p 5 s jinou skupinou 5 alergenů trávy.

Obr. 39A a B ukazují obrysy povrchu Phl p 5 model A a model B ze čtyř různých úhlů.

Obr. 40A a B ukazují obrysy povrchu mutanty Phl p 5 model A a model B ze čtyř různých úhlů.

- 39 Obr. 41 ukazuje proliferaci exprimovaných lymfocytů periferní krve vyjádřenou jako index stimulace (SI) pro různé preparáty Bet v 1.

Obr. 42 - 44 ukazují profil cytokinů T-buněk stimulovaných různými preparáty Bet v. Obr. 42 ukazuje pacienta s profilem ThO, obr. 43 s profilem Th1 a obr. 44 s profilem Th2.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příklad 1 popisuje přípravu rekombinantních mutantních alergenů s jednou a třemi primárními mutacemi. Rekombinantní mutantní alergeny podle vynálezu, tj. alergeny obsahující alespoň čtyři primární mutace, mohou být připraveny použitím stejných postupů.

Identifikace společných epitopů mezi pylovými alergeny Fagales

Hlavní pylový alergen břízy Bet v 1 vykazuje přibližně 90% identitu aminokyselinové sekvence s hlavními alergeny pylů taxonomicky příbuzných stromů, tj. Fagales (např. líska a habr) a pacienti alergičtí na pyl břízy často mají klinické příznaky zkřížené alergické reaktivity vůči těmto proteinům homologním s Bet v 1.

Bet v 1 také vykazuje přibližně 50 až 60% identitu sekvence s alergickými proteiny přítomnými v některém ovoci (např. jablko a třešeň) a zelenině (např. celer a mrkev) a existují klinické důkazy alergické zkřížené reaktivity mezi Bet v 1 a těmito proteiny souvisejícími s potravou.

Navíc sdílí Bet v 1 významnou sekvenční identitu (20 až 40 %) se skupinou rostlinných proteinů nazývaných proteiny související s patogenezí (pathogenesis-related proteins, PR-10), ale nejsou žádné zprávy alergické zkřížené reaktivity vůči těmto proteinům PR-10.

- 40 Molekulární modelování ukazuje, že struktury Fagales a potravinových alergenů a proteinů PR-10 jsou téměř identické se strukturou Bet v 1.

Strukturní základ pro alergickou zkříženou reaktivitu Bet v 1 byl popsán autory Gajhede M., Osmark P., Poulsen F. M., Ipsen H., Larsen J. N., Joost van Neerven R. J., Schou C., Lownstein H., a Spangfort M. D.: „X-ray and NMR structure of Bet v 1, the origin of birch pollen allergy“, Nátuře structural biology 3, 1040 - 1045 (1996), kde mohly být identifikovány tři oblasti (patches) na povrchu molekuly Bet v 1 jako společné pro známé hlavní alergeny stromových pylů. Jakýkoli IgE rozpoznávající tyto oblasti na Bet v 1 by tedy byl schopen zkříženě reagovat a vázat se na další hlavní pylové alergeny Fagales a poskytovat alergické příznaky. Identifikace těchto společných oblastí byla prováděna po porovnání všech známých aminokyselinových sekvencí tří hlavních pylových alergenů v kombinaci s analýzou molekulárního povrchu Bet v 1 odhaleného na základě terciární struktury α-uhlíkaté kostry popsané v článku Gajhede M., Osmark P., Poulsen F. M., Ipsen H., Larsen J. N., Joost van Neerven R. J., Schou C., L0wenstein H., a Spangfort M. D.: „X-ray and NMR structure of Bet v 1, the origin of birch pollen allergy“, Nátuře structural biology 3, 1040 - 1045 (1996). Navíc bylo definováno, že tyto oblasti mají určitou minimální velikost (> 400 Á² (1Á² = 0,01nm²)), a to na základě plochy zakryté protilátkou po navázání.

Volba aminokyselinových zbytků pro místně specifickou mutagenezi

Aminokyselinové zbytky pro místně specifickou mutagenezi byly vybírány ze zbytků přítomných v oblastech specifických pro Bet v 1 a společných oblastech, protože modifikace těchto oblastí bude podle očekávání ovlivňovat vazbu sérového IgE většiny pacientů vykazujících klinickou alergickou zkříženou reaktivitu na stromové pyly.

- 41 Relativní orientace a procento expozice rozpouštědlu pro každý aminokyselinový zbytek uvnitř příslušné oblasti bylo vypočteno na základě atomových souřadnic zbytků. Zbytky s nízkým stupněm expozice rozpouštědlu (< 20 %) nebyly považovány za relevantní pro účely mutageneze v důsledku možného narušení struktury nebo nedostatečné interakce s protilátkou. Zbývající zbytky byly seřazeny podle jejich míry expozice rozpouštědlu.

Porovnání sekvencí

Sekvence homologní se zkoumanou sekvencí (Bet v 1 No. 2801, WHO IUIS Nomenclature Subcommittee on Allergens) byly odvozeny z databází sekvencí GenBank a EMBL prohledávacím programem BLAST (Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W., a Lipman D. J.: „Basic local alignment search tool“, J. Mol. Biol. 215, 403 - 410 (1990)). Všechny sekvence, které dosáhly pravděpodobnosti v programu BLAST nižší než 0,1, byly brány v úvahu, a byl sestaven seznam obsahující nereduntantní výše homologních sekvencí. Ty byly porovnány pomocí programu CLUSTAL W (Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J. D., Higgins D. G., a Gibson T. J.: „CLUSTAL W: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Res. 22, 4673 - 4680 (1994)), a pro každou polohu v sekvenci bylo vypočteno procento identity, přičemž v úvahu se bral pouze úplný seznam nebo taxonomicky příbuzné druhy. Celkem 122 sekvencí bylo homologních s Bet v 1 No. 2801, přičemž 57 sekvencí pocházelo z taxonomicky příbuzných druhů.

-42 Klonování genu kódujícího Bet v 1

RNA byla připravena z pylu Betula verrucosa (Allergon, Švédsko) extrakcí fenolem a vysrážením LÍCI. Po jednotlivých alikvotech ve zkumavkách Eppendorf byla provedena afinitní chromatografie na Oligo(dT)-celulóze, a byla syntetizována dvojřetězcová cDNA použitím komerčně dostupného kitu (Amersham). DNA kódující Bet v 1 byla amplifikována PCR a klonována. Ve stručnosti, PCR byla prováděna s použitím cDNA jako templátů a primerů navržených tak, aby souhlasila sekvence cDNA v polohách odpovídajících aminovému konci Bet v 1, popřípadě 3’-nepřekládané oblasti. Primery byly prodlouženy na 5’-koncích, aby obsahovaly restrikční místa (Λ/col a HindWY) pro směrové klonování do pKK233-2.

Subklonování do pMAL-c

Gen kódující Bet v 1 byl potom subklonován do fuzního vektoru proteinu vázajícího maltózu pMAL-c (New England Biolabs). Gen byl amplifikován PCR a subklonován ve čtecím rámci s malE pro vytvoření fuzních operonů proteinu vázajícího maltózu (MBP) - proteinu Bet v 1, ve kterých byly odděleny MBP a Bet v 1 štěpícím místem proteázy faktoru X_a umístěným tak, aby bylo možno po rozštěpení obnovit autentickou aminokoncovou sekvenci Bet v 1, jak je popsáno v Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., Mortz E., Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombínant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 373 (1996a). Ve stručnosti, byla provedena PCR s použitím pKK233-3 s vloženým Bet v 1 jako templátů a primerů odpovídajících amino- a karboxykoncům proteinu. Primer blízký promotoru byl prodloužen na 5’-konci, aby obsahoval čtyři kodony kódující ve čtecím rámci štěpící místo proteázy faktoru X_a. Oba primery byly dále prodlouženy na 5'koncích, aby obsahovaly restrikční místa (Kpnl) pro klonování. Geny

- 43 ϊ ·, > >

) '5 >

kódující Bet v 1 byly subklonovány použitím 20 cyklů PCR pro snížení četnosti PCR artefaktů.

Mutageneze in vitro

Mutageneze in vitro byla prováděna pomocí PCR s použitím rekombinantního pMAL-c s vloženým Bet v 1 jako templátu. Každý mutantní gen Bet v 1 byl vytvořen třemi reakcemi PCR s použitím čtyř primerů.

Byly syntetizovány dva pro mutace specifické oligonukleotidové primery obsahující každou mutaci, jeden pro každý řetězec DNA, viz obr. 1 a 2. S použitím mutovaného nukleotidu nebo nukleotidů jako výchozího místa byly oba primery prodlouženy o sedm nukleotidů na 5’-konci a o patnáct nukleotidů na 3’-konci. Prodlužující nukleotidy měly identickou sekvenci jako gen Bet v 1 v příslušné oblasti.

Dále byly syntetizovány dva obecně použitelné primery (označené „všechny pozitivní“ a „všechny negativní“ ukázané na obr. 2), které byly použity pro všechny mutace. Tyto primery měly délku 15 nukleotidů a sekvencí odpovídaly oblastem vektoru pMAL-c přibližně 1 kb proti směru transkripce a po směru transkripce vzhledem k Bet v 1. Sekvence primerů proti směru transkripce se odvozuje od pozitivního řetězce a sekvence primerů ve směru transkripce se odvozuje od negativního řetězce, viz obr. 2.

Dvě nezávislé reakce PCR byly prováděny v podstatě standardními postupy (Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. T., Mullis K. B., Erlich H. A.: „Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase“, Science 239, 487 - 491 (1988)) s tím rozdílem, že bylo provedeno pouze dvacet teplotních cyklů pro snížení četnosti artefaktů PCR. Každá reakce PCR používala pMAL-c s vloženým Bet v 1 jako

- 44 templátu a používala jeden mutačně specifický a jeden obecně použitelný primer ve smysluplných kombinacích.

Zavedení čtyř substitucí aminokyselin (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly) v mutantě triple-patch bylo provedeno postupem popsaným výše po jednotlivých krocích. Nejprve byla provedena mutace Glu45Ser, potom mutace Pro108Gly a nakonec byly zavedeny mutace Asn28Thr, Lys32Gln použitím pMAL-c s vloženým Bet v 1 No. 2801, Bet v 1 (Glu45Ser), popřípadě Bet v 1 (Glu45Ser, Pro108Gly) jako templátů.

Produkty PCR byly čištěny elektroforézou na agarózovém gelu a elektroelucí a následně sráženy ethanolem. Třetí reakce PCR byla prováděna použitím kombinovaných PCR produktů z prvních dvou reakcí PCR jako templátu a obou obecně oužitelných primerů. Opět bylo použito dvaceti cyklů standardní PCR. Produkt PCR byl čištěn elektroforézou na agarózovém gelu a elektroelucí s následným srážením ethanolem, vyříznut restrikčními enzymy (Ss/WI/EcoRI) a ligován směrově do pMAL-c s vloženým Bet v 1 štěpeného stejnými enzymy.

Obr. 3 ukazuje přehled všech devíti mutací Bet v 1, které jsou následující: ThrlOPro, Asp25Gly, Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Asn47Ser, Lys55Asn, Glu60Ser (non-patch), Thr77Ala a Pro108Gly. Byla také připravena další mutanta se čtyřmi mutacemi (Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly). Z těchto mutací bylo vybráno pro další testování pět mutant: Asn28Thr + Lys32Gln, Glu45Ser, Glu60Ser, Pro108Gly a triple-patch mutant Asn28Thr, Lys32Gln, Glu45Ser, Pro108Gly.

Sekvenování nukleotidů

Určení nukíeotidové sekvence genu kódujícího Bet v 1 bylo provedeno před a po subklonování, popřípadě po mutagenezi in vitro.

-45- ,,, υ,'

Plasmidová DNA z 10 ml bakteriální kultury pěstované do nasycení přes noc v médiu LB doplněném 0,1 g/l ampicilinu byla čištěna na kolonách Qiagen-tip 20 a sekvenována použitím kitu Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit (USB) podle doporučení dodavatele.

Exprese a purifikace rekombinantního Bet v 1 a mutant

Rekombinantní Bet v 1 (Bet v 1 No. 2801 a mutanty) byly exprimovány v Escherichia coli DH 5a fúzované s proteinem vázajícím maltózu a čištěné jak bylo popsáno v Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., Mortz E., Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 - 373 (1996a). Ve stručnosti, rekombinantní buňky E. coli byly pěstovány při 37 °C na optickou hustotu 1,0 při 436 nm a potom byla zvýšená exprese fuzního proteinu Bet v 1 indukována přidáním IPTG. Buňky byly sklizeny centrifugací 3 hod po indukci, resuspendovány v lyzačním pufru a rozbity sonikaci. Po sonikaci a další centrifugací byl fuzní protein izolován amylózovou afinitní chromatografií a potom štěpen inkubací s faktorem Xa (Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., M0rtz E., Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 373 (1996a)). Po štěpení F Xa byl izolován rekombinantní Bet v 1 gelovou filtrací, a v případě potřeby čištěn dalším cyklem amylózové afinitní chromatografie s cílem odstranit stopová množství proteinu vázajícího maltózu.

Vyčištěný rekombinantní Bet v 1 byl zakoncentrován ultrafiltrací na přibližně 5 mg/ml a uchován při 4 °C. Celkové výtěžky preparátů

- 46 vyčištěného rekombinantního Bet v 1 byly 2 až 5 mg na litr buněčné kultury E. coli.

Čištěné preparáty rekombinantního Bet v 1 se na SDSpolyakrylamidové elektroforéze s barvením stříbrem jevily jako jednotlivé pruhy se zdánlivou molekulovou hmotností 17,5 kDa. Sekvenování N-konce ukázalo očekávané sekvence odvozené od nukleotidových sekvencí cDNA a kvantitativní analýza aminokyselin ukázala očekávané složení aminokyselin.

Autoři již dříve ukázali (Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., Mortz E., Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 - 373 (1996a)), že rekombinantní Bet v 1 No. 2801 je imunochemicky neodlišitelný od v přírodě se vyskytujícího Bet v 1.

Imunoelektroforéza s použitím králičích polyklonálních protilátek

Sedm mutant Bet v 1 bylo vytvořeno jako rekombinantní proteiny Bet v 1 a čištěno podle výše uvedeného popisu a byly provedeny testy na reaktivitu s polyklonálními králičími protilátkami vytvořenými proti Bet v 1 izolovanému z pylu břízy. Při analýze imunoelektroforézou (raketová imunoelektroforéza) za nativních podmínek byly králičí protilátky schopny srážet všechny mutanty, což ukazuje, že mutanty měly konzervovanou terciární strukturu α-uhlíkaté kostry.

Pro analýzu vlivu na odpověď lidského polyklonálního IgE byly vybrány mutanty Glu45Ser, Pro108Gly, Asn28Thr + Lys32Gln a Glu60Ser pro další analýzu.

- 47 Mutanta Bet v 1 Glu45Ser

Kyselina glutamová v poloze 45 má vysokou míru expozice rozpouštědlu (40 %) a je lokalizována v Oblasti povrchu známé pro alergeny Fagales (oblast I). Bylo zjištěno, že serinový zbytek zabírá polohu 45 u některých Bet v 1 - homologních proteinů PR-10, takže glutamová kyselina by mohla být nahrazena serinem bez rozrušení terciární struktury α-uhlíkaté kostry. Protože navíc žádná ze známých sekvencí alergenů Fagales neobsahuje serin v poloze 45, substituce glutamové kyseliny serinem poskytne molekulu Bet v 1, která se v přírodě nevyskytuje.

Proliferace T-buněk s použitím rekombinantní mutanty Glu45Ser Bet v

Analýza byla prováděna podle popisu uvedeného v Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., Mortz E., Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with MaltoseBinding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 - 373 (1996a). Bylo zjištěno, že rekombinantní mutanta Bet v 1 Glu45Ser byla schopna indukovat proliferaci linií T-buněk tří různých pacientů alergických na pyl břízy se stimulačními indexy podobnými rekombinantnímu a v přírodě se vyskytujícímu alergenu.

Krystalizace a určení struktury rekombinantního Glu45Ser Bet v 1

Krystaly rekombinantního Glu45Ser Bet v 1 byly ponechány narůst difúzí par při 25 °C, v podstatě jak je popsáno v Spangfort M. D., Larsen J. N., Gajhede M.: „Crystallization and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 A (1A = 0,1 nm) Resolution of Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing IgE-Mediated Allergy“, PROTEINS, Struc. Func. Genet. 26, 358 - 360 (1996b). Glu45Ser Bet v 1 v koncentraci 5

- 48 mg/ml byl smísen se stejným objemem 2,0 M síranu amonného, 0,1 M citranu sodného, 1% (obj./obj.) dioxanu, pH 6,0 a ekvilibrován proti stonásobnému objemu 2,0 M síranu amonného, 0,1 M citranu sodného, 1% (obj./obj.) dioxanu, pH 6,0. Po 24 h ekvilibrace byl indukován růst krystalů použitím techniky očkování popsané v Spangfort M. D., Larsen J. N., Gajhede M.: „Crystallization and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 A (1A = 0,1 nm) Resolution of Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing IgE-Mediated Allergy“, PROTEINS, Struc. Func. Genet. 26, 358 - 360 (1996b) s použitím krystalů rekombinantního Bet v 1 standardního typu jako zdroje očkovacích krystalů.

Po přibližně dvou měsících byly krystaly odděleny a analyzovány použitím rentgenového záření generovaného rotující anodou Rigaku, jak je popsáno v Spangfort M. D., Larsen J. N., Gajhede M.: „Crystallization and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 A (1A = 0,1 nm) Resolution of Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing IgEMediated Allergy“, PROTEINS, Struc. Func. Genet. 26, 358 - 360 (1996b), a pomocí metody molekulární náhrady byla vyřešena struktura.

Struktura mutanty Bet v 1 Glu45Ser

Strukturní vliv mutace byl zjišťován pěstováním trojrozměrných krystalů proteinu Bet v 1 Glu45Ser a rentgenovou difrakcí na rozlišení 3,0 A (1A = 0,1 nm) při analýze rentgenovým zářením generovaným rotující anodou. Náhrada glutamové kyseliny serinem v poloze 45 byla ověřena mapováním elektronové hustoty struktury Bet v 1 Glu45Ser, které také ukázalo, že je zachována celková terciární struktura auhlíkaté kostry.

- 49 Vazebná schopnost IgE pro mutantu Bet v 1 Glu45Ser

Vazebné schopnosti IgE pro mutantu Bet v 1 Glu45Ser. byly porovnány s rekombinantním Bet v 1 ve fluidní fázi inhibičním testem IgE s použitím směsného séra s IgE odvozeného od pacientů alergických na břízu.

Rekombinantní Bet v 1 no. 2801 byl biotinylován v molárním poměru 1 : 5 (Bet v 1 no. 2801: biotin). Inhibiční test byl prováděn následujícím způsobem: vzorek séra (25 μΙ) byl inkubován s protilátkou proti IgE na pevné fázi, promyt, resuspendován a dále inkubován se směsí biotinylovaného Bet v 1 no. 2801 (3,4 nM) a dané mutanty (0 až 28,6 nM). Množství biotinylovaného Bet v 1 no. 2801 navázaného na pevnou fázi bylo určeno měřením RLU po inkubaci se streptavídínem značeným akridiniovým esterem. Stupeň inhibice byl vypočten jako poměr mezi jednotkami RLU získanými s použitím pufru a mutanty jako inhibitoru.

Obr. 4 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE ze směsného séra alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 Glu45Ser.

Je vidět jasný rozdíl v množství příslušných rekombínantních proteinů nezbytných pro dosažení 50% inhibice vazby na sérový IgE přítomný ve směsném séru. Rekombinantní Bet v 1 dosahuje 50% inhibice při přibližně 6,5 ng, zatímco odpovídající koncentrace mutanty Bet v 1 Glu45Ser je přibližně 12 ng. To ukazuje, že bodová mutace zavedená v mutantě Bet v 1 Glu45Ser snižuje afinitu pro specifický sérový IgE přibližně dvakrát. Maximální míra inhibice dosažená mutantou Bet v 1 Glu45Ser je jasně nižší v porovnání s rekombinantním Bet v 1. To může ukazovat, že po substituci Glu45Ser není některý ze specifických IgE přítomných ve směsném séru schopný rozpoznat mutantu Bet v 1 Glu45Ser.

