BG108363A - Крипто блокиращи антитела и тяхното използване - Google Patents

Крипто блокиращи антитела и тяхното използване Download PDF

Info

Publication number
BG108363A
BG108363A BG108363A BG10836303A BG108363A BG 108363 A BG108363 A BG 108363A BG 108363 A BG108363 A BG 108363A BG 10836303 A BG10836303 A BG 10836303A BG 108363 A BG108363 A BG 108363A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
antibody
crypto
antibodies
tumor
epitope
Prior art date
Application number
BG108363A
Other languages
English (en)
Inventor
Michele Sanicola-Nadel
Kevin Williams
Susan Schiffer
Paul Rayhorn
Original Assignee
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27501437&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG108363(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen, Inc. filed Critical Biogen, Inc.
Publication of BG108363A publication Critical patent/BG108363A/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Това е продължение на U.S.S.N. 60/367,002 от 22 Март, 2002, който е частично продължение на U.S.S.N. 60/301,091 от 26 Юни, 2001, който е частично продължение на U.S.S.N. 60/293,020 от 17 Май, 2001, който е частично продължение на U.S.S.N. 60/286,782 от 26 Април, 2001. Пълното описание на всяка от горепосочените патентни заявки е включено тук като литературна справка.
ф
Област на изобретението
Настоящето изобретение се отнася най-общо до областта на генетиката и клетъчната и молекулярна биология. По-специално, изобретението се отнася до антитела, които се свързват с и модулират сигнализирането на Крипто, китове съдържащи такива антитела и методи, които използват антителата.
Ниво на техниката
Крипто е белтък на клетъчната повърхност, изграден от 188 ф аминокиселинни остатъци, случайно изолиран по време на скриниране на сДНК библиотека на карцинома на човешки ембрион (Ciccodicola et al, 1989, EMBO J, vol. 8, no 7, pp. 1987-1991). Крипто белтъкът притежава най-малко два забележителни домена: домен, богат на цистеин и един домен, за първи път характеризиран като подобен на домена открит в семейството на епидермалния растежен фактор (СЕРФ) (Ciccodicola et al, supra); обаче, последвалите анализи показват, че Крипто не се свързва с нито един от известните СЕРФ рецептори и неговият СЕРФ-подобен домен беше наистина разграничен от СЕРФ (Bianco et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:8624' 8629).
Крипто сигнализиращият път остана неразгадан, независимо от продължителните изследвания, като литературните данни поддържаха схващането за активиране на няколко различни пътя, включително пътя на MAP киназа (DeSantis et al., 1997, Cell Growth Differ., 8:1257-1266; Kannan et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:33303335), TGF-β пътя (Gritsman et al., 1999, Development, 127:921-932; Schier et al., 403 :385-389), възможни взаимодействия c пътя Wnt (Salomon et al., Endoct Relat Cancer. 2000 Dec; 7(4): 199-226; и кръстосване c EGF пътя (Bianco et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:8624Ф 8629).
U.S.Patent 5,264,557 и три под-заявки, отнасящи се към него (U.S.Patents 5,620, 866, 5,650,285 и 5,854,399) включват човешки Крипто-сроден ген и белтък. Включени са и антитела, които се свързват с Крипто-сродния белтък, но не проявяват кръстосана реактивоспособност на свързване към самия Крипто белтък.
Свръхекспресията на Крипто белтъка е свързана с много типове тумори (включително, но не ограничаващи се до гръден, на тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреаса и стомаха), както е показано чрез имунооцветяване на човешка тъкан със заешки поликлонални антитела, получени срещу малки крипто пептиди. Panico et al., 1996, Int. J. Cancer, 65: 51-56; Byrne et al., 1998, J. Pathology, 185:108-111; De Angelis et al., 1999, Int J. Oncology, 14 :437-440. Следователно, това ниво на техниката се нуждае от средства за контрол, ограничаване и/или предпазване от такава свръхекспресия, за модулиране на Крипто сигнализирането и модулиране на последствията от Крипто експресията (т.е. повишаване и/или поддържане на клетъчната трансформация).
Резюме на изобретението
Настоящето изобретение осигурява нови антитела, които специфично се свързват с Крипто, и метод за изготвянето на такива антитела. Изобретението също така осигурява антитела, които се свързват с Крипто и модулират Крипто сигнализирането или белтъчното взаимодействие, напр. антитяло, което се свързва с Крипто така, че сигналът, получен от белтъчното взаимодействие с Крипто, се модулира по-нататък. Изобретението осигурява също така антитела, които се свързват с Крипто и блокират взаимодействието между Крипто и ALK4. Изобретението осигурява също така антитела, които се свързват с Крипто и модулират растежа на туморите. Изобретението осигурява също така антитела, които се свързват с Крипто, модулират Крипто сигнализирането и модулират туморния растеж. Изобретението осигурява също така антитела, които се свързват с Крипто, блокират взаимодействието между Крипто и ALK4 и модулират туморния растеж.
В друг аспект на изобретението антитялото, съгласно настоящето изобретение, специфично се свързва с епитоп, избран измежду група епитопи, към които се свързват антителата А6С12.11, A6F8.6 (АТСС Вх.№ РТА-3318), А7Н1.19, A8F1.30, A8G3.5 (АТСС Вх.№ РТА-3317), А8Н3.1 (АТСС Вх.№ РТА-3315), А8Н3.2, А19А10.30, А10В2.18 (АТСС Вх.№ РТА-3311), A27F6.1 (АТСС Вх.№ РТА-3310), A40G12.8 (АТСС Вх.№ РТА-3316), A2D3.23, А7А10.29, A9G9.9, А15С12.10, А15Е4.14, А17А2.16, А17С12.28, A17G12.1 (АТСС Вх.№ РТА-3314), А17Н6.1, A18B3.il (АТСС Вх.№ РТА-3312), А19Е2.7, B3F6.17 (АТСС Вх.№ РТА-3319), B6G7.10 (АТСС Вх.№ РТА-3317), A6F8.6 (АТСС Вх.№ РТА-3317), A6F8.6 (АТСС Вх.№ РТА-3313), В11Н8.4.
В друг аспект на изобретението антитялото, съгласно изобретението, специфично се свързва с епитоп в лиганд/рецептор свързващия домен на Крипто. Крипто може да се подбере измежду CR-1 (SEQ.ID N0:1) или CR-3 (SEQ ID N0:2). В по-специален вариант на изобретението антителата, които специфично се свързват с епитопа в лиганд/рецептор свързващия домен, включват например A6C12.il, A6F8.6 (АТСС Вх.№ РТА-3318), A8G3.5, (АТСС Вх.№ РТА-3317), А19А10.30, А8Н3.1 (АТСС Вх.№ РТА-3315), A27F6.1 (АТСС Вх.№ РТА-3310), A40G12.8 (АТСС Вх.№ РТА-3316), A17G12.1 (АТСС Вх.№ РТА-3314), A18B3.il (АТСС Вх.№ РТА3312) и B6G7.10 (АТСС Вх.№ РТА-3313).
В един вариант епитопът, към който се свързват антителата съгласно настоящето изобретение, се свързват в EGF-подобен домен. Антителата, които специфично се свързват към епитопа в EGF-подобния домен включват, но не са ограничени до A40G12.8 (АТСС Вх.№ РТА-3316), А8Н3.1 (АТСС Вх.№ РТА-3315), A27F6.1 (АТСС Вх.№ РТА-3310), B6G7.10 (АТСС Вх.№ РТА-3313), A17G12.1 (АТСС Вх.№ РТА-3314) и A18B3.il (АТСС Вх.№ РТА3312).
В друг вариант на изобретението епитопът, към който антителата съгласно настоящето изобретение се свързват, е богат на цистеин домен. Антителата, които специфично се свързват към епитопа в богатия на цистеин домен, включват, но не се ограничават до А19А10.30, A8G3.5 (АТСС Вх.№ РТА-3317), A6F8.6 (АТСС Вх.№ РТА-3318) и А6С 12.11.
В друг вариант епитопът, към който антителата съгласно настоящето изобретение се свързват, е в домена, обхващащ аминокиселинни остатъци 46-62 от Крипто. Антителата, които специфично се свързват към епитопа в домена, обхващащ аминокиселинни остатъци 46-62 на Крипто, включват, но не се ограничават до А10В2.18 (АТСС Вх.№ РТА-3311) и B3F6.17 (АТСС Вх.№ РТА-3319) и А17А2.16.
Настоящите изобретения обсъждат и антитела, които се свързват специфично с Крипто, и могат да модулират Крипто сигнализирането. Антителата, които се свързват специфично към Крипто и които могат да модулират Крипто сигнализирането, включват, но не се ограничават до A40G12.8 (АТСС Вх.№ РТА3316), А8Н3.1 (АТСС Вх.№ РТА-3315), A27F6.1 (АТСС Вх.№ РТА3310) и A6C12.il. В един вариант антителата, съгласно настоящето изобретение, които свързват специфично Крипто и са способни да модулират Крипто сигнализирането, се свързват с епитопа в EGFподобен домен или в домен, богат на цистеин, от Крипто.
Настоящето изобретение обсъжда също така антитела, които се свързват специфично към Крипто и блокират взаимодействието между Крипто и ALK4. Антителата, които се свързват специфично към Крипто и които са способни да блокират взаимодействието между Крипто и ALK4, включват, но не сеограничават до A8G3.5 (АТСС Вх.№ РТА-3317), A6F8.6 (АТСС Вх.№ РТА-3318) и A6C12.il. В един вариант антителата, съгласно настоящето изобретение, които свързват специфично Крипто и са способни да блокират взаимодействието между Крипто и ALK4, се свързват с епитопа в EGF-подобен домен или в богат на цистеин домен от Крипто.
В друг аспект настоящето изобретение обсъжда антитела, които се свързват специфично към Крипто и са способни да модулират туморния растеж. Антителата, които се свързват специфично към Крипто и които са способни да модулират туморния растеж включват, но не се ограничават до A27F6.1 (АТСС Вх.№ РТА-3310), B6G7.10 (АТСС Вх.№ РТА-3313) и A8G3.5 (АТСС Вх.№ РТА-3317).
В един вариант антителата, съгласно настоящето изобретение, които свързват специфично Крипто и са способни да модулират туморния растеж, се свързват с епитопа в EGF-подобен домен или в богат на цистбин домен от Крипто.
В още един аспект настоящето изобретение обсъжда антитела, които се свързват специфично към Крипто, които са способни да модулират Крипто сигнализирането и които са способни да модулират туморния растеж. Антителата, които се свързват специфично към Крипто, които са способни да модулират Крипто сигнализирането и които са способни да модулират туморния растеж, включват, но не се ограничават до A27F6.1 (АТСС Вх.№ РТА-3310).
В един вариант антителата, съгласно настоящето изобретение, които свързват специфично Крипто и са способни да модулират Крипто сигнализирането и които са способни да модулират туморния растеж, се свързват с епитоп в EGF-подобен домен или в богат на цистеин домен от Крипто.
В още един аспект настоящето изобретение обсъжда антитела, които се свързват специфично към Крипто, които са способни да блокират взаимодействието между Крипто и ALK4 и които са способни да модулират туморния растеж. Антителата, които се свързват специфично към Крипто, които са способни да блокират взаимодействието между Крипто и ALK4 и които са способни да модулират туморния растеж, включват, но не се ограничават до A8G3.5 (ATCC Вх.№ РТА-3317).
В друг вариант настоящето изобретение осигурява антитяло, продуцирано от хибридома, избрано измежду група, състояща се от A6F8.6 (ATCC Вх.№ РТА-3318), A8G3.5 (АТСС Вх.№ РТА-3317), А8Н3.1 (АТСС Вх.№ РТА-3315), А10В2.18 (АТСС Вх.№ РТА-3311), A27F6.1 (АТСС Вх.№ РТА-3310), A40G12.8 (АТСС Вх.№ РТА3316), A17G12.1 (АТСС Вх.№ РТА-3314), A18B3.il (АТСС Вх.№
ΡΤΑ-3312), B3F6.17 (АТСС Βχ.№ ΡΤΑ-3319) и B6G7.10 (АТСС
Вх.№ РТА-3313).
