CZ20033208A3

CZ20033208A3 - Cripto blocking antibodies and uses thereof

Info

Publication number: CZ20033208A3
Application number: CZ20033208A
Authority: CZ
Inventors: Michele Sanicola-Nadel; Kevin Williams; Susan Schiffer; Paul Rayhorn
Original assignee: Biogen, Inc.
Priority date: 2001-04-26
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2004-03-17
Also published as: JP4307845B2; ATE420659T1; US7674462B2; CN100352501C; NZ566268A; IS6999A; CA2443840C; HUP0501113A3; JP4575983B2; US20120195912A1; US20100202962A1; CA2715570A1; EP2316486A2; PT1390389E; JP2009108100A; ATE533508T1; AR037223A1; KR100592357B1; EP1390389A2; WO2002088170A3

Description

Protilátka specifická pro Cripto a farmaceutický přípravek obsahující takovou protilátku

Související přihlášky vynálezu

Předkládaná přihláška je pokračovací přihláškou k přihlášce U.S. č. 60/367,002, podané 22. března 2002, která je přihláškou částečně pokračovací k přihlášce U.S. č. 60/301,091, podané 26. června 2001, která je přihláškou částečně pokračovací k přihlášce U.S. č. 60/293,020, podané 17. května 2001, která je přihláškou částečně pokračovací k přihlášce U.S. č. 60/286,782, podané 26. dubna 2001. Úplný popis každé z těchto přihlášek vynálezu je zahrnut formou odkazu v předkládané přihlášce.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká v širším genetiky a buněčné a molekulární biologie, vynález týká protilátek, které se váží na Cripto, modulují jeho signální dráhu, souprav obsahujících protilátky, a použití těchto protilátek.

smyslu oboru Konkrétně se tak a

takové

Dosavadní stav techniky

Cripto je protein buněčného povrchu sestávající ze 188 aminokyselinových zbytků, šťastnou náhodou izolovaný při screeningu cDNA knihovny humánního embryonálního karcinomu (Ciccodicola et al., 1989, EMBO J., vol. 8, no. 7, pp. 19871991). Protein Cripto má alespoň dvě pozoruhodné domény:

• · · ·

- 2 Doménu bohatou na cystein („cysteine-rich) a doménu, která byla zprvu charakterizována jako doména podobná doméně nalezené v rodině epidermálniho růstového faktoru (EGF) . Cripto byl původně klasifikován jako člen EGF rodiny (Ciccodicola et al., výše), nicméně následná analýza ukázala, že Cripto se neváže na žádný ze známých receptorů EGF a jeho domény podobné EGF („EGF-like) jsou ve skutečnosti odlišné od domén EGF rodiny (Bianco et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:8624-8629).

Signalizační dráha Cripto zůstala i přes pokračující výzkum nevyjasněna, přičemž odborná literatura podporovala domněnky o aktivaci několika různých drah, včetně dráhy MAP kinázy (DeSantis et al., 1997, Cell Growth Differ., 8:12571266, Kannan et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:3330-3335), TGF-á dráha (Gritsman et al. , 1999, Development, 127:921-932,

Schier et al., 2000, Nátuře, 403:385-389), možné interakce s dráhou Wnt (Salomon et al., Endocr Relat Cancer. 2000 Dec,7(4):199-226) a zkřížení s dráhou EGF (Bianco et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:8624-8629).

Patent U.S. č. 5 256 643 a dvě z něho vyloučené přihlášky vynálezu (nyní patenty U.S. č. 5 654 140 a 5 792 616), popisují humánní gen Cripto, protein Cripto a protilátky proti proteinu Cripto.

Patent U.S. č. 5 264 557 a tři z něho vyloučené přihlášky vynálezu (nyní patenty U.S. č. 5 620 866, 5 650 285 a 5 854 399) popisují gen a protein příbuzný humánnímu genu a proteinu Cripto. Také popisují protilátky, které se váží na protein příbuzný Cripto, přičemž se neváží zkříženě na protein Cripto samotný.

Nadměrná exprese („overexpression) proteinu Cripto je asociována s mnoho typy nádorů (např. nádor prsu, varlete,

- 3 tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku, aniž by tento výčet byl omezující), jak bylo demonstrováno pomocí imunoznačení humánních tkání králičími polyklonálními protilátkami proti malým peptidům cripto (Panico et al., 1996, Int. J. Cancer, 65: 51-56, Byrne et al., 1998, J Pathology, 185:108-111, De

Angelis et al., 1999, Int J Oncology, 14:437-440). Existuje v daném obor proto potřeba nalézt prostředky k řízení, omezování a/nebo prevenci takové nadměrné exprese Cripto, modulaci signální dráhy Cripto a modulaci důsledků exprese Cripto (tj. podpora a/nebo udržování buněčné transformace).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje nové protilátky, které se specificky váží na Cripto, a způsoby výroby a použití takových protilátek. Vynález také poskytuje protilátky, které se váží na Cripto a modulují signalizaci Cripto nebo proteinové interakce, např. protilátku, která se váže na Cripto tak, že výsledný signál z proteinové interakce s Cripto je modulován směrem dolů. Vynález také poskytuje protilátky, které se váží na Cripto a blokují tak interakci mezi Cripto a ALK4. Vynález také poskytuje protilátky, které se váží na Cripto a modulují tak nádorový růst. Vynález také poskytuje protilátky, které se váží na Cripto, a tak modulují Cripto signalizaci a modulují nádorový růst. Vynález také poskytuje protilátky, které se váží na Cripto, blokují interakci mezi Cripto a ALK4 a modulují nádorový růst

V jednom aspektu vynálezu, protilátka podle předkládaného • · • · · * • ·

- 4 vynálezu se specificky váže na epitop vybraný ze skupiny, obsahující epitopy, ke kterým se váže protilátka A6C12.il, A6F8.6 (ATCC přístupové č. PTA-3318), A7H1.19, A8F1.30, A8G3.5 (ATCC přístupové č. PTA-3317), A8H3.1 (ATCC přístupové č. PTA3315), A8H3.2, A19A10,30, A10B2.18 (ATCC přístupové č. PTA3311), A27F6.1 (ATCC přístupové č. PTA-3310), A40G12.8 (ATCC přístupové č. PTA-3316), A2D3.23, A7A10,29, A9G9.9, A15C12.10, A15E4.14, A17A2.16, A17C12.28, A17G12.1 (ATCC přístupové č. PTA-3314), A17H6.1, A18B3.11 (ATCC přístupové č. PTA-3312), A19E2.7, B3F6.17 (ATCC přístupové č. PTA-3319), B6G7.10 (ATCC přístupové č. PTA-3313), B11H8.4 .

V dalším aspektu vynálezu, protilátka podle předkládaného vynálezu se specificky váže k epitopu ve vazebné doméně ligand/receptor Cripto. Cripto přitom může být vybrán ze CR-1 (SEKV. ID. Č. 1) nebo CR-3 (SEKV. ID. Č. 2) . V konkrétním provedení protilátka, která se specificky váže k epitopu ve vazebné doméně ligand/receptor, je například A6C12.il, A6F8.6 (ATCC přístupové č. PTA-3318), A8G3.5 (ATCC přístupové č. PTA3317), A19A10.30, A8H3.1 (ATCC přístupové č. PTA-3315), A27F6.1 (ATCC přístupové č. PTA-3310), A40G12.8 (ATCC přístupové č. PTA-3316), A17G12.1 (ATCC přístupové č. PTA3314), A18B3.il (ATCC přístupové č. PTA-3312) a B6G7.10 (ATCC přístupové č. PTA-3313).

V jednom provedení vynálezu je epitop, ke kterému se protilátky podle předkládaného vynálezu váží, v doméně podobné EGF doméně. Protilátka, která se specificky váže na epitop v EGF podobné doméně je např. protilátka A40G12.8 (ATCC přístupové č. PTA-3316), A8H3.1 (ATCC přístupové č. PTA-3315), A27F6.1 (ATCC přístupové č. PTA-3310), B6G7.10 (ATCC přístupové č. PTA-3313), A17G12.1 (ATCC přístupové č. PTA3314) a A18B3.11 (ATCC přístupové č. PTA-3312), aniž by tento • · • · • · · » · · · · • *

- 5 výčet byl omezující.

V dalším provedení je epitop, ke kterému se váží protilátky podle předkládaného vynálezu, doméně bohaté na cys, t j . cystein („cys-rich domain). Protilátka, která se specificky váže na epitop v doméně bohaté na cystein je např. A19A10.30, A8G3.5 (ATCC přístupové č. PTA-3317), A6F8.6 (ATCC přístupové č. PTA-3318) a A6C12.11, aniž by tento výčet byl omezuj ící.

V dalším provedení vynálezu je epitop, ke kterému se váží protilátky podle předkládaného vynálezu, v doméně zahrnující aminokyselinové zbytky 46 až 62 z Cripto (46-62 Cripto). Protilátka, která se specificky váže na epitop v doméně zahrnující aminokyselinové zbytky 46-62 Cripto je např. A10B2.18 (ATCC přístupové č. PTA-3311), B3F6,17 (ATCC přístupové č. PTA-3319) a A17A2.16, aniž by tento výčet byl omezuj ící.

Předkládaný vynálezy také zahrnuje protilátky, které se váží specificky na Cripto a jsou schopny modulovat signalizaci Cripto. Protilátka, která se váže specificky na Cripto a je schopná modulovat signalizaci Cripto, je např. A40G12.8 (ATCC přístupové č. PTA-3316), A8H3.1 (ATCC přístupové č. PTA-3315), A27F6.1 (ATCC přístupové č. PTA-3310) a A6C12.il, aniž by tento výčet byl omezující. V jednom provedení protilátky podle předkládaného vynálezu, které se váží specificky na Cripto a jsou schopné modulovat signalizaci Cripto, se váží na epitop v doméně podobné EGF nebo v doméně bohaté na cystein v proteinu Cripto.

Předkládaný vynálezy také zahrnuje protilátky, které se váží specificky na Cripto a blokují interakci mezi Cripto a ALK4. Protilátka, která se váže specificky na Cripto a je schopná blokovat interakci mezi Cripto a ALK4, je např. A8G3.5 « · • · • · · ► · · · · (ATCC přístupové č. PTA-3317), A6F8.6 (ATCC přístupové č. PTA3318) a A6C12.il, aniž by tento výčet byl omezující. V jednom provedení protilátka podle předkládaného vynálezu, která se specificky váže na Cripto a je schopná blokovat interakci mezi Cripto a ALK4, se váže na epitop v doméně podobné EGF nebo doméně bohaté na cystein v Cripto.

V dalším aspektu předkládaný vynález zahrnuje protilátky, které se váží specificky na Cripto a jsou schopny modulovat nádorový růst. Protilátka, která se specificky váže na Cripto a je schopná modulovat nádorový růst, je např. A27F6.1 (ATCC přístupové č. PTA-3310), B6G7.10 (ATCC přístupové č. PTA-3313) a A8G3.5 (ATCC přístupové č. PTA3317), aniž by tento výčet byl omezující. V jednom provedení se protilátky podle předkládaného vynálezu, které se váží specificky na Cripto a jsou schopny modulovat nádorový růst, váží na epitop v doméně podobné EGF nebo v doméně bohaté na cystein v Cripto.

V ještě dalším aspektu předkládaný vynález zahrnuje protilátky, které se váží specificky na Cripto, které jsou schopné modulovat signalizaci Cripto, a které jsou schopny modulovat nádorový růst. Protilátka, která se specificky váže na Cripto, je schopná modulovat signalizaci Cripto a je schopná modulovat nádorový růst, je, avšak bez omezení, např. A27F6.1 (ATCC přístupové č. PTA-3310).

V jednom provedení protilátky podle předkládaného vynálezu, které se váží specificky na Cripto, jsou schopné modulovat signalizaci Cripto a jsou schopné modulovat nádorový růst, se váží na epitop v doméně podobné EGF nebo v doméně bohaté na cystein v Cripto.

V ještě dalším aspektu předkládaný vynález zahrnuje protilátky, které se váží specificky na Cripto, jsou schopné • · · ·

- 7 blokovat interakci mezi Cripto a ALK4 a jsou schopné modulovat nádorový růst. Protilátka, která se specificky váže na Cripto, je schopná blokovat interakci mezi Cripto a ALK4 a je schopná modulovat nádorový růst, je, avšak bez omezeni, např. A8G3.5 (ATCC přístupové č. PTA-3317).