- 50 Mutanta Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln

Aspartát a lysin v polohách 28, popř. 32, mají vysokou míru expozice rozpouštědlu (35 %, popř. 50 %) a jsou umístěny v oblasti molekulárního povrchu společné pro alergeny Fagales (oblast II). V této struktuře jsou umístěny aspartát 28 a lysin 32 těsně u sebe na povrchu molekuly a nejpravděpodobněji spolu interagují vodíkovými vazbami. Bylo zjištěno, že zbytky threoninu a gluatamátu zabírají polohy 28 a 32 u některých Bet v 1 - homologních proteinů PR-10, což ukazuje na možnost náhrady aspartátu a lysinu threoninem, popřípadě glutamátem, aniž by došlo k porušení terciární struktury a-uhlíkaté kostry. Navíc neobsahuje žádná ze sekvencí v přírodě se vyskytujících isoalergenů v polohách 28 a 32 threonin, popřípadě glutamát, takže substituce poskytne molekulu Bet v 1, která se nevyskytuje v přírodě.

Vazebné vlastnosti IgE mutanty Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln

Vazebné vlastnosti IgE pro mutantu Asn28Thr+Lys32Gln byly porovnávány s rekombinantním Bet v 1 v testu inhibice IgE ve fluidní fázi s použitím směsného séra IgE odvozeného od pacientů alergických na břízu popsaného výše.

Obr. 5 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE ze směsného séra alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln.

Je vidět jasný rozdíl v množství příslušných rekombinantních proteinů nezbytných pro dosažení 50% inhibice vazby na sérový IgE přítomný ve směsném séru. Rekombinantní Bet v 1 dosahuje 50% inhibice při koncentrací přibližně 6,5 ng, zatímco odpovídající koncentrace mutanty Bet v 1 Asn28Thr+Lys32GIn je přibližně 12 ng. To ukazuje, že bodové mutace zavedené v mutantě Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln snižují afinitu pro specifický sérový IgE faktorem přibližně 2.

- 51 Maximální míra inhibice dosažená mutantou Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln je jasně nižší ve srovnání s rekombinantním Bet v 1. To může ukazovat, že po substitucích Asn28Thr+Lys32Gln nejsou některé specifické IgE přítomné ve směsném séru schopny rozpoznat mutantu Bet v 1 Asn28Thr+Lys32Gln.

Mutanta Bet v 1 Pro108Gly

Prolin v poloze 108 vykazuje vysoký stupeň expozice rozpouštědlu (60 %) a je umístěn v oblasti molekulárního povrchu běžné pro alergeny Fagales (oblast III). Bylo zjištěno, že glycinový zbytek zabírá polohu 108 u některých Bet v 1 - homologních proteinů PR-10, což naznačuje, že prolin může být nahrazen glycinem, aniž by došlo k porušení terciární struktury α-uhlíkaté kostry. Navíc, protože žádná ze sekvencí isoalergenů vyskytujících se v přírodě neobsahuje v poloze 108 glycin, substituce prolinu glycinem poskytne molekulu Bet v 1, která se nevyskytuje v přírodě.

Vazebné vlastnosti IgE pro mutantu Bet v 1 Pro108Gly

Vazebné vlastnosti IgE pro mutantu Bet v 1 Pro108Gly byly porovnávány s rekombinantním Bet v 1 testem inhibice IgE ve fluidní fázi s použitím směsného séra s obsahem IgE odvozeného od pacientů alergických na břízu popsaného výše.

Obr. 6 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE ze směsného séra alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 Pro108Gly.

Je vidět jasný rozdíl v množství příslušných rekombinantních proteinů nezbytných pro dosažení 50% inhibice vazby na sérový IgE přítomný ve směsném séru. Rekombinantní Bet v 1 dosahuje 50% inhibice při koncentraci přibližně 6,5 ng, zatímco odpovídající koncentrace pro Bet v 1 Pro108Gly je 15 ng. To ukazuje, že jediná

- 52 bodová mutace zavedená v Bet v 1 Pro108Gly snižuje afinitu pro specifický sérový IgE přibližně dvakrát.

Maximální míra inhibice dosahovaná mutantou Bet v 1 Pro108Gly je poněkud nižší ve srovnání s rekombinantním Bet v 1. To může ukazovat, že po substituci Pro108Gly není některý ze specifických IgE přítomných ve směsném séru schopný rozpoznat mutantu Bet v 1 Pro108Gly.

Mutanta Bet v 1 Glu60Ser (mutanta typu non-patch)

Glutamová kyselina v poloze 60 vykazuje vysoký stupeň expozice rozpouštědlu (60 %), ale není umístěna v oblasti molekulárního povrchu společné pro alergeny Fagales. Bylo zjištěno, že serinový zbytek zabírá polohu 60 u některých Bet v 1 - homologních proteinů PR-10, což naznačuje, že glutamová kyselina může být nahrazéna serinem, aniž by došlo k porušení terciární struktury auhlíkaté kostry. Navíc neobsahuje žádná ze sekvencí isoalergenů vyskytujících se v přírodě serin v poloze 60, takže substituce glutamové kyseliny serinem poskytne molekulu Bet v 1, která se nevyskytuje v přírodě.

Vazebné vlastnosti IgE pro mutantu Bet v 1 Glu60Ser

Vazebné vlastnosti IgE pro mutantu Bet v 1 Glu60Ser byly porovnávány s rekombinantním Bet v 1 v testu inhibice IgE ve fluidní fázi s použitím směsného séra IgE odvozeného od pacientů alergických na břízu, popsaného výše.

Obr. 7 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE ze směsného séra alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 Glu60Ser. Na rozdíl od mutant Glu45Ser, Pro108Gly a Asn28Thr+Lys32Gln nemá substituce glutamové kyseliny v poloze 60 za serin žádný významný vliv na

- 53 vazebné vlastnosti IgE. To ukazuje, že substituce mimo definované společné oblasti Fagales, má pouze okrajový vliv na vazbu specifického sérového IgE, což podporuje představu, že konzervované oblasti molekulárního povrchu alergenu nesou dominantní epitopy vazby IgE.

Mutanta Bet v 1 typu triple-patch

U mutanty typu triple-patch (tři mutované obalsti) byly bodové mutace (Glu45Ser, Asn28Thr+Lys32Gln a Pro108Gly) současně zavedeny do tří různých společných oblastí Fagales popsaných výše, pro vytvoření umělé mutanty nesoucí čtyři substituce aminokyselin.

Strukturní analýza mutanty Bet v 1 Triple-patch

Strukturní identita vyčištěné mutanty triple-patch byla analyzována spektroskopií cirkulárním dichroismem (CD). Obr. 8 ukazuje spektra CD rekombinantního proteinu a mutanty triple-patch zaznamenaná při téměř stejných koncentracích. Překrytí amplitud vrcholů a jejich poloh ve spektrech CD dvou rekombinantních proteinů ukazuje, že dva preparáty obsahují stejná množství sekundárních struktur, což silně ukazuje na to, že terciární struktura a-uhlíkaté kostry není zavedením substitucí aminokyselin narušena.

Vazebné vlastnosti IgE pro mutantu Bet v 1 typu triple-patch

Vazebné vlastnosti IgE pro mutantu Bet v 1 typu triple-patch byly porovnány s rekombinantním Bet v 1 testem inhibice IgE ve fluidní fázi s použitím směsného séra obsahujícího IgE odvozeného od pacientů alergických na břízu, popsaného výše.

Obr. 9 ukazuje inhibicí vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1 na sérový IgE ze směsného séra alergických pacientů

- 54 nebiotinylovaným Bet v 1 a mutantou Bet v 1 triple-patch. Na rozdíl od jednoduchých mutant popisovaných výše již není inhibiční křivka mutanty triple-patch paralelní vzhledem k rekombinantnímu proteinu. To ukazuje, že substituce zavedené v mutantě triple-patch změnily vazebné vlastnosti IgE a profil epitopů ve srovnání s rekombinantní variantou. Nedostatečná paralelnost znesnadňuje kvantifikaci poklesu afinity mutanty triple-patch pro specifický sérový IgE.

Rekombinantní Bet v 1 dosahuje 50% inhibice při koncentraci přibližně 6 ng, zatímco odpovídající koncentrace pro mutantu Bet v 1 triple-patch je 30 ng, tj. pokles afinity je přibližně pětinásobný. Aby se dosáhlo 80% inhibice, odpovídající hodnoty jsou 20 ng, popř. 400 ng, tj. pokles je dvacetinásobný.

Test proliferace T-buněk použitím rekombinantní mutanty Bet v 1

Triple-patch

Analýza byla prováděna podle popisu v Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., Mortz E., Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with MaltoseBinding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 - 373 (1996a). Bylo zjištěno, že rekombinantní mutanta Bet v 1 triple-patch byla schopna indukovat proliferaci linií T-buněk u tří různých pacientů alergických na pyl břízy, přičemž stimulační indexy jsou podobné pro rekombinantní a přírodní alergen. To ukazuje, že mutanta triple-patch může vyvolat odpověď buněčné imunity nezbytnou pro tvorbu protilátek.

Příklad 2

Příklad 2 popisuje přípravu rekombinantních mutantních alergenů s jednou primární mutací. Rekombinantní mutantní alergeny ) >

podle vynálezu, tj. alergeny obsahující alespoň čtyři primární mutace, mohou být připraveny použitím stejných postupů.

Identifikace společných epitopů u hlavního aíergenního alergenu 5 jedu Vespula vulgaris

Antigen 5 je jeden ze tří proteinů jedu sršňovitého hmyzu, který je známým alergenem u člověka. Mezi sršňovité patřírůzné druhy sršňů a vos. Další dva známé alergeny jedů sršňovitých jsou fosfolipáza Ai a hyaluronidáza. Antigen 5 Vespula vulgaris (Ves v 5) byl klonován a exprimován jako rekombinantní protein v kvasinkovém systému (Monsalve R. I., Lu G., a King T. P.: „Recombinant venom allergen, antigen 5 of yellowjacket (Vespula vulgaris) and páper wasp (Polistes annulais) by expression in bacteria or yeast“ (1999)). Nedávno byla trojrozměrná krystalová struktura rekombinantního Ves v 5 určena s rozlišením 1,8 A (1Á = 0,1 nm) (článek se připravuje). Hlavní znaky struktury se skládají ze čtyř β-řetězců a čtyř a-šroubovic uspořádaných ve třech naskládaných vrstvách, takže vzniká struktura „sendvič α-β-α“. Sekvenční identita mezi alergeny homologními s antigenem 5 z různých druhů Vespula je přibližně 90 %, což ukazuje na přítomnost konzervovaných oblastí molekulárního povrchu a epitopů B-buněk.

Přítomnost a identifikace společných oblastí byla prováděna po porovnání všech známých aminokyselinových sekvencí, jak bylo popsáno výše pro tři pylové alergeny, alergenů antigenu 5 Vespula v kombinaci s analýzou molekulárního povrchu antigenu 5, který byl ukázán trojrozměrnou strukturou Ves v 5. Obr. 10 ukazuje dostupnost jednotlivě uspořádaných zbytků antigenu 5 rozpouštědlu a porovnání sekvencí antigenu 5 Vespula (levá část). Na pravé části obr. 10 je ukázaný molekulární povrch antigenu 5 s konzervovanými oblastmi mezi antigenem 5: s Vespula barevným označením.

- 56 Volba aminokyselinových zbytků pro místně specifickou mutagenezi

Aminokyselinové zbytky pro místně specifickou mutagenezi byly vybírány ze zbytků přítomných v oblastech společných pro Vespula, protože modifikace těchto oblastí bude podle očekávání ovlivňovat vazbu sérového IgE většiny pacientů, kteří vykazují klinicky zkříženou alergickou reaktivitu na hmyz Vespula.

Relativní orientace a procento expozice rozpouštědlu u každého aminokyselinového zbytku v rámci příslušné oblasti byly vypočteny na základě atomových souřadnic. Zbytky s nižším stupněm expozice rozpouštědlu nebyly pokládány za vhodné pro mutagenezi v důsledku možného porušení struktury nebo nedostatečné interakce s protilátkou. Zbývající zbytky byly seřazeny podle stupně expozice rozpouštědlu.

Klonování genu kódujícího Ves v 5

Celková RNA byla izolována z kyselých jedových žláz vos Vespula vulgaris, jak se popisuje v Fang K. S. F., Vitale M., Fehlner P. a King T. P.: „DNA cloning and primary structure of a white-face hornet venom allergen, antigen 5“, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 895 (1988).

Syntéza prvního řetězce cDNA amplifikace PCR a klonování genu Ves v 5 byly provedeny jak je popsáno v Lu G., Villalba M., Coscia M. R., Hoffman D. R. a King T. P.: „Sequence Analysis and Antigenic Cross-reactivity of a Venom Allergen, Antigen 5, from Hornets, Wasps, and Yellow Jackets“, Journal of Immunology 150, 2823 - 2830 (1993)

- 57 Subklonování do pPICZaA

Gen kódující Ves v 5 byl potom subklonován do vektoru pPICZaA (Invitrogen) pro sekreční expresi /es v 5 v Pichia pastoris. Gen byl amplifikován PCR a subklonován ve čtecím rámci s kódující sekvencí pro sekreční signál α-faktoru Saccharomyces cerevisiae. V tomto konstruktu se α-faktor odštěpuje in vivo proteázovým systémem Pichia pastoris Kex2 v průběhu sekrece proteinu.

Ve stručnosti, PCR byla prováděna použitím Ves v 5 jako templátu a primerů odpovídajících aminovému, popřípadě karboxylovému konci proteinu. Primery byly prodlouženy na 5’-konci, aby obsahovaly restrikční místa pro klonování EcoRI a Xbal. Nukleotidy kódující štěpící místo Kex2 byly v tomto konstruktu umístěny 18 nukleotidů proti směru transkripce vzhfedem k aminovému konci proteinu, což vedlo k expresi Ves v 5 společně s šesti dalšími aminokyselinami GIu-Ala-Glu-Ala-Giu-Phe na aminovém konci.

Vložení pPICZaA-Ves v 5 do P. pastoris

Vektory pPICZaA s vloženým genem Ves v 5 byly linearizovány štěpením Sac I a vloženy do místa A0X1 genomu Pichia pastoris. Vložení bylo provedeno homologní rekombinací buněk Pichia pastoris KM71 podle doporučení firmy invitrogen.

Mutageneze in vitro

Mutageneze in vitro se prováděla PCR použitím rekombinantního pPICZaA s vloženým Ves v 5 jako templátu. Každý mutantní gen Ves v 5 byl vytvořen třemi reakcemi PCR použitím čtyř primerů.

- 58 Byly syntetizovány dva oligonukleotidové primery specifické pro mutace zahrnující každou mutaci, jeden pro každý řetězec DNA, viz obr. 11 a 12. S použitím mutovaného nukleotidu nebo nukleotidů jako výchozího vodu byly prodlouženy oba primery o 6 až 7 nukleotidů na 5’-koncí a o 12 až 13 nukleotidů na 3’-konci. Prodlužující nukleotidy měly identickou sekvenci jako gen Ves v 5 v odpovídající oblasti.

Dále byly syntetizovány dva obecně použitelné primery (označené na obr. 12 „všechny pozitivní a „všechny negativní“), které byly použity pro všechny mutanty. Pro zajištění exprese mutant Ves v 5 s autentickým aminovým koncem byl prodloužen jeden primer odpovídající aminovému konci proteinu na 5’-konci o místo Xho I. Po vložení mutantních genů Ves v 5 do vektoru pPICZaA bylo regenerováno štěpící místo proteázy Kex2 přímo proti směru transkripce vzhledem k aminovému konci Ves v 5. Druhý primer měl odpovídající sekvenci jako oblast vektoru pPICZaA umístěná přibližně 300 bp ve směru transkripce vzhledem ke genu Ves v 5. Sekvence primeru odpovídajícího aminovému konci Ves v 5 je odvozena od pozitivního řetězce a sekvence primeru ve směru transkripce je odvozena od negativního řetězce, viz obr. 11.

Dvě nezávislé reakce PCR byly prováděny v podstatě standardními postupy (Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. T., Mullis K. B., Erlich H. A.; „Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase“, Science 239, 487 - 491 (1988)) s tím rozdílem, že bylo provedeno pouze dvacet teplotních cyklů, aby se snížila četnost výskytu artefaktů PCR. Každá reakce PCR používala pPICZaA s vloženým Ves v 5 jako templátů a jeden pro mutaci specifický a jeden obecně použitelný primer ve smysluplných kombinacích.

Produkty PCR byly čištěny použitím systému „Concert, Rapid PCR Purification System“ (Life Technologies). Třetí reakce PCR byla provedena použitím kombinovaných produktů PCR z prvních dvou

- 59 reakcí PCR jako templátu a obou obecně použitelných primerů. Znovu bylo použito dvacet cyklů standardní PCR. Produkt PCR byl čištěn systémem „Concert, Rapid PCR Purification System (Life Technologies), štěpen restrikčními enzymy (Xhol/Xbal) a vložen směrově do vektoru pPICZaA štěpeného stejnými enzymy. Obr. 13 ukazuje přehled všech mutací Ves v 5.

Vložení mutant pPICZaA-Ves v 5 do P. pastoris

Vektory pPICZaA s vloženými mutantními geny Ves v 5 byly linearizovány štěpením Sac I a vloženy do místa A0X1 genomu Pichia pastoris. Inzerce byly prováděny homologní rekombinaci na buňkách Pichia pastoris KM71 podle doporučení firmy Invitrogen.

Sekvenování nukleotidů

Určení nukleotidové sekvence genu kódujícího Ves v 5 bylo provedeno před a po subklonování a po mutagenezi in vitro.

Plasmidové DNA z 10 ml bakteriální kultury pěstované do saturace přes noc v médiu LB doplněném 0,1 g/l ampicilinu, byly čištěny na kolonách Qiagen-tip 20 a sekvenovány použitím sekvenačního kitu Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit (USB) podle doporučení dodavatelů.

Exprese a purifikace rekombinantního Ves v 5

Rekombinantni kvasinkové buňky Pichia pastoris kmen KM71 byly pěstovány v 500 ml lahvích obsahujících 100 ml fosfátového pufru pH 6,0 obsahujícího kvasničný dusíkatý základ, biotin, glycerol a histidin při 30 °C na rotační třepačce při 225 ot/min až do Αθοο nm 4 až 6. Buňky byly odděleny centrifugací a resuspendovány v 10 ml podobného pufrovaného média obsahujícího methanol namísto

- 60 glycerolu. Inkubace pokračovala při 30 °C 7 dnů, přičemž denně bylo přidáváno 0,05 ml methanolu.

Buňky byly sklizeny centrifugací a oddělená kultivační kapalina byla zakoncentrována ultrafiltrací. Po dialýze proti pufru s 50 mM octanem amonným pH 4,6 byl vzorek nanesen na kationtovou iontoměničovou kolonu FPLC (Pharmacia) SE-53 ekvilibrovanou ve stejném pufru. Kolona byla eluována lineárním gradientem 0 až 1,0M NaCl, 50 mM octan amonný. Vrchol rekombinantního Ves v 5 se eluoval při přibližně 0,4M NaCl a byl oddělen a dialyzován proti 0,02 N kyselině octové. Po zakoncentrování na přibližně 10 mg/ml byl vyčištěný Ves v 5 uchováván při 4 °C.