Антителата, съгласно настоящето изобретение, включват, но
не се ограничават до моноклонални, поликлонални, хуманизирани, химерични и човешки антитела.
Настоящето изобретение осигурява също така състав за даване на обект с тумор, който експресира Крипто, характеризиращ се с това, че включва поне едно от антителата, описани по-горе. В поспециален вариант обектът е човек. Съставът може да включва фармацевтично приемлив пълнител. Антителата, описани по-горе, могат да конюгират с химиотерапевтичен агент или да бъдат в комбинация с неконюгационен химиотерапевтик.
В друг аспект на изобретението се обсъждат методи на модулиране на растежа на туморни клетки in vitro в проба, характеризиращи се с това, че включват стъпка на добавяне към пробата на състави, описани по-горе.
Освен това се обсъждат методи на модулиране на растежа на туморните клетки in vivo в обект, характеризиращи се с това, че включват стъпка на даване на обекта на ефективно количество от съставите, описани по-горе. В по-специален вариант обектът е човек.
Друг аспект на изобретението са методи за лечение на обекти, притежаващи тумори, които свръхекспресират Крипто, характеризиращи се с това, че включват даване на обект на съставите, описани по-горе, в ефективни количества. Съставите за даване могат да включват фармацевтично приемливи пълнители, антитела конюгирани към химиотерапевтични агенти и антитела, прилагани в комбинация с неконюгирани химиотерапевтични агенти.
Методите, съгласно настоящето изобретение, са особено полезни при модулиране на растежа на туморни клетки и/или лечение на обект (напр. човек), притежаващ тумор, характеризиращи се с това, че туморните клетки се подбират измежду такива на гърдата, тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийка на матката, панкреаса и стомаха.
В един друг вариант настоящето изобретение обсъжда методи за определяне на това дали дадена тъкан експресира Крипто, характеризиращи се с това, че включват стъпка на анализиране на тъкан от обект чрез имуноанализ, използвайки всяко едно от антителата, описани по-горе. Освен това се обсъждат и методи за определяне на това дали дадена клетъчна линия свръхекспресира Крипто, характеризиращи се с това, че включват стъпка на анализ на клетъчната линия чрез имуноанализ, използвайки всяко едно от антителата, описани по-горе.
Тези и други аспекти на изобретението са посочени в повече детайли по-долу в детайлното описание на изобретението.
Детайлно описание на изобретението
Открити са антитела, които се свързват специфично с Крипто и тяхното използване за модулиране на Крипто сигнализирането или белтъчното взаимодействие и/или блокиране на взаимодействието между Крипто и ALK4p и/или модулиране на растежа на туморни клетки. Установени са няколко класа антитела, които се свързват специфично с Крипто, включително например антитела, които специфично се свързват с епитоп в лиганд/рецептор свързващ домен, както на нативен Крипто белтък, така и на денатурирана форма на Крипто; антитела, които се свързват в EGF-подобен домен, домен богат на цистеин или пептид (напр. с около 3 до около 20 аминокиселини) от региона, съдържащ аминокиселинни остатъци 46 до 150; антитела, които се свързват с Крипто и модулират Крипто сигнализирането; антитела, които се свързват с Крипто и модулират
растежа на туморните клетки; и антитела, които се свързват с Крипто, модулират Крипто сигнализирането и модулират растежа на туморните клетки. Тези антитела са подбрани с помощта на конвенционални in vitro анализи за подбор на антитела, които се свързват с лиганд/рецептор свързващият домен, модулират Крипто сигнализирането или модулират растежа на туморни клетки.
Методите, съгласно това изобретение, се използват в терапията на злокачествени или доброкачествени тумори в бозайници, при които скоростта на растеж на тумора (която скорост е анормална за нормалната тъкан) е поне частично зависима от Крипто. Анормална растежна скорост е скоростта на растеж, която надвишава тази, необходима за нормалната хомеостаза и надвишава тази на нормална тъкан със същия произход.
Определения
Различни дефиниции се въвеждат в този документ. Повечето думи имат значение, което се придава на същите думи от хората с опит в това ниво на техниката. Специфично дефинираните думи, дефинирани или по-долу или другаде в този документ, притежават значение, осигурено от контекста на настоящето изобретение като цяло и принципно са разбираеми от тези с опит в това ниво на техниката.
Като е употребен тук терминът “регион” означава физически непрекъсната част от първичната структура на една биомолекула. В случая с белтъците, регион се дефинира като непрекъсната част от аминокиселинната последователност на този белтък.
Като е употребен тук терминът “домен” се отнася до структурна част от биомолекула, която допринася за известна или предполагаема функция на биомолекулата. Домените могат да бъдат ко-екстензивни с региони или техни части; домените могат също така да включват част от биомолекула, която е различна от даден регион, в допълнение на целия или част от региона. Примери за белтъчни домени включват, но не се ограничават до извънклетъчен домен (обхващащ област от около остатък 31 до около остатък 188 от Крипто, включително Крипто, CR-1 (SEQ ID NO: 1) и CR-3 (SEQ ID NO: 2)) и трансмембранен домен (обхващащ област от около остатък 169 до около остатък 188 от Крипто, включително Крипто, CR-1 (SEQ ID NO: 1) и CR-3 (SEQ ID NO: 2)). Лиганд/рецептор свързващият домен от Крипто белтъка обхваща област от около остатък 75 до около остатък 150 от Крипто, включително Крипто, CR-1 (SEQ ID NO: 1) и CR-3 (SEQ ID NO: 2) и включва EGFподобния домен на Крипто, който се простира например от около остатък 75 до около остатък 112 от Крипто, включително Крипто, CR-1 (SEQ ID NO: 1) и CR-3 (SEQ ID NO: 2) и богатият на цистеин домен на Крипто, който обхваща например от около остатък 114 до около остатък 150 от Крипто, включително Крипто, CR-1 (SEQ ID NO: 1) и CR-3 (SEQ ID NO: 2). Например, много моноклонални антитела, съгласно настоящето изобретение, са идентифицирани като свързващи се към EGF-подобен или богат на цистеин домен. Допълнително, моноклонално антитяло А10В2.18 (АТСС Вх. № РТА-3311), B3F6.17 (АТСС Вх. № РТА-3319) и А17А2.16 са идентифицирани като свързващи се с епитоп, образуван в домена в региона, обхващащ аминокиселинни остатъци 46 - 62, в посока нагоре от EGF-подобния домен. Виж Пример 3 по-долу. Един епитоп в лиганд/рецептор свързващия домен е епитопът, образуван или в конформационния нативен Крипто белтък, или в денатурирания Крипто белтък, към които могат да се свържат антителата.
Както е употребен тук терминът “антитяло” означава пълно, интактно антитяло и Fab, Fab’, F(ab)2 и други негови фрагменти. Пълните, интактни антитела включват, но не се ограничават до
моноклонални антитела, като миши моноклонални антитела, поликлонални антитела, химерични антитела, човешки антитела и хуманизирани антитела. Различните форми на антителата могат да се получават с помощта на стандартни рекомбинантни ДНК техники (Winter and Milstein, Xature 349: 293-99, 1991). Например, могат да се конструират “химерични” антитела, в които антиген свързващият домен от животинското антитяло се свързва с домен на човешки конструкт (антитяло, произхождащо от бозайник, различен от човека, на което е приложена рекомбиннатна ДНК технология за заместване на целите или част от връзката и постоянните региони на тежката верига и/или постоянния регион от леката верига, със съответните региони от тежката или лека верига на човешки имуноглобулин) (виж напр. Cabilly et al., United States patent 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-55, 1984). Химеричните антитела намаляват имуногенните отговори, провокирани от животинските антитела, когато се употребяват при клинично лечение на хора.
В допълнение, могат да се синтезират рекомбинантни “хуманизирани” антитела. Хуманизираните антитела са антитела, първоначално получени от бозайник, различен от човек, в който е приложена ДНК рекомбинантна технология за заместване на някои или всички аминокиселини, които не са необходими за свързването на антигена, с аминокиселини от съответните региони на леката или тежка верига на човешки имуноглобулин. Поради тази причина това са химери, представляващи преди всичко аминокиселини от човешки имуноглобулин, в които са внедрени региони, отговорни за специфичното свързване с антигена (виж напр. РСТ патентна заявка WO 94/04679). Животните се имунизират с желания антиген, съответните антитела се изолират и частта от променливия регион, отговорна за специфичното свързване с антигена, се отстранява.
Антиген-свързващите региони с такъв произход често се клонират в подходяща позиция в гените за човешкото антитяло, от които са отстранени чрез делеция регионите, отговорни за свързването с антигена. Хуманизираните антитела намаляват до минимум използването на хетероложни (между-видови) последователности в антителата за използване в човешката терапия и е по-малко вероятно да провокират нежелани имунни отговори. По подобен начин могат да се получават приматизирани антитела.
Друг вариант на изобретението включва използването на човешки антитела, които могат да се продуцират в животни, различни от човека, като напр. трансгенни животни, носещи един или повече трансгени за човешки имуноглобулин. Такива животни могат да се използват като източник на спленоцити за получаване на хибридоми, като е описано в US Patent 5, 569, 825.
Фрагменти от антителата и едновалентни антитела могат да се използват също така в методите и съставите, съгласно настоящето изобретение. Едновалентните антитела се състоят от димер тежка верига/лека верига, свързан към Fc (или стволов) регион на втора тежка верига. “Fab регион” се отнася до тези части от веригите, които са приблизително еквивалентни или аналогични на последователностите, които изграждат частите на Y-клона на тежката верига в нейната цялост и които заедно (в агрегати) е показано, че проявяват активността на антитялото. Fab белтъкът включва агрегати на една тежка и една лека верига (обикновено известни като Fab’), както и тетрамери, които отговарят на двата сегмента от клона Y на антитялото, (обикновено известни като F(ab)2), като всеки от горепосочените агрегира квалентно или нековалентно, така че агрегатът може специфично да реагира с определен антиген или антигенно семейство.
Всяко от антителата, съгласно изобретението, може по избор да конюгира с химиотерапевтик, както е описано по-долу.
Както е използван тук терминът «свързване» означава физично или химично взаимодействие между два белтъка или съединения, или асоциирани белтъци или съединения, или техни комбинации, включително взаимодействие между антитяло и белтък. Свързването включва йонни, нейонни, водородни връзки, ван дер Ваалсови взаимодействия, хидрофобни взаимодействия и т.н. При физичното взаимодействие, свързването може да бъде или директно или индиректно, индиректно свързване чрез или благодарение на ефектите на друг белтък или съединение. Директното свързване се отнася да взаимодействия, които не се извършват нито чрез нито благодарение на ефектът на друг белтък или съединение, а вместо това се извършват без други значителни химични опосредствания. Свързването може да се детектира по много различни начини. Методите за детекция на свързването са добре известни на тези, с опит в даденото ниво на техниката.
Както е употребен тук “антитяло, способно да интернализира Крипто” означава антитяло, което навлиза в клетката, отстранявайки Крипто от клетъчната повърхност. Експериментаторът може да направи скрининг за Крипто антитела, които са способни за интернализират Крипто, използвайки флуоресцентно белязани Крипто моноклонални антитела. С цел да се определи, кои антитела приемат Крипто в Крипто положителни клетки, експериментаторът може да изследва поемането на флуоресцентния сигнал от антителата в клетките чрез наблюдение на клетките на флуоресцентен и/или конфокален микроскоп. Тези антитела, които приемат Крипто, ще бъдат регистрирани като флуоресцентни сигнали в цитоплазмата и или клетъчните везикули.
Неограничаващи примери на Крипто антитела, способни да приемат Крипто, включват A27F6.1 и B3F6.17.
Както е употребен тук терминът «съединение» означава всеки идентифицируем химикал или молекула, но не ограничаващ се до йон, атом, малка молекула, пептид, белтък, захар, нуклеотид или нуклеинова киселина, и такова съединение може да бъде природно или синтетично.