V dalším provedení předkládaný vynález poskytuje protilátku produkovanou hybridomem, který je vybrán ze skupiny sestávající z A6F8.6 (ATCC přístupové č. PTA-3318), A8G3.5 (ATCC přístupové č. PTA-3317), A8H3.1 (ATCC přístupové č. PTA3315) , A10B2.18 (ATCC přístupové č. PTA-3311), A27F6.1 (ATCC přístupové č. PTA-3310), A40G12.8 (ATCC přístupové č. PTA3316) , A17G12.1 (ATCC přístupové č. PTA-3314), A18B3.il (ATCC přístupové č. PTA-3312), B3F6.17 (ATCC přístupové č. PTA-3319) a B6G7.10 (ATCC přístupové č. PTA-3313).

Protilátky podle předkládaného vynálezu zahrnují, ale bez omezení, monoklonální, polyklonální, humanizované, chimérické a humánní protilátky.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutický přípravek pro podávání pacientovi, který trpí nádorem exprimujícím Cripto, obsahující alespoň jednu z protilátek popsaných ve vynálezu. V konkrétním provedení je pacient člověk. Přípravek může obsahovat také farmaceuticky přijatelný excipient. Protilátky popsané výše mohou být konjugované (kondenzované) s chemoterapeutickým agens nebo mohou být podávány v kombinaci s nekonjugovaným chemoterapeutickým agens.

V jiném aspektu vynálezu jsou zahrnuty způsoby modulace růstu nádorové buňky in vitro ve vzorku zahrnující krok přidání přípravku popsaného výše ke vzorku.

Vynález se také týká způsobů modulace růstu nádorové buňky in vivo u pacienta, zahrnujících krok podávání • · ·

- 8 pacientovi účinného množství přípravku popsaného výše. V konkrétním provedení je pacientem člověk.

Další aspekt vynálezu se týká způsobů léčení pacientů majících nádor, který nadměrně exprimuje Cripto, zahrnujících podávání pacientovi přípravku popsaného výše v účinném množství. Přípravky pro podávání mohou dále obsahovat farmaceuticky přijatelné excipienty, protilátky konjugované s chemoterapeutickým agens a protilátky podávané v kombinaci s nekonjugovanými chemoterapeutickými agens.

Způsoby podle předkládaného vynálezu jsou zejména užitečné při modulaci růstu nádorové buňky a/nebo léčení pacienta (tj. člověka) majícího nádor, kde nádorová buňka je vybrána ze skupiny, kterou tvoří buňky prsu, varlat, tračníku, plic, vaječníku, močového měchýře, dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku.

V ještě dalším provedení předkládaný vynález zahrnuje způsoby pro určení toho, zda tkáň exprimuje Cripto, kteréžto způsoby zahrnují krok, kdy se analyzuje tkáň pacienta v imunotestu s použitím kterýchkoliv protilátek popsaných výše. Vynález také zahrnuje způsoby pro určení toho, zda buněčná linie exprimuje (nadměrně exprimuje) Cripto, kteréžto způsoby zahrnují krok, kdy se analyzuje buněčná linie v imunotestu s použitím kterýchkoliv protilátek popsaných výše.

Tyto a další aspekty vynálezu jsou uvedeny ještě detailněji v následujícím podrobném popisu vynálezu.

Podrobný popis vynálezu

Byly nalezeny protilátky, které se specificky váží na Cripto, jejich použití pro modulaci signalizace Cripto nebo • ·

• · · · · • ····· · · • · ♦ · ···· · ··· ···

- 9 proteinové interakce a/nebo blokování interakce mezi Cripto a ALK4, a/nebo modulaci růstu nádorové buňky. Byly objeveny různé třídy protilátek, které se specificky váží na Cripto, včetně například protilátek, které se specificky vážou na epitop ve vazebné doméně ligand/receptor buďto nativního protein Cripto a/nebo denaturované formy Cripto, protilátek, které se vážou na doménu podobnou EGF, doménu bohatou na cystein nebo peptid (složený např. z přibližně 3 až přibližně 20 aminokyselin) z úseku obsahujícího aminokyselinové zbytky 46 až 150, protilátek, které se váží na Cripto a modulují signalizaci Cripto, protilátek, které se váží na Cripto a modulují růst nádorových buněk, a protilátek, které se váží na Cripto, modulují signalizac Cripto a modulují růst nádorových buněk. Tyto protilátky jsou selektovány s použitím obvyklých in vitro testů pro selekci protilátky, které se váží na vazebnou doménu ligand/receptor, modulují signalizaci Cripto nebo modulují růst nádorových buněk.

Způsoby podle předkládaného vynálezu jsou použitelné při léčení maligní nebo benigních nádorů savců, kde rychlost růstu nádoru (která je pro normální tkáň abnormální rychlostí) je alespoň částečně závislá na Cripto. Abnormální rychlost růstu je taková rychlost růstu, která převyšuje rychlost potřebnou pro normální homeostázu a převyšuje rychlost, která je normální pro tkáně stejného původu.

Definice

V průběhu popisu vynálezu jsou vytvořeny různé definice. Většina termínů má význam, který je jim odborníky běžně přiřazen. Termíny specificky definované buďto v předchozím nebo následujícím textu mají význam odpovídající kontextu • · • ·

- 10 předkládaného vynálezu jako celku a význam, který je běžně odborníkům srozumitelný.

Termín úsek, jak se v tomto textu používá, znamená fyzicky sousedící část primární struktury z biomolekule. V případě proteinu je úsek definován jako souvislá, nepřerušená část aminokyselinové sekvence proteinu.

Termín doména, jak se v tomto textu používá, se týká strukturální část biomolekuly, která přispívá ke známé nebo domnělé funkci biomolekuly. Domény mohou být tzv. koextensivní s úseky nebo jejich částmi, domény mohou také obsahovat část biomolekuly, která je odlišná od konkrétního úseku, navíc kromě celého části úseku. Příklady proteinových domén zahrnují, ale bez omezení, extracelulární doménu (zahrnuje přibližně zbytek 31 až přibližně zbytek 188 Cripto, pro Cripto CR-1 (SEKV. ID. Č. 1) a CR-3 (SEKV. ID. Č. 2)), a transmembránovou doménu (zahrnuje přibližně zbytek 169 až přibližně zbytek 188 Cripto, a to pro Cripto CR-1 (SEKV. ID. Č. 1) a CR-3 (SEKV. ID. Č. 2)). Vazebná doména ligand/receptor Cripto proteinu zahrnuje přibližně zbytek 75 až přibližně zbytek 150 Cripto, a to pro Cripto, CR-1 (SEKV. ID. Č. : 1) a CR-3 (SEKV. ID. Č. 2) a zahrnuje EGF podobnou doménu Cripto, která zahrnuje přibližně 75 až přibližně zbytek 112 Cripto, a to pro Cripto, CR-1 (SEKV. ID. Č. : 1) a CR-3 (SEKV. ID. Č. 2) a doménu bohatou na cystein Cripto, která zahrnuje přibližně zbytek 114 až přibližně zbytek 150 Cripto, a to pro Cripto, CR-1 (SEKV. ID. Č. : 1) a CR-3 (SEKV. ID. Č.

2). Například mnoho monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu byly identifikováno jako protilátky, které se váží k EGF podobné doméně nebo cys bohaté doméně. Dále monoklonální protilátka A10B2.18 (ATCC přístupové č. PTA3311), B3F6.17 (ATCC přístupové č. PTA-3319) a A17A2.16 byly

- 11 identifikovány jako protilátky, které se váži na epitop vytvořený v doméně v úseku zahrnujicim aminokyselinové zbytky 46 až 62, v protisměru („upstream) od EGF podobné domény (viz přiklad 3 dále). Epitop ve vazebné doméně ligand/receptor je epitop, ať už je vytvořen v konformačně nativním Cripto proteinu nebo denaturovaném Cripto proteinu, na který se protilátky mohou vázat.

Termín protilátka, jak se v tomto textu používá, se týká kompletní, neporušené protilátky, fragmentů Fab, Fab', F(ab)₂ a dalších fragmentů protilátky. Kompletní, neporušené protilátky zahrnují, ale bez omezení, monoklonální protilátky jako například myší monoklonální protilátky, polyklonální protilátky, chimérické protilátky, humánní protilátky a humanizované protilátky. Různé formy protilátek mohou být připraveny s použitím standardní rekombinantní DNA techniky (Winter a Milstein, Nátuře 349: 293-99, 1991). Tak například mohou být konstruovány chimérické protilátky, ve kterých vazebná doména pro antigen ze zvířecí protilátky je spojena s humánní konstantní doménou (protilátka pocházející původně ze savce s výjimkou člověka, ve které byla technikami rekombinantní DNA nahrazena část nebo celá kloubová část a konstantní úsek těžkého řetězce a/nebo konstantní úsek lehkého řetězce odpovídajícími úseky lehkého řetězce nebo těžkého řetězce humánního imunoglobulinu) (viz např., Cabilly et al., United States patent 4 816 567, Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 81: 6851-55, 1984). Chimérické protilátky redukují imunogenní reakci vyvolanou zvířecími protilátkami, když jsou použity u člověka při klinické léčbě.

Kromě toho mohou být syntetizovány rekombinantní humanizované protilátky. Humanizované protilátky jsou protilátky zpočátku pocházející ze savce s výjimkou člověka, * · • · · ·

- 12 ve kterých rekombinantní DNA technologie byla použita k náhradě některých nebo všech aminokyselin nepotřebných pro vazbu antigenu aminokyselinami z odpovídajících úseků lehkého nebo těžkého řetězce humánního imunoglobulinu. To znamená, že to jsou chiméry obsahující většinu sekvence humánního imunoglobulinu, do kterého byly vloženy úseky zodpovědné za specifickou vazbu antigenu (viz např. PCT přihláška publikovaná jako WO 94/04679). Zvířata jsou imunizována požadovaným antigenem, odpovídající protilátky jsou izolovány a část sekvence variabilního úseku zodpovědná za specifickou vazbu antigenu je odstraněna. Vazebné úseky pro antigen pocházející ze zvířat jsou pak klonovány do vhodné polohy genu humánní protilátky, ze kterého byly vazebné úseky pro antigen odstraněny. Humanizované protilátky minimalizují použití heterologní (mezidruhové) sekvence v protilátkách pro použití v humánní terapii a tudíž jsou méně náchylné k vyvolání nežádoucí imunitní reakce. Podobně mohou být vytvořeny i primatizované protilátky.

Další provedení vynálezu zahrnuje použití humánních protilátek, které mohou být produkovány ve zvířatech s výjimkou člověka, jako jsou například transgenní zvířata nesoucí jeden nebo více transgenů pro humánní imunoglobulin. Taková zvířata mohou být použita jako zdroj splenocytů pro přípravu hybridomů, jak je to popsána v patentu U.S. č. 5 569 825.

Protilátkové fragmenty a univalentní protilátky mohou být také použity ve způsobech a přípravcích podle předkládaného vynálezu. Univalentní protilátky zahrnují dimer těžký řetězec/lehký řetězec navázaný k Fc (nebo stonkovému) úseku druhého těžkého řetězce. Fab úsek se týká těch úseků řetězců, které jsou zhruba ekvivalentní nebo analogické,

- 13 k sekvencím, které zahrnují jako celek části těžkého řetězce a lehkého řetězce ve tvaru Y, a který kolektivně (v agregátech) projevují protilátkovou aktivitu. Fab protein zahrnuje agregáty jednoho těžkého a jednoho lehkého řetězce (obecně známé jako Fab'), a také tetramery, které odpovídají dvěma rozvětveným segmentům protilátky tvaru Y (obecně známé jako F(ab)₂), ať jsou již agregovány kovalentně nebo nekovalentně, pokud je agregát schopný specificky reagovat s určitým antigenem nebo rodinou antigenů.

Kterákoliv z protilátek podle předkládaného vynálezu může být volitelně konjugovaná s chemoterapeutickým agens, jak bude definováno dále.

Termín vazba, jak se v tomto textu používá, znamená fyzikální nebo chemickou interakci mezi dva proteiny nebo sloučeninami nebo asociovanými proteiny nebo sloučeninami nebo jejich kombinacemi, zahrnující interakce mezi protilátkou a proteinem. Vazba zahrnuje iontovou, neiontovou a vodíkovou vazbu, Van der Waalsovu vazbu, hydrofobní interakce apod. Fyzikální interakce, vazba, může být buď přímá nebo nepřímá, kdy nepřímá je zprostředkována účinky dalšího proteinu nebo sloučeniny. Přímý vazba se týká interakce, která není zprostředkována účinky dalšího proteinu nebo sloučeniny, ale je naproti tomu bez dalších podstatných chemických meziproduktů. Vazba může být detekována mnoha různými způsoby. Metody detekce vazba jsou odborníkům dobře známy.