Krystalizace rekombinantního Ves v 5

Krystaly Ves v 5 byly pěstovány technikou difúze par při 25 °C. Pro krystalizaci bylo smíseno 5 μΙ 5 mg/ml Ves v 5 s 5 μΙ 18% PEG 6000, 0,1M citranem sodným pH 6,0 a ekvilibrováno proti 1 ml 18% PEG 6000, 0,1M citran sodný pH 6,0.

Rentgenová difrakční data byla měřena při 100 K z nativních krystalů Ves v 5 a po inkorporaci derivátů s těžkými atomy a použita pro vyřešení trojrozměrné struktury Ves v 5, viz obr. 10 (rukopis v přípravě).

Imunoelektroforéza s použitím králičích polyklonálních protilátek

Dvě mutanty Ves v 5 byly produkovány jako rekombinantní proteiny Ves v 5 a testovány na reaktivitu vůči polyklonálním králičím protilátkám proti rekombinantnímu Ves v 5. Při analýze raketovou imunoelektroforézou za nativních podmínek byly králičí protilátky schopny srážet rekombinantní Ves v 5 stejně jako obě mutanty, což ukazuje, že mutanty mají konzervovanou terciární strukturu a-uhlíkaté kostry.

- 61 Inhibice specifického sérového IgE

Vazebné schopnosti IgE mutantů Ves v 5 byly porovnány s rekombinantním Ves v 5 testem inhibice IgE ve fluidní fázi s použitím směsného séra s obsahem IgE odvozeného od pacientů alergických na vosí jed.

Test inhibice byl prováděn jako bylo popsáno výše, s použitím biotinylovaného rekombinantního Ves v 5 namísto Bet v 1.

Mutanta Ves v 5 Lys72Ala

Lysin v poloze 72 vykazuje vysoký stupeň expozice rozpouštědlu (70 %) a je umístěn v oblasti molekulárního povrchu společné pro antigen 5 Vespula. Relativní orientace a vysoký stupeň expozice rozpouštědlu podporují úvahu, že lysin 72 může být nahrazen zbytkem alaninu, aniž by došlo k porušení terciární struktury α-uhlíkaté kostry. Navíc, protože žádná ze sekvencí isoalergenů vyskytujících se v přírodě neobsahuje alanin v poloze 72, substituce lysinu alaninem poskytne molekulu Ves v 5, která se nevyskytuje v přírodě.

Vazebné vlastnosti IgE mutanty Ves v 5 Lys72Ala

Vazebné vlastnosti IgE mutanty Ves v 5 Lys72Ala byly srovnávány s rekombinantním Ves v 5 v testu inhibice IgE ve fluidní fázi s použitím směsného séra s obsahem IgE odvozeného od alergických pacientů popsaného výše.

Obr. 14 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Ves v 5 na sérový IgE ze směsného séra alergických pacientů nebiotinylovaným Ves v 5 a mutantou Ves v 5 Lys72Ala.

Je vidět jasný rozdíl v množství příslušných rekombinantních proteinů nutném pro dosažení 50% inhibice vazby na sérový IgE

- 62 přítomný ve směsném séru. Rekombinantní Ves v 5 dosahuje 50% inhibice při přibližně 6 ng, zatímco odpovídající koncentrace pro mutantu Ves v 5 Lys72Ala je 40 ng. To ukazuje, že jednobodová mutace zavedená v mutantě Ves v 5 Lys72Ala snižuje afinitu pro specifický sérový IgE přibližně šestkrát. Maximální míra inhibice dosažená mutantou Ves v 5 Lys72Ala je podstatně nižší ve srovnání s rekombinantním Ves v 5. To může ukazovat, že po substituci Lys72Ala nejsou schopny některé specifické IgE přítomné ve směsném séru rozpoznat mutantu Ves v 5 Lys72Aia.

Mutanta Ves v 5 Tyr96Ala

Tyrosin v poloze 96 vykazuje vysoký stupeň expozice rozpouštědlu (65 %) a je umístěn v oblasti molekulárního povrchu společné pro antigen 5 Vespula. Relativní orientace a vysoký stupeň expozice rozpouštědlu podporuje myšlenku, že tyrosin 96 může být nahrazen zbytkem alaninu, aniž by došlo k porušení trojrozměrné struktury. Navíc neobsahuje žádná ze sekvencí isoalergenů vyskytujících se v přírodě alanin v poloze 96, takže substituce tyrosinu alaninem poskytne molekulu Ves v 5, která se nevyskytuje v přírodě.

Vazebné vlastnosti IgE mutanty Ves v 5 Tyr96Ala

Vazebné vlastnosti IgE mutanty Ves v 5 Tyr96Ala byly porovnány s rekombinantním Ves v 5 testem inhibice IgE ve fluidní fázi s použitím směsného séra IgE odvozeného od výše popsaných alergických pacientů.

Obr. 14 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Ves v 5 na sérový IgE ze směsného séra alergických pacientů nebiotinylovaným Ves v 5 a mutantou Ves v 5 Tyr96Ala.

Je vidět jasný rozdíl v množství příslušných rekombinantních proteinů nutných pro dosažení 50% inhibice vazby na sérový IgE

- 63 přítomný ve směsném séru. Rekombinantní Ves v 5 dosahuje 50% inhibice při přibližně 6 ng, zatímco odpovídající koncentrace pro mutantu Ves v 5 Tyr96Ala je 40 ng.

To ukazuje, že jednobodová mutace zavedená v mutantě Ves v 5 Tyr96Ala snižuje afinitu pro specifický sérový IgE přibližně šestkrát.

Maximální míra inhibice dosažená mutantou Ves v 5 Tyr96Ala je podstatně nižší ve srovnání s rekombinantním Ves v 5. To může ukazovat, že po substituci Tyr96Ala nejsou některé specifické IgE přítomné ve směsném séru schopny rozpoznávat mutantu Ves v 5 Tyr96Ala.

Příklad 3

Identifikace a volba aminokyselin pro substituci

Pro volbu aminokyselin exponovaných na povrchu vhodných pro substituci pro alegeny Bet v 1, Der p 2 a Ves v 5 byly použity parametry dostupnosti rozpouštědlu a stupně konzervace.

Dostupnost rozpouštědlu

Dostupnost rozpouštědlu byla vypočtena pomocí softwaru Insightll, verze 97.0 (MSI) a poloměru sondy 1,4 A (1A = 0,1 nm) (povrch Connolly).

Vnitřní dutiny byly z analýzy vyloučeny vyplněním sond s použitím softwaru PASS (Putative Active Sites with Spheres). Sondy na povrchu byly potom odstraněny manuálně.

- 64 Konzervace

Bet v 1:

3-D struktura je založena na vzorku s depozitním číslem Z80104 (1 bvl. pdb).

dalších sekvencí Bet v 1 zahrnutých do analýzy konzervovaných zbytků má depozitní čísla:

P15494=X15877=Z80106, Z80101, AJ002107, Z72429,

AJ002108, Z80105, Z80100, Z80103, AJ001555, Z80102, AJ002110, Z72436, P43183=X77271, Z72430, AJ002106, P43178=X77267,

P43179=X77268, P43177=X77266, Z72438, P43180=X77269,

AJ001551, P43185=X77273, AJ001557, Z72434, AJ001556,

Z72433=P43186, AJ001554, X81972, Z72431, P45431=X77200,

P43184=X77272, P43176=X77265, S47250, S47251, Z72435,

Z72439, Z72437, S47249.

Der p 2

3-D struktura je založena na vzorku s depozitním číslem P49278 (1a9v. pdb).

Šest dalších sekvencí Der p 2 zahrnutých do analýzy konzervovaných zbytků obsahuje následující substituce:

ALK-G: V40L, T47S, M111L, D114N.

ALK-101: M76V.

ALK-102 : V40L, T47S.

ALK-104: T47S, M111I, D114N.

ALK-113: T47S.

ALK-120: V40L, T47S, D114N.

- 65 Ves v 5

3-D struktura je založena na vzorku s depozitním číslem Q05110 (nepublikované souřadnice pdb).

Další sekvence Ves v 5 v analýze konzervovaných zbytků obsahuje jednu aminokyselinovou substituci M202K.

Výsledky

Bet v 1 aminokyselin s vysokou expozicí rozpouštědlu:

K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D125, R-145, D-109, T-77, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, L-62, S-155, H126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153,1-44, E-138, G61, A-130, R-70, N-28, P-35,. S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87, E-73.

aminokyselin s vysokou expozicí rozpouštědlu a konzervací (více než 70 %):

K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153,1-44, E-138, G-61, A-130, R70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K-115, P14, Y-5, K-137, E-141, E-87, E-73.

provedených mutací:

Y5V, T10P, D25E, N28T, K32Q, E42S, E45S, N47S, K55N, K65N, T77A, N78K, E96L, K97S, K103V, P108G, D109N, K123I, D125Y, K134E, R145E, D156H,+160N.

Tabulka 1 ukazuje výpis v sestupném pořadí expozice aminokyselin Bet v 1 rozpouštědlu. Sloupec 1 uvádí pořadí

- 66 aminokyseliny počínaje aminovým koncem, sloupec 2 uvádí aminokyselinu jako jednopísmenovou zkratku, sloupec 3 uvádí normalizovaný index expozice rozpouštědlu, sloupec 4 uvádí procento známých sekvencí, které obsahují stejnou aminokyselinu v odpovídající poloze.

Tabulka 1: Bet v 1

No aminokyseliny	Expozice rozpouštědlu	Konzervace %
129K	1,000	90
60E	0,986	97
47N	0,979	100
65K	0,978	100
108P	0,929	100
159N	0,869	100
93D	0,866	100
123K	0,855	100
32K	0,855	100
125D	0,821	74
145R	0,801	90
109D	0,778	82
77T	0,775	56
127E	0,760	100
36Q	0,749	95
131E	0,725	100
152L	0,718	97
6E	0,712	100

96E	0,696	100
156D	0,693	97
63P	0,692	97
76H	0,683	90
8E	0,638	97
134K	0,630	100
45E	0,623	100
10T	0,613	97
12V	0,592	100
20K	0,584	100
62L	0,575	5
155S	0,568	97
126H	0,551	95
50P	0,541	100
78N	0,538	100
119K	0,529	100
2V	0,528	100
24L	0,528	100
42E	0,519	100
4N	0,517	95
153A	0,513	100
441	0,508	97
138E	0,496	100
61G	0,488	100
130A	0,479	97

70R	0,474	100
28N	0,469	90
35P	0,467	100
149S	0,455	92
103K	0,447	100
150Y	0,438	100
154H	0,436	100
43N	0,412	100
106A	0,411	95
115K	0,411	100
14P	0,410	97
5Y	0,410	100
137Κ	0,396	100
141Ε	0,387	95
87Ε	0,385	100
73Ε	0,384	100
16Α	0,367	100
79F	0,362	100
3F	0,355	100
158Υ	0,346	100
105V	0,336	100
101Ε	0,326	100
64 F	0,325	100
86Ι	0,322	100
39S	0,314	100

124G	0,310	100
72D	0,308	97
142T	0,293	67
66Y,	0,289	100
55K	0,288	100
7T	0,279	67
40S	0,274	95
25D	0,271	87
135Α	0,267	92
68Κ	0,262	100
97Κ	0,247	100
46G	0,235	100
27D	0,232	97
1G	0,227	100
1131	0,225	77
51G	0,220	100
92G	0,218	100
80Κ	0,212	100
110G	0,211	100
107Τ	0,203	85
94Τ	0,202	92
41V	0,201	97
48G	0,198	100
911	0,192	18
31Ρ	0,188	100

75D	0,188	97
33V	0,183	100
49G	0,176	100
17R	0,172	100
99S	0,158	64
89G	0,154	100
53I	0,154	100
121Η	0,153	100
9Τ	0,150	72
74V	0,148	97
132Q	0,146	72
57S	0,137	49
148Ε	0,135	100
82Ν	0,133	41
128V	0,125	64
117S	0,124	87
90Ρ	0,117	67
1161	0,112	100
122Τ	0,107	100
139Μ	0,104	62
95L	0,104	97
54 Κ	0,096	100
146Α	0,095	100
59Ρ	0,088	97
157Α	0,088	100

133V	0,077	44
88G	0,068	100
140G	0,053	85
37A	0,042	95
81Y	0,041	100
23I	0,036	95
1041	0,036	92
15A	0,036	97
58F	0,029	100
29L	0,028	100
19F	0,027	100
100N	0,022	97
22F	0,021	97
71V	0,014	100
111G	0,014	100
131	0,014	100
181	0,014	97
114L	0,014	100
11 s	0,007	100
151L	0,007	97
144L	0,007	90
52T	0,007	100
84S	0,007	97
118N	0,007	97
1021	0,007	100

21A	0,000	97
26G	0,000	97
30F	0,000	44
34A	0,000	100
38I	0,000	87
56I	0,000	100
67V	0,000	97
69D'	0,000	62
83Y	0,000	95
85V	0,000	72
98I	0,000	95
112S	0,000	77
120Y	0,000	95
136S	0,000	67
143L	0,000	100
147V	0,000	100

Der ρ 2 aminokyselin s vysokou expozicí rozpouštědlu:

R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K 96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, 1-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K 126, L-61, P-26, N-93, D-64, 1-28, K-14, K-100, E-62, 1-127, E-102 E-25, P-66, D-114, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N 46, E-42, T-91, D87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109, K

15.

- 73 54 aminokyselin s vysokou expozicí rozpouštědlu a konzervací (více než 70 %):

R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K6, K96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, I-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K126, L-61, P-26, N-93, D-64, I-28, K-14, K-100, E-62, 1-127, E-102, E25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109, K-15.

Šest provedených mutací:

K6A, K15E, H30N, E62S, H74N, K82N

Tabulka 2 ukazuje výpis v sestupném pořadí expozice aminokyselin Der p 2 rozpouštědlu. Sloupec 1 uvádí pořadí aminokyseliny počínaje aminovým koncem, sloupec 2 uvádí aminokyselinu jako jednopísmenovou zkratku, sloupec 3 uvádí normalizovaný index expozice rozpouštědlu, sloupec 4 uvádí procento známých sekvencí, které obsahují stejnou aminokyselinu v odpovídající poloze.

Tabulka 2: Der p 2

No aminokyseliny	Expozice rozpouštědlu	Konzervace %
128R	1,000	100
129D	0,965	100
11H	0,793	100
30H	0,712	100
1S	. 0,700	100
77K	0,694	100
75Y	0,681	100
31R	0,677	100

82K	0,658	100
6K	0,645	100
96Κ	0,643	100
48Κ	0,642	100
55Κ	0,641	100
89Κ	0,627	100
85Q	0,624	100
92W	0,610	100
971	0,581	100
22Η	0,568	100
65V	0,559	100
24S	0,557	100
74Η	0,542	100
126Κ	0,542	100
61	L	0,539
100	26Ρ	0,516
100	93Ν	0,513
100	64D	0,509
100	28Ι	0,504
100	14Κ	0,493
100	10ΟΚ	0,489
100	62Ε	0,454
100	1271	0,439
100	102Ε	0,428
100	25Ε	0,428

100	66Ρ	0,427
100	114D	0,418
57	17L	0,412
100
60G	0,390	100
95P	0,388	100
53E	0,377	100
81V	0,377	100
51K	0,370	100
103N	0,369	100
2Q	0,366	100
46N	0,360	100
42E	0,357	100
91T	0,340	100
87D	0,334	100
10N	0,333	100
111Μ	0,325	71
8C	0,323	100
124Η	0,315	100
68Ι	0,313	100
79Ρ	0,307	100
109Κ	0,307	100
15Κ	0,302	100
49Τ	0,292	100
44Ν	0,291	100

113D	0,290	100
63V	0,286	100
105V	0,280	100
19P	0,270	100
84Q	0,264	100
76M	0,262	86
7D	0,251	100
116V	0,244	100
78C	0,238	100
36Q	0,235	100
45Q	0,233	100
40V	0,223	57
57S	0,212	100
38E	0,205	100
69D	0,203	100
9A	0,196	100
71N	0,190	100
98A	0,186	100
115G	0,180	100
131	0,179	100
123T	0,179	100
34P	0,178	100
4D	0,157	100
20G	0,150	100
107T	0,143	100

12E	0,137	100
94V	0,137	100
1211	0,136	100
83G	0,128	100
70P	0,128	100
73C	0,120	100
3V	0,116	100
35F	0,111	100
59D	0,099	100
291	0,098	100
23G	0,085	100
541	0,075	100
5V	0,075	100
101S	0,074	100
72A	0,069	100
27C	0,060	100
32G	0,059	100
99P	0,058	100
86Y	0,056	100
16V	0,052	100
50A	0,040	100
90Y	0,039	100
18V	0,035	100
33K	0,033	100
52I	0,029	100

581	0,029	100
104V	0,024	100
112G	0,023	100
21C	0,023	100
88I	0,023	100
117L	0,016	100
56A	0,011	100
41F	0,011	100
120A	0,006	100
119C	0,006	100
67G	0,005	100
122A	0,005	100
37L	0,000	100
39A	0,000	100
43A	0,000	100
47T	0,000	29
80L	0,000	100
106V	0,000	100
108V	0,000	100
110V	0,000	100
118A	0,000	100
125A	0,000	100

Ves v 5 aminokyselin s vysokou expozicí rozpouštědlu:

) )

- 79 Κ-16, Κ-185, Κ-11, Κ-44, Κ-210, R-63, Κ-13, F-6, Κ-149, Κ-128, Ε-184, Κ-112, Κ-202, F-157, Ε-3, Κ-29, Ν-203, Ν-34, Κ-78, Κ-151, L15, L-158, Y-102, W-186, Κ-134, D-87, Κ-52, Τ-67, Τ-125, Κ-150, Υ40, Q-48, L-65, Κ-81, Q-101, Q-208, Κ-144, Ν-8, Ν-70, Η-104, Q-45, Κ-137, Κ-159, Ε-205, Ν-82, Α-111, D-131, Κ-24, V-36, Ν-7, Μ-138, Τ209, V-84, Κ-172, V-19, D-56, Ρ-73, G-33, Τ-106, Ν-170, L-28, Τ-43, Q-114, C-10, Κ-60, Ν-31, Κ-47, Ε-5, D-145, V-38, Α-127, D-156, Ε204, Ρ-71, G-26, Υ-129, D-141, F-201, R-68, Ν-200, D-49, S-153, Κ35, S-39, Υ-25, V-37, G-18, W-85, 1-182.

aminokyselin s vysokou expozicí rozpouštědlu a konzervací (více než 70 %):

K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6, K-149, K-128, E-184, K-112, F-157, E-3, K-29, N-203, N-34, K-78, K-151, L-15, L158, Y-102, W-186, K-134, D-87, K-52, T-67, T-125, K-150, Y-40, Q48, L-65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S-153, K-35, S-39, Y25, V-37, G-18, W-85, 1-182.

Devět provedených mutací:

K29A, T67A, K78A, V84S, Y102A, K112S, K144A, K202M, N203G.

Tabulka 3 ukazuje výpis v sestupném pořadí expozice aminokyselin Ves v 5 rozpouštědlu. Sloupec 1 uvádí pořadí aminokyseliny počínaje aminovým koncem, sloupec 2 uvádí aminokyselinu jako jednopísmenovou zkratku, sloupec 3 uvádí normalizovaný index expozice rozpouštědlu, sloupec 4 uvádí procento známých sekvencí, které obsahují stejnou aminokyselinu v odpovídající poloze.