Както е употребен тук терминът «модулира» или «модифицира» означава увеличаване или намаляване на количеството, качеството или ефектът на определена белтъчна активност.
Както е употребен тук терминът “модулира Крипто сигнализирането” означава увеличаване или намаляване на количеството или ефекта на Крипто активността с около 5 %, за предпочитане 10 %, преди всичко за предпочитане 20 %, преди всичко за предпочитане 30 %, преди всичко за предпочитане 40 %, преди всичко за предпочитане 50 %, преди всичко за предпочитане 60 %, преди всичко за предпочитане 70 %, преди всичко за предпочитане 80 %, преди всичко за предпочитане 90 %, преди всичко за предпочитане 100 %. Активността може да бъде измерена
чрез анализи, известни в това ниво на техниката, като анализ “недействителна клетка”, показан в Пример 3. В друг вариант, белтъчното взаимодействие между Крипто и друг белтък е по подобен начин модулирано надолу чрез свързване на антителата, съгласно изобретението.
Както е употребен тук терминът “блокиране на взаимодействието между Крипто и ALK4” означава увеличаване или намаляване на взаимодействието, т.е. свързването между Крипто и ALK4, с около 5 %, за предпочитане 10 %, преди всичко за предпочитане 20 %, преди всичко за предпочитане 30 %, преди всичко за предпочитане 40 %, преди всичко за предпочитане 50 %, преди всичко за предпочитане 60 %, преди всичко за предпочитане 70 %, преди всичко за предпочитане 80 %, преди всичко за предпочитане 90 %, преди всичко за предпочитане 100 %. Активността може да бъде измерена чрез анализи, известни в това ниво на техниката, такива като анализ на свързване в Пример 8.
Както е употребен тук терминът “модулира растежа на туморни клетки in vitro означава увеличаване или намаляване на броя на туморните клетки in vitro с около 5 %, за предпочитане 10 %, преди всичко за предпочитане 20 %, преди всичко за предпочитане 30 %, преди всичко за предпочитане 40 %, преди всичко за предпочитане 50 %, преди всичко за предпочитане 60 %, преди всичко за предпочитане 70 %, преди всичко за предпочитане 80 %, преди всичко за предпочитане 90 %, преди всичко за предпочитане 100 %. In vitro модулирането на растежа на туморните клетки може
да се измери чрез анализи, известни в това ниво на техниката като анализ “GEO клетки полусолиден агар”, показан в Пример 4.
Както е употребен тук терминът “модулира растежа на туморни клетки in vivo означава увеличаване или намаляване на броя на туморните клетки in vivo с около 5 %, за предпочитане 10 %, преди всичко за предпочитане 20 %, преди всичко за предпочитане 30 %, преди всичко -за предпочитане 40 %, преди всичко за предпочитане 50 %, преди всичко за предпочитане 60 %, преди всичко за предпочитане 70 %, преди всичко за предпочитане 80 %, преди всичко за предпочитане 90 %, преди всичко за предпочитане 100 %. In vivo модулирането на растежа на туморните клетки може да се измери чрез анализи, известни в това ниво на техниката, като тези показани в Пример 5.
Терминът “предпазване” се отнася до намаляване на вероятността даден организъм да предизвика или развие анормално състояние.
Терминът “лекуване” се отнася до проявяване на терапевтичен ефект и поне частично облекчение или анулиране на анормалното състояние в организма. Лекуването включва поддържане на инхибиран туморен растеж и индуциране на ремисия.
Терминът “терапевтичен ефект” се отнася до инхибиране на анормално състояние. Терапевтичният ефект облекчава до известна
степен един или повече от симптомите на анормалното състояние. По отношение на лечението на анормални условия, терапевтичният ефект може да се отнася до един или повече от следните: (а) увеличаване или намаляване на пролиферацията, растежа и/или диференцирането на клетките; (б) инхибиране (т.е. забавяне или спиране) или подпомагане на клетъчната смърт; (в) инхибиране на дегенерацията; (г) облекчаване до известна степен на един или повече от симптомите, свързани с анормалното състояние и (д) усилване на функциите на популация от клетки. Съединенията, демонстриращи ефикасност срещу анормални състояния, могат да се идентифицират както е описано тук.
Терминът “даване” се отнася до метод на инкорпориране на съединение в клетките или тъканите на един организъм. Анормалното състояние може да се предотврати или лекува при клетки или тъкани в или извън организма. Клетките, съществуващи извън организма, могат да се поддържат или отглеждат в тъканни култури или в друг организъм. По отношение на клетките от самия организъм съществуват много техники в това ниво на техниката за даване на съединения, включително чрез (но не ограничаващо до) орално, парентерално, кожно, инжекционно и аерозолно прилагане. За клетките извън организма съществуват множество техники в това ниво на техниката за даване на съединения, включително (но не ограничаващо до) техники на микроинжектиране, трансформационни техники и техники с носител. Даването може да бъде извършено по един от многото начини, известни в това ниво на техниката, напр. орално, интравенозно, интраперитонеално, интрамускулно и др. Когато се използва терапия in vivo, антителата, обект на изобретението, се дават на пациент в ефективни количества. Както е употребено тук “ефективно количество” е количеството, достатъчно да доведе до полезен ефект или желани клинични резултати (т.е. количества, които елиминират или намаляват туморния товар в пациент). Ефективно количество от антителата, съгласно изобретението, може да бъде давано с едно или няколко приемания. За целите на изобретението ефективно количество от антителата, съгласно изобретението, е количеството антитела, което е достатъчно да облекчи, стабилизира или забави развитието на Крипто-асоциираните болестни състояния, по-специално Криптоасоциирани тумори. Детекцията и измерването на тези индикатори на ефективността се обсъждат по-долу. Един пример за типичен режим на лечение включва даване чрез интравенозно преливане в обект на антитела, съгласно изобретението, по седмично предписание в доза от около 2-5 mg/kg. Антителата се подават като хемоинфузионна единица за приходящи болни, освен ако пациентът не изисква хоспитализиране. Обсъждат се и други режими на даване, известни в това ниво на техниката.
Анормалното състояние може да се предотврати или лекува чрез даване на антитяло, съгласно изобретението, на група от клетки, притежаващи отклонения в пътя на сигнална трансдукция в един организъм. Ефектът на даване на съединение върху функциите на организма може след това да се проследи. Организмът за предпочитане е човек.
“Крипто свръхекспресия” е употребена със значението на експресия на Крипто от тъкан, чиято експресия е по-висока от експресията на Крипто в съседната нормална тъкан в статистически значимо количество.
“Химиотерапевтици” се отнася до всеки агент, идентифициран в това ниво на техниката, който упражнява терапевтичен ефект върху инхибирането на туморния растеж, поддържане на инхибиран туморен растеж и/или индуциране на ремисия, такива като природни съединения, синтетични съединения, белтъци, модифицирани белтъци и радиоактивни съединения.
Химиотерапевтичните агенти обсъждани тук включват агенти, които могат да конюгират с антитела, съгласно настоящето изобретение, или алтернативно - агенти, които могат да се използват в комбинация с антителата, съгласно настоящето изобретение, без да конюгират със самото антитяло. Примери за химиотерапевтици, които могат да конюгират с антителата, съгласно настоящето избретение, включват, но не се ограничават до радиоконюгати (90Y, 1311, 99шТс, 11 Un, 186Rh, et al), тумор активирани προ-лекарства (майтанозиди, СС-1065 аналози, клихеамицин производни, антрациклини, алкалоиди на винка и др.), рицин, дифтериен токсин, екзотоксин от Pseudomonas.
Химиотерапевтичните агенти, които могат да се употребяват в комбинация с антителата, съгласно настоящето изобретение, в поголяма степен, отколкото да конюгират с тях (т.е. неконюгирани химиотерапевтици), включват, но не се ограничават до следните: платинумс (т.е. цис-платина), антрациклини, нуклеозидни аналози (пурини и пиримидини), таксени, камптотецини, епиподофилотоксини, ДНК алкилиращи агенти, антагонисти на фолат, алкалоиди на винка, инхибитори на рибонуклеотид редуктаза, инхибитори на естрогени, инхибитори на прогестерон, инхибитори
на андроген, инхибитори на ароматаза, интерферони, интерлевкини, моноклонални антитела, таксол, камптозар, адриамицин (докс), 5-FU и гемцитабин. Такива химотерапевтици могат да се използват в практиката, съгласно изобретението, в комбинация с антитела, съгласно изобретението, чрез съвместно даване на антитялото и неконюгирания химиотерапевтик.
«Фармацевтично приемлив носител или пълнител» се отнася до биологично инертни съединения, известни в това ниво на техниката и използвани в даването на антителата, съгласно изобретението. Приемливи носители са известни в това ниво на техниката и са описани например в Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., 1990. Приемливи носители могат да включват биосъвместими, инертни или биоабсорбируеми соли, буфериращи агенти, олиго- или полизахариди, полимери, вискоеластични съединения, такива като хиалуронова киселина, агенти повишаващи вискозитета, консерванти и други подобни.
«Обект» се отнася до гръбначни, по-специално представители на бозайниците и включва, но не се ограничава до домашни животни, състезателни животни и примати, включително хора.
Антитела, съгласно изобретението
Антителата, съгласно изобретението, специфично се свързват с Крипто: като е употребено тук Крипто включва CR-1 Крипто белтък, CR-З Крипто белтък и техни фрагменти. Такива фрагменти може да представляват целия домен, като например извънклетъчните или вътреклетъчни домени, EGF-подобният домен, домен богат на цистеин, рецептор свързващ домен и други подобни. Такива фрагменти могат също така да включват съседни и несъседни епитопи във всеки домен на Крипто белтъка.
Последователността на CR-1 [SEQ ID NO: 1], включваща 188 аминокиселини е както следва
MDCRKMARFSYSVraEMAISWFELGLVAGLGHQEFAAPSRGYLAFREES
IWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPS
ЕУСМГСЕНОУК.КЕМССЗУРЕСТ№РККС31,СКСЮНС0ЬНСГ?0АРЬР5СО бЬУМОЕНЬУАЗЯТРЕЬРРЗАКТТТРМЬУИСЬЗХОЗУУ
Последователността на CR-3 [SEQ ID N0: 2], включваща 188 аминокиселини е както следва
MDCRKMVRFSYSVIWIMAISKAFELGLVAGLGHQEFARPSRGDLAFRDDS
IWPQEEPAIRPRSSQRVLPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLESFCACPPSF YGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGL УЖЕНЬУАЗЕТРЕЬРРЕАЕТТТЕМЬАСТСЬЗТСЗУУ
В един вариант антителата, съгласно изобретението, се свързват с епитопа в EGF-подобния домен на Крипто. EGFподобният домен се простира от аминокиселинен остатък 75 до около аминокиселинен остатък 112 от зрелия Крипто белтък. Епитопите в EGF-подобния домен могат да представляват линейни или нелинейни области от аминокиселинни остатъци. Обсъжданите примери за линейни епитопи включват, но не се ограничават до остатъци 75 - 85, 80 - 90, 85 - 95, 90 - 100, 100 - 110 или 105 - 112. В един вариант епитопът в EGF-домена е епитоп, образуван в конформационно нативният Крипто белтък срещу денатурирания Крипто белтък.
В друг вариант антителата, съгласно изобретението, се свързват с епитоп в домена от Крипто, богат на цистеин. Богатият на цистеин домен обхваща областта от аминокиселинен остатък 114 до аминокиселинен остатък 150 от нативния Крипто белтък. Епитопите в богатия на цистеин домен могат да съдържат линейни или
нелинейни области от аминокиселинни остатъци. Обсъжданите примери за линейни епитопи включват, но не се ограничават до остатъци 114 - 125, 120- 130, 125 - 135, 130- 140, 135 - 145 или 140 - 150. В един вариант епитопът в богатия на цистеин домен е един епитоп, образуван в конформационно нативния Крипто белтък срещу денатурирания Крипто белтък.