Termín protilátka schopná internalizovat Cripto, jak se v tomto textu používá, označuje protilátku, která vstupuje do buňky zatímco odstraňuje Cripto z buněčného povrchu. Lze provádět screening na Cripto protilátky, které jsou schopné internalizovat Cripto, s použitím fluorescenčně značené Cripto monoklonální protilátky. Aby bylo možné určit, které ♦ ·

- 14 protilátky internalizují do Cripto pozitivních buněk, lze provádět test na přijímání fluorescenčního signálu protilátek do buněk tak, že se buňky prohlížejí pod fluorescenčním a/nebo konfokálním mikroskopem. Ty protilátky, které jsou internalizovány, jsou viditelné jako fluorescenční signály v cytoplazmě a nebo buněčných vezikulech. Příklady, avšak neomezujícími rozsah vynálezu, Cripto protilátek schopných internalizovat Cripto jsou A27F6.1 a B3F6.17.

Termín sloučenina, jak se v tomto textu používá, znamená jakoukoliv identifikovatelnou chemickou entitu nebo molekulu, včetně iontu, atomu, malé molekuly, peptidu, proteinu, sacharidu, nukleotidu nebo nukleové kyseliny, aniž by tento výčet byl omezující, přičemž sloučenina může být buďto přírodní nebo syntetická.

Termíny moduluje nebo modifikuje, jak se v tomto textu používají, znamenají zvýšení nebo pokles množství, kvality nebo účinku konkrétní aktivity nebo proteinu.

Termín moduluje signalizaci Cripto, jak se v tomto textu používá, znamená zvýšení nebo pokles v množství, kvalitě nebo účinku aktivity Cripto, přibližně o 5 %, výhodně 10 %, výhodněji 20 %, výhodněji 30 %, výhodněji 40 %, výhodněji 50 %, výhodněji 60 %, výhodněji 70 %, výhodněji 80 %, výhodněji 90 % a nejvýhodněji 100 %. Aktivita může být měřena testy známými v oboru, jako je například nulový buněčný test popsaný v příkladu 3. V dalším provedení proteinová interakce mezi Cripto a dalším proteinem je podobně modulována klesajícím směrem prostřednictvím vazby protilátky podle vynálezu.

Termín blokáda interakce mezi Cripto a ALK 4, jak se v tomto textu používá, znamená zvýšení nebo pokles interakce, tj . vazby, mezi Cripto a ALK4, přibližně o 5 %, výhodně 10 %, • «

- 15 výhodněji 20 %, výhodněji 30 %, výhodněji 40 %, výhodněji %, výhodněji 60 %, výhodněji 70 %, výhodněji 80 %, výhodněji 90 % a nejvýhodněji o 100%. Aktivita může být měřena testy známými v oboru, jako je například vazebný test popsaný v příkladu 8.

Termín modulace růstu nádorové buňky in vitro, jak se v tomto textu používá, znamená zvýšení nebo pokles počtu nádorových buněk in vitro, přibližně o 5 %, výhodně 10 %, výhodněji 20 %, výhodněji 30 %, výhodněji 40 %, výhodněji %, výhodněji 60 %, výhodněji 70 %, výhodněji 80 %, výhodněji 90 % a nejvýhodněji o 100 %. In vitro modulace růstu nádorových buněk může být měřena testy známými v oboru, jako je například test s GEO buňkami v měkkém agaru popsaný v příkladu 4.

Termín modulace růstu nádorové buňky in vivo, jak se v tomto textu používá, znamená zvýšení nebo pokles počtu nádorových buněk in vivo, přibližně o 5 %, výhodně 10 %, výhodněji 20 %, výhodněji 30 %, výhodněji 40 %, výhodněji %, výhodněji 60 %, výhodněji 70 %, výhodněji 80 %, výhodněji 90 % a nej výhodněj i 100 %. In vivo modulace růstu nádorových buněk může být měřena testy známými v oboru, jako je například test popsaný v příkladu 5.

Termín prevence se týká snížení pravděpodobnosti, že organizmus získá nebo se u něho vyvine abnormální stav (nemoc).

Termín léčení se týká terapeutického účinku a alespoň částečného zmírnění nebo úplného potlačení abnormálního stavu (nemoci) v organismu. Léčení zahrnuje také udržování inhibice nádorového růstu a indukci remise.

Termín terapeutický účinek se týká inhibice abnormálního stavu (nemoci). Terapeutický účinek vede • · • · · · ···· · ·

- 16 v určitém rozsahu k úlevě od jednoho nebo více symptomů abnormálního stavu (nemoci). Ve vztahu k léčení nenormálního stavu (nemoci) terapeutický účinek se týká jednoho nebo více z následujících: (a) zvýšení nebo pokles proliferace, růstu a/nebo diferenciace buněk, (b) inhibice (tj . zpomalení nebo zastavení) nebo podpora (indukce) buněčné smrti, (c) inhibice degenerace, (d) úleva v určitém rozsahu od jednoho nebo více symptomů asociovaných s abnormálním stavem a (e) zesílení funkce populace buněk. Sloučeniny projevující účinky proti nenormálním stavům (nemocem) mohou být identifikovány postupy, jak jsou popsány v tomto textu.

Termín podávání se týká způsobu začlenění sloučenin do buněk nebo tkání organismu. Abnormální stav může být předcházen nebo léčen, když buňky nebo tkáně organizmu jsou přítomny v organizmu, nebo když jsou mimo organizmus. Buňky existující mimo organizmus mohou být udržovány nebo dále kultivovány v miskách tkáňových kultur nebo v jiném organizmu. Pro buňky uvnitř organizmu existuje v oboru mnoho známých způsobů, jak podávat sloučeniny, které zahrnují (bez omezení) perorální, parenterální, dermální, injekční a aerosolové aplikace. Pro buňky mimo organizmus existuje v oboru mnoho známých způsobů, které zahrnují (bez omezení) postupy buněčné mikroinjekce, transformace a postupy s nosičem. Podávání může být uskutečněno jedním z mnoha způsobů známých v oboru, jako je např. způsob perorální, intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární, apod. Když je použita in vivo terapie, protilátky podle vynálezu jsou podávány pacientovi v účinném množství. Termín účinné množství, jak se v tomto textu používá, označuje množství dostatečné k tomu, aby způsobilo prospěšný nebo požadovaný klinický výsledek (tj . množství, které eliminuje nebo redukuje pacientovu nádorovou zátěž). Účinné množství může být podáno v jednom nebo více podáních.

- 17 Pro účely tohoto vynálezu, účinné množství protilátek podle předkládaného vynálezu je takové množství protilátek, které je dostatečné ke zlepšení, stabilizaci nebo zdržení rozvoje onemocnění asociovaného s Cripto, konkrétně nádorů asociovaných s Cripto. Detekce a měření těchto indikátorů účinnosti jsou diskutovány ještě níže. Příklad typického léčebného schématu zahrnuje podávání pacientovi intravenózní infúze protilátky podle vynálezu v týdenním režimu, v dávce přibližně 2 až 5 mg/kg. Protilátky jsou podávány pacientovi ambulantně na chemoinfúzní jednotce, pokud pacient nevyžaduje hospitalizaci. Připadají v úvahu i jiné dávkovači režimy, které jsou odborníkům známé.

Abnormálním stavům (nemocem) lze předcházet nebo mohou být léčeny podáváním protilátky podle vynálezu skupině buněk, která projevuje odchylku v dráze signální transdukce do organizmu. Účinek podávání sloučenina na funkce organizmu pak může být monitorován. Organizmus je výhodně organizmus člověka.

Termín nadměrná exprese Cripto znamená expresi Cripto ve tkáních, kde exprese je větší než exprese Cripto v přilehlé normální tkáni ve statisticky významné výši.

Termín chemoterapeutikum se týká jakéhokoliv agens známého v oboru jako agens mající terapeutický účinek na inhibici nádorového růstu, udržení inhibice růstu nádoru a/nebo indukce remise, jako jsou například přírodní sloučeniny, syntetický sloučeniny, proteiny, modifikované proteiny a radioaktivní sloučeniny. Chemoterapeutická agens zahrnují agens, která mohou být konjugována s protilátkami podle předkládaného vynálezu nebo alternativní agens, která mohou být použita v kombinaci s protilátkami podle předkládaného vynálezu aniž by byla konjugována

V 999 ·

- 18 • 99 9 s protilátkou. Příklady chemoterapeutik, která mohou být konjugována s protilátkami podle předkládaného vynálezu, zahrnují radiokonjugáty (90Y, 1311, 99mTc, Hlín, 186Rh a další) , nádorem aktivovaná předléčiva (maytansinoidy, analogy CC-1065, deriváty clicheámicinu, anthracykliny, alkaloidy z barvínku (Vinca sp.) a další), ricin, difterický toxin, exotoxin z Pseudomonas, přičemž tento výčet není omezující.

Chemoterapeutická agens, která mohou být použita v kombinaci s protilátkami podle vynálezu, spíše než s nimi být konjugována (tj. nekonjugovaná chemoterapeutika), zahrnují, následující agens: platinu (např. cis analogy nukleosidů (purinu a ale bez omezení, platinu), anthracykliny, pyrimidinu) , taxany, csmptotheciny, epipodophyllotoxiny, činidla alkylující (Vinca) , estrogenu, z barvínku inhibitory androgenu,

DNA, antagonisté folátu, alkaloidy ihhibitory ribonukleotidreduktázy, inhibitory progesteronu, inhibitory inhibitory aromatázy, interferony, interleukiny, monoklonální protilátky, taxol, camptosar, adriamycin (dox),

5-FU a gemcitabin. Takový chemoherapeutika mohou být použity v realizaci vynálezu v kombinaci s protilátkami podle vynálezu tak, že se společně podává (ko-administrace) protilátka a nekonjugované chemoterapeutikum.

Termín farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient se týká biologicky inertní sloučeniny známé v oboru a používané při podávání protilátky podle vynálezu. Přijatelné nosiče jsou v oboru dobře známy a jsou popsány například v publikaci: Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., 1990. Přijatelný nosiče zahrnují biologicky kompatibilní, inertní nebo bioabsorbovatelné soli, pufrovací činidla, oligo- nebo polysacharidy, polymery, viskoelastické sloučeniny jako je například hyaluronová kyselina, viskozitu • « · « ·

- 19 upravující činidla, konzervační činidla apod.

Termín pacient se týká obratlovců, zejména konkrétné druhů savců, a zahrnuje domácí zvířata, sportovní zvířata a primáty, včetně lidí, aniž by tento výčet byl omezující.

Protilátky podle vynálezu

Protilátky podle vynálezu se specificky váží na Cripto: Jak se v tomto textu používá, termín Cripto zahrnuje protein CR-1 Cripto, protein CR-3 Cripto a jejich fragmenty. Takové fragmenty mohou být celé domény, jako například extracelulární nebo intracelulární domény, EGF-podobná doména, cys-bohatá doména, vazebná doména pro receptor apod. Tyto fragmenty mohou také obsahovat souvislé i nesouvislé epitopy kterýkoliv domény Cripto proteinu.

Sekvence CR-1 obsahující 188 aminokyselin je následující [SEKV. ID. Č. 1]:

MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDS IWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPS FYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCD GLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGI CLS IQS YY

Sekvence CR-3 obsahující 188 aminokyselin je následující [SEKV. ID. Č. 2]:

MDCRKMVRFSYSVIWIMAISKAFELGLVAGLGHQEFARPSRGDLAFRDDS

IWPQEEPAIRPRSSQRVLPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLESFCACPPSF

YGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGL

VMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLAGICLSIQSYY

- 20 Příkladem uvažovaného zahrnující přibližně

V jednom provedení se protilátky podle vynálezu vážou na epitop v EGF-podobné doméně Cripto. EGF-podobná doména zahrnuje přibližně aminokyselinový zbytek 75 až přibližně aminokyselinový zbytek 112 zralého proteinu Cripto. Epitopy v EGF-podobné doméně mohou zahrnovat lineární nebo nelineární úsek aminokyselinových zbytků.

lineárního epitopu je epitop aminokyselinové zbytky 75-85, 80-90, 85-95, 90-100, 95-105,

100-110 nebo 105-112, aniž by tento výčet byl omezující. V jednom provedení epitop v EGF doméně je epitop vytvořený v konformačně nativním Cripto proteinu proti denaturovanému Cripto proteinu.