- 80 Tabulka 3: Ves v 5

No aminokyseliny	Expozice rozpouštědlu	Konzervace %
16K	1,000	100
185K	0,989	100
11K	0,978	100
44K	0,978	100
210K	0,962	100
63R	0,956	100
13K	0,951	100
6F	0,868	100
149K	0,868	100
128K	0,857	100
184E	0,841	100
112K	0,824	100
202K	0,824	50
157F	0,819	100
3E	0,802	100
29K	0,797	100
203N	0,797	100
34 N	0,775	100
78K	0,775	100
151K	0,753	100
15L	0,714	100
158L	0,714	100

102Y	0,687	100
186W	0,665	100
134K	0,654	100
87D	0,621	100
52K	0,615	100
67T	0,610	100
125T	0,610	100
150K	0,604	100
40Y	0,593	100
48Q	0,593	100
65L	0,593	100
81K	0,588	100
101Q	0,577	100
208Q	0,566	100
144K	0,560	100
8N	0,555	100
70N	0,549	100
104H	0,549	100
45Q	0,538	100
137K	0,538	100
159K	0,533	100
205E	0,511	100
82N	0,500	100
111A	0,500	100
131D	0,495	100

24K	0,489	100
36V	0,489	100
7N	0,484	100
138M	0,473	100
209T	0,473	100
84V	0,462	100
172K	0,451	100
19V	0,445	100
56D	0,445	100
73P	0,440	100
33G	0,429	100
106T	0,429	100
170N	0,429	100
28L	0,423	100
43T	0,423	100
114Q	0,423	100
10C	0,412	100
60K	0,407	100
31N	0,396	100
47K	0,396	100
5E	0,390	100
145D	0,390	100
38V	0,379	100
127A	0,379	100
156D	0,379	100

204E	0,374	100
71P	0,363	100
26G	0,352	100
129Y	0,352	100
141D	0,341	100
201F	0,341	100
68R	0,335	100
200N	0,308	100
49D	0,302	100
153S	0,302	100
35K	0,297	100
39S	0,291	100
25Y	0,280	100
37V	0,280	100
18G	0,275	100
85W	0,275	100
1821	0,275	100
46E	0,264	100
126A	0,253	100
88E	0,247	100
76P	0,236	100
79N	0,236	100
124S	0,236	100
30P	0,231	100
123G	0,231	100

162H	0,231	100
183Q	0,231	100
121	0,225	100
197P	0,225	100
130D	0,220	100
148P	0,214	100
180K	0,214	100
23C	0,209	100
75P	0,209	100
113Y	0,209	100
108R	0,203	100
188K	0,203	100
51L	0,198	100
59Q	0,198	100
121L	0,198	100
122T	0,198	100
154G	0,192	100
53E	0,170	100
72G	0,170	100
41G	0,165	100
86N	0,165	100
147N	0,165	100
173E	0,165	100
27S	0,159	100
94Q	0,159	100

187H	0,159	100
142E	0,154	100
64G	0,148	100
17G	0,143	100
133V	0,137	100
42L	0,121	100
155N	0,121	100
55N	0,115	100
91Y	0,115	100
69G	0,110	100
103G	0,110	100
198S	0,110	100
109D	0,093	100
207Y	0,082	100
96W	0,077	100
161G	0,077	100
140E	0,071	100
152F	0,071	100
80M	0,066	100
117Q	0,066	100
4A	0,060	100
32C	0,055	100
90A	0,055	100
206L	0,055	100
22A	0,049	100

11 ον	0,044	100
146Υ	0,044	100
14C	0,038	100
9Υ	0,033	100
62Α	0,033	100
132Ρ	0,033	100
57F	0,027	100
99Q	0,027	100
1OOC	0,027	100
199G	0,027	100
77Α	0,022	100
105D	0,022	100
119V	0,022	100
20Η	0,016	100
83L	0,016	100
120Α	0,016	100
139W	0,016	100
176C	0,016	100
178S	0,016	100
181Υ	0,016	100
95V	0,011	100
115V	0,011	100
116G	0,011	100
165Q	0,011	100
169Α	0,011	100

189H	0,011	100
66E	0,005	100
74Q	0,005	100
89L	0,005	100
92V	0,005	100
98N	0,005	100
118N	0,005	100
168W	0,005	100
21T	0,000	100
50I	0,000	100
54H	0,000	100
58R	0,000	100
611	0,000	100
93A	0,000	100
97A	0,000	100
107C	0,000	100
135L	0,000	100
136V	0,000	100
143V	0,000	100
160T	0,000	100
163Y	0,000	100
164T	0,000	100
166M	0,000	100
167V	0,000	100
171T	0,000	100

174V	0,000	100
175G	0,000		100
177G	0,000		100
1791	0,000		100
190Y	0,000		100
191L	0,000		100
192V	0,000		100
193C	0,000		100
194N	0,000		100
195Y	0,000		100
196G	0,000		100
Příklad 4
Tento příklad popisuje rekombinantních mutantních alergenů alergenů se zmenšenou vazebnou	přípravu i Bet v afinitou	a charakterizaci 1 podle vynálezu, tj. pro IgE obsahujících

alespoň čtyři primární mutace.

Volba aminokyselinových zbytků pro místně specifickou mutagenezi

Bet v 1

Dostupnost aminokyselinových zbytků Bet v 1 rozpouštědlu je ukázána v příkladu 3, tabulka 1. Míra zakonzervování aminokyselin je založena na porovnání sekvencí provedeném na serveru ExPaSy Molecular Biology Server (http://www. expasy. ch/) s použitím algoritmu ClustalW na hledání programem BLAST, kde jako vstupní sekvence je použita aminokyselinová sekvence Bet v 1.2801 standardního typu. Srovnání zahrnuje sekvence 67 alergenů (39

- 89 sekvencí Bet v 1, 11 sekvencí Car b 1, 6 sekvencí Cor a 1, a 13 sekvencí Aln g 1) z druhů v rámci řádu Fagales (Bet v 1; Betula verrrucosa; Carb 1: Carpinus betulus; Cor a Corylus avellana·, Aln g 1: Alnus glutinosay Vzhledem k mutovaným rekombinantním alergenům Bet v 1 ukázaným v příkladech byly cílové zbytky pro substituci založeny na identitě aminokyselin >95%.

Jak se popisuje v příkladu 1, pro místně specifickou mutagenezi byly vybrány aminokyselinové zbytky s vysokým stupněm expozice rozpouštědlu a vysokým stupněm konzervace mezi pylovými alergeny z příbuzných druhů. Zbytky s nízkým stupněm expozice rozpouštědlu (<20 %) nebyly považovány za relevantní pro mutagenezi v důsledku možného porušení terciární struktury nebo nepřítomnosti interakce s protilátkou.

Zavedené zbytky byly všechny přítomny v odpovídajících polohách v isoformách skupiny rostlinných proteinů nazývaných proteiny související s patogenezí (PR-10). Molekulární modelování ukazuje, že terciární struktury alergenů Fagales a proteinů PR-10 jsou téměř identické. Bet v 1 sdílí významnou sekvenční identitu (20 až 40 %) s proteiny PR-10. Nejsou však žádné údaje o přítomnosti zkřížené alergické rektivity vůči těmto proteinům PR-10. Záměna vysoce konzervované a rozpouštědlu exponované aminokyseliny z Bet v 1 aminokyselinou v odpovídající poloze v proteinu PR-10 tedy vede k mutovanému proteinu Bet v 1 s nezměněnou terciární strukturou auhlíkaté kostry, ale se zmenšenou vazebnou afinitou IgE.

Mutageneze in vitro

Mutageneze in vitro byla prováděna PCR s použitím rekombinantního pMAL-c s vloženým Bet v 1 jako templátů. Příprava rekombinantních mutantních alergenů obsahujících 5 až 9 primárních mutací zahrnovala dva kroky PCR; krok I a II. Nejprve byla zavedena každá jednotlivá mutace (nebo několik mutací, jestliže jsou umístěny

- 90 v sekvenci DNA blízko u sebe) do sekvencí DNA Bet v 1.2801 nebo derivátů Bet v 1.2801, s použitím pozitivních a negativních oligonukleotidových primerů specifických pro mutace obsahujících každou mutaci nebo mutace spolu s pozitivními a negativními oligonukleotidovými primery obsahujících buď sousední mutace proti směru transkripce nebo ve směru transkripce, nebo N-konec/C-konec Bet v 1, jak je schematicky znázorněno na obr. 17 (I). Jako druhý krok byly produkty z PCR reakce I čištěny, míchány a použity jako templáty pro další reakci PCR (II) s oligonukleotidovými primery obsahujícími PCR obsahujícími N-konec a C-konec Bet v 1, jak je schematicky znázorněno na obr. 17 (II). Produkty PCR byly čištěny elektroforézou na agarózovém gelu a gelovou purifikací PCR (Life Techhnologies) a následným srážením ethanolem, štěpeny restrikčními enzymy (Sacl/EcoRI) nebo (Sacl/Xbal) a vloženy směrově do pMAL-c štěpeného stejnými enzymy.

Obr. 18 ukazuje syntetizované oligonukleotidové primery a schematická znázornění konstrukce mutant Bet v 1 s pěti až devíti primárními mutacemi. Mutované aminokyseliny byly přednostně voleny ze skupiny aminokyselin, které jsou charakterizovány vysokou expozicí rozpouštědlu a jsou konzervovány, jak se popisuje v příkladu 3. Mutanty Bet v 1 jsou následující primární a sekundární mutace uvedené v závorkách:

Mutanta Bet v 1 (2628): TyrSVal, Glu45Ser, Lys65Asn,

Lys97Ser, Lysl34Glu.

Mutanta Bet v 1 (2637): Ala16Pro (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys103Thr, Pro108Gly (Leu152Lys, Ala153Gly, Ser155Pro).

Mutanta Bet v 1 (2733): (Tyr5Val, Lys134Glu), (Asn28Thr, Lys32Gln), Glu45Ser, Lys65Asn, (Asn78Lys, Lys103Val), Lys97Ser, Pro108Gly, Arg145Glu, (Asp156His, +160Asn).

Mutanta Bet v 1 (2744): (Tyr5Val, Lys134Glu), (Glu42Ser, Glu45Ser), (Asn78Lys, Lys103Val), Lys123lle, (Asp156His, +160Asn).

-91 _

Mutanta Bet v 1 (2753): (Asn28Thr, Lys32Gln), Lys65Asn, (Glu96Leu, Lys97Ser), (Pro108Gly, Asp109Asn), (Asp125Tyr, Glu127Ser), Arg145Glu.

Sekvenování nukieotidů

Zjištění nukleotidové sekvence genu kódujícího Bet v 1 bylo provedeno před a po subklonování, popřípadě po mutagenezi in vitro.

Plasmidové DNA z 10 ml bakteriální kultury pěstované do nasycení přes noc v médiu LB doplněném 0,1 g/l ampicilinu byly čištěny na kolonách Qiagen-tip 20 a sekvenovány použitím sekvenačního kitu Ready reaction dye terminátor cycle sequencing kit a sekvenátoru Fluorescence Sequencer AB PRISM 377, oba od firmy Perkin Elmer, s použitím doporučení dodavatelů.

Exprese a purifikace rekombinantního Bet v 1 a mutant

Rekombinantní Bet v 1 (Bet v 1.2801 a mutanty) byly exprímovány v bakterii Escherichia coli DH 5a fúzované s proteinem vázajícím maltózu a purifikovány jak bylo popsáno v Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., M0rtz E., Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with MaltoseBinding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 - 373 (1996a). Ve stručnosti, rekombinantní buňky E. coli byly pěstovány při 37 °C na optickou hustotu 0,8 při 600 nm, a potom byla exprese fuzního proteinu Bet v 1 indukována přidáním IPTG. Buňky byly sklizeny centrifugací 3 hodiny po indukci, resuspendovány v lyzačním pufru a rozbity sonikací. Po sonikaci a další centrifugaci byl rekombinantní fuzní protein izolován amylózovou afinitní chromatografií a potom štěpen inkubací s faktorem Xa (Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., M0rtz E., Roepstorff P., Larsen J.

- 92 N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 - 373 (1996a)). Po štěpení F Xa byl rekombinantní Bet v 1 izolován gelovou filtrací a čištěn dalším cyklem amylózové afinitní chromatografie pro odstranění stopových množství proteinu vázajícího maltózu.

Purifikovaný rekombinantní Bet v 1 byl zakoncentrován ultrafiltrací na přibližně 5 mg/ml a uchováván při 4 °C. Konečné výtěžky purifikovaných preparátů rekombinantního Bet v 1 byly mezi 2 až 5 mg na litr buněčné kultury E. coli.

Purifikované preparáty rekombinantního Bet v 1 se jevily na SDS-polyakrylamidové elektroforéze s barvením stříbrem jako jednotlivé pruhy se zdánlivou molekulovou hmotností 17,5 kDa. Autoři vynálezu již dříve ukázali (Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., Mortz E., Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic Nterminus, Cloned in Fusion with Maltose-Binding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 - 373 (1996a)), že rekombinantní Bet v 1 No. 2801 je imunochemicky neodlišitelný od Bet v 1, který se vyskytuje v přírodě.

Bet v 1 (2628) a mutanty Bet v 1 (2637)

Obr. 19 ukazuje zavedené bodové mutace na molekulárním povrchu Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637). V mutantě Bet v 1 (2628) bylo zavedeno pět primárních mutací v jedné polovině Bet v 1, přičemž druhá polovina zůstala nezměněná. V mutantě Bet v 1 (2637) byly v druhé polovině zavedeny pět primárních a tři sekundární mutace a první polovina zůstala nezměněna. Takto ovlivňují mutace v mutantním Bet v 1 (2628) a mutantním Bet v 1 (2637) různé poloviny povrchu Bet v 1.

- 93 Krystalizace a určení struktury rekombinantního mutantního proteinu

Bet v 1 (2628)

Krystaly rekombinantního Bet v 1 (2628) byly pěstovány difúzí par při 25 °C, v podstatě jak je popsáno v Spangfort M. D., Larsen J. N., Gajhede M.: „Crystallization and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 Á (1Á = 0,1 nm) Resolution of Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing IgE-Mediated Allergy“, PROTEINS, Struc. Func. Genet. 26, 358 - 360 (1996b). Bet v 1 (2628) byl při koncentraci 5 mg/ml smísen se stejným objemem 2,2 M síranu amonného, 0,1 M citranu sodného, 1% (obj./obj.) dioxanu pH 6,3 a ekvilibrován proti stonásobnému objemu 2,2 M síranu amonného, 0,1 M citranu sodného, 1% (obj./obj.) dioxanu, pH 6,3. Po 24 hodinách ekvilibrace byl indukován růst krystalů použitím techniky očkování popsané v Spangfort M. D., Larsen J. N., Gajhede M.: „Crystallization and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 A (1A = 0,1 nm) Resolution of Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing IgE-Mediated Allergy“, PROTEINS, Struc. Func. Genet. 26, 358 - 360 (1996b) použitím krystalů rekombinantního Bet v 1 standardního typu jako zdroje očkovacích zárodků.

Po přibližně čtyřech měsících byly krystaly odděleny a analyzovány použitím rentgenových paprsků generovaných rotující anodou Rigaku, jak se popisuje v Spangfort M. D., Larsen J. N., Gajhede M.: „Crystallization and Preliminary X-ray Investigation at 2.0 A (1A = 0,1 nm) Resolution of Bet v 1, a Birch Pollen Protein Causing IgE-Mediated Allergy“, PROTEINS, Struc. Func. Genet. 26, 358 - 360 (1996b), a struktura byla vyřešena použitím metody molekulární náhrady.

) >3 3 ) ) 3 , > ) 1 > J 3 ; i .3 3 3 » ) i > > )3))

Struktura mutanty Bet v 1 (2628)

Strukturní vliv mutací byl testován pěstováním trojrozměrných krystalů proteinu Bet v 1 (2628) a analýzou rentgenovou difrakcí s rozlišením 2,0 A (1Á = 0,1 nm) s použitím rotující anody. Substituce Tyr5Val, Glu45Ser, Lys65Asn, Lys97Ser, Lys134Glu byly ověřeny mapováním elektronové hustoty struktury Bet v 1 (2628), které také ukázalo, že celková terciární struktura α-uhlíkaté kostry zůstala zachována.

Strukturní analýza mutanty Bet v 1 (2637)

Strukturní integrita čištěné mutanty Bet v 1 (2637) byla analyzována spektroskopií cirkulárním dichroismem (CD). Obr. 20 ukazuje spektra CD rekombinantního Bet v 1.2801 (standardní typ) a mutanty Bet v 1 (2637) zaznamenaná při téměř stejných koncentracích. Překrytí amplitud vrcholů a poloh vrcholů v CD spektrech dvou rekombinantních proteinů ukazuje, že tyto dva preparáty obsahují stejná množství sekundárních struktur, což silně podporuje domněnku, že terciární struktura α-uhiíkaté kostry není ovlivněna zavedením aminokyselinových substitucí.

Vazebné vlastnosti IgE mutant Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637)

Vazebné vlastnosti IgE Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637) stejně jako směsi 1 : 1 Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637) byly srovnány s rekombinantním Bet v 1.2801 inhibičním testem IgE ve fluidní fázi s použitím směsného séra obsahujícího IgE od alergických pacientů. Jak je popsáno v příkladu 1, rekombinantni Bet v 1.2801 byl bíotinyiován s molárním poměrem 1 : 5 (Bet v 1 no. 2801 : biotin). Inhibiční test byl prováděn následovně: vzorek séra (25 μΙ) byl inkubován s protilátkou proti IgE na pevné fázi, promyt, resuspendován a dále inkubován se směsí biotinylovaného Bet v

- 95 - ' ’ “ ”

1.2801 a dané mutanty nebo směsí 1 : 1 těchto dvou mutant. Množství biotinylovaného Bet v 1.2801 navázaného na pevnou fázi bylo odhadnuto ze změřených RLU po inkubaci se streptavidinem značeným akridiniovým esterem. Stupeň inhibice byl vypočten jako poměr mezi jednotkami RLU získanými s použitím pufru a mutanty jako inhibitoru.

Obr. 21 ukazuje inhibici vazby biotinylovaného rekombinantního Bet v 1.2801 na sérový IgE ze směsného séra alergických pacientů nebiotinylovaným Bet v 1.2801 a Bet v 1 (2628), Bet v 1 (2637) a směsí 1 : 1 Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637).

Je vidět jasný rozdíl v množství odpovídajících rekombinantních proteinů nutných pro dosažení 50% inhibice vazby sérového IgE přítomného ve směsném séru. Rekombinantní Bet v 1.2801 dosahuje 50% inhibice při koncentraci přibližně 5 ng, zatímco odpovídající koncentrace pro mutantu Bet v 1 (2628) je přibližně 15 až 20 ng. To ukazuje, že bodová mutace zavedená v mutantě Bet v 1 (2628) snižuje afinitu ke specifickému sérovému IgE faktorem alespoň přibližně 3 až 4.

Maximální míra inhibice dosažená mutantním proteinem Bet v 1 (2628) je jasně nižší ve srovnání s rekombinantním Bet v 1.2801. To může naznačovat, že některý ze specifických IgE přítomných ve směsném séru není schopen rozpoznávat mutantní protein Bet v 1 (2628) v důsledku zavedených bodových mutací.

Bet v 1 (2637) dosahuje 50% inhibice při koncentraci přibližně 400 až 500 ng, což ukazuje, že bodová mutace zavedená v mutantě Bet v 1 (2637) snižuje afinitu pro specifický sérový IgE 80 až 100násobně ve srovnání s Bet v 1.2801. Velký rozdíl ve vazbě IgE je dále podporován jasným rozdílem ve sklonu inhibiční křivky získané s mutantním proteinem Bet v 1 (2637) ve srovnání s inhibiční křivkou pro Bet v 1.2801. Rozdílný sklon poskytuje důkaz, že snížení vazby

- 96 IgE je důsledkem jasně odlišného uspořádání epitopu mutanty ve srovnání s Bet v 1.2801.

Navíc k inhibičním testům s jednotlivými modifikovanými alergeny byla testována směs 1 : 1 Bet 1 (2628) a Bet v 1 (2637) se stejnou molární koncentrací Bet v 1 jako v každém ze vzorků s Bet 1 (2628), popř. Bet v 1 (2637), přičemž byla ukázána plná (100 %) schopnost inhibovat vazbu igE na Bety 1.2801. Schopnost úplně inhibovat vazbu IgE jasně ukazuje, že všechny reaktivní epitopy přítomné na Bet v 1.2801 byly přítomné ve směsi alergenů 1:1. Další podpora této domněnky přichází z porovnatelného sklonu dvou inhibičních křivek pro Bet v 1.2801 a směs alergenů. Snížená reaktivita IgE vzorku směsného alergenu je ukázána potřebou čtyřnásobně vyšší koncentrace směsi alergenů ve srovnání s Bet v 1.2801 pro dosažení 50% inhibice vazby IgE.