Веднъж образувани антителата, свързването им с Крипто може да бъде изследвано с помощта на стандартни техники, известни в това ниво на техниката, като ELISA, докато наличието на Крипто върху клетъчната повърхност може да се изследва с помощта на поточен цитометър (FACS), както е показано в Пример 2. Всяка друга техника на измерване на това свързване може алтернативно да се използва.
Настоящето изобретение осигурява антитела (напр. моноклонални и поликлонални антитела, антитела с единична верига, химерични антитела, бифункционални/биспецифични антитела, хуманизирани антитела, човешки антитела и присадени антитела - регион, определен от комплементарност (РОК), включително съединения, които включват РОК последователности, които разпознават специфично полипептида, съгласно изобретението), специфични за Крипто или негови фрагменти. Изобретението осигурява и фрагменти от антитела, включително Fab, Fab’, F(ab’)2 и Fv. Термините “специфичен” и “селективен”, когато са употребени за описване на антителата, съгласно изобретението, показват, че променливите региони на антителата, съгласно изобретението, разпознават и свързват Крипто полипептидите. Трябва да се разбира, че специфичните антитела, съгласно изобретението, могат също така да взаимодействат с други белтъци (напр. S. aureus белтък А или други антитела в техниката ELISA), чрез взаимодействие с последователностите извън променливия регион на антителата и по-специално, в постоянния регион на молекулата. Добре известни в това ниво на техниката и рутинно практикувани са анализи по скрининг за определяне на свързващата специфичност на антитяло, съгласно изобретението (т.е. антителата, които специфично се свързват с епитоп от лиганд/рецепторния домен и с домена, обхващащ аминокиселинни остатъци 46 - 62). За подробна дискусия на такива анализи виж Harlow et al. (Eds.), Antibodies. A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6. Антитела, които разпознават и свързват фрагменти от Крипто белтък също се обсъждат, показвайки че антителата са специфични за Крипто полипептидите. Антителата, съгласно изобретението, могат да се продуцират използвайки всеки метод, добре известен и рутинно практикуван в това ниво на техниката.
В един вариант изобретението осигурява антитяло, което специфично се свързва с епитоп в лиганд / рецептор свързващия домен на Крипто. Специфичността на антитялото е описана в повече детайли по-долу. Въпреки това, трябва да се отбележи, че антителата, които могат да се генерират от други полипептиди, описани преди това в литературата и които могат по случайност да проявяват кръстосана реактивоспособност по отношение на Крипто (напр. поради съществуването по случайност на подобни епитопи в двата полипептида), се наричат по подразбиране “антитела с кръстосана реактивоспособност”. Такива антитела с кръстосана реактивоспособност не са “специфични” за Крипто. Може да се извърши определяне на това дали едно антитяло се свързва специфично с даден епитоп на Крипто по няколко метода, като напр. Уестърн блотинг анализи, които са добре известни в науката. За идентифициране на клетките, които експресират Крипто, а също така и за модулиране на Крипто лиганд / рецептор свързващата
активност, антителата, които се свързват специфично с извънклетъчния епитоп на белтъка Крипто (т.е. частите от Крипто белтъка, които се откриват извън клетката), са особено полезни.
В един вариант изобретението осигурява безклетъчен състав, характеризиращ се с това, че се състои от поликлонални антитела, в който поне едно от антителата е антитяло, съгласно изобретението, специфично за Крипто. Антисерум, изолиран от животно, е един пример за такъв състав, тъй като е състав, представляващ фракция антитела от антисерум, ресуспендирана във вода или в друг разтворител, пълнител или носител.
В друг вариант изобретението осигурява моноклонални антитела. Моноклоналните антитела са високо специфични, тъй като са насочени срещу едно единствено антигенно място. Освен това, за разлика от поликлоналните антитела, които типично включват различни антитела насочени срещу различни епитопи, всяко моноклонално антитяло е насочено срещу една единствена детерминанта на антигена. Моноклоналните антитела са полезни за подобряване на селективността и специфичността на диагностичните и аналитични методи за анализ, използващи свързване от типа антиген-антитяло. Друго предимство на моноклоналните антитела е, че те се синтезират чрез хибридомна култура, неконтаминирана с други имуноглобулини.
В още един друг сроден вариант изобретението осигурява анти-идиотипично антитяло, специфично за антитялото, специфично за Крипто. За по-детайлно обсъждане на анти-идиотипичните антитела виж, напр. U.S. Patents 6,063,379 и 5,780,029.
Добре известно е, че антителата съдържат относително малки антиген-свързващи домени, които могат да се изолират химично или чрез рекомбинантни техники. Такива домени са полезни за самите Крипто свързващи молекули, а също така могат да се внасят повторно в човешки антитела или да се сливат с химиотерапевтици или полипептиди. По този начин, в един друг вариант изобретението осигурява полипептид, представляващ фрагмент от Криптоспецифично антитяло, в който фрагмента и асоциираната молекула, ако има такава, се свързват към Крипто. Чрез един неограничаващ пример изобретението осигурява полипептиди, които са едноверижни антитела и CDR-присадени антитела. За по-детайлна дискусия на CDR-присадените антитела вижте напр. U.S.Patent 5,859,205.
В друг вариант нехуманизираните антитела могат да се
хуманизират по всеки един от методите, известни в това ниво на техниката. Хуманизираните антитела се използват за in vivo терапевтични приложения. В допълнение, могат да се синтезират рекомбинантни “хуманизирани” антитела. Хуманизирани антитела са антителата, първоначално получени от бозайник, различен от човек, при използването на рекомбинантна ДНК технология за заместване на някои или всички аминокиселини, които не са необходими за свързването с антигена, с аминокиселини от съответните региони в последователностите от тежката и лека верига на човешки имуноглобулин. Следователно, те са химери съдържащи преди всичко последователности от човешки имуноглобулин, в които са внедрени региони, отговорни за специфичното свързване с антигена (виж напр. РСТ заявка WO 94/04679). Животните се имунизират с желания антиген, съответните антитела се изолират и частта от последователностите от променливия регион, отговорни за специфичното свързване с антигена, се отстраняват. Антиген-свързващите региони от антителата получени в животни се клонират в подходящо място на гени от човешко антитяло, в които са отстранени антигенсвързващите региони. Хуманизираните антитела минимизират
употребата на хетероложни (вътре-видово специфично) последователности в антителата за употреба в човешката терапия и е по-малко вероятно да предизвикат нежелани имунни отговори. Приматизираните антитела могат да се получат по подобен начин, използвайки приматни (напр. резус, бабун и шимпанзе) гени за антителата. Допълнителни промени могат да се внедрят в рамките на антитялото за модулиране на афинитета или имуногенността. Виж напр. U.S. Patent Nos 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 и 6,180,370.
Друг вариант на изобретението включва използването на човешки антитела, които могат да се получат в животни, различни от човека, като напр. трансгенни животни, носещи един или повече човешки имуноглобулинови трансгени. Такива животни могат да се използват като източник на спленоцити за получаване на хибридоми, както е описано в U.S. Patent 5,569,825, W000076310, W000058499 и W000037504 и включени тук като литературна справка.
Модулиране на сигнал
В друг вариант антителата, съгласно изобретението, се свързват с Крипто и модулират Крипто сигнализирането или взаимодействието между Крипто и белтък. Свръхекспресията на Крипто активността може да доведе до дедиференцирано състояние изявяващо характеристиките на мезенхимните клетки, до повишаване пролиферацията и клетъчното мигриране (Salomon et al., BioEssays 21: 61-70, 1999; Ciardiello et al., Oncogene 9: 291-298, 1994; and Baldassarre et al., Int. J. Cancer 66:538-543, 1996), до фенотипове, асоциирани c клетъчна трансформация, наблюдавани при неоплазия.
Един метод на изследване на активността на анти-Крипто антитела и тяхната способност да модулират Крипто сигнализирането е с F9 - Крипто поразена (П) клетъчна линия (Minchiotti at al., Meeh Dev. 90: 133-142, 2000). Крипто стимулира smad2 фосфорилирането и транскрипционния фактор FAST в ембриони на Xenopus и активността на транскрипционния фактор FAST може да бъде проследена чрез измерване на луциферазната активност на репортерен ген FAST регулаторен елемент луцифераза (Saijoh et al., Mol. Cell 5:35-47, 2000). Крипто гена в F9Крипто П клетките е делетиран, следователно те са нулеви по Крипто и Крипто-зависимото сигнализиране (Minchiotti at al., Meeh. Dev. 90: 133-142, 2000). Крипто-сигнализирането може да бъде оценено в Р9-Крипто П клетки чрез трансфекция в Крипто, FAST и конструктът FAST регулаторен елемент - луцифераза. В тези клетъчни линии няма да се наблюдава зависима от Крипто FAST луциферазна активност, освен ако те не са трасфектирани с Крипто сДНК и FAST сДНК. Антителата, способни да блокират Криптозависимото сигнализиране по Nodal, са антителата, които блокират функцията на Крипто сигнализиране.
Може да се използва и друг анализ, способен да измери активността на Крипто, от тези с познания в това ниво на техниката, като напр. анализ на растежа в полусолиден агар (виж Пример 4, подолу). Способността на клетките да растат в полусолиден агар се свързва с клетъчната трансформация и анализът е класически in vitro тест за измерване на инхибирането на растежа на туморните клетки. Други анализи, използвани в определяне на инхибирането на активността, включват in vitro анализ върху пластмаса и други подобни.
Терапевтични използвания
Антителата, съгласно изобретенията, се използват и за терапевтични цели, като напр. модулиране на растежа на туморните клетки, за диагностични цели,за количествено определяне на Крипто и за пречистване на Крипто.
В един вариант се осигуряват антитела, които могат да се свързват специфично с Крипто и които модулират растежа на туморните клетки в пациент. В един вариант туморните клетки са тестикулни, гръдни, тестикулни, от дебелото черво, белодробни, от яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреатични и стомашни туморни клетки
В друг вариант се осигуряват антитела, които могат да се свързват специфично с Крипто и които модулират растежа на туморни клетки, които свръхекспресират Крипто. В един вариант
туморните клетки са клетъчни линии, които свръх експресират Крипто, такива като клетъчни линии, получени от рак на гърдата, тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреаса и стомаха.
Анти-Крипто антителата могат да се скринират за активност in vivo, като потенциални противоракови агенти, спазвайки стандартните протоколи, използвани от тези с опит в това ниво на техниката, както е показано в Пример 4, по-долу. Примери за такъв протокол се показани от Националния Институт по Рак (НИР) в протоколите на “in vivo скриниране на ракови модели”, публикация на Националния Здравен Институт № 84-2635 (Февруари, 1984).
В друг вариант на изобретението антителата, съгласно изобретението, се използват за лечение на пациент с раков тумор.
Антителата, съгласно настоящето изобретение, могат да се комбинират с фармацевтично приемлив носител и дават в терапевтично активна доза на пациент. За коментар на методите на инхибиране на растежа на туморите виж напр. U.S. Patent 6,165,464.
Обсъдени са също така и методи на лекуване на обект, страдащ от нарушения, свързани с анормални нива (т.е. повишени или намалени) на Крипто, характеризиращ се с това, че включва даване на обект на ефективно количество от антитяло, което специфично се свързва с епитоп в литанд / рецептор свързващия домен на Крипто, включващ, но не ограничаващ се до епитоп, който е EGF-подобен домен или богат на цистеин домен в Крипто.
Обсъждат се и методи на лечение на обект, страдащ от нарушение свързано с анормални нива (т.е. повишени или намалени) на Крипто, характеризиращ се с това, че включва даване на обект на ефективно количество от антитяло, което специфично образува комплекс с Крипто и е насочен към епитопа, към който се насочва антитялото, подбрано измежду група, състояща се от A6C12.il, A6F8.6 (АТСС Вх.№ РТА-3318), А7Н1.19, A8F1.30, A8G3.5 (АТСС Вх.№ РТА-3317), А8Н3.1 (АТСС Вх.№ РТА-3315), А8Н3.2, А19А10.30, А10В2.18 (АТСС Вх.№ РТА-3311), A27F6.1 (АТСС Вх.№ РТА-3310), A40G12.8 (АТСС Вх.№ РТА-3316), A2D3.23, А7А10.29, A9G9.9, А15С12.10, А15Е4.14, А17А2.16, А17С12.28, A17G12.1 (АТСС Вх.№ РТА-3314), А17Н6.1, A18B3.il (АТСС Вх.№ РТА-3312), А19Е2.7, B3F6.17 (АТСС Вх.№ РТА-3319) и B6G7.10 (АТСС Вх.№ РТА-3317).