V dalším provedení se protilátky podle vynálezu váží na epitop v cys-bohaté doméně Cripto. Cys-bohatá doména zahrnuje přibližně aminokyselinový zbytek 114 až přibližně aminokyselinový zbytek 150 zralého Cripto proteinu. Epitopy v cys-bohaté doméně mohou zahrnovat lineární nebo nelineární úsek aminokyselinových zbytků. Příkladem uvažovaného lineárního epitopu je epitop zahrnující přibližně aminokyselinové zbytky 114-125, 120-130, 125-135, 130-140,

135-145 nebo 140-150, aniž by tento výčet byl omezující. V jednom provedení epitop v cys-bohaté doméně je epitop vytvořený v konformačně nativním Cripto protein proti denaturovanému Cripto proteinu.

Jakmile jsou jednou protilátky vytvořeny, vazba protilátek na Cripto může být testována s použitím standardních technik známých v oboru, jako je například ELISA, a přítomnost Cripto na buněčném povrchu může být testována s použitím průtoková cytometrie (FACS), jak je ukázáno v příkladu 2. Alternativně mohou být použity kterékoliv další způsoby měření takové vazby.

• · · · « • · « · « · · • « · *

Předkládaný monoklonální a vynález poskytuje protilátky (např. polyklonální protilátky, jednořetězcové protilátky, protilátky, protilátky chimérické protilátky, bifunkční/bispecifické humanizované protilátky, humánní protilátky a s roubovaným úsekem určujícím komplementaritu (CDR), včetně sloučenin, které obsahují CDR sekvence, které specificky rozpoznávají polypeptid podle vynálezu) specifické pro Cripto nebo jejich fragmenty. Protilátkové fragmenty, včetně Fab, Fab', F(ab')₂ a F_v jsou také poskytnuty ve vynálezu. Termíny specifický a selektivní, když jsou použity k popisu vazby protilátky podle vynálezu, ukazují, že variabilní úseky protilátky podle vynálezu rozpoznávají Cripto polypeptidy a také se na ně váží. Je třeba rozumět, že specifické protilátky podle vynálezu mohou také interagovat s dalšími proteiny (například protein S. aureus nebo další protilátky v testu ELISA) prostřednictvím interakce se sekvencemi vně variabilních úseků protilátky, a zejména v konstantním úsek molekuly. Screeningové testy k určení vazebné specifity protilátky podle vynálezu (tj. protilátky, která se specificky váže na epitop vazebné domény ligand/receptor a domény zahrnující aminokyselinové zbytky 46-62) jsou známy a rutinně prováděny. Pro obsažnou diskusi o takových testech viz Harlowa et al. (Eds.), Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988), Kapitola 6. Protilátky, které rozpoznávají a vážou fragmenty Cripto proteinu jsou také zvažovány, za předpokladu, že protilátky jsou specifické pro Cripto polypeptidy. Protilátky podle vynálezu mohou být vytvořeny užitím kteréhokoliv způsobů v oboru známého a rutinně prováděného.

V jednom provedení vynález poskytuje protilátku, která se specificky váže na epitop vazebné domény ligand/receptor Cripto. Protilátkové specifita je popsána ještě detailněji • ·

- 22 níže. Nicméně mělo by být zdůrazněno, že protilátky, které mohou být připraveny z jiných polypeptidů, které již dříve byly popsány v literatuře a které jsou schopné náhodně zkříženě reagovat s Cripto (např. v důsledku náhodné existence podobného epitop v obou polypeptidech) jsou považovány za zkříženě reaktivní protilátky. Takové zkříženě reaktivní protilátky nejsou protilátky, které jsou specifický pro Cripto. Stanovení toho, zda se protilátka specificky váže na epitop Cripto, se provádí s použitím jakéhokoliv ze známých testů, jako je například Western blot, které jsou dobře známy v oboru. Pro identifikaci buněk exprimujících Cripto a také pro modulaci vazebné aktivity Cripto ligand/receptor, jsou zvláště použitelné protilátky, které se specificky váží na extracelulární epitop Cripto proteinu (tj . část Cripto proteinu nacházející se vně buňky).

V jednom provedení vynález poskytuje bezbuněčnou kompozici obsahující polyklonální protilátky, kde alespoň jedna z protilátek je protilátka podle vynálezu specifická pro Cripto. Antiséra izolovaná ze zvířat jsou příkladem takové kompozice, stejně jako kompozice obsahující protilátkovou frakci z antiséra, která byla resuspendována ve vodě nebo v jiném ředidle, excipientů nebo nosiči.

V dalším provedení vynález poskytuje monoklonální protilátky. Monoklonální protilátky jsou vysoce specifické, neboť jsou namířeny proti jedinému antigennímu místu. A dále, na rozdíl od polyklonálních preparátů, které typicky zahrnují různé protilátky namířené proti různým epitopům, každá monoklonální protilátka je namířena proti jediné determinantě na antigenu. Monoklonální protilátky jsou užitečné ke zlepšení selektivity a specifity postupů při diagnostických a analytických testech využívajících vazby antigen-protilátka.

• · · · ·

- 23 Další výhodou monoklonálních protilátek je to, že sou syntetizovány hybridomovou kulturou, nekontaminovanou jinými imunoglobuliny. Hybridomy, který produkují protilátky podle vynálezu, jsou také zahrnuty jakožto aspekty vynálezu.

V ještě dalším příbuzném provedení vynález poskytuje anti-idiotypové protilátky specifické pro protilátku, která je specifická pro Cripto. Pro detailnější diskusi o antiidiotypových protilátkách viz např. patenty U.S. č. 6 063 379 a 5 780 029.

Je dobře známo, že protilátky obsahují relativně malé domény pro vazbu antigenu, které mohou být izolovány chemickými nebo rekombinantní technikami. Takové domény jsou samotné užitečné jako molekuly vážící Cripto a mohou být zpětně vneseny do humánních protilátek nebo fúzovány s chemoterapeutickým agens nebo polypeptidem. Takže v ještě dalším provedení vynález poskytuje polypeptid obsahující fragment Cripto-specifické protilátky, kde fragment a asociovaná molekula, jestliže je nějaká taková, se váží na Cripto. Jako neomezující příklady vynález poskytuje polypeptidy, který jsou jednořetězcové protilátky a CDRroubované protilátky. Pro detailnější diskusi o CDRroubovaných protilátkách viz např. patent U.S. č. 5 859 205.

V jiném provedení protilátky jiného než lidského původu mohou být humanizovány kteroukoliv z metod známých v oboru. Humanizované protilátky jsou použitelný pro in vivo terapeutické aplikace. Kromě toho mohou být syntetizovány rekombinantní humanizované protilátky. Humanizované protilátky jsou protilátky pocházející původně ze savce jiného než člověka, ve kterých byla metody rekombinantní DNA použita k náhradě některých nebo všech aminokyselin nepotřebných pro vazbu antigenu aminokyselinami z odpovídajících úseků lehkého • · · · ·

- 24 nebo těžkého řetězce humánního imunoglobulinu. Čili chiméry obsahují většinou humánní imunoglobulinové sekvence, do kterých byly vloženy úseky zodpovědné za specifickou vazbu antigenu (viz např. PCT patentová přihláška WO 94/04679). Zvířata jsou imunizována požadovaným antigenem, odpovídající protilátky jsou izolovány a část sekvence variabilního úseku zodpovědná za specifickou vazbu antigenu je vyjmuta. Vazebný úsek pro antigen pocházející ze zvířete je pak klonován do vhodné polohy v genu humánní protilátky, ze kterého byly odstraněny úseky pro vazbu antigenu. Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (mezidruhových) sekvencí v protilátkách při použití při léčení člověka a jsou tudíž méně náchylné k vyvolání nežádoucí imunitní reakce. Podobně mohou být vytvořeny primatizované protilátky s použitím protilátkových genů primátů (např. makak „rhesus (Macaca mullata) , pavián a šimpanz). Další změny mohou pak být vneseny do rámcových úseků protilátky, aby byla modulována afinita nebo imunogenicita protilátky (viz např. patenty U.S. č. 5 585 089, 5 693 761, 5 693 762 a 6 180 370).

Další provedení vynálezu zahrnuje použití humánních protilátek, které mohou být připraveny ve zvířatech odlišných od člověka, jako jsou například transgenní zvířata nesoucí jeden nebo více transgenů pro humánní imunoglobulin. Taková zvířata mohou být použita jako zdroj splenocytů pro přípravu hybridomů, jak je např. popsáno v patentu U.S. č. 5 569 825, a PCT přihláškách W000076310, W000058499 a W000037504, které jsou celé zahrnuty formou odkazu v tomto text

Modulace signálu

V dalším provedení vynálezu, protilátky podle vynálezu se váží na Cripto a modulují signalizaci Cripto nebo interakce Cripto-protein. Nadměrná exprese Cripto aktivity může vést k dediferenciovanému stavu, který podporovat mesenchymální buněčné charakteristiky, zvýšené proliferací a buněčné migraci (Salomon et al. , BioEssays 21: 61-70, 1999, Ciardiello et al., Oncogene 9: 291-298, 1994, and Baldassarre et al., Int. J. Cancer 66:538-543, 1996), fenotypy asociované s buněčnou transformací pozorované u neoplázií.

Jeden ze způsobů testování aktivity anti-Cripto protilátek a jejich schopnosti modulovat Cripto signalizaci je buněčná linie F9-Cripto KO (Knock-out) (Minchiotti et al., Mech. Dev. 90: 133-142, 2000). Cripto stimuluje fosforylaci smad2 a transkripční faktor FAST v embryích Xenopus, aktivita transkripčního faktoru FAST může být monitorována měřením luciferázové aktivity konstruktu FAST regulační elementluciferázový reportérový gen (Saijoh et al., Mol. Cell 5:3547, 2000). F9-Cripto KO buňky mají odstraněný Cripto gen a jsou tak nulitní pro Cripto a Cripto-závislou signalizaci (Minchiotti et al., Mech. Dev. 90:

signalizace může být hodnocena v transfekovaných genovým konstruktem regulační element-luciferáza. Žádná Cripto-závislá FAST luciferázová aktivita nebude v této buněčné linii pozorována, dokud do nich není transfekována Cripto cDNA a FAST cDNA. Protilátky schopné blokovat Cripto-závislou nodální signalizaci jsou protilátky, které blokují signalizační funkci Cripto.

133-142, 2000) F9 Cripto KO Cripto, FAST

Cripto buňkách a FAST

Odborníci mohou použít i další testy schopné měřit aktivitu Cripto, jako například test růstu v měkkém agar (viz příklad 4 níže). Schopnost buněk růst v měkkém agaru je asociována s buněčnou transformací a test je klasický in vitro • · • ·

- 26 test pro měření inhibice růstu nádorových buněk. Další testy použitelné pro určení inhibice aktivity zahrnují in vitro testy na plastu apod.

Terapeutické použití

Protilátky podle vynálezu jsou také terapeutické účely, jako například pro nádorových buněk, pro diagnostické účely kvantifikaci Cripto a pro purifikaci Cripto.

použitelné pro modulaci růstu k detekci nebo

V jednom provedení vynálezu jsou poskytnuty protilátky, které jsou schopné se specificky vázat na Cripto a které modulují růst nádorové buňky u pacienta. V jednom provedení nádorové buňky jsou buňky varlat, prsu, tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku.

V dalším provedení jsou poskytnuty protilátky, které jsou schopný se specificky vázat na Cripto a který modulují růst nádorových buněk, které nadměrně exprimuji Cripto. V jednom provedení nádorové buňky jsou buněčné linie, které nadměrně exprimuji Cripto, jako například buněčné linie pocházející z karcinomu prsu, varlat, tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, dělohy, děložního krčku, pankreatu a žaludku.

Anti-Cripto protilátky mohou být podrobeny screeningu na in vivo aktivitu jako potenciální protinádorová agens podle standardních protokolů používaných odborníky, jak je ukázáno v příkladu 4 níže. Příklad takových protokolů byl zveřejněn National Cancer Institute (NCI) v protokolech in vivo cancer models screening, NIH publikace č. 84-2635 (únor 1984).

- 27 V dalším provedení vynálezu jsou protilátky podle vynálezu použity k léčbě pacientů majících rakovinný nádor.