Test proliferace T-buněk s použitím mutovaných rekombinantních Bet v 1 jako alergenů

Analýza byla prováděna jak je popsáno v Spangfort M. D., Ipsen H., Sparholt S. H., Aasmul-Olsen S., Larsen M. R., Mortz E., Roepstorff P., Larsen J. N.: „Characterization of Purified Recombinant Bet v 1 with Authentic N-terminus, Cloned in Fusion with MaltoseBinding Protein“, Prot. Exp. Purification 8, 365 - 373 (1996a). Mutantní proteiny Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637) byly oba schopny indukovat proliferaci linií T-buněk u pacientů alergických na pyl břízy, přičemž bylo dosaženo podobných stimulačních indexů jako u rekombinantních a v přírodě se vyskytujících alergenů. To ukazuje, že obě mutanty Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637) mohou iniciovat imunitní reakci buněk nutnou pro tvorbu protilátek.

- 97 Test uvolňování histaminu lidskými bazofily

Uvolňování histaminu z bazofilních leukocytů bylo testováno následujícím způsobem. Heparinizovaná krev (20 ml) byla odebrána každému pacientovi alergickému na pyl břízy, uchována při laboretovní teplotě a použita během 24 hodin. 25 μΙ heparinizované úplné krve bylo naneseno do mikrotitračních jamek potažených skelným vláknem (Reference Laboratory, Kodaň, Dánsko) a inkubováno s 25 μΙ alergenu nebo protilátky proti IgE 1 hod při 37 °C. Potom byly destičky opláchnuty a byly odstraněny interferující látky. Nakonec byla vazba histaminu na mikrovlákna měřena spektrofluorometricky.

Vlastnosti mutantních proteinů Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637) z hlediska uvolňování histaminu

Údaje týkající se uvolňování histaminu jsou ukázány na obr. 22 a obr. 23. Byla testována schopnost mutantních proteinů Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637) indukovat uvolňování histaminu lidskými bazofily u dvou pacientů alergických na pyl břízy. V obou případech je křivka uvolňování mutovaných alergenů pro indukci uvolňování histaminu jasně posunuta doprava ve srovnání s křivkou uvolňování Bet v 1.2801. Posun ukazuje, že schopnost Bet v 1 (2628) a Bet v 1 (2637) je snížena 3 až 10 x.

Mutanta Bet v 1 (2744) a mutanta Bet v 1 (2753)

Bet v 1 (2744) a Bet v 1 (2753) byly podobně konstruovány pro použití jako směsná alergenová vakcina. U těchto mutantních alergenů byly rozloženy bodové mutace po celém povrchu, jak je ukázáno na obr. 24 a obr. 25, a návrh byl opět proveden tak, aby byly ovlivněny rozdílné plochy povrchu těchto dvou molekul, jak je ukázáno na obr. 26. Tyto modifikované alergeny by však mohly být použity i jednotlivě jako jednoalergenní vakciny.

- 98 Strukturní analýza mutantního proteinu Bet v 1 (2744)

Strukturní integrita čištěné mutanty Bet v 1 (2744) byla analyzována spektroskopií cirkulárním dichroismem (CD). Obr. 27 ukazuje CD spektra rekombinantního Bet v 1.2801 (standardní typ) a mutanty Bet v 1 (2744) zaznamenaná při téměř stejných koncentracích. Překrytí amplitud a poloh vrcholů v CD spektrech dvou rekombinantních proteinů ukazuje, že dva preparáty obsahují stejná množství sekundárních struktur, což silně ukazuje na to, že zavedením aminokyselinových substitucí není narušena terciární struktura auhlíkaté kostry.

Vlastnosti Bet v 1 (2744) z hlediska uvolňování histaminu

Údaje týkající se uvolňování histaminu z pěti experimentů s bazofilními leukocyty pěti různých pacientů alergických na pyl břízy jsou ukázány v obr. 28 a obr. 29A-D. Byla testována schopnost mutantního proteinu Bet v 1 (2744) indukovat uvolňování histaminu v lidských bazofilech. Křivky uvolňování mutovaných alergenů jsou jasně posunuty doprava ve srovnání s křivkami uvolňování Bet v 1.2801, což ukazuje, že schopnost Bet v 1 (2744) uvolňovat histamin je snížena 3 až 5 x.

Mutanta Bet v 1 (2733)

Byla zkonstruována a rekombinantně exprimována mutanta Bet v 1 (2733) s devíti primárními mutacemi. Distribuce bodových mutací v Bet v 1 (2733) nechává nezměněných několik povrchových oblastí tvořících plochu >400 Á (1Á = 0,1 nm²) (1Á = 0,1 nm²) = 0,01nm²). Obr. 30 ukazuje zavedené bodové mutace na molekulárním povrchu Bet v 1 (2733).

-99-.

Příklad 5

Tento příklad popisuje klonování genu kódujícího Der p 2 Dermatophagoides pteronyssinus a konstrukci mutant se sníženou vazebnou afinitou IgE. Produkty amplifikované PCR ze syntézy prvního řetězce cDNA z RNA Dermatophagoides pteronyssinus byly získány od Dr. Wendy-Anne Smith a Dr. Wayne Thomas (TVW Telethon Institute for Child Health Research, 100 Roberts Rd, Subiaco, Western Australia 6008). Při amplifikaci knihovny prvního řetězce cDNA byl Der p 2 selektivně amplifikován použitím primerů specifických pro Der p 2. Fragmenty PCR byly potom klonovány do místa Bam Hl pUC19 (New England BioLabs). Sekvenování DNA Der p 2 bylo provedeno použitím pro vektor specifických primerů pozitivního (5’-GGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG-3’) a negativního (5’-GGARACAGCTATGACCATGATTACGCC-3’).

Bylo identifikováno celkem sedm jedinečných isoforem Der p 2 označených ALK-101, ALK-102, ALK-103, ALK-104, ALK-113, ALK114 a ALK120. Jako zahajovací pro tvorbu mutant IgE s nízkou afinitou byl zvolen klon označený ALK-114 pro jeho vysokou sekvenční identitu se strukturou Der p 2 NMR s databází s depozitním číslem 1A9V. Ve srovnání s ALK-114 obsahuje šest dalších v přírodě se vyskytujících isoforem následující substituce:

ALK-101:	M76V
ALK-102:	V40L, T47S
ALK-103:	M111L, D114N
ALK-104:	T47S, M111I, D114N
ALK-113:	T47S
ALK-120:	V40L, T47S, D114N

- 100 ,:

Vložení Der p 2 di pGAPZa-A

Gen kódující Der p 2 (ALK-114) byl potom vložen do vektoru pGAPZa-A (Invitrogen) pro sekrenovanou expresi Der p 2 v kvasince Pichia pastorís. Gen byl amplifikován použitím pozitivního (sense) primerů OB27 (5’-GGAATTCCTCGAGGAGATCAAGTCGATGTCAAAGATTGTGCC-3’) a negativního primerů (anti-sense) OB28 (5’CGTTCTAGACTATTAATCGCGGATTTTAGCATGAGTTGC-3’) odpovídajících aminovému, popřípadě karboxylovému konci polypeptidů Der p 2. Primery byly prodlouženy na 5’-konci tak, aby obsahovaly restrikční místa Xho I, popř. Xba I. Restrikční místo Xho I fuzuje první kodon Der p 2 ve čtecím rámci se sekvencí nukleové kyseliny kódující štěpící místo KEX2 (LYS-ARG) pGAPZot-A. Byl proveden jeden cyklus amplifikace PCR v objemu 100 pl: 0,1 mg templátů ALK-114 DNA, 1 x pufr Expand polymerase buffer (Boehringer Mannheim), 0,2 mM každý ze čtyř dNTP, 0,3 μΜ každý z pozitivního a negativního primerů a 2,5 jednotek polymerázy Expand polymerase (Boehringer Mannheim). DNA byla amplifikována pomocí 25 následujících cyklů: 95 °C 15 s, 45 °C 30 s, 72 °C 1 min, a potom následoval jeden cyklus 72 °C 7 min. Výsledný fragment o délce 475 bp ALK-114 byl purifikován postupem QIAquick spin purification proceduře (Qiagen). Čištěný fragment DNA byl potom štěpen Xho I a Xba I, čištěn na gelu a vložen do podobně štěpeného pGAPZa-A. Ligační reakce byla převedena do kmene E. coli DH5a, za získání plasmidu pCBo06.

Nukleotidová sekvence Der p 2 byla potvrzena sekvenováním DNA před a po klonování a po mutagenezi in vitro (viz dále).

Sekvence Der p 2

SEQ ID No. 1 odpovídá sekvenci nukleové kyseliny Der p 2 (ALK-114):

-101-.;· ' ·, , 1 I -, , gatcaagtcgatgtcaaagaixgtgccaa tcatgaaatcaaaaaagtttfcggtaccagga 61 tgccatggttcagaaccatgtatcattcatcgtggfcaaaccattccaattggaagccgtt 121 ttcgaagccaaccaaaacacaaaaaccgctaaaattgaaa t caaagcctcaatcgatggt 181 ttagaagttgatgttcccggtatccatccaaatgcatgccattacatgaaatgcccattg 241 gttaaaggacaacaatatgatattaaatstacatggaatgttccgaaaattgcaccaaaa 301 tctgaaaatgttgtcgtcactgttaaacttatgggtgatgatggtgttttggcctgtgct 361 attgctactcatgctaaaatccgcgattaa

SEQ ID No. 2 odpovídá dedukované aminokyselinové sekvenci Der p 2 (ALK-114):

dqvGvkdcanheikkvlvpgc-gsepciihrgkpfqleavf eanqntktakieikasidg 61 levdvpgidpnachymkcplvkgccydikytwnvpkiacks envwtvkvmgddgvlaca 121 iathakird

Vložení pGAPZa-A-Per p 2 do P. pastoris

Vektor pCBo06 byl linearizován použitím restrikčního enzymu Avr II a transformován do kompetentního kmene P. pastoris X-33, jak se popisuje v manuálu Invitrogen. Rekombinantní buňky rezistentní na 100 pg/ml Zeocinu byly vybrány a kolonie byly čištěny na čerstvých plotnách YPD obsahujících 100 pg/ml Zeocinu.

Exprese a purifikace rekombinantního Der p 2

250 ml média YPD (1% kvasničný extrakt, 2% pepton, 2% glukóza) obsahujícího 100 pg/mi Zeocinu bylo zaočkováno kulturou rekombinantních kvasinkových buněk exprimujících Der p 2 narostlou přes noc. Kultura byla pěstována při 30 °C 72 hodin pro získání optimální exprese Der p 2. Buňky byly sklizeny centrifugací a získaný kultivační supernatant byl nasycen 50% síranem amonným. Po centrifugací při 3000 x g 30 min byi supernatant nasycen 80% síranem amonným. Po centrifugací byl centrifugát resuspendován ve 150 mM

- 102

NH4HCO3 a frakcionován na gelové filtrační koloně Superdex 75 ekvilibrované stejným pufrem. Der p 2 byl eluován jako hlavní vrchol odpovídající očekávané molekulové hmotnosti. Eluce Der p 2 byla monitorována jak elektroforézou SDS PAGE s barvením stříbrem, tak analýzou imunitním přenosem použitím specifických polyklonálních protilátek Der p 2.

Volba aminokyselinových zbytků pro místně specifickou mutagenezi

Volba aminokyselinových zbytků pro mutagenezi byla založena na identifikaci zbytků, které jsou ve velké míře vystaveny rozpouštědlu a jsou vysoce konzervovány mezi alergeny roztočů domácího prachu (Der p 2/f 2 a Eur m 2) a roztočů ničivých (Tyr p 2, Lep d 2, Gly d 2). Aminokyselinové zbytky s vysokou expozicí rozpouštědlu byly identifikovány vizuálně analýzou molekulárního povrchu NMR struktury Der p 2 (# 1,9, 1A9V. pdb). Pro mutagenezi bylo vybráno dvanáct aminokyselinových zbytků: K6A, N10S, K15E, S24N, H30N, K48A, E62S, H74N, K77N, K82N, K100N a R128Q.

Místně specifická mutageneze

Konstrukce rekombinantních mutantních alergenů s jednou primární mutací a jejich vícečetnými kombinacemi se popisují v následující části.

Byly vytvořeny expresní plasmidy kódující mutanty Der p 2 s použitím pCBo06 jako templátu DNA. Reakce PCR byly prováděny použitím pozitivních a negativních primerů obsahujících specifikované mutace. Páry primerů použitých při reakcích PCR pro tvorbu specifikovaných mutací jsou uvedeny v obr. 31. Mutace jsou označeny tučně a restrikční místa použitá při náseldném kroku klonování jsou na obrázku podtržena. Pro konstrukci mutant K6A, K15E, H30N, H74N a K82N, byly prováděny reakce PCR v podstatě stejně jako bylo

- 103 popsáno v části „Klonování Der p 2 do pGAPZa-A“. Čištěné fragmenty PCR byly štěpeny v navržených místech restrikčních enzymů (viz obr. 31), čištěny na gelu, vloženy do podobně štěpeného pCBo06 a transformovány do E. coli DH5a.

Mutace E62S byla vytvořena použitím alternativní metodologie PCR mutageneze popsané pro tvorbu mutant Bet v 1 v příkladu 1. Byly syntetizovány dva oligonukleotidové primery specifické pro mutace pokrývající uvedené mutace (OB47 a OB48, ukázáno na obr. 31). Pro krok sekundární amplifikace byly použity dva další primery OB27 a OB28, jak se popisuje v části „Vložení Der p 2 do pGAPZa-X“.

Vytvořené mutantní alergeny se charakterizují použitím stejných metod jako bylo popsáno v příkladu 4, např. spektroskopie cirkulárním dichroismem (CD), krystalizace, měření vazebných vlastností IgE, uvolňování histaminu, schopnost stimulovat proliferaci T-buněk atd.

Příklad 6

Mutované rekombinantní alergeny roztočů (Der p 2) se zlepšenou bezpečností pro specifickou protialergickou vakcinaci

V tomto příkladu se použití konceptu předkládaného vynálezu ukazuje na alergenech roztočů domácího prachu, přičemž jako příklad se používá jeden alergen Der p 2. Postupy používané pro jiné alergeny roztočů domácího prachu se mohou provádět stejnými postupy.

Návrh mutovaných rekombinantních molekul Der p 2

SEQ ID No. 3 ukazuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci klonu Der p 2-ALK-G, což je isoforma standardního typu.

- 104 SEQ ID No. 3: Nukleotidové a dedukovaná aminokyselinová sekvence Der p 2-ALK-G.

GAT D

CAA Q

GTC V

GAT D

GTC V

AAA K

GAT D

TGT C

GCC A

AAT N

CAT H

GAA E

ATC X

AAA K

AAA K

15

45

GTT

TTG

GTA

CCA

GGA

TGC

CAT

GGT

TCA

GAA

CCA

TGT

ATC

ATT

CAT

90

V

L

V

P

G

C

H

G

S

E

P

C

I

T

H

30

CGT

GGT

AAA

CCA

TTC

CAA

TTG

GAA

GCT

TTA

TTC

GAA

GCC

AAT

CAA

135

R

G

K

P

r

Q

L

E

A

L

F

E

A

N

Q

45

AAC

TCA

AAA

ACA

GCT

AAA

ATT

GAA

ATC

AAA

GCT

TCA

ATC

GAT

GGT

180

N

3

K

T

A

K

I

E

I

K

A

S

I

D

G

60

TTA

GAA

GTT

GAT

GTT

CCC

GGT

ATC

GAT

CCA

AAT

GCA

TGC

CAT

TAT

225

L

E

V

D

V

?

G

I

D

P

N

A

C

H

Y

75

ATG

AAA

TGT

CCA

TTC-

GTT

AAA

GGA

CAA

CAA

TAT

GAT

ATT

AAA

TAT

270

M

K

C

P

L

V

K

G

Q

Q

Y

D

T

K

Y

90

ACA

TGG

AAT

GTT

CCA.

AAA

ATT

GCA

CCA

AAA

TCT

GAA

AAT

GTT

GTC

105

315

T

W

N

V

P

K

I

A

P

K

s

E

N

V

V

GTC

ACT

GTT

AAA

GTT

TTG

GGT

GAT

AAT

GGT

GTT

TTG

GCC

TGT

GCT

360

V

T

V

K

V

L

G

D

N

G

V

L

A

C

A

120

ATT

GCT

ACT

CAT

GCT

AAA

AIC

CGC

GAT

387

I

A

T

H

K

I

R

D

129

Obr. 32 ukazuje porovnání sekvencí provedených na serveru ExPaSy Molecular Biology Server (http://www.expasy.ch/) s použitím algoritmu ClustalW na vyhledávací program BLAST s použitím aminokyselinové sekvence Der p 2-ALK-G ukázané v SEQ ID No. 3 jako vstupní sekvence. Porovnání zahrnuje sekvence druhů roztočů domácího prachu, tj. Der p 2, Der f 2 a Eur m 2. Na obr. 32 jsou zbytky aminokyselin identické s aminokyselinami ve stejné poloze proteinové sekvence Der p 2-ALK-G zvýrazněny použitím černých písmen na šedém pozadí. Neidentické aminokyseliny jsou vytištěny černě na bílém pozadí.

Zobrazen? povrchové struktury

Aminokyselinové sekvence reprezentující skupinu 2 alergenů roztočů domácího prachu mají podobnost vyšší než 85 % a některé

- 105 části molekulárního povrchu jsou konzervované (šedě zbarvené zóny), viz obr. 33.

Obr. 33 ukazuje obrys povrchu ze čtyř různých úhlů při superpozici proteinové sekvence Der p 2-ALK-G na publikovanou strukturu NMR PDB: 1A9V číslo 1 z 10 obsažených v souboru PDB.

Pro mutaci se volí konzervované aminokyseliny s vysokou expozicí rozpouštědlu, které jsou prostorově rozloženy po celém povrchu ve vzdálenostech v rozmezí 25 až 30 A (1Á = 0,1 nm). V následujících částech se poskytují následující informace: Seznam aminokyselin považovaných za vhodné pro mutaci (A), seznam navrhovaných mutací (B) a sekvence DNA reprezentující navržené mutanty (C). Obr. 34 ukazuje povrchové kontury mutanty č. 1 jako příklad. Šedá barva ukazuje konzervované aminokyselinové zbytky. Černá barva označuje aminokyselinové zbytky vybrané pro mutaci.

A. Seznam aminokyselin zvolených pro mutaci

K15, S24, H30, R31, K48, E62, H74, K77, K82, K100, R128

B. Seznam navržených mutantů

Mutanta 1:

K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, X77N, K82N, K100N Mutanta 2:

K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, R128Q

Mutanta 3:

K15E, S24N, H30G, K48A, K77N, K82N, K100N, R128Q Mutanta 4:

K15E, S24N, H30G, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q

- 106 Mutanta 5:

K15E, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q

Mutanta 6:

S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q

Mutanta 7:

K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N

Mutanta 8:

K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, R128Q

Mutanta 9:

K15E, S24N, R31S, K48A, H74N, K82N, K100N, R128Q

Mutanta 10:

K15E, S24N, R31S, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q

Mutanta 11:

K15E, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q

Mutanta 12:

S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q

C. Nukleotidová sekvence mutant

Mutanta 1

K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatg

AACtgtccattggttAACggacaacaafcatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat

- 107 Mutanta 2

K15E, S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, R126Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAActtttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaafccaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatg

AACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutanta 3

K15E, S24N, HGOG, K48A, K77N, K82N, K100N, R12 3Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttafctcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttagaagttgatgttcccagfatcgatccaaatgcatgccattatatg

AACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgtígtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCA.Ggat

Mutanta 4

K15E, S24N, K30G, Eo2S_z K77N, K32N, K100N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAA-gttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaaaaacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccgctatcgatccaaatgcatgccattatatg

AACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgítgacgtcactgttaaagttřtgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat.