Диагностициране чрез откриване на Крипто се провежда лесно чрез стандартни анализи на свързване с използване на нови антитела, съгласно изобретението, което позволява на тези с опит в това ниво на техниката да откриват специфичното присъствие на Крипто в широк набор от проби, култури и други подобни.
Китовете, съдържащи антитяло съгласно изобретението, обхващат която и да е от целите, описани тук. По принцип един кит съгласно изобретението включва също така контролен антиген, към който антитялото е имуноспецифичен. Вариантите включват китове, съдържащи всички реагенти и инструкции за тяхното използване.
Допълнителните характеристики на изобретението ще станат очевидни от следните илюстративни примери.
Примери
Пример 1: Свръхекспресия и пречистване на Крипто
Беше конструиран един експресионен плазмид, наречен pSGS480, чрез субклониране на сДНК, коидираща аминокиселинни остатъци от 1 до 169 от човешки Крипто [аминокиселини 1 до 169 от SEQ ID NO: 1], слят към Fc домен на човешки IgGi (т.е. “CR(delC)Fc”) във вектор pEAGllOO. За по-детайлно описание на този вектор, виж предстояща заявка на U.S.Patent Serial No 60/233,148, от 18 Септември, 2000. Векторът pEAGllOO е производен на плазмид pCM-Sport-betagal на GIBCO-BRL Life Technologies, чието използване във временни СНО трасфекции е описано от Schifferli et al., 1999, Focus 21: 16. Той е конструиран чрез отстраняване на Notl фрагмент, съдържащ репортерен ген бета-галактозидаза, от плазмида pCMV-Sport-Betagal (каталожен № 10586-014) както следва: плазмидът се срязва с Notl и EcoRV, 4.38 kb Notl основа на вектора се пречиства в гел и лигира. Лигираната ДНК се трансформира в компетентни клетки Е. coli DH5alpha. Изолира се pEAGllOO като плазмид, съдържащ желания рекомбинант, изолиран от единична колония. Последователността на pEAGl 100, обхващаща промотора, полилинкера и сигнала за прекъсване на транскрипцията, се потвърждава.
Плазмидът pSGS480 беше временно трансфектиран в СНО клетки и клетките бяха култивирани при 28°С за 7 дни. Наличието на CR(del C)-Fc белтък в тези клетки и физиологично подходяща среда беше изследвано чрез Уестърн-блот анализ. За Уестрн-блот анализа физиологично подходящата среда и Крипто трансфектираните клетки бяха подложени на SDS-PAGE на 4-20 % градиентни гелове при редуциращи условия, прехвърлени електрофоретично върху нитроцелулоза и Крипто-слетият белтък беше детектиран със заешки поликлонален антисерум, получен срещу конюгат на
принципа “ключ-ключалка” между Крипто 17-мер пептид (съдържащ остатъци от 97 до 113 от SEQ ID NO: 1) и хемоцианин. След центрофугиране за отстраняване на клетките, Уестърн блот анализът показа, че CR(del C)-Fc белтъкът се секретира ефективно във физиологично подходяща среда (супернатанта). Супернатантата беше приложен на Белтьк-А-Сефароза (Pharmacia), и свързаният белтък бе елуиран с 25 шМ натриев фосфат pH 2.8, 100 mM NaCl. Елуираният белтък беше неутрализиран с 0.5 М натриев фосфат при pH 8.6 и анализиран за съдържание на тотален белтък чрез измерване на абсорбцията при 240 - 340 nm и за чистота чрез SDSPAGE. Елуираният белтък беше филтриран на филтър с размер на порите 2 pm и съхранен при -70°С.
Пример 2: Генериране и скрининг на антитела
Елуираният CR(del C)-Fc белтък се инжектира в мишки и с помощта на стандартни хибридомни техники, известни на тези с опит в това ниво на техниката, са генерирани антитела.
А. Генериране на антитела
По-специално, женски мишки Robertsonian (Jackson Labs) бяха имунизирани интраперитонеално с 25 pg пречистен човешки CR СFc емулгиран с пълен пълнител на Frend (GibcoBRL#15721-012). Мишките бяха подложени на двукратно третиране интерперитонеално с 25 pg CR C-Fc, емулгиран с непълен пълнител на Frend (GibcoBRL#l 5721-014) и веднъж с перли белтък А. Серумите бяха скринирани и 3 дни след последната доза, мишките с най-добър титьр бяха подложени на второ третиране интерперитонеално с 50pg разтворим CR del C-Fc, три дни преди сливането. На мишките беше приложен интравенозно 50 pg CR del C-Fc в деня преди сливането. Мишите далачни клетки бяха слети с FL653 миеломни клетки при съотношение 1 далачна клетка : 6 миеломни клетки и бяха посети при концентрация 100 000, 33 000 и 11 000 клетки за ямка в плака за тъканни култури с 96 ямки в селекционна среда. Една седмица покъсно ямките, в които имаше растеж, бяха скринирани чрез FACS и ELISA тестове. Бяха проведени две сливания.
Б. Скриниране на антитела
Супернатантите, получени като резултат от първото или второто сливане, бяха скринирани първо чрез плаки ELISA за разпознаване на белтъците Крипто del С и/или Крипто EGF-подобен домен. Един контролен слят белтък (LT-бета рецептор-Fc) беше покрит в плаки ELISA за отстраняване на моноклоналните антитела, които разпознават човешки Fc епитоп. Анализът ELISA беше проведен, както е описано по-долу в част В. При първото сливане първичните супернатанти бяха скринирани и за своята способност да разпознават Крипто белтък от клетъчната повърхност в клетъчна линия от тестикулти туморни клетки, NNCIT чрез FACS. В случая на второто сливане, беше изследвана способността на супернатантата да разпознава Крипто в две туморни клетъчни линии, NCCIT и клетъчната линия на рак на гърдата DU4475, чрез FAC. Вторичните скрининги включват тестване на способността на супернатантата от моноклоналните антитела да разпознават Крипто от клетъчната повърхност в панел от туморни клетъчни линии (виж Таблица 1 и 2 за резултатите), способността на моноклоналните антитела да разпознават имунохистохимично човешки Крипто върху срези от рак на гърдата и дебелото черво, способността на моноклоналните антитела да блокират в анализ на Крипто-Nodal сигнализиране, способността за блокиране на растежа на туморни клетки при анализ върху пластини или в полусолиден агар, и способността да интернализират Крипто от клетъчната повърхност.
В. ELISA
Изследването ELISA беше проведено както следва:
Материали:
Плаки: Costar high-binding Easy-wash плаки (07-200-642) 2’ антитяло: Pierce Gt anti-Ms IgG (H + L)-HRP (P131430) Субстрат: Pierce TMB Substrate Kit (34021) Стоп разтвор: IN H2SO4
Буфери:
Буфер за свързване: 0.1 М NaHPC>4 pH 9.0 Блокиращ буфер: PBS + 10 % Donor Calf Serum Буфер за промиване: PBS + 0.1 % tween-20
Антигените CR-del-C-Fc и CR EGF-fc и контролният слят белтък hu IgGl бяха разредени в буфер за свързване до 500 ng/ml. 100 μΐ бяха добавени във всяка ямка и инкубирани за 1 час при 37°С или за една нощ при 4°С. След това бяха добавяни 250 μΐ/ямка, последвано от инкубиране за 30 мин при 37°С. Отново течността беше отдекантирана и плаката - обърната и попивана до изсушаване. Супернатантите бяха разредени 1 : 50 в буфер за промиване и посети при концентрация 50 μΐ/ямка, последвано от инкубиране за 1 час при стайна температура. Плаките бяха промити трикратно обилно с 250 μΐ/ямка буфер за промиване. След това бяха добавени 100 μΐ/ямка 2’ антитяло, разредено в буфер за промиване при 1:10 000, последвано от инкубиране за 30 мин. при стайна температура. След това плаките бяха промити трикратно, обилно с 250 μΐ/ямка буфер за промиване, след това беше добавен субстрат при 100 μΐ/ямка. Цветът беше оставен да се развие до наситено черно и след това бяха добавяни 100 μΐ/ямка стоп разтвор и абосрбцията в плаките беше отчитана при 450 nm.
Г. Поточна цитометрия
Крипто положителните клетъчни линии могат да се използват за изследване на моноклоналните антитела за свързване с Крипто, прилагайки оцветяване и поточна цитометрия както следва:
Клетките от ΤΙ62 флаконите се освобождават с 2 ml PBS’ с 5 mM EDTA при 10 min и 37°С. Сместа се довежда до 20 ml със серум,
чрез последователно неколкократно пипетиране за разпръскване на клетъчните агрегати. Сместа се центрофугира при 1 200 rpm за 5 минути. Клетките се промиват с 5 - 10 ml PBS в 0.1% BSA (буфер за промиване) при 4°С. Центрофугират се при 1 200 rpm за 5 минути. Ресуспендират се при 4 х 106 - 107 / ml в буфер за промиване. Съхраняват се на лед.
Подготовка на антителата за оцветяване. Пречистените антитела се разреждат до 1 - 10 pg/ml в буфер за промиване. Добавят се 50 μΐ от клетки в плака с 96 ямки (Linbro V bottomed, ICN 7632105). За всяка контрола се посява по една ямка с клетки от дадена клетъчна линия, която трябва да се анализира, включително и клетки без антитяло, само с 2° антитяло, хибридомна среда, супернатанта от антитела за положителна контрола, ако е налична или пречистена, и контрола за субклас IgG (ако се използват пречистени антитела).
Посява се по една ямка с клетки за всяка експериментална проба, за всяка клетъчна линия, която ще се изследва. Плаката се центрофугира при 1 200 rpm за 5 минути в настолна центрофуга при 4°С. Буферът леко се отстранява чрез обръщане на плаката и почукване докато течността надлежно се отстрани. След това към ямките се добавят по 40 - 50 μΐ от антителата (или буфер за промиване за пробата без антитяло и тази само с 2° антитяло). Провежда се инкубиране за най-малко 30 мин - 1 час при 4°С. Плаката се центрофугира при 1 200 rpm за 5 минути. Разтворът с антителата леко се отстранява. Ямките се промиват двукратно с 200 μΙ/ямка буфер за промиване, като след всяко промиване плаката се центрофугира. Буферът се отстранява.
Клетките от всяка ямка се ресуспендират в 50 μΐ от 1 : 200 разреден (в буфер за разреждане) R-РЕ-свързан анти-миши IgG, Fc специфичен (Jackson Immunoresearch Laboratories Cat# 115-116-071). Инкубират се за 20 мин. при 4°С на тъмно. Добавят се 150 μΐ буфер за промиване във всяка ямка. Клетките се ресуспендират в 150 μΐ 1% PFA в PBS. Съдържанието на всяка ямка се премества в отделна епруветка (5 ml полистиренова Falcon епруветка с обло дъно 352052). Епруветките се обвиват в тънко фолио.
Съдържанието на епруветките след това се отчита на поточен цитометьр.
Резултатите от двата скрининга на моноклоналните антитела, получени чрез този метод, са обобщени в Таблици 1 и 2, по-долу, в които първата колона показва имената на хибридомните субклонове, следващите две колони показват резултатите от ELISA скрининга и останалите колони показват анализите от поточната цитометрия на четири Крипто-положителни клетъчни линии. Резултатите са представени в единици на среден флуоресцентен индекс (СФИ).