Protilátky předkládaného vynálezu mohou být kombinovány s farmaceuticky přijatelným excipientem a podávány v terapeuticky účinných dávkách pacientovi. Pro diskusi o metodách inhibice růstu nádorů viz např. patent U.S. č. 6 165 464.

Také jsou uvažovány metody léčení pacientů trpících chorobným stavem asociovaným s abnormálními hladinami (tj. zvýšenou nebo sníženou) Cripto, kde způsob zahrnuje podávání pacientovi účinného množství protilátky, která se specificky váže na epitop vazebné domény ligand/receptor Cripto, včetně epitopu, který je EGF-podobné doméně nebo cys-bohaté doméně Cripto, aniž by tyto byly omezující.

Také jsou uvažovány metody léčení pacientů trpících chorobným stavem asociovaným s abnormálními hladinami (tj. zvýšenou nebo sníženou) Cripto, kde způsob zahrnuje podávání pacientovi účinného množství protilátky, která specificky vytváří komplex s Cripto a je namířena proti epitopu, proti kterému je namířena protilátka vybraná ze skupiny, kterou tvoří A6C12.il, A6F8.6 (ATCC přístupové č. PTA-3318), A7H1.19, A8F1.30, A8G3.5 (ATCC přístupové č. PTA-3317), A8H3.1 (ATCC přístupové č. PTA-3315), A8H3.2, A19A10.30, A10B2.18 (ATCC přístupové č. PTA-3311), A27F6.1 (ATCC přístupové č. PTA3310), A40G12.8 (ATCC přístupové č. PTA-3316) , A2D3.23,

A7A10.29, A9G9.9, A15C12.10, A15E4.14, A17A2.16, A17C12.28,

A17G12.1 (ATCC přístupové č. PTA-3314), A17H6.1, A18B3.il (ATCC přístupové č. PTA-3312), A19E2.7, B3F6.17 (ATCC přístupové č. PTA-3319) a B6G7.10 (ATCC přístupové č. PTA3313) .

Diagnóza prostřednictvím detekce Cripto je snadno

- 28 uskutečněna standardními vazebnými testy s použitím nové protilátky podle vynálezu, což dovoluje odborníkům detekovat přítomnost Cripto specificky v široké škále různých vzorků, buněčných kultur apod.

Soupravy (křty) obsahující protilátku podle vynálezu pro kterýkoliv z účelů popsaných v tomto textu jsou také zahrnuty ve vynálezu. Obecně, souprava podle vynálezu také obsahuje kontrolní antigen, pro který je protilátka imunospecifická. Provedení vynálezu se týkají souprav obsahujících všechna potřebná činidla a instrukce pro jejich použití.

Další rysy vynálezu budou zjevné z následujících názorných příkladů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese a purifikace Cripto

Expresní plazmid nazvaný pSGS480 byl konstruován subklonováním cDNA kódující Cripto aminokyselinové zbytky 1 až 169 [aminokyseliny 1-169 SEKV. ID. Č. 1] humánního Cripto, fúzované s humánní Fc doménou IgGi (tj. CR(delC)-Fc) do vektoru pEAGUOO. Pro detailnější popis tohoto vektor viz společně projednávaná patentová přihláška U.S. č. 60/233,148, podaná 18. září 2000. Vektor pEAGUOO je derivát plazmidu pCMV-Sport-betagal od firmy GIBCO-BRL Life Technologies, jehož použití při tranzientní transfekci CHO bylo popsáno • ·

- 29 v publikaci Schifferli et al., 1999, Focus 21: 16. Byl vytvořen tím, že se odstranil Notl fragment reportérového genu β-galaktosidázy z plazmidů pCMV-Sport- betagal (katalogové č. 10586-014) následujícím postupem: Plazmid byl štěpen Notl a EcoRV, hlavní Notl fragment vektoru velikosti 4,38 kb byl purifikován z gelu a ligován. Ligovaná DNA byla transformována do kompetentních buněk E. coli DH5 alfa. pEAGUOO byl izolován jako plazmid obsahující požadovanou rekombinantu z jediné izolované kolonie. Sekvence pEAGUOO zahrnující promotor, polylinker a signál terminace transkripce byla potvrzena.

Plazmid pSGS480 byl přechodně transfekován do buněk CHO a buňky byly pěstovány ve 28 °C po dobu 7 dnů. Přítomnost CR(delC)-Fc proteinu v těchto buňkách a kondicionovaném médiu byla vyšetřena analýzou Western blot. Pro Western blot analýzu bylo kondicionované médium a buňky transfekované Cripto podrobeny SDS-PAGE na 4-20% gradientovém gelu za redukčních podmínek, pak byl proveden elektroforetický přenos na nitrocelulózu a fúzní protein Cripto byl detekován užitím králičího polyklonálního antiséra připraveného proti Cripto peptidovému 17-meru (který obsahoval aminokyselinové zbytky 97-113 ze SEKV. ID. Č. 1) konjugovanému s hemokyaninem přílipky. Po odstranění buněk centrifugací ukázala Western blot analýza, že CR(delC)-Fc protein byl účinně sekretován do kondicionovaného média (supernatantu). Supernatant byl nanesen na kolonu Protein A-Sepaharose (Pharmacia) a navázaný protein byl eluován 25mM fosforečnanem sodným s pH 2,8, lOOmM NaCl. Eluovaný protein byl neutralizován 0,5M fosforečnanem sodným s pH 8,6 a analyzován na celkový obsah proteinu měřením absorbance v 240-340 nm a pak na čistotu užitím SDS-PAGE. Eluovaný protein byl filtrován přes 0,2μfiltr a uložen při teplotě -70 °C.

0 0 • 0 0

0 0 • 0 0 0 0 0

- 30 0·0<

• 0 · ·

0· 0 «

Příklad 2

Vytvoření a screening protilátek

Eluovaný CR(delC)-Fc protein byl injikován myším a pomocí standardní hybridomové techniky, která je odborníkům známa, byly připraveny monoklonální protilátky.

A. Vytvoření protilátek

Konkrétně, samice myší kmene Robertson (Jackson Labs) byly imunizován intraperitoneálně 25 μg purifikovaného humánního CRdelC-Fc emulgovaného v úplném Freundově adjuvans (GibcoBRL katalog. č. 15721-012). Byly posíleny („boost) dvakrát intraperitoneálně 25 μg CRdelC-Fc emulgovaného v neúplném Freundově adjuvans (GibcoBRL katalog, č. 15720-014) a jednou na perličkách s Protein-A. Séra byla podrobena screeningu a 3 týdny po poslední posilovači dávce byly myši s nej lepším titrem dále posíleny intraperitoneální dávkou 50 μρ rozpustného CRdelC-Fc tři dny před plánovanou fúzí. A dále byly myší posíleny intravenózně dávkou 50 gg CRdelC-Fc den před fúzí. Myší slezinné buňky pak byly fúzovány s myelomovými buňkami FL653 v poměru 1:6 (slezina:myelom) a byly naneseny na 96 jamkové tkáňového kultivační destičky se selekčním médiem v množství 100 000, 33000 a 11000 buněk na jamku. Jamky, kde byl pozitivně zaznamenán růst, byly o týden později podrobeny screeningu užitím FACS a ELISA. Byly provedeny dvě fúze.

B. Screening protilátek

Supernatanty získané z první nebo druhý fúze byly podrobeny screeningu nejdříve na destičkách ELISA pro • · · · • · · · · ·

- 31 rozpoznání proteinů Cripto del C a/nebo Cripto EGF-podobná doména. ELISA destičky byl potaženy kontrolním fúzním proteinem (LT-beta receptor-Fc), aby byly odtraněny monoklonální protilátky, které rozpoznávají humánní Fc epitop. ELISA byla jinak provedena postupem, který je popsán popsán níže v části C. V první fúzi, primární supernatanty byly také podrobeny screeningu na schopnost rozpoznávat Cripto protein buněčného povrchu na linii buněk z nádoru varlete NCCIT, a sice užitím FACS. v případě druhé fúze byla schopnost supernatantů rozpoznávat Cripto analyzována užitím FACS na dvou nádorových buněčných liniích, NCCIT a linii buněk karcinomu prsu DU4475. Sekundární screening zahrnoval testování supernatantů na schopnost monoklonální protilátky rozpoznávat Cripto na buněčném povrchu užitím panelu nádorových buněčných linií (viz výsledky uvedené v tabulkách 1 a 2), schopnost monoklonální protilátky rozpoznávat humánní Cripto imunohistochemickým způsobem na tkáňových řezech z humánního nádoru prsu a tračníku, a dále testy na schopnost monoklonální protilátky blokovat Cripto-nodální signalizaci, schopnost blokovat růst nádorové buněčné linie na plastu nebo v měkkém agaru a schopnost internalizovat Cripto buněčného povrchu.

C. ELISA

ELISA testy byly prováděny následujícím způsobem:

Materiál:

Destičky: 96-jamkové destičky „high-binding Easywash od firmy Costar (07-200-642)

2' protilátka: Gt anti- Ms IgG (H⁺L)- HRP od Pierce (P131430) • · · · ·

- 32 Substrát: TMB substrátová Souprava (34021), Pierce

Zastavovací roztok: IN H2SO4

Pufry:

Vazebný pufr: 0,1 M NaHPO₄, pH 9,0

Blokovací pufr: PBS + 10% donorové telecí sérum

Promývací pufr: PBS + 0,1% Tween-20

Antigeny CR-del-C-Fc a CR-EGF-Fc, kontrolní fúzní protein hu IgGl byly naředěny ve vazebném pufru na koncentraci 500 ng/ml. Po 100 μΐ bylo pak naneseno do jamek a inkubováno po dobu 1 hodiny ve 37° C nebo přes noc ve 4° C. Kapalina pak byla slita a destička obrácena a ponechána na sacím papíru do uschnutí. Pak bylo přidáno 250 μΐ/jamku blokovacího pufru, následovala inkubace po dobu 30 minut ve 37 ⁰ C. Znovu pak byla kapalina slita a destička obrácena a ponechána na sacím papíru do uschnutí. Supernatanty byly naředěny 1:50 v promývacím pufru a naneseny po 50 μΐ/jamka, následovala inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Destičky pak byly promyty 3X důkladně 250 μΐ/jamka promývacího pufru. Pak bylo přidáno 100 μΐ/jamka sekundární (2') protilátky naředěné promývacím pufrem 1:10000, následovala inkubace po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Destičky pak byly pak promyty 3X důkladně 250 μΐ/jamka promývacího pufru a pak byl přidán substrát v množství ΙΟΟμΙ/jamka. Barva byla ponechána vyvíjet až k dosažení dostatečné tmavosti, pak bylo přidáno 100 μΐ/jamka zastavovacího roztoku a destičky byly proměřeny na absorbanci ve 450nm.

• · • · · · · · • · · · · · · · ·· • · · · · ···· * ··· ···

- 33 D. Průtoková cytometrie

Cripto pozitivní buněčné linie mohou být použit k testování monoklonálních protilátek na vazba ke Cripto s využitím barvení buněčného povrchu a průtokové cytometrie, a sice způsobem podle protokolu, který obsahuje následující kroky:

Uvolnění buněk z T162 kultivačních lahví užitím 2 ml PBS s 5mM EDTA, 10 minut, 37 °C. Doplnit do 20 ml médiem se sérem, opakovaným pipetováním rozvolnit nahloučené buňky. Centrifugovat ve 1200 rpm po dobu 5 minut. Promýt buňky s 5 až 10 ml 4°C PBS s 0,1% BSA (promývací pufr). Centrifugovat ve 1200 rpm po dobu 5 minut. Resuspendovat na hustotu 4xl0⁶-10⁷/ml v promývacím pufru. Udržovat na ledu.

Příprava protilátek pro barvení. Purifikované protilátky jsou naředěna promývacím pufrem na koncentraci až 1-10 μg/ml. Přidá se po 50 μΐ buněk do jamek 96-jamkové destičky Linbro s dnem tvaru V (ICN 7632105). Nanese se po jedné jamce buněk pro každou kontrolu pro každou buněčnou linii, která má být analyzována, včetně buněk jako kontroly bez protilátky, pouze sekundární protilátky, hybridomového média, supernatantu pozitivní kontrolní protilátky, jestliže je dostupná nebo purifikované, a kontrolní podtřídy IgG (jestliže se užívá purifikované protilátka).