- 108 Mutanta 5

K15E, H30G, K48A, E62S, K77N, K82N, K100N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggttcagaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatg AACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaa ttgcaccaAAC tet gaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutanta 6

S24N, H30G, K48A, E62S, K77N, XS2N, K100N, R12SQ

Gatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattGGCcgtggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgccattatatg

AACtgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat.

Mutanta 7

K15E, S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatccgcgat

- 109 Mutanta 8

K15E, S24N, R3ÍS, K48A, E62S, H74N, K82N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaaaatctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagtťttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutanta 9

K15E, S24N, R3ÍS, K48A, H74N, K82N, K100N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcaagaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaafccaaagcttca atcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttaggtgataat ggtgttttggcctgtgcfcattgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutanta 10

K15E, S24N, R31S, E62S, H74N, K32N, K100N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttagaagttgatgttcccggtatcgatccaaatgca.tgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcstgctaaaatcCAGgat

-110Mutanta 11

K15E, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q

GatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaGAAgttttggtacca ggatgccatggttcagaaccafcgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaatgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat

Mutanta 12

S24N, R31S, K48A, E62S, H74N, K82N, K100N, R128Q

Gatcaagtcgatgtcaaagattgtgccaatcatgaaatcaaaaaagttttggtacca ggatgccatggtAACgaaccatgtatcattcatAGCggtaaaccattccaattggaa gctttattcgaagccaatcaaaactcaGCGacagctaaaattgaaatcaaagcttca atcgatggtttaAGCgttgatgttcccggtatcgatccaaatgcatgcAACtatatg aaatgtccattggttAACggacaacaatatgatattaaatatacatggaatgttcca aaaattgcaccaAACtctgaaaafcgttgtcgtcactgttaaagttttgggtgataat ggtgttttggcctgtgctattgctactcatgctaaaatcCAGgat ) ϊ >

- 111 Příklad 7

Mutované rekombinantni alergeny roztočů (Der p 1) se zlepšenou bezpečností pro specifickou protialergickou vakcinaci

V tomto příkladu se ukazuje koncept předkládaného vynálezu na jednom alergenu z alergenů roztočů domácího prachu, Der p 1. Postupy s jinými alergeny roztočů domácího prachu se mohou provádět ekvivalentním způsobem.

Návrh molekul mutovaného rekombinantního Der p 1

SEQ ID No. 4 ukazuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci klonu Der p 1-ALK, což je isoforma standardního typu.

SEQ ID No. 4: Nukleotidová a dedukovaná aminokyselinová sekvence Der p 1-ALK

ACT T

AAC N

GCC A

TGC C

AC-T S

ATC I

AAT N

GGA G

AAT GCT

CCA 3

GCT A

GAA ATC

GAT D

15

45

N

A

ε

I

TTG

CGA

CAA

ATG

CGA

ACT

GTC

ACT

ccc

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

90

L

R

Q

M

R

T

V

T

P

T

R

M

Q

G

G

30

TGT

GGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

135

C

G

S

C

M

A

F

S

G

V

A

A

T

ε

S

45

GCT

TAT

TTG

GCT

TAC

CGT

AAT

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

180

A

Y

L

A

Y

R

N

Q

S

T.

D

L

A

E

Q

60

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

TCC

CAA

CAC

GGT

TGT

CAT

GGT

GAT

ACC

225

ε

L

V

D

C

A

S

Q

H

G

C

H

G

D

T

75

ATT

CCA

CGT

GGT

ATT

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA

270

I

P

R

C-

I

E

Y

T

Q

v

N

G

V

V

Q

90

GAA

AGC

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

CGA

GAA

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

315

E

S

Y

v

R

Y

V

A

R

ε

Q

S

C

R

R

105

CCA

AAT

GCA

CAA

CGT

TTC

GGT

ATC

TCA

AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

TAC

360

E

N

A

Q

R

F

G

X

S

H

v

C

Q

I

Y

120

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CGT

GAA.

GCT

TTG

GCT

CAA

ACC

CAC

4 05

P

P

N

V

N

K

X

R

ε

A.

í

A

Q

T

H

135

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

450

S

A

I

A

V

I

I

G

I

K

0

L

D

A

F

150

CGT

CAT

TAT

GAT

GGC

CGA

ACA

ATC

ATT

CAA

CGC

GAT

AAT

GGT

TAC

495

R

H

Y

D

G

R

T

X

I

Q

R

D

N

G

Y

1SS

CAA

CCA

AAC

TAT

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

- 112 -

Q

P

N

Y

H

A

V

N

I

V

G

Y

s

N

A

180

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AGT

TGG

GAT

ACC

AAT

585

Q

G

V

D

Y

W

I

V

R

N

5

W

D

T

N

195

TGG

GGT

GAT

AAT

GGT

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

TTG

630

W

G

D

N

G

Y

G

Y

F

A

A

N

I

D

L

'210

ATG

ATG

ATT

GAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

ATT

CTC

666

M

M

I

ε

E

v

P

Y

V

V

I

L

222

Obr

. 35

ukazuje

porovnán

i sekvencí

provedené na serveru

ExPaSy Molecular Biology Server (http://www.expasy.ch/) s použitím algoritmu ClustalW na vyhledávacím programu BLAST použitím aminokyselinové sekvence Der p 1-ALK ukázané v SEQ ID No. 4 jako vstupní sekvence. Porovnání zahrnuje sekvence druhů roztočů domácího prachu, tj. Der p 1, Der f 1 a Eur m 1. V obr. 35 jsou aminokyselinové zbytky identické s aminokyselinami ve stejné poloze proteinové sekvence Der p 1-ALK zvýrazněny použitím černých písmen na šedém pozadí. Neidentické aminokyseliny jsou vytištěny černě na bílém pozadí.

Zobrazení povrchové struktury

Aminokyselinové sekvence reprezentující skupinu 1 alergenů roztočů domácího prachu jsou do určité míry podobné a některé části molekulárního povrchu jsou konzervované (šedě zbarvené zóny), viz obr. 36. Obr. 36 ukazuje kontury povrchu pozorované ze čtyř různých úhlů při superpozici proteinové sekvence Der p 1-ALK na model molekulární struktury Derp 1.

Pro mutaci jsou vybrány konzervované aminokyseliny s vysokou expozicí rozpouštědlu prostorově rozložené po celém povrchu ve vzdálenosti v rozmezí 25 až 30 A (1A = 0,1 nm). V následujících částech se uvádějí tyto informace: seznam aminokyselin považovaný za vhodný pro mutace (A), seznam navržených mutací (B) a sekvence DNA reprezentující navržené mutace (C). Obr. 37 ukazuje povrchové obrysy mutanty č. 11 jako příklad.

-¹¹³- γ. ' ,^{1 : ;}

Šedá barva označuje konzervované aminokyselinové zbytky. Černá barva označuje aminokyselinové zbytky vybrané pro mutaci.

A. Seznam aminokyselin vybraných pro mutace

E13, P24, R20, Y50, S67, R78, R99, Q109, R128, R156, R161, P167, W192

B. Seznam navržených mutant

Mutanta 1:

P24T, Y50V, R78E, R99Q, R156Q, R161E, P167T

Mutanta 2:

P24T, Y50V, R78Q, R99E, R156E, R161Q, P167T

Mutanta 3:

R20E, Y50V, R78Q, R99Q, R156E, R161E, P167T

Mutanta 4:

R20Q, Y50V, R78E, R99E, R156Q, R161Q, P167T

Mutanta 5:

P24T, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161Q, P167T

Mutanta 6:

R20E, Y50V, S67N, R99E, R156Q, R161E, P167T

Mutanta 7:

R20Q, Y50V, S67N, R99Q, R156E, R161E, P167T

Mutanta 8:

E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T

114

Mutanta 9:

E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T

Mutanta 10:

E13S, P24T, Y50V, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T, W192F

Mutanta 11:

E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, P167T, W192F

C. Nukleotidová sekvence mutant

Mutanta 1

P24T, Y50V_z R78E, R99Q_Z R156Q_Z R161E, P167T

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

CCA

GCT

GA.A

ATC

GAT

TTG

CGA

CAA

rtTG

CGA

60

ACT

GTC

ACT

ACC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

1 * ΦΙ r.-.„

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

ISO

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

TCC

CAA

CAC

GGT

TGT

GGT

GAT

ACC

ATT

CCA

GAA

GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA

i-A

A2C

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

CAG

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA

AAT

GCA

CAA

CGT

TTC

GGT

ATC

TCA

AAC

TAT

TC-C

CAA

ATT

TAC

360

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CGT

GAA

GCT

TTG

GCT

CAA

ACC

CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

CAT

TAT

GAT

GGC

CAG

ACA

ATC

ATT

CAA

430

GAA

GAT

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

'TGG

ATC

C-TA

CGA

AAC

AGT

TGG

GAT

ACC

AAT

TGG

GGT

GAT

AAT

GGT

SOO

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

TTG

ATG

ATT

GAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

660

ATT CTC 666

Mutanta 2

P24T_Z Y50V_z R78Q_Z R99E_z R156E, R161Q, P167T

ACT AAC GCC TGC AGT ATC AAT GGA. AAT GCT CCA GCT GAA ATC GAT TTG CGA CAA ATG CGA SO

115

ACT

GTC

ACT

ACC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

GGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

AAT

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

180

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

TCC

CAA

CAC

GGT

TGT

CAT

GGT

GAT

ACC

ATT

CCA

CAG

GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA

GAA

AGC

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

GAA

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA

AAT

GCA

CAA

CGT

TTC

GGT

ATC

TCA

AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

TAC

360

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CGT

GAA

GCT

TTG

GCT

CAA

ACC

CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

CAT

TAT

GAT

GGC

GAA

ACA

ATC

ATT

CAA

480

CAG

GAT

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AGT

TGG

GAT

ACC

AAT

TGG

C-GT

GAT

AAT

GGT

600

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

C-CC

AAC

ATC

GAT

TTG

ATG

ATG

ATT

GAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

660

ATT

CTC

666

Mutanta 3

R20E,	Y50V,	, R78Q, R99Q,	R156E, R161E,	P167T
ACT AAC	GCC TGC	AGT ATC AAT GGA AAT	GCT CCA GCT GAA ATC	GAT TTG CGA CAA ATG GAA 60
ACT GTC	ACT CCC	ATT CGT ATG CAA GGA	GGC TGT GGT TCA TGT	TGG GCT TTC TCT GGT GTT 120
GCC GCA	ACT GAA	TCA GCT TAT TTG GCT	GTG CGT AAT CAA TCA	TTG GAT CTT GCT GAA CAA 180
GAA TTA	GTC GAT	TGT C-CT TCC CAA CAC	GGT TGT CAT GGT GAT	ACC ATT CCA CAG GGT ATT 24 0
GAA TAC	ATC CAA	CAT AAT GGT GTC GTC	CAA GAA AGC TAC TAT	CGA TAC GTT GCA CAG GAA 300
CAA TCA	TGC CGA	CGA CCA AAT GCA C.AA	CGT TTC GGT ATC TCA	AAC TAT TGC CAA ATT TAC 360
CCA CCA	AAT GTA	AAC AAA. ATT CGT GAA	GCT TTG GCT CAA ACC	CAC AGC GCT ATT GCC GTC 420
ATT ATT	GGC ATC	AAA GAT TTA GAC GCA	TTC CGT CAT TAT GAT	GGC GAA ACA ATC ATT CAA 4 80
CAG GAT	AAT GGT	TAC CAA ACC AAC TAT	CAC GCT GTC AAC ATT	GTT GGT TAC AGT AAC GCA 540
CAA GGT	GTC GAT	TAT TGG ATC GTA CGA	AAC AGT TGG GAT ACC	AAT TGG GGT GAT AAT GGT 600
TAC GGT	TAT TTT	GCT GCC AAC ATC GAT	TTG ATG ATG ATT GAA	GAA TAT CCA TAT GTT GTC 660

ATT CTC 666

Mutanta 4

R20Q, Y50V, R78E, R99E_Z R156Q, R161Q, P167T

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

CCA

GCT

GAA

ATC

GAT

TTG

CGA

CAA

ATG

CAG

60

ACT

GTC

ACT

CCC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

GGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

AAT

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

180

116

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

TCC

CAA

CAC

GGT

TGT

CA?

C\J i,

GAT

ACC

ATT

CCA

GAA

•GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA

GAA

AGC

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

GAA

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA

AAT

GCA

CAA

CGT

TTC

GGT

ATC

TCA

A.AC

TAT

TGC

CAA.

ATT

TAC

3G0

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CGT

GAA

GCT

TTG

GCT

CAA

ACC

CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

CAT

GAT

GGC

CAG

ACA

ATC

ATT

CAA

480

CAG

GAT

AA.T

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

GCT

G?C

r.-.C

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AGT

TGG

GAT

ACC

AAT

TGG

GGT

GAT

AA.T

GGT

500

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

TTG

ATG

ATG

.·<* -

GAA

GaA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

660

ATT CTC 655

Mutanta 5

P24T, Y50V, SG7N, R99E, R15SQ, RLólQ, P167T

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

CCA

GC?

GAA

ATC GAT

TTG

CGA

CAA

ATG

CGA

60

ACT

GTC

ACT

ACC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

TCA

TC-? TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

r»«\i

CAA

^TG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

180

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

AAC

CAA

CAC

GGT

TGT

CA?

•T-GT

C-AT ACC

ATT

CCA

CGT

GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA

GAA

AG?

T.AC

TAT CGA

TAC

GTT

GCA

GAA.

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA

AAT

GCA

CAA

CGT

TTC

GG?

ATC

TCA AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

TAC

360

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CGT

GAA

GCT

TTG

GC?

CAA

ACC CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

TAT

GAT GGC

CAG

ACA

ATC

ATT

CAa

480

CAG

GAT

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

GTC

rAC

ATT GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AG?

TC-G

GA?

ACC AAT

TGG

GGT

GAT

AAT

GG?

600

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

TTG

ATG

ATT-

ATT

GAA GAA

TAT

CCA

Φη.φ

GTT

GTC

650

ATT

CTC

666

Mutanta 6

R20E, Y50V, SS7N, R99E, R156Q, R'_51E, P167T

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

CCA

GAA

ATC

GAT

TTG

CGA

CAA

ATG

GAA

60

ACT

GTC

ACT

CCC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

C-C-7

CCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

120

GCC

GCA

ACT

GAA.

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

» - í-4

CAA

CCA

TTG

GAT

CTT

GCT

3AA

CAA

180

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

AAC

CAA

CAC

GGT

GGT

GA?

ACC

ATT

CCA

CGT

GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA

GAA

AG··*

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

GAA

GAA

300

- 117 -

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA

AAT

GCA

CAA

CG7

TTC

GGr'

ATC

TCA

AAC

řTX

TGC

CAA.

ATT

TAC

360

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CGT

GAA

GCT

TTG

GCT

CAA

ACC

CAC

AC-C

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

CAT

TAT

GAT

GGC

CAG

ACA

ATC

ATT

CAA

490

GAA

GAT

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

C-CT

GTC

AAC

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

ríGT

TGG

GAT

ACC

AAT

TGG

GGT

GAT

AAT

GGT

600

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

TTG

ATG

ATG

ATT

GAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

660

ATT CTC 666

Mutanta 7

R20Q, Y50V, S67N, R99Q, RLČcE, R161E, P167T

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

CCA

GCT

GAA

ATC

GAT

TTC-

CGA

CAA.

ATG

CAG

60

ACT

GTC

ACT

CCC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

GGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

AAT

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

160

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

AAC

CAA

CAC

GGT

TGC

CA.T

GGT

GAT

ACC

ATT

CCA

CGT

GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA.

GAA.

AGC

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA.

CAG

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA.

AAT

GCA

CAA

CGT

TTC

GGT

ATC

TCA

AAC

TAT

TC-C

CA.A

ATT

TAC

360

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CGT

GAA

GCT

TTC-

GCT

CAA

ACC

CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

CAT

TAT

GAT

GGC

GAA

ACA

ATC

ATT

CAA

480

GAA

GAT

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CA.C

C-CT

GTC

AAC

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TC-G

ATC

GTA

CGA

AA.C

AGT

TGG

GAT

ACC

AAT

TGG

GGT

GA.T

AAT

GGT

600

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

ATG

ATT

GAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

660

ATT CTC 666

Mutanta 8

E13S, P24T, Y50V, R78E, E5SQ, Q1Q9D, R128E, R156Q, R161E, P167T

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

C CA C CT

AGC

ATC

GAT

TTG

CGA

CAA

ATG

CGA

60

ACT

GTC

ACT

ACC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA.

TCA

GCT

TA.T

TTG

GCT

GTG

CCC AAT

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

180

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

TCC

CAA

CAC

GGT

TGT CAT

GGT

GAT

ACC

ATT

CCA

GAA

GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA

Gr·.“. Λ1.*'-

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

CAG

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA

AAT

GCA

GAT

CGT

TTC GGT

ATC

TCA

AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

TAC

360

118

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

GAA

GAA

GCT

TTG

GCT

CAA

ACC

CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

CAT

TAT

GAT

GGC

CAG

ACA

ATC

ATT

CAA

480

GAA

GAT

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AGT

TGG

GAT

ACC

AAT

TGG

GGT

GAT

AAT

GGT

600

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

TTG

ATG

ATG

ATT

GAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

660

ATT CTC 6S6

Mutanta 9

E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, R161Q, R167T

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

CCA

GCT

AGC

ATC

GAT

TTG

CGA

CAA

ATG

CGA

60

ACT

GTC

ACT

ACC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

GGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

AAT

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA'

Ί80

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

TCC

CAA

CAC

GGT

TC-T

CAT

GGT

GAT

ACC

ATT

CCA

CAG

GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA

GAA

AGC

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

GAA

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA

AAT

GCA

GAT

CGT

TTC

GGT

ATC

TCA

AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

TAC

360

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CAG

GAA

GCT

TTG

GCT

CAA

ACC

CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

CAT

TAT

GAT

GGC

GAA

ACA

ATC

ATT

CAA

430

CAG

GAT

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

54 0

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AGT

X uu

GAT

ACC

AAT

TGG

GGT

GAT

AAT

GGT

600

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

TTG

ATC-

ATG

ATT

GAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

660

ATT CTC ^ses

Mutanta 10

E13S, P24T, Y5OV, R78E, R99Q, Q109D, R128E, R156Q, R161E, P167T, W192F

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

CCA

GCT

AGC

ATC

GAT

TTG

CGA

CAA

ATG

CGA

60

ACT

GTC

ACT

ACC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

GGT

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

AAT

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

180

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

TCC

CAA

CAC

GGT

TGT

CAT

GGT

C-AT

ACC

ATT

CCA

GAA

GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CAA

GAA

AGC

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

CAG

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA

AAT

GCA

GAT

CGT

TTC

GGT

ATC

TCA

AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

TAC

350

- 119 -

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

GAA

GAA

GCT

TTG

GC?

CAA

ACC

CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CGT

CAT

TAT

GAT

GGC

CAG

ACA

ATC

ATT

CAA

480

GAA

GAT

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAC

GCT

GTC

AAC

ATT

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AGT

TTT

GAT

ACC

AAT

TGG

GGT

GAT

AAT

GGT

600

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

TTG

ATG

ATG

ATT

GAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

660

ATT CTC sss

Mutanta 11

E13S, P24T, Y50V, R78Q, R99E, Q109D, R128Q, R156E, RI61Q, P167T, W192F

ACT

AAC

GCC

TGC

AGT

ATC

AAT

GGA

AAT

GCT

CCA

GGT

AGC

ATC

C-AT

TTG

CGA

CAA

ATG

CGA

€0

ACT

GTC

ACT

ACC

ATT

CGT

ATG

CAA

GGA

GGC

TGT

GG“^

TCA

TGT

TGG

GCT

TTC

TCT

GGT

GTT

120

GCC

GCA

ACT

GAA

TCA

GCT

TAT

TTG

GCT

GTG

CGT

1 i Ή

CAA

TCA

TTG

GAT

CTT

GCT

GAA

CAA

1Θ0

GAA

TTA

GTC

GAT

TGT

GCT

TCC

CAA

CAC

GGT

TGT

G.-,.