Таблица 1: Характеризиране на анти-Крипто моноклонално антитяло
Хибридомен субклон АТТС № ELISA Крипто delC Sups ELISA Крипто EGFподобен домен Sups DU4475 СФИ NCCIT СФИ GEO СФИ НТЗ СФИ
Контрола ELISA 0.06 0.07
Контрола - Миши Ig 14 9 37 18
A6C12.il 2.21 0.07 11 35 29 8
A6F8.6 РТА-3318 2.32 0.08 11 50 29 10
А7Н1.19 2.14 0.09 14 34 27 12
A8F1.30 2.15 0.1 17 27 32 28
A8G3.5 РТА-3317 2.39 0.09 9 30 25 15
А8Н3.1 РТА-3315 2.4 1.7 9 44 23 10
А8Н3.2 2.54 0.07 13 13 16 14
А19А10.30 2.02 0.09 9 40 20 10
А10В2.18 РТА-3311 2.36 0.07 40 63 100 43
A27F6.1 РТА-3310 2.28 1.19 9 44 26 17
A40G12.8 РТА-3316 2.27 1.59 10 47 26 16
Таблица 2: Характеризиране на анти-Крипто моноклонално
антитяло
Хибрвдомен субклон АТТС№ ELISA Крипто delC Sups ELISA Крипто EGFподобен домен Sups DU4475 СФИ NCCIT СФИ GEO СФИ нтз СФИ
Контрола ELISA 0.05 0.05
Контрола - Миши Ig 10 6 4 6
A2D3.23 0.93 0.90 73 138 37 27
А7А 10.29 1.37 0.07 75 83 33 83
A9G9.9 1.39 0.07 52 62 32 82
А15С12.100 1.42 0.06 46 55 25 93
А15Е4.14 1.38 0.06 50 63 23 95
А17А2.16 1.40 0.06 76 97 41 81
А17С12.28 0.96 0.97 6 16 3 22
A17G12.1 РТА-3314 1.30 1.37 61 66 28 78
А17Н6.1 1.38 0.05 35 30 5 28
A18B3.il РТА-3312 1.36 1.38 50 42 33 65
А19Е2.7 1.40 0.06 53 59 26 99
B3F6.17 РТА-3319 1.37 0.06 77 51 39 89
B6G7.10 РТА-3313 1.38 1.40 28 22 22 56
В11Н8.4 1.41 0.06 59 101 39 107
В12С12.5 1.10 1.04 27 14 23 59
В15А2.6 1.40 0.06 36 44 22 59
С4А2.16 1.40 0.06 24 36 22 65
Пример 3: Анализ тип “Недействителна клетка” за инхибиране на Крипто-сигнализирането
По-долу е описан анализът по “F9 Крипто недействителна клетка сигнализиране”, използван за оценка на инхибирането на Крипто сигнализирането.
Ден 0 Покриват се плаки със шест ямки с 0.1 % желатин в количество 2 ml/ямка при 37°С за 15 минути. Клетките се посяват в концентрация 6 х 105 F9 Крипто недействителни клетки за ямка.
Ден 1 Трансфекция:
Всяка една от следните проби се добавя към 300 μΐ OptiMeml за получаване на Разтвор А за всяка проба:
Проба 1: 0.5 pg (N2)7 луцифераза FAST репортерена сДНК плюс 1.5 pg сДНК на празен вектор.
Проба 2: 0.5 pg (N2)7 луцифераза FAST и 1 pg сДНК на празен вектор.
Проба 3: 0.5 pg (N2)7 луцифераза, 0.5 pg Крипто ADD 0.5 FAST и
10.5 pg сДНК на празен вектор.
Проба 4: 0.5 pg (N2)7 луцифераза, 0.5 pg Крипто, 0.5 FAST и 0.5 pg сДНК на празен вектор.
Проба 5: 0.5 pg (N2)7 луцифераза, 0.5 pg Крипто, 0.5 FAST и 0.5 pg сДНК на празен вектор.
Проба 6: 0.5 pg (N2)7 луцифераза, 0.5 pg Крипто, 0.5 FAST и 0.5 pg сДНК на празен вектор.
Проба 7: 0.5 pg (N2)7 луцифераза, 0.5 pg Крипто, 0.5 FAST и 0.5 pg сДНК на празен вектор.
Проба 8: 0.5 pg (N2)7 луцифераза, 0.5 pg Крипто, 0.5 FAST и 0.5 pg сДНК на празен вектор.
Проба 9: 0.5 pg (N2)7 луцифераза, 0.5 pg Крипто, 0.5 FAST и 0.5 pg сДНК на празен вектор.
Разтвор Б представлява 30 pl луцифектамин плюс 270 pl Optimem 1.
За всяка проба се смесват разтвори А и Б заедно. Инкубират се 45 минути при стайна температура. Промиват се ямките с 2 ml/ямка от Optimem 1. Аспирира се непосредствено преди следващата стъпка. Добавят се 2.4 ml Optimem 1 към всяка смес от разтвори А + Б, смесват се, добавят се 1.5 ml/ямка за дублиране на ямките. Инкубират се 5 часа при 37°С. Добавят се 1.5 ml/ямка от DMEM + 20 % FCS, 2 mM Gin, Р/S към ямките, които получават проби 1 до 3. Добавят се анти-Крипто антитела както следва: в ямки на Проба 4: A27F6.1, 10 pg/ml; в ямки на Проба 5: A27F6.1, 2 pg/ml; в ямки на Проба 6: A40G12.8, 10 pg/ml, в ямки на Проба 7: A40G12.8, 2 pg/ml; в ямки на Проба 8: А10В2.18, 10 pg/ml, 2 pg/ml; в ямки на Проба 9: А10В2.18,2 pg/ml.
Ден 2 Средата се отстранява, клетките се промиват с PBS, 2 ml/ямка. Добавя се DMEM + 0.5 % FCS, 2 mM Gin, Р/S и същите количества антитела, както в предишния ден, в същите ямки.
Ден 3 Проявяване на луциферазен сигнал. Клетките се промиват с PBS + Са2+ и Mg2+, 2 ml/ямка. Използва се LucLite кит, Packard cat #6016911. Буферът и субстратът се темперират до стайна температура. Осветлението се загася. Субстратът се разтваря с 10 ml буфер. Разрежда се 1 : 1 с PBS + Са2+ и Mg2+. Ямките се аспирират. Бързо се добавят 250 μΐ разтворен субстрат към всяка ямка с помощта на автоматична пипета, Falcon 35-3296. Реакцията в ямките се отчита на луминометьр и с помощта на Winglow, данните се прехвърлят във формат Excel.
Резултатите от този анализ са обобщени в Таблица 3, по-долу.
Таблица 3: Анализ на Крипто-сигнализиране: инхибиране с антиКрипто моноклонални антитела
Трансфектирана сДНК Анти-Крипто антитяло Относителна луминисцентност (единици)
(N2)7 luc Без 123
(N2)7 luc, FAST, Без 259
(N2)7 luc, FAST, Крипто Без 3091
(N2)7 luc, FAST, Крипто A27F6.1 lOpg/ml 1507
(N2)7 luc, FAST, Крипто A27F6.1 2 gg/ml 2297
(N2)7 luc, FAST, Крипто A40G12.8 10 pg/ml 1213
(N2)7 luc, FAST, Крипто A40G12.8 2 pg/ml 2626
(N2)7 luc, FAST, Крипто A10B2.18 lOpg/ml 3466
(N2)7 luc, FAST, Крипто A10B2.18 2 pg/ml 3103
Пример 4: Анализ по in vitro инхибиране на растежа на туморни клетки
Инхибирането на Крипто сигнализирането може да бъде изследвано и чрез измерване на растежа на GEO клетки в полусолиден агар. Виж напр. Ciardiello et al., Oncogene. 1994 Jan; 9 (1): 291-8; Ciardiello et al., Cancer Res. 1991 Feb 1 ; 51 (3) : 1051-4.
Първо се разтапя 3 % бактоагар. Държи се при 42°С на водна баня. След това се смесват разтопеният 3 % бактоагар и предварително затоплена пълноценна среда до получаване на разтвор от 0.6 % бактоагар, поддържан при 42°С. 4 ml от разтвора се изливат в петриева паничка с диаметър 6 cm и се оставят да се охладят за поне 30 минути за образуване на основен слой от агара. GEO клетките се трипсинизират и ресуспендират в пълноценна среда до концентрация 105 cells/ml. Добавят се антителата, които ще се изследват или контролите, към клетъчните суспензии, антителата се титруват от 200 pg до 1 pg. Смесват се равни обеми от GEO клетъчна суспензия и 0.6 % бактоагар и от тази смес (2 ml) се поставя върху основният слой агар. Петритата се оставят да се охладят най-малко за 1 час. Инкубират се за 14 дни при 37°С в СО2 инкубатор. Преброяват се видимите колонии без използване на микроскоп. Липсата на колонии, в сравнение с отрицателните контроли, показва, че изследваното антитяло инхибира in vitro растежа на туморните клетки.
Този анализ беше използван за получаване на резултатите, показани в Таблица 4, за антитела A27F6.1 и B6G7.10, като и двете антитела показват способност да намаляват растежа на GEO клетъчните колонии.
Таблица 4: Резултати от растежа при анализ в полусолиден агар
Антитяло Среден брой колонии
Без 109.0
Без 104.3
A27.F6 20 pg/ml, 82.0
A27F6.1 10 pg/ml 78.3
A27F6.1 5 pg/ml 79.0
A27F6.1 1 pg/ml 108.7
B6G7 20 pg/ml 102.3
B6G7 10 pg/ml 71.7
изливат в петриева паничка с диаметър 6 cm и се оставят да се охладят за поне 30 минути за образуване на основен слой от агара. GEO клетките се трипсинизират и ресуспендират в пълноценна среда до концентрация 105 cells/ml. Добавят се антителата, които ще се изследват или контролите, към клетъчните суспензии, антителата се титруват от 200 pg до 1 pg. Смесват се равни обеми от GEO клетъчна суспензия и 0.6 % бактоагар и от тази смес (2 ml) се поставя върху основният слой агар. Петритата се оставят да се охладят най-малко за 1 час. Инкубират се за 14 дни при 37°С в СО2 инкубатор. Преброяват се видимите колонии без използване на микроскоп. Липсата на колонии, в сравнение с отрицателните контроли, показва, че изследваното антитяло инхибира in vitro растежа на туморните клетки.
Този анализ беше използван за получаване на резултатите, показани в Таблица 4, за антитела A27F6.1 и B6G7.10, като и двете антитела показват способност да намаляват растежа на GEO клетъчните колонии.
Таблица 4: Резултати от растежа при анализ в полусолиден агар
Антитяло Среден брой колонии
Без 109.0
Без 104.3
A27.F6 20 pg/ml, 82.0
A27F6.1 10 pg/ml 78.3
A27F6.1 5 pg/ml 79.0
A27F6.1 1 pg/ml 108.7
B6G7 20 pg/ml 102.3
B6G7 10 pg/ml 71.7
Пример 5: Анализ по in vivo инхибиране на растежа на туморни клетки
За изследване на инхибиране на растежа на туморни клетки, клетъчна линия от човешки туморни клетки се имплантира подкожно в голи мишки без тимус и се наблюдава ефектът на антителата, съгласно изобретението, при или без допълнителни химиотерапевтични лечения, които могат да доведат до синергичен или допълнителен ефект върху туморното инхибиране.