Nanese se po jedné jamce buněk pro každý experimentální vzorek pro každou buněčnou linii, která má být analyzována. Destička se centrifuguje při 1200 rpm po dobu 5 minut, s použitím stolní centrifugy, ve 4° C. Pufr se odstraní tím, že se destička převrátí a otřepe, až je kapalina v podstatě odstraněna. Přidá se 40-50 μΐ protilátek (nebo promývacího • · » · · 9

- 34 pufru pro kontrolu bez protilátky kontrolu pouze se sekundární protilátkou) do každé jamky. Inkubuje se alespoň 30 minut až 1 hodinu ve 4 °C. Destička se centrifuguje při 1200 rpm po dobu 5 minut. Roztoky protilátek se vytřepou. Jamky se promyjí dvakrát 200 μΐ promývacího pufru na jamku, po každém promytí se destička centrifuguje. Pufr se z destičky vytřepne.

Resuspendují se buňky v každé jamce v 50 μΐ kozí antimyšího IgG, Fc specifického (Jackson Immunoresearch Laboratories, katalog, č. 115-116-071) značeného R-PE v ředění 1:200 (v promývacím pufru) . Inkubuje se 20 minut ve 4° C ve tmě. K buňkám se přidá 150 μΐ promývacího pufru do každé jamky. Destička se centrifuguje při 1200 rpm po dobu 5 minut. Promyje se jednou s 200 μΐ promývacího pufru na jamku. Buňky se resuspendují ve 150 μΐ 1% PFA v PBS. Obsah každé jamky se přenést do samostatné 5 ml polystyrénové zkumavky s kulatým dnem (Falcon, katalog. č. 352052). Zkumavky se obalí hliníkovou fólií.

Obsahy cytometrií.

zkumavek jsou pak analyzovány průtokovou zbýváj ící cytometrií

Výsledky

Výsledky ze dvou screeningů monoklonálních protilátek produkovaných tímto způsobem jsou shrnuty v tabulkách 1 a 2 níže, kde první sloupec uvádí jména hybridomových subklonů, další dva sloupce ukazují výsledky ELISA screeningu a sloupce ukazují výsledky analýzy průtokovou u čtyřech Cripto-pozitivních buněčných linií, jsou uvedeny v jednotkách průměrného indexu fluorescence (MFI).

- 35 Tabulka 1

Charakterizace monoklonálních protilátek anti-Cripto

Hybridom. Subklon	ATCC deposit č.	ELISA Cripto delC Sups.	ELISA Cripto EGF- pdobná doména Sups.	DU4475 MFI	NCCIT MFI	GEO MFI	HT3 MFI
Kontrola ELISA		0,06	0,07
Kontrola myši Ig				14	9	37	18
A6C12.il		2,21	0,07	11	35	29	8
A6F8.6	PTA-3318	2,32	0,08	11	50	29	10
A7H1.19		2,14	0,09	14	34	27	12
A8F1.30		2,15	0,1	17	27	32	28
A8G3.5	PTA-3317	2,39	0,09	9	30	25	15
A8H3.1	PTA-3315	2,4	1,7	9	44	23	10
A8H3.2		2,54	0, 07	13	13	16	14
A19A10.30		2,02	0,09	9	40	20	10
A10B2.18	PTA-3311	2,36	0,07	40	63	100	43
A27F6.1	PTA-3310	2,28	1,19	9	44	26	17
A40G12.8	PTA-3316	2,27	1,59	10	47	26	16

Tabulka 2

Charakterizace monoklonálních protilátek anti-Cripto

Hybridom. Subklon	ATCC deposit č.	ELISA Cripto delC	ELISA Cripto EGF- pdobná doména	DU4475 MFI	NCCIT MFI	GEO MFI	HT3 MFI
Kontrola ELISA		0, 05	0,05
Kontrola myší Ig				10	6	4	6
A2D3.23		0,93	0,90	73	138	37	27
A7A10.29		1,37	0,07	75	83	33	83
A9G9.9		1, 39	0,07	52	62	32	82
A15C12.10		1,42	0,06	46	55	25	93
A15E4.14		1,38	0,06	50	63	23	95
A17A2.16		1,40	0,06	76	97	41	81
A17C12.28		0, 96	0,97	6	16	3	22
A17G12.1	PTA-3314	1, 30	1,37	61	66	28	78
A17H6.1		1, 38	0,05	35	30	5	28
A18B3.11	PTA-3312	1,36	1,38	50	42	33	65
A19E2.7		1,40	0,06	53	59	26	99
B3F6.17	PTA-3319	1,37	0,06	77	51	39	89

- 37 Tabulka 2 - pokračování

B6G7.10	PTA-3313	1,38	1, 40	28	22	22	56
B11H8.4		1,41	0,06	59	101	39	107
B12C12.5		1,10	1,04	27	14	23	59
B15A2.6		1,40	0, 06	36	44	22	59
C4A2.16		1,40	0,06	24	36	22	65

Příklad 3

Test inhibice Cripto signalizace s Cripto-nulitníini buňkami

Následující příklad popisuje test signalizce s F9 Cripto nulitními buňkami použitý k hodnocení inhibice Cripto signalizace, který sestával z následujících kroků.

Den 0: Potažení 6-jamkových destiček 0,1% želatinou, nanesením 2 ml/jamka ve 37 °C po dobu 15 minut.

Vysetí buněk F9 CRIPTO NULL v hustotě 6xl0⁵ buňky na j amku.

Den 1:

Transfekce:

Každý z následujících vzorků se přidá k 300 μΐ média OptiMeml, čímž se připraví pro každý vzorek roztok A:

Vzorek 1: 0,5μς cDNA pro (N₂) 7luciferáza-FAST reportérový gen plus 1,5 μρ cDNA prázdného vektoru.

Vzorek 2: 0,5μg cDNA (N₂) ₇luciferázy, 0,5 μg cDNA FAST a μg cDNA prázdného vektoru.

·· · · « · φ · · · · · • a · · · · ·

	Vzorek	3:	0,5gg cDNA	(N₂)7luciferázy,	0,5 gg	cDNA	Cripto
ADD	0,5FAST	a 0	, 5gg cDNA prázdného vektoru	•
	Vzorek	4:	0,5gg cDNA	(N₂)₇luciferázy,	0,5 gg	cDNA	Cripto,
0,5	gg cDNA	FAST a 0,5 gg	cDNA prázdného vektoru.
	Vzorek	5:	0,5gg cDNA	(N₂) ₇luciferázy,	0,5 gg	cDNA	Cripto,

0,5 gg cDNA FAST a 0,5 gg cDNA prázdného vektoru.

Vzorek 6: 0,5gg cDNA (N₂)₇luciferázy, 0,5 μg cDNA Cripto, 0,5 μg cDNA FAST a 0,5 gg cDNA prázdného vektoru.

Vzorek	7: 0,5gg	cDNA	(N₂)7luciferázy,	0,5 gg	cDNA	Cripto,
0,5 gg cDNA	FAST a 0,	5 gg	cDNA prázdného vektoru.
Vzorek	8: 0,5gg	cDNA	(N₂)₇luciferázy,	0,5 gg	cDNA	Cripto,

0,5 μg cDNA FAST a 0,5 μg cDNA prázdného vektoru.

Vzorek 9: 0,5μg cDNA (N₂) ₇luciferázy, 0,5 μg cDNA Cripto, 0,5 μg cDNA FAST a 0,5 gg cDNA prázdného vektoru.

Roztok B obsahuje 30 μΐ Lipofectaminu plusu 270 μΐ OptiMeml.

Pro každý vzorek se smíchá roztok A a roztok B. Inkubuje se 45 minut při teplotě místnosti. Jamky se vypláchnou OptiMeml 2 ml/jamka. Odsají se těsně před dalším krokem.

Přidají se 2,4 ml OptiMeml ke každé směsi roztoků A+B, promíchá se, přidá se 1,5 ml/jamka, aby se jamky duplikovaly. Inkubuje se 5 hodin ve 37 °C. Přidá se 1,5 ml/jamka DMEM+20% FCS, 2mM Gin, P/S k jamkám, do kterých byly naneseny vzorky 1 až 3. Přidají se protilátky anti-Cripto podle následujícího schématu:

Jamky vzorku 4: A27F6,1, 10 gg/ml, jamky vzorku 5:

A27F6,1, 2gg/ml, jamky vzorku 6: A40G12,8, 10gg/ml, jamky « · • · · · ·

- 39 vzorku 7: A40G12,8 2μ9/πι1, jamky vzorku 8: A10B2,18, 10gg/ml, jamky vzorku 9: A10B2,18, 2μg/ml.

Den 2: Odstraní se médium, buňky se promyjí PBS, 2 ml/jamka. Přidá se DMEM+0,5% FCS, 2mM Gin, P/S se stejným množstvím Cripto protilátek jako předcházející den, do stejných jamek.

Den 3: Vyvíjí se luciferázový signál. Jamky se promyjí s PBS+CA²⁺ a Mg²⁺, 2 ml/jamka. Použije se souprava LucLite, Packard kat.č. 6016911. Pufr a substrát se ponechají, aby získaly teplotu místnosti. Tlumené světlo. Substrát se naředí 10 ml pufru. Naředí se 1:1 s PBS + Ca²⁺ a Mg²⁺. Jamky se odsají. Rychle se přidá 250 μΐ naředěného substrátu na jamku s použitím opakovači pipety. Roztokem se zavíří a 200 μΐ se přenese do jamek na 96-jamkové destičce s bílým neprůhledným dnem, Falcon 35-3296. Destička se odečte na luminometru s použitím programu Winglow, data se exportují do programu Excel.

Výsledky tohoto testu jsou shrnuty dále v tabulce 3.

• · • · · ·

- 40 Tabulka 3

Test signalizace Cripto: Inhibice monoklonálními protilátkami anti-Cripto

Transfekované cDNA	Protilátka antiCripto	Relativní luminiscenční jednotky
(N₂)₇ luc	žádný	123
(N₂)₇ luc, FAST	žádný	259
(N₂)₇ luc, FAST, Cripto	žádný	3091
(N₂)₇ luc, FAST, Cripto	A27F6.1 10 μς/ιτιΐ	1507
(N₂)₇ luc, FAST, Cripto	A27F6.1 2 μς^Ι	2297
(N₂)₇ luc, FAST, Cripto	A40G12.8 10 μρ/ιηΐ	1213
(N₂)₇ luc, FAST, Cripto	A40G12.8 2 μς/ιηΐ	2626
(N₂)₇ luc, FAST, Cripto	Α10Β2.18 10 μρ/πιΐ	3466
(N₂)₇ luc, FAST, Cripto	Α10Β2.18 2 μρ/πιΐ	3103

Příklad 4

Test In vitro inhibice růstu nádorových buněk

Inhibice signalizace Cripto může také být testována měřením růstu buněk GEO na měkkém agaru. (Viz např. Ciardiello et al., Oncogene, 1994, leden, 9(1):291-8, Ciardiello et al., Oncogene, únor 1,51(3):1051-4).

Nejdříve se rozehřeje 3% baktoagar. Drží se ve vodní « · e « · · • · · • · · • · · · · • · • · · · ·

- 41 lázni o teplotě 42 C. Pak se smísí 3% roztok baktoagaru s předem ohřátým kompletním médiem za vzniku roztoku 0,6% baktoagaru, při udržování ve 42 C. 4 ml roztoku se nanesou na misku o průměru 6 cm a roztok se nechá ochladit alespoň 30 minut, aby se vytvořila spodní vrstva agaru. GEO buňky se trypsinizují a resuspendují na koncentraci 10⁵ buněk/ml v kompletním médiu. K buněčné suspenzi se přidají testované protilátky nebo kontroly, protilátky se titrují od 20 pg do 1 pg. Stejné objemy GEO buněčné suspenze a 0,6% baktoagar se smíchají a 2 ml se překryje spodní vrstva agaru. Nechá se ochladnout po dobu alespoň 1 hodiny. Inkubuje se po dobu 14 dnů ve 37 °C v C0₂ inkubátoru. Kolonie viditelné bez použití mikroskopu se spočítají. Nepřítomnost kolonií, ve srovnání s negativními kontrolami, ukazuje, že testovaná protilátka inhibuje in vitro růst nádorových buněk.