C-GT

GA?

ACC

ATT

CCA

CAG

GGT

ATT

240

GAA

TAC

ATC

CAA

CAT

AAT

GGT

GTC

GTC

CPA

GAA

AGG

TAC

TAT

CGA

TAC

GTT

GCA

GAA

GAA

300

CAA

TCA

TGC

CGA

CGA

CCA

AAT

GCA

GAT

CGT

TTC

ATC

TCA

AAC

TAT

TGC

CAA

ATT

TAC

360

CCA

CCA

AAT

GTA

AAC

AAA

ATT

CAG

GAA

GCT

•TTG

GCT

CAA

ACC

CAC

AGC

GCT

ATT

GCC

GTC

420

ATT

ATT

GGC

ATC

AAA

GAT

TTA

GAC

GCA

TTC

CC-T

GAT

TAT

GA a

GC-C

GAA

ACA

ATC

ATT

CAA

480

CAG

GAT

AAT

GGT

TAC

CAA

ACC

AAC

TAT

CAG

GCT

GTC

AAC

GTT

GGT

TAC

AGT

AAC

GCA

540

CAA

GGT

GTC

GAT

TAT

TGG

ATC

GTA

CGA

AAC

AG?

TTT

GAT

ACw

AAT

TGG

GGT

GAT

AAT

GGT

600

TAC

GGT

TAT

TTT

GCT

GCC

AAC

ATC

GAT

TTG

A”G

ATT

GAA

GAA

TAT

CCA

TAT

GTT

GTC

660

ATT CTC 666

Příklad 8

Mutované rekombinantní alergeny trav (Phl p 5) se zlepšenou bezpečností pro specifickou protialergíckou vakcinaci

V tomto příkladu je použití konceptu předkládaného vynálezu na alergenech pylů trav ukázáno na jednom alergenu, Phl p 5. Postupy pro jiné alergeny pylů trav jsou ekvivalentní.

- 120 Návrh mutovaných rekombínantních molekul Phl p 5

SEQ ID No. 5 ukazuje nukleotidovou a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci klonu Phl p 5.0103, který je isoformou standardního typu.

SEQ ID No. 5: Nukleotidové a dedukovaná aminokyselinová sekvence Phl p 5.0103 gccga tctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60

ADLGYGEATPAAPAAGYTPA 20 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120

T.PAAEAGAEPAC-KATTEEQK 40 ctga tcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttgcccgctgccgccggcgtcccg 18 0

LIEKINAGFKAAL.AAAAGVP 60 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 24 0

PADKYRTFVATEGAASNKAE 80 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300

AEGLSGEPKGAASSSSXAAL 100 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 3 60

T S KLDAAYKLAYKTAE GAT P 120 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctccgcatcatcgccggc 420

EAKYDAYVATVSEAL. RIXAG 140 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcgcccgaggaggfccaaggtcatccccgccggc 480

TLEVKAVKPAAEEVKVI PAG 160 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540

ELQVIEKVDAAFKVAATAAN 180 gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600

AAPANDKFTVFSAAFNDAIK 200 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggagaccgccgtc 660

ASTGGAYESYKEIPALEAAV 220 aaacaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720

KQAYAATVATAPEVKYTVFE 2 40 accgcactgaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcacagaaggctaccaagcccgcc 7 80

TALKKAITAMSSAQKAAKPA 260 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgctcgcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840

AAATATATAAVGAAT G A A T A 280 gctactggtggcfcacaaagtc 861

- 121 Obr. 38 ukazuje porovnání sekvence provedené na serveru ExPaSy Molecular Biology Server (http://www.expasy.ch/) s použitím algoritmu ClustalW na vyhledávacím programu BLAST s použitím aminokyselinové sekvence Phl p 5.0103 ukázané v SEQ ID No. 5 jako vstupní sekvence. Porovnání zahrnuje skupinu sekvencí pěti alergenů různých druhů trav, tj. Phl p 5, Poa p 5, Lol p 5, Hol I 5, Pha a 5, Hor v 9 a Hor v 5. V obr. 38 jsou aminokyselinové zbytky identické s aminokyselinami ve stejných polohách proteinové sekvence Phl p 5.0103 zvýrazněny použitím černých písmen na šedém pozadí. Neidentické aminokyseliny jsou vytištěny černě na bílém pozací.

Zobrazení struktury povrchu aminokyselinové sekvence reprezentující skupinu pěti alergenů pylů trav jsou do určité míry podobné a některé části molekulárního povrchu jsou konzervované (šedě zbarvené zóny), viz obr. 39. Obr. 39 ukazuje obrysy povrchu pozorované ze čtyř různých úhlů při superpozici proteinové sekvence Phl p 5.0103 na model molekulární struktury Phl p 5. Model struktury zahrnuje molekulu ve dvou polovinách, model A (aminokyseliny 34 - 142) ukázaný na obr. 39A, a model B (aminokyseliny 149 - 259) ukázaný na obr. 39B.

Pro mutaci se vybírají aminokyseliny s vysokou expozicí rozpouštědlu prostorově rozložené po celém povrchu ve vzdálenostech v rozmezí 25 - 30 A (1Á = 0,1 nm). V následujících částech se uvádějí tyto informace: seznam aminokyselin, které jsou považovány za vhodné pro mutace (A), seznam navržených mutací (B) a sekvence DNA reprezentující navržené mutanty (C). Obr. 40 A a B ukazuje jako příklad obrysy povrchu mutanty č. 1, a to jako model A, popř. model B. Šedá barva znázorňuje konzervované aminokyselinové zbytky. Černá barva ukazuje aminokyselinové zbytky vybrané pro mutaci.

- 122 A. Seznam aminokyselin vybraných pro mutaci

I45, R66, E133, R136, 1137, D186, F188, K211, P214, Q222, P232, L243, Q254

B. Seznam navržených mutant

Mutanta 1:

I45K, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutanta 2:

R66N, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutanta 3:

I45K, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutanta 4:

I45K, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutanta 5:

I45K, E133S, D186H, Q222K, L243E, Q254K

Mutanta 6:

I45K, E133S, Q222K, P232G, L243E, Q254K

Mutanta 7:

I45K, E133S, F188I, P214G, L243E, Q254K

Mutanta 8:

I45K, E133S, F188I, K211N, L243E, Q254K

Mutanta 9:

R66N, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K

Mutanta 10:

R66N, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K

- 123 Mutanta 11:

I45K, E133S, D186H, P214G, L243E, Q254K

Mutanta 12:

I45K, E133S, D186H, K211N, L243E, Q254K

Mutanta 13:

I45K, E133S, P214G, P232G, L243E, Q254K

Mutanta 14:

I45K, E133S, K211N, P232G, L243E, Q254K

C, Nukleotidové sekvence mutant

Mutanta 1

I45K, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgccgacttcaaggcggccctggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 3 00 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 3 60 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcactccgcatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaccaggtcaaggtcatccccgccggc 4 80 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgcccgaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 7 80 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 8 40 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 2

R66N, E133S, F188I, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccaaggagcagaag 120 ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaa-cccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 3 60

- 124 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaaccAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgagcaggtcaaggtcat ccccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgagcccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacg.agagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 860 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcsccgccatgtccgaaccaAAAaaggctgccaagcccacc 78 0 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 3

I45K, R136S, F188I, Q222K, L243Z, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAPAaacgccggcttcaaggccgcctcggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcgccgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacatcgccaccgtaagcgaggcgctcAGCatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcgaccgaggaggtcaaggt cat ccccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcaiccccgccctggaggccgccgtc 66 0 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggagctcaagtacactgtctttgag 72 0 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatatccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 78 0 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 84 0 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 4

I45K, I137K, F188I, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccacctaccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAáacgccggcttcaagccggccttggccgctgccgccagcgtcccg 180 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaacctacggcgcggcctccaacaaggccttc 24 0 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggccccaccgaatccagctccaaggccgcgctc 3 00 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 3 60 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctccgcAAAatcgccggc 420 a ccct cgaggt ccacgccgt ca a gcccgcgcccga gga ggt ca aggt cat ccccgccggc 4 80 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgcctccaaggtcgctgccaccaccgccaac 540 gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagtcoatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 7 20 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtcccaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 780 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgctggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 5

I4SK, E133S, D186K, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccaccaccccagctcccccggccgccggctacacccccgcc 60

- 125 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 12 0 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg ISO ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcgg.cgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 42 0 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccgac 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 54 0 gccgcccccgccaacCATaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 60 0 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAa aa aaggccat ca ccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 78 0 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 84 0 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 6

I45K, E133S, Q222K, P232G, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggcccctgccgccggcgtcccg 18 0 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcccggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacacccgagggcgcgacgcct 3 60 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 4 80 gaactgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaacgtcgctgccaccgccgccaac 5 40 gccgcccccgccaacgacaagttcaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgGGCgaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAa a a aaggccat ca ccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 7 8 0 gccgctgccaccaccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 3 40 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 7

I45K, E133S, F188I, P214G, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 2 4 0 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgaccccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 3 60 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCccgctccgcatcatcgccggc 42 0 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 48 0 gagctgcaggtcatcaagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatcGGCgccctggaggccgccgtc 660 aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 7 8 0 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 3 61

- 126 Mutanta 8

Ϊ45Κ, E133S, F188I, K211N, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 18 0 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 24 0 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgaggccgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 42 0 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacAACttcatccccgccctggaagccgccgtc 660 aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 72 0 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 7 80 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 9

R66N, R136S, F188I, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcgcagccagcaggtaaggcgacgaccgaagagcagaag 120 ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 18 0 ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 3 00 acctccaagctcgacgccccctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaggcgctcAGCatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 480 gagctgcaggtcatcgagaaggtcaacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 54 0 gccgcccccgccaacgacaagAT? accgtcttcgaggccgccttcaaccacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 72 0 accgcaGAAaaaaaggccatcacccccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 78 0 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 8 4 0 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 10

R66N, I137K, FL88I, Q222K, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacgcccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggaaccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagatcaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgcccccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacAACacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 2 40 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 3 00 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 3 60 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcgaagcgctccgcAAAatcgccggc 42 0 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 4 80 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 540 gccgcccccgccaacgacaagATTaccgtcttcgaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagAAAgcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 72 0 accgcaGÍAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 7 8 0

- 127 gccgctgccaccgcwaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 84 0 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 11

I45K, E133S/ D186H, P214G, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacgaccccgccaccccagctgccccggccgccggctacacccccgcc 50 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggcaaggcgacgaccgaggagcagaag 12 0 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 18 0 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctccggcgagcccaagggccccgccgaatccagctccaaggccgccctc 3 00 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgaggacgcgacccct 3 60 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaaccAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggcccaggaggtcaaggtcatccccgcccgc 4 80 gagctgcaggtcatcgagaaggtcgacgccgccttcaaggtcgctgccaccgccgccaac 5 40 gccgcccccgccaacCATaagttcaccgtcttccaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcggcgcctacgagagctacaagttcatcGGCgccctggaggccgccgtc 6 60 aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 7 8 0 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttcccgcggccaccggcgccgccaccgcc 8 40 gctactggtggctacaaagtc 861

Mutanta 12

I45K, E133S, D186H, K211N, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagctgccccgaccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcacgtaaggcgacgaccgaggagcagaag 120 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcgcccttggccgctgccgccggcgtcccg 18 0 ccagcgaacaagtacaggacgttcgtcgcaaccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 2 40 gcggagggcctctcggacgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 3 00 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcccacaagacagccgagggcgcgacgcct 3 60 gaggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggcccaggaggtcaaggtcatccccgccggc 48 0 gagctgcaggtcatccagaaggtcgacgccgccctcaaggtcgctgccaccgccgccaac 54 0 gccgcccccgccaacCATaagttcaccgtcttccaggccgccttcaacgacgccatcaag 600 gcgagcacgggcgccacctacgagagctacAACTtcatccccgccctggaggccgccgtc 660 aagcaggcctacgccgccaccgtcgccaccgcgccggaggtcaagtacactgtctttgag 720 accgcaGAAaaaaaggccatcaccgccatgtccgaagcaAAAaaggctgccaagcccgcc 7 80 gccgctgccaccgccaccgcaaccgccgccgttggcgcggccaccggcgccgccaccgcc 840 gctactggtggctacaaagtc 861

- 128 Mutanta 13

I45K, E133S, P214G, P232G, L243E, Q254K:

gccgatctcggttacggccccgccaccccagccgccccggccgccggctacacccccgcc 60 acccccgccgccccggccggagcggagccagcaggtaaggcgacgaccgaggagcagaag 12 0 ctgatcgagaagAAAaacgccggcttcaaggcggccttggccgctgccgccggcgtcccg 180 ccagcggacaagtacaggacgttcgtcgcasccttcggcgcggcctccaacaaggccttc 240 gcggagggcctctcgggcgagcccaagggcgccgccgaatccagctccaaggccgcgctc 300 acctccaagctcgacgccgcctacaagctcgcctacaagacagccgagggcgcgacgcct 360 gsggccaagtacgacgcctacgtcgccaccgtaagcAGCgcgctccgcatcatcgccggc 420 accctcgaggtccacgccgtcaagcccgcggccgaggaggtcaaggtcatccccgccggc 48 0

Příklad 9

Reaktivita T-buněk pro rekombinantni a mutantní Bet v 1

Cíl testu

Cílem testu je zjistit reakci T-buněk in vitro na mutované alergeny z hlediska proliferace a produkce cytokinů.

Metody

Při následujícím testu byly použity PBL (lymfocyty periferní krve) pacientů s alergií. Osm linií T-buněk specifických pro Bet v 1 bylo vytvořeno z PBL s přirozeně čištěným Bet v 1 pro udržení různosti isoforem Bet v 1, kterým jsou T- buňky předkládány, jak se popisuje v protokolu popsaném dříve (P. A. Wurzen, M. Wissenbach, H. Ipsen, A. Bufě, J. Arnved, a R. J. J. van Neerven, J. Allergy Clin. Immunol.,

- 129 1999, 104, 115 - 23). Deset PBL a osm linií T-buněk bylo stimulováno extraktem břízy (Bet v), přirozeně čištěným Bet v 1. (nfíeř v 1), rekombinantním Bet v 1 (rBet v 1 nebo standardní typ; Sparholt S. H., Larsen J. N., Ipsen H., Schou C., van Neerven R. J., Clin. Exp. Allergy 1997, srpen, 27 (8), 932 - 41) a čtyřmi různými mutovanými formami rSeř v 1 (popisovanými jinde): 2595, 2628, 2637, 2744, 2773. Později bylo zjištěno, že mutanta 2637 má částečně rozloženou strukturu, a nebude tedy diskutována.

Ve stručnosti, do 96-jamkové destičky s kulovým dnem byly přidány PBL v množství 2 x 10⁵ na jamku. Byly přidávány různé vzorky břízy ve třech různých koncentracích při čtyřnásobném opakování a buňky byly ponechány růst 6 dnů. Šestý den byla sklizena polovina objemu buněk (100 pl) z každé jamky s nejvyšší koncentrací břízy pro test na produkci cytokinů. Do jamek byl přidán radioaktivně značený thymidin. Další den (den 7) byly buňky odděleny na filtru. K filtrům byla přidána scintilační kapalina a na scintilačním čítači byla měřena radioaktivita.

Podobně bylo do 96-jamkové destičky s kulovým dnem přidáno 3 x 10⁴ T-buněk na jamku, které byly stimulovány ozářenými autologními PBL (1 x 10⁵ buněk/jamku) a tři různé koncentrace různých vzorků břízy. Po jednom dni byly buňky z každé jamky s nejvyšší koncentrací břízy sklizeny pro test na produkci cytokinů. Do jamek byl přidán radioaktivně značený thymidin. Druhý den byly buňky odfiltrovány a radioaktivita filtru byla měřena podle popisu pro PBL.

Supernatant ze čtyřnásobných stanovení byl spojen a cytokiny byly měřeny použitím kitu CBA (cytokine bead array) firmy Becton Dickinson.

- 130 Výsledky

Deset kultur PBL ukázalo specifickou stimulaci břízou. Obecně byla proliferace PBL v reakci na různé vzorky břízy podobná, ačkoli bylo vidět různé variace. U tří PBL stimuloval nBet v 1 proliferaci lépe než rBet v 1 a mutanty. Mutantní vzorky břízy stimulovaly PBL téměř stejně jako rBet v 1 (obr. 41). Obr. 41 ukazuje stimulační index pro výše uvedené preparáty Bet v 1. Stimulační index (Sl) se vypočte jako proliferace (cpm: počet impulsů za minutu) dělený proliferaci (cpm) kontroly s médiem. PPD označuje čištěný proteinový derivát Mycobacterium tuberculosis, který slouží jako pozitivní kontrola.

V produkci cytokinů převažoval IFN-gama, jehož koncentrace stoupala úměrně s proliferaci PBL. Nebyly zřejmé žádné známky posunu Th1/Th2 (obr. 42 až 44). Obr. 42 ukazuje pacienta s profilem ThO, obr. 43 pacienta s profilem Th1 a obr. 44 pacienta s profilem Th2. Produkce cytokinů se měří v pg/ml ukázaných jako pruhy, a poměr mezi IL-5/IFN-gama je dolní čárkovaná čára (osa Y napravo). Proliferace se měří v cpm, a je vidět na ose Y napravo jako plná čára měření v cpm. Jako kontroly pozadí jsou použity médium a MBP (protein vázající maltózu).

Na nfíeř v 1 se vytvořilo osm linií T-buněk, a všechny kromě jedné proliferovaly stejně dobře u všech vzorků břízy. Čtyři linie Tbuněk vylučovaly cytokiny podobné ThO ba základě poměru IL-5 a IFN-gama (Th2 > 5, 5 > ThO > 0,2, 0,2 > Th1). Tři linie T-buněk sekrenovaly cytokiny Th1 a jedna buněčná linie sekrenovala cytokiny Th2. Poměr IL-5/IFN-gama nebyl různými vzorky břízy ovlivněn.

Závěr

Všechny kultury PBL a 7/8 linií T-buněk, které ukázaly specifickou stimulaci jako reakci na nBet v 1, také reagovaly na rBet v 1 a mutanty. Tyto údaje ukazují, že pro stimulaci T-buněk mohou

- 131 jediná isoforma Bet v 1 nebo tyto čtyři mutanty nahradit směs jednotlivých isoforem, které se nacházejí v přírodních preparátech alergenů. Vakciny založené na rekombinantních alergenech nebo těchto čtyřech mutantách budou tedy vyvolávat reakci existující populace T-buněk specifických pro Bet v 1.

Příklad 10

Indukce Bet v 1-specifických protilátek IgG a blokování protilátek po imunizaci rekombinantními a mutantními proteiny Bet v 1

V této části je termín „blokující protilátky“ definován jako protilátky různé od lidských protilátek IgE, které jsou schopny vázat se na antigen a zabránit vazbě lidských protilátek IgE na tento antigen.

Schopnost rekombinantního proteinu Bet v 1 2227 standardního typu (rBet v 1) a mutantních proteinů Bet v 1 2595, 2628, 2744 a 2773 indukovat Bet v 1-specifické protilátky IgG a blokující protilátky, byla testována imunizačními experimenty na myších.