Този анализ може да се провежда и по алтернативен начин с използване на различни клетъчни линии от туморни клетки, като напр. GEO (добре диференцирана in vitro клетъчна линия от рак на дебелото черво в човек, получена от Американската Колекция за Типови Култури (АТСС)), DU-4475 (in vitro клетъчна линия от рак на гърдата, получена от АТСС), NCCIT (клетъчна линия от рак на тестисите, получена от АТСС) или други, известни в това ниво на техниката. Един пример за такъв анализ е следният:
Животните се маркират индивидуално чрез продупчване на ухото. GEO клетъчната линия се пасажира in vitro и in vivo за 1-4 пасажа. В животните се имплантират подкожно GEO клетки в областта на деснияхълбок. Могат да се използват следните групи животни:
Група # 1. Лечение Солева контрола, 0.2 ml/мишка, интраперитонеално (ип), три пъти дневно (пн., ср., пт.) # на мишката 20
2. mAb, ниска доза, ип, 10
3. mAb, средна доза, ип, 10
4. mAb, висока доза, ип, 10
5. 5-FU, 30 mg/kg/inj, ип, 3 Rx/wk (пн., ср., пт.) 10
6. Цисплатина, 2 mg/kg/inj, ип, 3 Rx/wk (пн., ср., пт.) 10
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Адриамицин, 1.6mg/kg/inj, ип, 3Rx/wk (пн., ср., пт.) Иринотекан, 10 mg/kg/inj, ип, 3Rx/wk (пн., - пт.) mAb, ниска доза, ип, + 5-FU (междинна доза) mAb, средна доза, ип, + 5-FU (междинна доза) mAb, висока доза, ип, + 5-FU (междинна доза) mAb, ниска доза, ип, + цисплатина (междинна доза) mAb, средна доза, ип, + цисплатина (междинна доза) mAb, висока доза, ип, + цисплатина (междинна доза) mAb, ниска доза, ип, + Адриамицин (междинна доза) mAb, средна доза, ип, + Адриамицин (междинна доза) mAb, висока доза, ип, + Адриамицин (междинна доза) mAb, ниска доза, ип, + Иринотекан (междинна доза) mAb, средна доза, ип, + Иринотекан (междинна доза) mAb, висока доза, ип, + Иринотекан (междинна доза)
Ден 0: Имплантиране на тумора, отбелязване на началното тегло на животните.
Ден 1: Начало на лечението, както е показано по-горе.
Ден 5: Начало на измерванията на размера на туморите и телесното тегло два пъти седмично и продължаване до прекратяване на експеримента.
Проследяват се началното телесно тегло, измерванията на размера на туморите и телесното тегло, хистология при умъртвяване и имунохистохимичен анализ на туморите, провеждат се анализи за Крипто-експресия, растеж на туморите и инхибиране на растежа на туморите.
Пример 6: In vivo присадъчен туморен модел - богато на цистеин блокиращо анти-Крипто антитяло
За оценка на отговора на NCCIT беше имплантирана подкожно клетъчна линия от карцинома на тестисите у човек, заедно с антитяло, което се свързва с богат на цистеин домен на Крипто. Експерименталните методи са изброени по-долу. Резултатите са показани на Фигура 1.
Методи и материали
Животни: Бяха използвани голи мишки без тимус. Животните бяха индивидуално белязани чрез продупчване на ухото.
Тумор: NCCIT, in vitro клетъчна линия от медиастенални смесени зародишни клетки от крацинома на тестисите в човек беше първоначално получена от Американската Колекция за Типови Култури. Клетъчната линия беше пасажирана in vitro в шест пасажа в RPMI-1640/ 10 % FBS без антибиотици. На животните бяха имплантирани подкожно 5 х 106 cells /0.2 ml матригел в десния хълбок.
Група # Лечение # на мишката
1. Носител контрола, (25 тМ натриев фосфат, 100 тМ натриев хлорид, pH 7.2), 0.2 mV мишка, ип, Q14D Лечението започна на Ден -1 20
2. A8G3.5, 1 mg/kg/inj, ип., Q14D Лечението започна на Ден -1 10
3. A8G3.5, 3 mg/kg/inj, ип., Q14D Лечението започна на Ден -1 10
4. A8G3.5, 10 mg/kg/inj, ип., Q14D Лечението започна на Ден -1 10
5. Цис-платина, 2 mg/kg/inj, пк., 3 x/wk (пн., ср., пт.) за 6 третирания 10
Лечението започва на Ден 1
Схема на тестване
Ден-1 Случайно разпределение на мишките в контролната и експериментална групи. Отчитане на началното телесно тегло на животните. Прилагане на първите лечения на групите с антитела. Изготвяне на разтворите с дозите. Леченията бяха неизвестни за техническия персонал до приключване на анализа.
Ден 0 Имплантиране на тумор. Провеждане на бактериални култури върху туморите, имплантирани в мишките.
Ден 1 Прилагане на първото лечение към положително химиотерапевтична група.
Ден 4 Отчитане на измерванията на първоначалните размери на туморите и отбелязване на базовата линия в матригела. Проследяване на параметрите веднъж дневно и отбелязване на всяко нетипично наблюдение в животните.
Крайни Начално телесно тегло
точки Измервания на размера на тумора и телесното тегло
Пример 7: In vivo присадъчен туморен модел - EGF-подобнен домен блокиращо анти-Крипто антитяло
За оценка на отговора на NCCIT беше имплантирана подкожно клетъчна линия от карцинома на тестисите у човек, заедно с антитяло, което се свързва с EGF-подобен домен на Крипто. Експерименталните методи са изброени по-долу. Резултатите са показани на Фигура 2.
Методи и материали
Животни: Бяха използвани голи мишки без тимус. Животните бяха индивидуално белязани чрез продупчване на ухото.
Тумор: NCCIT, in vitro клетьна линия от медиастенални смесени зародишни клетки от крацинома на тестисите в човек беше първоначално получена от Американската
Колекция за Типови Култури. Клетъчната линия беше пасажирана in vitro в осем пасажа в RPMI-1640/ 10 % FBS без антибиотици. На животните бяха имплантирани подкожно 5 х 106 cells /0.2 ml матригел в десния хълбок.
Група# 1. Лечение Носител контрола, (25 mM натриев фосфат, 100 mM натриев хлорид, pH 7.2), 0.2 ml/ мишка, ип, Q14D Лечението започна на Ден -1 # на мишката 18
2. A27F6.1, 1 mg/kg/inj, ип., Q14D Лечението започна на Ден -1 с доза 2.6 mg/kg/мишка 10
3. A27F6.1, 1 mg/kg/inj, ип., Q14D Лечението започна на Ден -1 с доза 21.2 mg/kg/мишка 10
4. Цис-платина, 2 mg/kg/inj, пк., 3 x/wk (пн., ср., пт.) за 6 третирания 10
Лечението започва на Ден 1
Схема на тестване
Ден -1 Случайно разпределение на мишките в контролната и експериментална групи. Отчитане на началното телесно тегло на животните. Прилагане на първите лечения на групите с антитела. Изготвяне на разтворите с дозите. Леченията бяха неизвестни за техническия персонал до приключване на анализа.
Ден 0 Имплантиране на тумор. Провеждане на бактериални култури върху туморите, имплантирани в мишките
Ден 1
Ден 4 на 24 и 48 час след взимането на пробите.
Прилагане на първото лечение към положително химиотерапевтична група.
Отчитане на измерванията на първоначалните размери на туморите и отбелязване на базовата линия в матригела. Продължаване снемането на данни за размера на тумора и телесното тегло на мишките два пъти седмично. Проследяване на параметрите веднъж дневно и отбелязване на всяко нетипично наблюдение в животните.
Крайни
Начално телесно тегло точки
Измервания на размера на тумора и телесното тегло
Пример 8: Крипто моноклонални антитела, които блокират АЬК4-свързването
С цел да се прецени дали Крипто-специфичните моноклонални антитела могат да пречат на способността на крипто да се свързва с А1к4, активидин тип 1 рецептора, ние използвахме анализ с помощта на поточна цитометрия с клетъчна линия 293, която експресира стабилно А1к4. За генериране на тази клетъчна линия 293, клетките бяха ко-трансфектирани с плазмид, който експресира А1к4, свързан със С-края на НА епитопа и с плазмид, който експресира лекарството пуромицин при съотношение 10 : 1. Трансфектираните клетки бяха след това селекционирани по пуромицин за появата на колонии. След това колониите бяха взети, намножени и после анализирани за експресия на А1к4, използвайки Уестърн блот анализ за НА. Беше установено, че клон 21 (293-А1к4-21) експресира найвисоки нива на А1к4 в сравнение с контролата, нетрансфектирани клетки от линия 293.
За анализ на Крипто-А1к4 свързването чрез поточна цитометрия, беше използвана пречистена разтворима форма на човешки Крипто (ак 1-169) слят към Fc частта на човешки IgG (CrdelC-Fc). Приблизително 5 pg/ml CrdelC-Fc или контролен Fc белтък бяха инкубирани с 3 х 105 2 93-А1к4-21 клетки върху лед за 30 минути в 50 μΐ краен обем от FACS буфер (PBS с 0.1 % BSA). За пробите, съдържащи анти-Крипто антитела, 5 μg/ml CrdelC-Fc беше преинкубиран с 50 μΐ от всяко Крипто антитяло (А10.В2.18, A40.G12.8, A27.F6.1, А8.Н3.1, А19.А10.30, A6.F8.6, A8.G3.5, A6.C12.il) върху лед преди добавянето на клетките. Клетките след това бяха промивани с FACS буфер и свързаният Fc белтък беше детектиран чрез инкубиране на клетките с R-фикоеритринконгюгиран кози анти-човешки IgG (специфичен Fc фрагмент) от Jackson Immunologies. Пробите бяха след това промити повторно, фиксирани в 1 % параформалдехид в PBS и анализирани с помощта на стандартни процедури за поточна цитометрия. Резултатите от анализът FACS са показани на Фигура 3.
Някои от вариантите, съгласно изобретението, описани погоре, са посочени по-долу и включват, но не се ограничават до следните примери. Тези с опит в даденото ниво на техника могат да въведат множество промени и модификации в отделните примери по изобретението, отклоняващи се от идеята на изобретението. Счита се, че всички такива вариации попадат в обсега на изобретението.
Пълното описание на всяка публикация, цитирана тук, е включено тук като литературна справка.

Claims (61)

1. Антитяло, което специфично се свързва с епитопа в лиганд/рецептор свързващия домен на Крипто.
2. Антитяло, съгласно Претенция 1, характеризиращо се с това, че Крипто е избран измежду група, състояща се от SEQ ID NO: 1 и 2.
3. Антитяло, съгласно Претенция 2, характеризиращо се с това, че епитопът е в EGF-подобен домен.
4. Антитяло, съгласно Претенция 2, характеризиращо се с това, че епитопът е в богат на цистеин домен.
5. Антитяло, съгласно Претенция 2, което е избрано измежду група, характеризираща се с това, че включва A6C12.il, A6F8.6, А7Н1.19, A8F1.30, A8G3.5, А8Н3.1, А8Н3.2, А19А10.30, А10В2.18, A27F6.1, A40G12.8, A2D3.23, А7А10.29, A9G9.9, А15С12.10, А15Е4.14, А17А2.16, А17С12.28, A17G12.1, А17Н6.1, A18B3.il, А19Е2.7, B3F6.17 и B6G7.10.
6. Антитяло, съгласно Претенция 3, което е избрано измежду група, характеризираща се с това, че включва A40G12.8, А8Н3.1, A27F6.1, B6G7.10, A17G12.1 и А18В3.11.
7. Антитяло, съгласно Претенция 4, което е избрано измежду група, характеризираща се с това, че включва А19А10.30, А8Н3.1, A6F8.6, и A6C12.il.
8. Антитяло, което специфично се свързва с епитоп, характеризиращ се с това включва домен, обхващащ аминокиселинни остатъци 46 - 62 от Крипто.
9. Антитяло, съгласно Претенция 8, което е А10В2.18 и B3F6.17.
10. Антитяло, което специфично се свързва с епитоп, избран измежду група от епитопи, към които се свързват антителата A6C12.il, A6F8.6, А7Н1.19, A8F1.30, A8G3.5, А8Н3.1, А8Н3.2,
А19А10.30, А10В2.18, A27F6.1, A40G12.8, A2D3.23, А7А10.29, A9G9.9, А15С12.10, А15Е4.14, А17А2.16, А17С12.28, A17G12.1, А17Н6.1, А18В3.11, А19Е2.7, B3F6.17 и B6G7.10.
11. Антитяло, което специфично се свързва с Крипто и е способно да модулира Крипто сигнализирането.
12. Антитяло, съгласно Претенция 11, което специфично се свързва с епитоп в EGF-подобен домен на Крипто.
13. Антитяло, съгласно Претенция 12, което е избрано измежду A40G12.8, А8Н3.1 и A27F6.1.