Tento test tabulce 4, pro vykazují schopnost byl použit protilátky snížit růst a poskytl výsledky

A27F6.1 a B6G7.10, kolonií buněk GEO.

ukázané v které obě

Tabulka 4: Výsledky růstu v testu na měkkém agaru

Protilátka	Průměrný počet kolonií
žádná	109, 0
žádná	104,3
A27.F6 20 pg/ml	82,0
A27F6.1 10 pg/ml	78,3
A27F6.1 5 pg/ml	79, 0
A27F6.1 1 pg/ml	108,7
B6 G7.10 20 pg ml	102,3
B6 G7.10 10 pg/ml	71,7

• · · · · • · ·

- 42 Příklad 5

Test In vivo inhibice růstu nádorových buněk

Aby se vyhodnotila inhibice růstu nádorových buněk, humánní nádorová buněčná linie byla implantována subkutánně athymickým nahým myším a účinky protilátek podle vynálezu byly pozorovány, s další chemoterapeutickou léčbou a bez ní, která by mohla poskytnout synergické nebo aditivní účinky na inhibici nádoru.

Tento test může být prováděn alternativně s použitím různých nádorových buněčných linií, jako je například GEO (in vitro buněčná linie dobře diferencovaného humánního karcinomu tračníku, byla získána od American Tissue Type Collection (ATCC)), DU-4475 (in vitro buněčná linie karcinom prsu získaná od ATCC), NCCIT (buněčná linie nádoru varlat získaná od ATCC) nebo dalších v oboru známých. Následuje jeden příklad takových testů:

Zvířata byla individuálně označena procvaknutím uší. Buněčná linie GEO je 1 až 4 pasážována ín vitro nebo in vivo. Zvířatům jsou implantovány buňky GEO subkutánně do oblasti pravého boku. Mohou být použity následující skupiny zvířat:

c.

skupiny

Léčba

Počet myší

1. Kontrola s fyziologickým roztokem, 0,2 ml/myš, i.p. 20 třikrát týdně (po, st, pá)

2. mAb, nízká dávka, i.p. 10

3. mAb, střední dávka, i.p. 10

4. mAb, vysoká dávka, i.p. 10

5. 5-FU, 30 mg/kg/inj, i.p., 3 x týdně (po, st, pá)

- 43 6.

7.

8.

9.

Cisplatina, pá)	2 mg/kg/inj, s.c.,	3 x týdně	(po, st,
Adriamycin,	1,6 mg/kg/inj, i.p.	, 3 x týdně	(po, st,
pá)
Irinotecan,	10 mg/kg/inj., i.p.	, 5 x týdně	(po-pá)

5-FU (střední dávka) mAb, střední dávka, i.p. + 5-FU (střední dávka) mAb, vysoká dávka, i.p. + 5-FU (střední dávka) mAb, nízká dávka, i.p. + Cisplatina (střední dávka) mAb, střední dávka, i.p. + Cisplatina (střední dávka) mAb, vysoká dávka, i.p. + Cisplatina (střední dávka) mAb, nízká dávka, i.p. + Adriamycin (střední dávka) mAb, střední dávka, i.p. + Adriamycin (střední dávka) mAb, vysoká dávka, i.p. + Adriamycin (střední dávka) mAb, nízká dávka, i.p. + Irinotecan (střední dávka) mAb, střední dávka, i.p. + Irinotecan (střední dávka) mAb, vysoká dávka, i.p. + Irinotecan (střední dávka)

Den 0: Implantuje tělesná hmotnost zvířat.

se nádor, zaznamená se počáteční

Den 1:

Den 5:

hmotnosti a experimentu.

Zahájí se ošetření, jak je ukázáno výše.

počínají měření velikosti nádoru pokračuje se dvakrát týdně až do tělesné ukončení

Výchozí tělesná hmotnost, měření velikosti nádoru a tělesné hmotnosti, histologie po utracení a imunohistochemická • · • · · ·

- 44 analýza nádorů jsou vyšetřovány, analyzovány na Cripto expresi, nádorový růst a jeho inhibici.

Příklad 6

In vivo model s nádorovým xenotransplantátem - anti-Cripto protilátka blokující Cys-bohatý úsek

Pro vyhodnocení reakce NCCIT, buňky humánní buněčné linie karcinomu varlete byly implantovány subkutánně s protilátkou, která se váže na cys-bohatou doménu Cripto. Experimentální metody jsou uvedeny níže. Výsledky jsou ukázány na obrázku 1.

Metody a materiály

Zvířata: Byli použiti samci athymických „nahých myší.

Zvířata byly individuálně očíslována propíchnutím uší.

Nádor: NCCIT, mediastinální smíšené zárodečné buňky z in vitro buněčné linie humánního karcinomu varlete, původně získané z Americké sbírky buněčných kultur (ATCC). Buněčná linie byla in vitro šestkrát pasážována v RPMI-1640/10% FBS bez antibiotik. Zvířatům bylo implantováno subkutánně do pravého boku 5 x 10⁶ buněk/0,2 ml matrigelu.

Číslo	Počet
skupiny	Léčba	myší

Kontrola s vehikulem (25mM fosforečnan sodný, 20 lOOmM chlorid sodný, pH 7,2), 0,2 ml/myš, i.p.,

Q14D.

Podávání zahájeno v den -1

2	A8G3.5, 1 mg/kg/inj, i.p., Podávání zahájeno v den -1	Q14D	10
3	A8G3.5, 3 mg/kg/inj, i.p., Podávání zahájeno v den -1	Q14D	10
4	A8G3.5, 10 mg/kg/inj, i.p., Podávání zahájeno v den -1	Q14D	10
5	Cis-platina, 2 mg/kg/inj,	s. c. ,	3 x/týden (Po, 10

st, pá) pro 6 léčeb Podávání zahájeno v den 1

Testovací schéma

Den -1: Myši byly náhodně rozděleny do kontrolní skupiny a léčených skupin. Byla zaznamenána počáteční hmotnost zvířat. Bylo provedeno první podání protilátky ve skupinách s protilátkou. Byly připraveny dávkovači roztoky. Léčba byla prováděna „slepě vzhledem k personálu, až do ukončení.

Den 0: Byl implantován nádor. Bakteriální kultury na nádoru implantovaném do myší.

Den 1: Podání první léčby pozitivní chemoterapeutické skupině.

Den 4: Zaznamenání počáteční velikosti nádoru měřené jako bazální hodnota nádoru v matrigelu.

Pokračování v zaznamenávání velikosti nádoru a • · • · · ·

- 46 ··· · · · · · » · · · · ·

hmotnosti myší 2x/týden. Denní mMonitorování celé studie a případný zápisy jakéhokoliv neobvyklého pozorování na zvířatech.

Výstupy: Počáteční tělesná hmotnost

Velikost nádoru a tělesná hmotnost v průběhu měření

Příklad 7

In vivo model s nádorovým xenotransplantátem - anti-Cripto protilátka blokující EGF-podobnou doménu

Pro vyhodnocení reakce NCCIT, buňky humánní buněčné linie karcinomu varlete byly implantovány subkutánně s protilátkou, která se váže na EGF-podobnou doménu Cripto. Experimentální metody jsou uvedeny níže. Výsledky jsou ukázány na obrázku 2.

Metody a materiály

Zvířata: Byli použiti samci athymických „nahých myší.

Zvířata byly individuálně očíslována propíchnutím uší.

• · • · • · · > · · · β • ·

- 47 Číslo Počet skupiny Léčba ^mV^ší

Kontrola s vehikulem (25mM fosforečnan sodný, 18 lOOmM chlorid sodný, pH 7,2), 0,2 ml/myš, i.p.,

Q14D.

Podávání zahájeno v den -1

A8G3.5, 3 mg/kg/inj, i.p., Q14D 10

Podávání zahájeno v den -1

A27F6.1, 10 mg/kg/inj, i.p., Q14D 10

Podávání zahájeno v den -1

Cis-platina, 2 mg/kg/inj, s.c., 3 x/týden (Po, 10 st, pá) pro 6 léčeb

Podávání zahájeno v den 1

Testovací schéma

Den -1: Myši byly náhodně rozděleny do kontrolní skupiny a léčených skupin. Byla zaznamenána počáteční hmotnost zvířat. Bylo provedeno první podání protilátky ve skupinách s protilátkou. Byly připraveny dávkovači roztoky. Léčba byla prováděna „slepě vzhledem k personálu, až do ukončení experimentu.

Den 0: Byl implantován nádor. Bakteriální kultury na nádoru implantovaném do myší. Bakteriální kultury byly negativní na kontaminace 24 a 48 hodin po odebrání vzorků.

Den 1: Podání první léčby pozitivní chemoterapeutické skupině.

Pokračování v zaznamenávání velikosti nádoru a • ·

- 48 hmotnosti myší 2x/týden. Denní mMonitorování celé studie a případný zápisy jakéhokoliv neobvyklého pozorování na zvířatech.

Výstupy: Počáteční tělesná hmotnost

Velikost nádoru a tělesná hmotnost v průběhu měření

Příklad 8

Monoklonální protilátky Cripto, které blokují vazbu ALK4

Pro vyhodnocení toho, zda Cripto-specifické monoklonální protilátky mohou interferovat se schopnostní Cripto vázat se na Alk4, receptor activinu typu I, byla použita analýza průtokovou cytometrie na buněčné linii 293, která trvale exprimuje Alk4. Pro přípravu této buněčné linie byly buňky 293 kotransfekovány plazmidem, který exprimuje Alk4 označený na C-konci HA epitopem, a plazmidem, který exprimuje léčivo, puromycin, v poměru 10:1. Transfekované buňky byly pak selektovány v médiu s puromycinem až do vytvoření kolonií. Kolonie byly pak odebrány, namnoženy a pak analyzovány na expresi Alk4 s použitím Western blot testu s HA. Klon 21 (293— Alk4-21) byl zjištěn jako klon exprimující vysoké hladiny Alk4 ve srovnání k kontrolními netransfekovanými buňkami 293.

Pro analýzu vazby Cripto-Alk4 průtokovou cytometrií byla použita purifikovaná rozpustná forma humánního Cripto (aminokyseliny 1-169) fúzovaná s Fc částí humánního IgG (CrdelC-Fc). Přibližně 5pg/ml CrdelC-Fc nebo kontrolního Fc proteinu bylo inkubováno s 3x10^ buněk 293-Alk4-21 na ledu pro 30 minut v 50 μΐ celkového objemu FACS pufru (PBS s 0,1% BSA).

• ·

- 49 Pro vzorky obsahující anti-Cripto protilátky, 5pg/ml CrdelC-Fc bylo preinkubováno s 50pg/ml každé z Cripto protilátky (A10.B2.18, A40.G12.8, A27.F6.1, A8.H3.1, A19.A10.30, A6.F8.6, A8.G3.5, A6.C12.il) na ledu před přidáním buněk. Buňky byly pak promyty FACS pufrem a navázaný Fc protein byl detekován tím, že se buňky inkubovaly s kozím antí-humánním IgG (specifickým pro Fc fragment) konjugovaným s R-fykoerytrinem (Jackson Immunologics). Vzorky byly pak znovu promyty, fixovány v 1% paraformaldehydu v PBS a analyzovány standardními postupy průtokové cytometrie. Výsledky FACS testů jsou ukázány na obrázku 3.

Provedení vynálezu zde popsaná jsou ukázána jako příklady a nijak neomezují rozsah provedení vynálezu. Odborník si je vědom toho, že mohou být provedeny početné změny a modifikace v různých provedeních vynálezu, aniž by došlo k odchýlení od vynálezecké myšlenky předkládaného vynálezu. To znamená, že všechny takové variace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Publikace citované v popisu jsou v plném rozsahu zahrnuty formou odkazu.