Myši BALB/cA (8 v každé skupině) byly imunizovány intraperitoneálními injekcemi rekombinantního proteinu Bet v 1 2227 standardního typu nebo čtyř mutantních proteinů. Myši byly imunizovány čtyřikrát s intervalem mezi dávkami 14 dnů. Různé proteiny byly konjugovány na 1,25 mg/ml Alhydrogel (gel hydroxidu hlinitého, 1,3% pH 8,0 - 8,4, Superfos Biosector). Myši byly imunizovány buď 1 pg proteinu/dávku nebo 10 pg proteinu/dávku. Vzorky krve byly odebírány ve dnech 0, 14, 35, 21,49 a 63.

Hladiny specifických protilátek IgG byly analyzovány metodou přímé ELISA s použitím mikrotitračních destiček potažených rBet v 1 a biotinylovaných králičích protilátek proti myšímu IgG (Jackson) jako detekční protilátky. Imunizace rekombinantním proteinem Bet v 1 2227 standardního typu nebo čtyřmi mutantními proteiny indukovala silnou r Bet v 1 specifickou odpověď IgG. Toto zjištění ukazuje, že čtyři

-132-.

mutované proteiny jsou schopné indukovat protilátky, které vykazují vysokou zkříženou reaktivitu vůči proteinu Bet v 1 2227 standardního typu.

Pro hodnocení indukce blokujících protilátek byly inkubovány vzorky séra pacientů alergických na pyl břízy s paramagnetickými kuličkami potaženými monoklonální myší protilátkou proti lidskému IgE. Po inkubaci byly kuličky promyty a resuspendovány v pufru nebo zředěných vzorcích (1 : 100) myšího séra neimunizovaných myší (kontrola) nebo myší imunizovaných jak bylo popsáno výše. K této směsi kuliček a protilátek myšího séra byl potom přidán biotinylovaný r Bet v 1. Po inkubaci byly kuličky promyty a navázaný biotinylovaný rBet v 1 byl detekován použitím akridiniem značeného streptavidinu. Inkubace kuliček se sérem neimunizovaných myší nezměnila vazbu r Bet v 1 na kuličky. Naopak inkubace kuliček se sérem myší imunizovaných s rekombinantním proteinem Bet v 1 2227 standardního typu nebo čtyřmi mutantními proteiny významně snížila vazbu r Bet v 1 na tyto kuličky, což ukazuje přítomnost blokujících protilátek specifických pro Bet v 1 ve vzorcích séra. V den 63 byly tedy jeden nebo více vzorků séra ze všech skupin vyšších imunizačních dávek (10 pg/dávku) schopny snížit vazbu r Bet v 1 na kuličky o více než 80 %. Tato zjištění ukazují, že čtyři mutované proteiny jsou schopny indukovat protilátky, které mohou působit jako Bet v 1specifické blokující protilátky.

Zastupuje:

Claims (64)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní alergen, který je mutantou v přírodě se vyskytujícího alergenu, přičemž mutantní alergen obsahuje alespoň čtyři primární mutace, z nichž každá snižuje vazebnou schopnost mutovaného alergenu pro specifický IgE ve srovnání s vazebnou schopností pro IgE uvedeného v přírodě se vyskytujícího alergenu, přičemž každá primární mutace je substituce jednoho na povrchu exponovaného aminokyselinového zbytku dalším zbytkem, který se nevyskytuje ve stejné poloze v aminokyselinové sekvenci kteréhokoli známého homologního proteinu v rámci taxonomického druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, a kde každá primární mutace je vzdálena od každé další primární mutace o alespoň 15 A (1A = 0,1 nm), a kde primární mutace jsou umístěny takovým způsobem, že alespoň jedna kruhová oblast povrchu s plochou 800 A² (1Á² = 0,01 nm²) neobsahuje žádnou mutaci.
2. 2. Rekombinantní alergen podle nároku 1, kde primární mutace jsou od sebe vzdáleny 20 Á, s výhodou 25 Á a nejvýhodněji 30 A (1A = 0,1 nm).
3. 3. Rekombinantní alergen podle nároku 1 nebo 2, který obsahuje určitý počet sekundárních mutací, kde každá tato mutace snižuje vazebnou schopnost mutovaného alergenu ke specifickému IgE ve srovnání s vazebnou schopností v přírodě se vyskytujícího alergenu, přičemž každá sekundární mutace je substituce jednoho na povrchu exponovaného aminokyselinového zbytku

   - 134 jiným zbytkem, který se nevyskytuje ve stejné poloze v aminokyselinové sekvenci kteréhokoli známého homologního proteinu v rámci taxonomického druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, přičemž sekundární mutace jsou umístěny mimo uvedenou kruhovou oblast.
4. 4. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 3, kde alespoň jedna z aminokyselin exponovaných na povrchu, které mají být v alergenu vyskytujícím se v přírodě substituovány, dostupnost rozpouštědlu více než 20 %, s výhodou více než 30 %, výhodněji více než 40 % a nejvýhodněji více než 50 %.
5. 5. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 4, kde alespoň jedna z aminokyselin exponovaných na povrchu, které mají být v alergenu vyskytujícím se v přírodě substituovány, je konzervována s více než 70%, s výhodou s více než 80% a nejvýhodněji s více než 90% identitou u všech známých homologních proteinů v rámci druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází.
6. 6. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 5, který má v podstatě stejnou terciární strukturu α-uhlíkaté kostry jako uvedený v přírodě se vyskytující alergen.
7. 7. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 6, ve kterém se každý aminokyselinový zbytek, který má být inkorporován do mutantního alergenu, nevyskytuje ve stejné poloze v aminokyselinové sekvenci kteréhokoli známého homologního proteinu v rámci taxonomického rodu, s výhodou podčeledi, výhodněji čeledi, výhodněji nadčeledi, výhodněji

   - 135 - _; legionu, ještě výhodněji podřádu a nejvýhodněji řádu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází.
8. 8. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 7, ve kterém vazba specifického IgE na mutovaný alergen je s výhodou snížena o alespoň 5 %, s výhodou o alespoň 10 %,
9. 9. Rekombinantní alergen podle nároku 6, který má při porovnání terciární struktury α-uhlíkaté kostry molekuly mutantního a v přírodě se vyskytujícího alergenu průměrnou střední kvadratickou odchylku atomových souřadnic nižší než 2 A (1A = 0,1 nm).
10. 10. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 9, kde uvedená kruhová oblast povrchu obsahuje atomy 15 až 25 aminokyselinových zbytků.
11. 11. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 10, kde na povrchu exponované aminokyselinové zbytky jsou roztříděny z hlediska dostupnosti rozpouštědlu, a substituovaná je jedna nebo více aminokyselin z aminokyselin více dostupných rozpouštědlu.
12. 12. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 11, kde aminokyselinové zbytky exponované na povrchu jsou roztříděny z hlediska stupně konzervace u všech známých homologních proteinů v rámci druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, a substituovaná je jedna nebo více aminokyselin mezi více konzervovanými aminokyselinami.

    )

    - 136
13. 13. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 12, kde mutantní alergen je alergen nevyskytující se v přírodě.
14. 14. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 13, který obsahuje 5 až 20, výhodněji 6 až 15, ještě výhodněji 7 až 12, a nejvýhodněji 8 až 10 primárních mutací.
15. 15. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 14, kde mutantní alergen obsahuje 1 až 4 sekundární mutace na primární mutaci.
16. 16. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 15, kde jedna nebo více substitucí jsou provedeny metodou místně specifické mutageneze.
17. 17. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 16, kde jedna nebo více substitucí je získaná mícháním DNA.
18. 18. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 17, který je mutantou inhalačního alergenu.
19. 19. Rekombinantní alergen podle nároku 18, který je mutantou pylového alergenu.
20. 20. Rekombinantní alergen podle nároku 19, který je mutantou pylového alergenu pocházejícího z taxonomických řádů Fagales, Oleales nebo Pinales,

    -13721. Rekombinantní alergen podle nároku 20, který je mutantou Bet v 1.
21. 22. Rekombinantní alergen podle nároku 21, kde jedna nebo více substitucí jsou zvoleny ze skupiny V2, D72, E87, K-129, E-60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D-156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H-126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153, I-44, E-138, G-61, A-130, R70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H-154, N-43, A-106, K115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 a E-73.
22. 23. Rekombinantní alergen podle nároku 19, který je mutantou pylového alergenu pocházejícího z taxonomického řádu Poales.
23. 24. Rekombinantní alergen podle nároku 19, který je mutantou pylového alergenu pocházejícího z taxonomického řádu Asterales nebo Urticales.
24. 25. Rekombinantní alergen podle nároku 18, který je mutantou alergenu roztočů domácího prachu.
25. 26. Rekombinantní alergen podle nároku 25, který je mutantou alergenu roztoče pocházejícího z Dermatophagoides.
26. 27. Rekombinantní alergen podle nároku 18, který je mutantou alergenu švába.

    - 138
27. 28. Rekombinantní alergen podle nároku 18, který je mutantou zvířecího alergenu.
28. 29. Rekombinantní alergen podle nároku 28, který je mutantou zvířecího alergenu pocházejícího z kočky, psa nebo koně.
29. 30. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 17, který je mutantou alergenu jedu.
30. 31. Rekombinantní alergen podle nároku 30, který je mutantou alergenu jedu pocházejícího z taxonomického řádu Hymenoptera.
31. 32. Rekombinantní alergen podle nároku 31, který je mutantou alergenu jedu pocházejícího z taxonomického řádu Vespidae, Apidae a Formicoidae.
32. 33. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 30 až 32, který je mutantou Ves v 5.
33. 34. Rekombinantní alergen podle nároku 33, kde jedna nebo více substitucí jsou zvoleny ze skupiny K-16, K-185, K-11, K-44, K210, R-63, K-13, F-6, K-149, K-128, E-184, K-112, F-157, E-3, K-29, N-203, N-34, K-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K134, D-87, K-52, T-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L-65, K-81, Q101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T-209, V-84,

    - 139 K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D-49, S153, K-35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 a 1-182.
34. 35. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 34 pro použití jako farmaceutický prostředek.
35. 36. Použití rekombinantního alergenu podle některého z nároků 1 až 34 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení alergie.
36. 37. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje dvě nebo více variant rekombinantního mutantního alergenu podle některého z nároků 1 až 34, přičemž každá varianta je definovaná obsahem alespoň jedné hlavní mutace, která není přítomna v alespoň jedné z dalších variant, kde u každé varianty není sekundární mutace přítomná v rozmezí vzdáleností 15 Á (1A = 0,1 nm) od každé nepřítomné primární mutace.
37. 38. Kompozice podle nároku 37, vyznačující se tím, ž e obsahuje 2 až 12, výhodněji 3 až 10, výhodněji 4 až 8 a nejvýhodněji 5 až 7 variant.
38. 39. Kompozice podle nároku 37 nebo 38 pro použití jako farmaceutický prostředek.
39. 40. Použití kompozice podle nároku 37 nebo 38 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení alergie.

    - 140
40. 41. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 34 nebo kompozici podle nároku 37 nebo 38, popřípadě v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem a/nebo pomocnou látkou, a popřípadě adjuvans.
41. 42. Farmaceutický prostředek podle nároku 41, vyznačující se tím, že ve formě vakciny proti alergickým reakcím vyvolaným v přírodě se vyskytujícím alergenem u pacientů trpících alergií.
42. 43. Způsob vyvolání imunitní odpovědi u pacienta, který zahrnuje podávání rekombinantního alergenu podle některého z nároků 1 až 34 nebo kompozice podle nároku 37 nebo 38 nebo farmaceutického prostředku podle nároku 41 nebo 42 pacientovi.
43. 44. Vakcinace nebo léčení pacienta, které zahrnují podávání rekombinantního alergenu podle některého z nároků 1 až 34, kompozice podle nároku 37 nebo 38 nebo farmaceutického prostředku podle nároku 41 a 42 pacientovi.
44. 45. Způsob výroby farmaceutického prostředku podle nároku 41 nebo 42, vyznačující se tím, že rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 34 nebo kompozice podle nároku 37 nebo 38 se mísí s farmaceuticky přijatelnými substancemi a/nebo pomocnými látkami.

    - 141
45. 46. Farmaceutický prostředek získatelný způsobem podle nároku 45.
46. 47. Způsob léčení, prevence nebo zmírnění alergických reakcí u pacienta, který zahrnuje podávání rekombinantního alergenu podle některého z nároků 1 až 34, kompozice podle nároku 37 nebo 38 nebo farmaceutického prostředku podle nároků 41 a 42 nebo 46 pacientovi.
47. 48. Způsob výroby rekombinantního alergenu podle některého z nároků 1 až 34, vyznačující se tím, že:

    a) v alergenu vyskytujícím se v přírodě se identifikuje určitý počet aminokyselinových zbytků, které mají dostupnost rozpouštědlu alespoň 20 %;

    b) vyberou se alespoň čtyři identifikované aminokyselinové zbytky takovým způsobem, že každá vybraná aminokyselina je ve vzdálenosti od každé další vybrané aminokyseliny alespoň 15 Á (1Á = 0,1 nm), a vybrané aminokyseliny jsou umístěny takovým způsobem, že alespoň jedna kruhová oblast povrchu s plochou 800 A² (1Á² = 0,01nm²) neobsahuje žádnou vybranou aminokyselinu; a

    c) pro každou z vybraných aminokyselin se provede primární mutace, která sníží vazebnou schopnost specifického IgE mutovaného alergenu ve srovnání s vazebnou schopností uvedeného v přírodě se vyskytujícího alergenu, přičemž každá primární mutace je substituce vybraného aminokyselinového zbytku jinou aminokyselinou, která se nevyskytuje ve stejné poloze v aminokyselinové sekvenci kteréhokoli známého homologního proteinu v rámci taxonomického druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází.

    - 142
48. 49. Způsob podle nároku 48, vyznačující se tím, že se uvedené identifikované aminokyselinové zbytky seřadí z hlediska dostupnosti rozpouštědlu a provede se substituce jedné nebo více aminokyselin vybraných z aminokyselin s vyšší dostupností rozpouštědlu.
49. 50. Způsob podle nároku 48 nebo 49, vyznačující se tím, že se zvolí identifikované aminokyselinové zbytky, které jsou konzervované s více než 70% identitou u všech známých homologních proteinů v rámci druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází.
50. 51. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že se uvedené identifikované aminokyselinové zbytky seřadí z hlediska stupně konzervace ve všech známých homologních proteinech v rámci druhu, ze kterého uvedený v přírodě se vyskytující alergen pochází, a provede se substituce jedné nebo více aminokyselin z více konzervovaných zbytků.
51. 52. Způsob podle některého z nároků 48 až 51, vyznačující se tím, že se identifikované aminokyseliny zvolí tak, aby tvořily mutantní alergen, který má v podstatě stejnou terciární strukturu α-uhlíkaté kostry, jako uvedený v přírodě se vyskytující alergen.
52. 53. Způsob podle některého z nároků 48 až 52, vyznačující se tím, že se substituce aminokyselinových zbytků provádí místně specifickou mutagenezí.

    - 143
53. 54. Způsob výroby rekombinantního alergenu podle některého z nároků 1 až 34, vyznačující se tím, že se alergen vyrábí ze sekvence DNA získané metodou míchání DNA neboli křížení DNA kódující odpovídající v přírodě se vyskytující alergen.
54. 55. Sekvence DNA kódující rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 34, její derivát, její částečná sekvence, její degenerovaná sekvence nebo sekvence, která s ní za stringentních podmínek hybridizuje, přičemž uvedený derivát, parciální sekvence, degenerovaná sekvence nebo hybridizující sekvence kóduje peptid obsahující alespoň jeden epitop Bbuněk.
55. 56. Sekvence DNA podle nároku 55, která je derivátem sekvence DNA kódující v přírodě se vyskytující alergen.
56. 57. Sekvence DNA podle nároku 56, kde derivát je získaný místně specifickou mutací sekvence DNA kódující v přírodě se vyskytující alergen.
57. 58. Sekvence DNA podle některého z nároků 55 až 57, kde sekvence je derivátem sekvence ukázané na obr. 3, a kde sekvence DNA je mutovaná tak, aby kódovala alergen obsahující alespoň čtyři mutace zvolené ze skupiny V2, D72, E87, K-129, E60, N-47, K-65, P-108, N-159, D-93, K-123, K-32, D-125, R-145, D-109, E-127, Q-36, E-131, L-152, E-6, E-96, D156, P-63, H-76, E-8, K-134, E-45, T-10, V-12, K-20, S-155, H126, P-50, N-78, K-119, V-2, L-24, E-42, N-4, A-153,1-44, E- 144 138, G-61, A-130, R-70, N-28, P-35, S-149, K-103, Y-150, H154, N-43, A-106, K-115, P-14, Y-5, K-137, E-141, E-87 a E-73
58. 59. Sekvence DNA podle některého z nároků 55 až 57, kde sekvence je derivátem sekvence ukázané na obr. 13, a kde sekvence DNA je mutovaná tak, aby kódovala alergen obsahující alespoň čtyři mutace zvolené ze skupiny K-16, K-185, K-11, K-44, K-210, R-63, K-13, F-6, K-149, K-128, E-184, K-112, F-157, E-3, K-29, N-203, N-34, K-78, K-151, L-15, L-158, Y-102, W-186, K-134, D-87, K-52, T-67, T-125, K-150, Y-40, Q-48, L65, K-81, Q-101, Q-208, K-144, N-8, N-70, H-104, Q-45, K-137, K-159, E-205, N-82, A-111, D-131, K-24, V-36, N-7, M-138, T209, V-84, K-172, V-19, D-56, P-73, G-33, T-106, N-170, L-28, T-43, Q-114, C-10, K-60, N-31, K-47, E-5, D-145, V-38, A-127, D-156, E-204, P-71, G-26, Y-129, D-141, F-201, R-68, N-200, D49, S-153, K-35, S-39, Y-25, V-37, G-18, W-85 a 1-182.
59. 60. Sekvence DNA podle některého z nároků 55 až 57, kde sekvence je derivátem sekvence ukázané na obr. 16, a kde sekvence DNA je mutovaná tak, aby kódovala alergen obsahující alespoň čtyři mutace zvolené ze skupiny R-128, D129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K-96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, 1-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L61, P-26, N-93, D-64, 1-28, K-14, K-100, E-62, 1-127, E-102, E25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103, Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, I-68, P-79, K-109 a R-128, D-129, H-11, H-30, S-1, K-77, Y-75, R-31, K-82, K-6, K96, K-48, K-55, K-89, Q-85, W-92, 1-97, H-22, V-65, S-24, H-74, K-126, L-61, P-26, N-93, D-64, 1-28, K-14, K-100, E-62, 1-127, E-102, E-25, P-66, L-17, G-60, P-95, E-53, V-81, K-51, N-103,

    - 145 Q-2, N-46, E-42, T-91, D-87, N-10, M-111, C-8, H-124, 1-68, P79, K-109 a K-15.
60. 61. Expresního vektor, který obsahuje DNA podle některého z nároků 55 až 60.
61. 62. Hostitelská buňka, která obsahuje expresní vektor podle nároku 61.
62. 63. Způsob přípravy rekombinantního mutantního alergenu, vyznačující se tím, že se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 62.
63. 64. Rekombinantní alergen podle některého z nároků 1 až 34 nebo kódovaný sekvencí DNA podle některého z nároků 55 až 60, který obsahuje alespoň jeden epitop T-buňky schopný stimulovat klon T-buněk nebo linii T-buněk specifickou pro v přírodě se vyskytující alergen.
64. 65. Diagnostickéý test pro zjišťování relevance, bezpečnosti nebo vyhlídek léčení pacienta, vyznačující se tím, ž e obsahuje rekombinantní mutantní alergen podle některého z nároků 1 až 34 nebo kompozice podle nároku 37 nebo 38, přičemž vzorek pacienta obsahující IgE se smísí s uvedenou mutantou nebo uvedenou kompozicí, a testuje se na hladinu reaktivity mezi IgE v uvedeném vzorku a uvedenou mutantou.