- 50 Seznam sekvencí <160> 2 <170> FastSEQ pro Windows 4.0 <210> 1 <211> 188 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1

Met

Asp

Cys

Arg

Lys

Met

Ala

Arg

Phe

Ser

Tyr

Ser

Val

Ile

Trp

Ile

1

5

10

15

Met

Ala

Ile

Ser

Lys

Val

Phe

Glu

Leu

Gly

Leu

Val

Ala

Gly

Leu

Gly

20

25

30

His

Gin

Glu

Phe

Ala

Arg

Pro

Ser

Arg

Gly

Tyr

Leu

Ala

Phe

Arg

Asp

35

40

45

Asp

Ser

Ile

Trp

Pro

Gin

Glu

Pro

Ala

Ile

Arg

Pro

Arg

Ser

50

55

60

Gin

Arg

Val

Pro

Met

Gly

Ile

Gin

'His

Ser

Lys

Glu

Leu

Asn

Arg

65

70

75

80

Thr

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

Cys

Met

Leu

Gly

Ser

Phe

Cys

Ala

85

90

95

Cys

Pro

Ser 100

Phe

Tyr Gly

Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys

105

110

Glu

Asn

Cys

Gly

Ser

Val

Pro

His

Asp

Thr

Tip

Leu

Pro

Lys

Cys

115

120

125

Ser

Leu

Cys

Lys

Cys

Trp

His

Gly

Gin

Leu

Arg

Cys

Phe

Pro

Gin

Ala

130

135

140

Phe

Leu

Pro

Gly

Cys

Asp

Gly

Leu

Val

Met

Asp

Glu

His

Leu

Val

Ala

145

150

155

160

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Leu

Pro

Ser

Ala

Arg

Thr

Phe

Met

165

170

175

Leu

Val

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Ile

Gin

Ser

Tyr

180

185

• ·

- 51 <210> 2 <211> 188 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2

Met

Asp

Cys

Arg

Lys

Met

Val

Arg

Phe

Ser

Tyr

Ser

Val

Ile

Trp

Ile

1

5

10

15

Met

Ala

Ile

Ser

Lys

Ala

Phe

Glu

Leu

Gly Leu

Val

Ala

Gly

Leu

Gly

20

25

30

His

Gin

Glu

Phe

Ala

Arg

Pro

Ser

Arg

Gly Asp

Leu

Ala

Phe

Arg

Asp

35

40

45

Asp

Ser

Ile

Trp

Pro

Gin

Glu

Pro

Ala

Ile

Arg

Pro

Arg

Ser

50

55

60

Gin

Arg

Val

Leu

Pro

Met

Gly

Ile

Gin

His

Ser

Lys

Glu

Leu

Asn

Arg

65

70

75

80

Thr

Cys

Leu

Asn

Gly Gly

Thr

Cys

Met

Leu

Glu

Ser

Phe

Cys

Ala

85

90

95

Cys

Pro

Ser

Phe

Tyr

Gly Arg

Asn

Cys

Glu

His

Asp

Val

Arg

Lys

100

105

110

Glu

Asn

Cys

Gly

Ser

Val

Pro

His

Asp

Thr

Trp

Leu

Pro

Lys

Cys

115

120

125

Ser

Leu

Cys

Lys

Cys

Trp

His

Gly

Gin

Leu

Arg

cys

Phe

Pro

Gin

Ala

130

135

140

Phe

Leu

Pro

Gly

Cys

Asp

Gly

Leu

Val

Met

Asp

Glu

His

Leu

Val

Ala

145

150

155

160

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Leu

Pro

Ser

Ala

Arg

Thr

Phe

Met

165

170

175

Leu

Ala

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Ile

Gin

Ser

Tyr

180

185

Aminokyselinová sekvence CR-1 obsahující 188 aminokyselin [SEKV. ID. Č. 1]

MDCKKMARFSYSVTWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDS

IWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCI.NGGTCMLGSFCACPPS

FYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCD

GLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYY

Aminokyselinová sekvence CR-3 obsahující 188 aminokyselin [SEKV. ID. Č. 2]

WCRRMVRFSySVIWIMAISKAFELGLVAGLGHQEFARPSRGDLAFRDDS

IWPQEEPAIRPRSSQRVLPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLESFCACPPSF

YGRNCEHDVlUCENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGL

VMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLAGICLSIQSYY » ·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Protilátka, která se specificky váže na epitop ve vazebné doméně ligand/receptor Cripto.
2. Protilátka podle nároku 1, kde Cripto je vybrán ze skupiny, kterou tvoří sekvence uvedené v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1 a 2.
3. Protilátka podle nároku 2, kde epitop je v doméně podobné EGF.
4. Protilátka podle nároku 2, kde epitop je v doméně bohaté na cys.
5. Protilátka podle nároku 2, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří A
6C12.il, A6F8.6, A
7H1.19, A8F1.30,

A8G3.5, A8H3.1, A8H3.2, A19A10.30, A10B2.18, A27F6.1,

A40G12.8, A2D3.23, A7A10.29, A9G9.9, A15C12.10, A15E4.14,

A17A2.16, A17C12.28, A17G12.1, A17H6.1, A18B3.il, A19E2.7,

B3F6.17 a B6G7.10.

6. Protilátka podle nároku 3, která je vybraná ze skupiny, kterou tvoří A40G12.8, A8H3 .1, A27F6.1, B6G7.10, A17G12.1 a A18B3.11. 7 . Protilátka podle nároku 4, která je vybraná ze skupiny, kterou tvoří A19A10.30, A8G3.5, A6F8.6 a A6C12.il.
8. Protilátka, která se specificky váže na epitop obsažený v doméně zahrnující aminokyselinové zbytky 46 až 62 • · · • ·

- 53 Cripto.
9. Protilátka podle nároku 8, kterou je A10B2.18 nebo B3F6.17.
10. Protilátka, která se váže specificky na epitop vybraný ze skupiny epitopů, na které se váží protilátky A6C12.il, A6F8.6, A7H1.19, A8F1.30, A8G3.5, A8H3.1, A8H3.2,

A19A10.30, A10B2.18, A27F6.1, A40 G12.8, A2D3.23, A7A10.29,

A9G9.9, A15C12.10, A15E4.14, A17A2.16, A17C12.28, A17G12.1,

A17H6.1, A18B3.il, A19E2.7, B3F6.17 a B6G7.10.
11. Protilátka, která se váže specificky na Cripto a je schopná modulovat Cripto signalizaci.
12. Protilátka podle nároku 11, která se specificky váže na epitop v doméně podobné EGF v Cripto.
13. Protilátka podle nároku 12, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří A40G12.8, A8H3.1 a A27F6.1.
14. Protilátka podle nároku 11, která se specificky váže na epitop v doméně bohaté na cys v Cripto.
15. Protilátka podle nároku 14, kterou je A6C12.il.
16. Protilátka podle nároku 11, která je vybraná ze skupiny, kterou tvoří A40G12.8, Ά8Η3.1, A27F6.1 a A6C12.il.
17. Protilátka, která se váže specificky na Cripto a je schopná modulovat růst nádorů.

• · • · · · · » * · · · · • · • · • · • · · · · ·

- 54
18. Protilátka podle nároku 17, která se specificky váže na epitop v doméně podobné EGF v Cripto.
19. Protilátka podle nároku 17, která se specificky váže na epitop v doméně bohaté na cys v Cripto.
20. Protilátka podle nároku 17, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří A27F6.1, A8 G3.5 a B6G7.10.
21. Protilátka, která se váže specificky na Cripto, je schopná modulovat Cripto signalizaci a je schopná modulovat růst nádorů.
22. Protilátka podle nároku 21, která se specificky váže na epitop v doméně podobné EGF v Cripto.
23. Protilátka podle nároku 21, která se specificky váže na epitop v doméně bohaté na cys v Cripto.
24. Protilátka podle nároku 21, kterou je A27F6.1.
25. Protilátka produkovaná hybridomem vybraným ze skupiny, kterou tvoří A6F8.6 (ATCC přístupové č. PTA-3318), A8G3.5 (ATCC přístupové č. PTA-3317), A8H3.1 (ATCC přístupové č. PTA-3315), A10B2.18 (ATCC přístupové č. PTA-3311), A27F6.1 (ATCC přístupové č. PTA-3310), A40G12.8 (ATCC přístupové č. PTA-3316), A17G12.1 (ATCC přístupové č. PTA-3314), A18B3.il (ATCC přístupové č. PTA-3312), B3F6.17 (ATCC přístupové č. PTA-3319) a B6G7.10 (ATCC přístupové č. PTA-3313).
26. Protilátka, která se váže specificky na Cripto a je schopná blokovat interakci mezi Cripto a ALK4.

• ·

- 55 - 27. Protilátka podle nároku 26, která se specificky váže na epitop v doméně podobné EGF v Cripto. 28. Protilátka podle nároku 26, která se specificky váže na epitop v doméně bohaté na cys v Cripto.
29. Protilátka podle nároku 26, která je vybraná ze skupiny, kterou tvoří A8G3.5, A6F8.6 a A6C12.il.
30. Protilátka, která se váže specificky na Cripto, je schopná blokovat interakci mezi Cripto a ALK4 a je schopná modulovat růst nádorů.
31. Protilátka podle nároku 30, která se specificky váže na epitop v doméně podobné EGF v Cripto.
32. Protilátka podle nároku 30, který se specificky váže na epitop v doméně bohaté na cys v Cripto.
33. Protilátka podle nároku 30, kterou je A8G3.5.
34. Cripto protilátka schopná internalizovat Cripto.
35. Protilátka podle nároku 34, kde protilátka je konjugována s chemoterapeutikem.
36. Protilátka podle nároku 34, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří A27F6.1 a B3F6.17.
37. Přípravek pro podávání pacientovi majícímu nádor, který exprimuje Cripto, vyznačující se tím, že • · • · * » · · · <

• · obsahuje alespoň jednu z protilátek podle kterýkoliv z nároků 1 až 35.
38. Přípravek podle nároku 37 vyznačující se tím, že pacient je člověk.
39. Přípravek podle nároku 37 vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient.
40. Přípravek podle nároku 37 vyznačující se tím, že protilátka je konjugována s chemoterapeutikem.
41. Přípravek podle nároku 37 vyznačující se tím, že dále obsahuje nekonjugované chemoterapeutikum.
42. Způsob modulace růstu nádorové buňky in vitro ve vzorku vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se ke vzorku přidá přípravek podle nároku 37.
43. Způsob modulace růstu nádorové buňky in vivo u pacienta vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se podává pacientovi účinné množství přípravku podle nároku 37.
44. Způsob podle nároku 43 vyznačující se tím, že pacient je člověk.
45. Způsob léčení pacienta majícího nádor, který nadměrně exprimuje Cripto, vyznačující se tím, že obsahuje krok podávání pacientovi přípravku podle nároku 37 v účinném množství.
46. Způsob léčení pacienta majícího nádor, který nadměrně

- 57 exprimuje Cripto, vyznačující se tím, že obsahuje krok podávání pacientovi přípravku podle nároku 39 v účinném množství.
47. Způsob léčení pacienta majícího nádor, který nadměrně exprimuje Cripto, vyznačující se tím, že obsahuje krok podávání pacientovi přípravku podle nároku 40 v účinném množství.
48. Způsob léčení pacienta majícího nádor, který nadměrně exprimuje Cripto, vyznačující se tím, že obsahuje krok podávání pacientovi přípravku podle nároku 41 v účinném množství.
49. Způsob podle nároku 42 vyznačující se tím, že buňka nádoru je vybraná ze skupiny, kterou tvoří buňky nádoru prsu, varlete, tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku.
50. Způsob podle nároku 43 vyznačující se tím, že buňka nádoru je vybraná ze skupiny, kterou tvoří buňky nádoru prsu, varlete, tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku.
51. Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že buňka nádoru je vybraná ze skupiny, kterou tvoří buňky nádoru prsu, varlete, tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku.
52. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že buňka nádoru je vybraná ze skupiny, kterou tvoří buňky nádoru prsu, varlete, tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, • · * ·

- 58 dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku.
53. Způsob podle nároku 46 vyznačující se tím, že buňka nádoru je vybraná ze skupiny, kterou tvoří buňky nádoru prsu, varlete, tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku.
54. Způsob podle nároku 47 vyznačující se tím, že buňka nádoru je vybraná ze skupiny, kterou tvoří buňky nádoru prsu, varlete, tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku.
55. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že buňka nádoru je vybraná ze skupiny, kterou tvoří buňky nádoru prsu, varlete, tračníku, plic, vaječníků, močového měchýře, dělohy, děložního čípku, pankreatu a žaludku.
56. Způsob stanovení toho, zda tkáň exprimuje Cripto, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se analyzuje tkáň pacienta v imunotestu s použitím protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 37.
57. Způsob stanovení toho, zda exprimuje Cripto, vyznačující se kdy se analyzuje buněčná linie v protilátky podle kteréhokoliv z nároků
58. Protilátka podle nároku 1, protilátka.

buněčná linie nadměrně tím, že obsahuje krok, imunotestu s použitím 1 až 37.

která je monoklonální
59. Protilátka podle nároku 1, která je humanizovaná protilátka.

• ΦΦΦ

- 59
60. Protilátka podle nároku 1, která je humánní protilátka.
61. Způsob léčení pacienta se stavem asociovaným s nežádoucí buněčnou proliferaci vyznačující se tím, že obsahuje podávání pacientovi přípravku podle nároku 37.