14. Антитяло, съгласно Претенция 11, което специфично се свързва с епитоп в богатия на цистеин домен на Крипто.
15. Антитяло, съгласно Претенция 14, което е А6С12.11.
16. Антитяло, съгласно Претенция 11, което е избрано измежду група, характеризираща се с това, че включва A40G12.8, A8H3.1,A27F6.1 и A6C12.il.
17. Антитяло, което специфично се свързва с Крипто и е способно да модулира туморния растеж.
18. Антитяло, съгласно Претенция 17, което специфично се свързва с епитоп в EGF-подобен домен на Крипто.
19. Антитяло, съгласно Претенция 17, което специфично се свързва с епитоп в богатия на цистеин домен на Крипто.
20. Антитяло, съгласно Претенция 17, което е избрано измежду група, характеризираща се с това, че включва A27F6.1, A8G3.5, и B6G7.10.
21. Антитяло, което специфично се свързва с Крипто, способно е да модулира Крипто сигнализирането и еспособно да модулира туморния растеж.
22. Антитяло, съгласно Претенция 21, което специфично се свързва с епитоп в EGF-подобен домен на Крипто.
23. Антитяло, съгласно Претенция 21, което специфично се свързва с епитоп в богатия на цистеин домен на Крипто.
24. Антитяло, съгласно Претенция 21, което е A27F6.1.
25. Антитяло, получено чрез хибридома, избрано измежду група, характеризираща се с това, че включва A6F8.6 (АТСС Вх.№ РТА-3318), A8G3.5 (АТСС Вх.№ РТА-3317), А8Н3.1 (АТСС Вх.№ РТА-3315), А10В2.18 (АТСС Вх.№ РТА-3311), A27F6.1 (АТСС Вх.№ РТА-3310), A40G12.8 (АТСС Вх.№ РТА-3316), A17G12.1 (АТСС Вх.№ РТА-3314), A18B3.il (АТСС Вх.№ РТА-3312), B3F6.17 (АТСС Вх.№ РТА-3319) и B6G7.10 (АТСС Вх.№ РТА3313).
26. Антитяло, което специфично се свързва с Крипто и е способно да блокира взаимодействието между Крипто и ALK4.
27. Антитяло, съгласно Претенция 26, което специфично се свързва с епитоп в EGF-подобен домен на Крипто.
28. Антитяло, съгласно Претенция 26, което специфично се свързва с епитоп в богатия на цистеин домен на Крипто.
29. Антитяло, съгласно Претенция 26, което е избрано измежду група, характеризираща се с това, че включва A8G3.5, A6F8.6 и A6C12.il.
30. Антитяло, което специфично се свързва с Крипто и е способно да блокира взаимодействието между Крипто и ALK4 и което е способно да модулира туморния растеж.
31. Антитяло, съгласно Претенция 30, което специфично се свързва с епитоп в EGF-подобен домен на Крипто.
32. Антитяло, съгласно Претенция 30, което специфично се свързва с епитоп в богатия на цистеин домен на Крипто.
33. Антитяло, съгласно Претенция 30, което е A8G3.5.
34. Крипто антитяло, което може да интернализира Крипто.
35. Антитяло, съгласно Претенция 34, характеризиращо се с това, че антитялото е конюгирано с химотерапевтик.
36. Антитяло, съгласно Претенция 34, което е избрано измежду A27F6.1 HB3F6.17.
37. Състав за даване на обект с тумор, който състав експресира Крипто, характеризиращ се с това, че включва най-малко едно от антителата, съгласно всяка една от Претенции 1-35.
38. Състав, съгласно Претенция 37, характеризиращ се с това, че обектът е човек.
39. Състав, съгласно Претенция 37, допълнително характеризиращ се с това, че включва фармацевтично приемлив носител.
40. Антитяло, съгласно Претенция 37, характеризиращо се с това, че антитялото е конюгирано с химотерапевтик.
41. Състав, съгласно Претенция 37, допълнително характеризиращ се с това, че включва неконюгиран химотерапевтик.
42. Метод за модулиране на растежа на туморни клетки in vitro в проба, характеризиращ се с това, че включва стъпка на добавяне към пробата на състав, съгласно Претенция 37.
43. Използване на състав, съгласно Претенция 37, за получаване на лекарствено средство за модулиране на растежа на туморни клетки in vivo в обект, характеризиращ се с това, че включва стъпка на даване на обекта на ефективно количество от състава, съгласно Претенция 37.
44. Използване, съгласно Претенция 43, характеризиращ се с това, че обектът е човек.
45. Използване на състав, съгласно Претенция 37, за получаване на лекарствено средство за лечение на обект с тумор, който свръхекспресира Крипто, характеризиращ се с това, че включва даване на въпросния обект на състав, Съгласно Претенция 37 в ефективно количество.
46. Използване на състав, съгласно Претенция 39, за получаване на лекарствено средство за лечение на пациент с тумор, който свръхекспресира Крипто, характеризиращ се с това, че включва даване на въпросния пациент на състав, съгласно Претенция 39, в ефективно количество.
47. Използване на състав, съгласно Претенция 40, за получаване на лекарствено средство за лечение на пациент с тумор, който свръхекспресира Крипто, характеризиращ се с това, че включва даване на въпросния пациент на състав, съгласно Претенция 40, в ефективно количество.
48. Използване на състав, съгласно Претенция 41, за получаване на лекарствено средство за лечение на пациент с тумор, който свръхекспресира Крипто, характеризиращ се с това, че включва даване на въпросния пациент на състав, съгласно Претенция 41, в ефективно количество.
49. Използване, съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че туморната клетка е подбрана измежду група, състояща се от туморни клетки на гърдата, тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреаса и стомаха.
50. Използване, съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че туморната клетка е подбрана измежду група, състояща се от туморни клетки на гърдата, тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреаса и стомаха.
51. Използване, съгласно претенция 44, характеризиращ се с това, че туморната клетка е подбрана измежду група, състояща се от туморни клетки на гърдата, тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреаса и стомаха.
52. Използване, съгласно претенция 45, характеризиращ се с това, че туморът е подбран измежду група, състояща се от тумори на гърдата, тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреаса и стомаха.
53. Използване, съгласно претенция 46, характеризиращ се с това, че туморът е подбран измежду група, състояща се от тумори на гърдата, тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреаса и стомаха.
54. Използване, съгласно претенция 47, характеризиращ се с това, че туморът е подбран измежду група, състояща се от тумори на гърдата, тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреаса и стомаха.
55. Използване, съгласно претенция 48, характеризиращ се с това, че туморът е подбран измежду група, състояща се от тумори на гърдата, тестисите, дебелото черво, белите дробове, яйчниците, пикочния мехур, матката, шийката на матката, панкреаса и стомаха.
56. Използване на антитяло, съгласно Претенции 1 - 37, за определяне на това дали една тъкан експресира Крипто, характеризиращ се с това, че включва стъпка на анализиране на тъкан от обект чрез имуноанализ, използвайки антитяло, съгласно всяка една от Претенции 1-37.
57. Използване на антитяло, съгласно Претенции 1 - 37, за определяне на това дали една клетъчна линия експресира Крипто, характеризиращ се с това, че включва стъпка на анализиране на клетъчната линия чрез имуноанализ, използвайки антитяло, съгласно всяка една от Претенции 1-37.
58. Антитяло, съгласно Претенция 1, характеризиращо се с това, че антитялото е моноклонално антитяло.
59. Антитяло, съгласно Претенция 1, характеризиращо се с това, че антитялото е хуманизирано антитяло.
60. Антитяло, съгласно Претенция 1, характеризиращо се с това, че антитялото е човешко антитяло.
61. Използване на състав, съгласно Претенция 37, за получаване на лекарствено средство за лечение на обект за състояние, свързано с нежелана клетъчна пролиферация, като въпросният метод се характеризира с това, че включва даване на въпросния обект на състав, съгласно Претенция 37.
BG108363A 2001-04-26 2003-11-14 Крипто блокиращи антитела и тяхното използване BG108363A (bg)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28678201P 2001-04-26 2001-04-26
US29302001P 2001-05-17 2001-05-17
US30109101P 2001-06-26 2001-06-26
US36700202P 2002-03-22 2002-03-22
PCT/US2002/011950 WO2002088170A2 (en) 2001-04-26 2002-04-17 Cripto blocking antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG108363A true BG108363A (bg) 2004-09-30

Family

ID=27501437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG108363A BG108363A (bg) 2001-04-26 2003-11-14 Крипто блокиращи антитела и тяхното използване

Country Status (33)

Country Link
US (6) US7531174B2 (bg)
EP (3) EP1390389B1 (bg)
JP (4) JP4307845B2 (bg)
KR (1) KR100592357B1 (bg)
CN (1) CN100352501C (bg)
AR (3) AR037223A1 (bg)
AT (2) ATE420659T1 (bg)
BG (1) BG108363A (bg)
BR (1) BR0209254A (bg)
CA (2) CA2443840C (bg)
CL (1) CL2009002199A1 (bg)
CY (1) CY1108960T1 (bg)
CZ (1) CZ20033208A3 (bg)
DE (1) DE60230868D1 (bg)
DK (1) DK1390389T3 (bg)
EA (1) EA007469B1 (bg)
EE (1) EE200300528A (bg)
ES (1) ES2321065T3 (bg)
GE (1) GEP20074091B (bg)
HU (1) HUP0501113A3 (bg)
IS (1) IS2662B (bg)
MX (1) MXPA03009797A (bg)
MY (2) MY157382A (bg)
NO (1) NO20034805L (bg)
NZ (1) NZ566268A (bg)
PL (1) PL207087B1 (bg)
PT (1) PT1390389E (bg)
RS (2) RS51635B (bg)
SG (1) SG157951A1 (bg)
SI (1) SI1390389T1 (bg)
SK (1) SK14432003A3 (bg)
TR (1) TR200301846T2 (bg)
WO (1) WO2002088170A2 (bg)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPR395801A0 (en) 2001-03-26 2001-04-26 Austin Research Institute, The Antibodies against cancer
US20090123470A1 (en) * 2001-03-26 2009-05-14 The Macfarlane Burnet Istitute For Medical Research And Public Health Ltd. Antibodies Against Cancer
US7582299B2 (en) 2001-04-26 2009-09-01 Biogen Idec Ma Inc. Cripto-specific antibodies
PT1390389E (pt) * 2001-04-26 2009-04-03 Biogen Idec Inc Anticorpos que bloqueiam o cripto e as utilizações dos mesmos
JP2005520566A (ja) * 2002-03-22 2005-07-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体
CA2529945A1 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Biogen Idec Ma Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
CA2539116C (en) 2003-09-15 2014-11-18 Research Development Foundation Cripto antagonism of activin and tgf-b signaling
US7498298B2 (en) 2003-11-06 2009-03-03 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
KR20120064120A (ko) 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
WO2006074399A2 (en) 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
ES2408704T3 (es) 2005-01-05 2013-06-21 Biogen Idec Ma Inc. Moléculas de unión a Cripto
EP2074209A2 (en) 2006-07-28 2009-07-01 Children's Memorial Hospital Methods of inhibiting tumor cell aggressiveness using the microenvironment of human embryonic stem cells
AU2008260445A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Biogen Idec Ma Inc. Cripto binding molecules
JP2011522224A (ja) * 2008-04-21 2011-07-28 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 膵ベータ細胞質量生物マーカー
US20100135904A1 (en) * 2008-11-07 2010-06-03 Research Development Foundation Compositions and methods for the inhibition of cripto / grp78 complex formation and signaling
CA2809819A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
DK2528625T3 (da) 2010-04-15 2013-10-14 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepiner og konjugater deraf
BR112012030311A2 (pt) 2010-06-08 2017-01-24 Genentech Inc anticorpo
JP5889912B2 (ja) 2010-11-17 2016-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート
JP6130307B2 (ja) 2011-03-17 2017-05-17 ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム 再指向性免疫療法
KR102023496B1 (ko) 2011-04-21 2019-09-20 시애틀 지네틱스, 인크. 신규 결합제-약물 콘주게이트 (adc) 및 그의 용도
KR101992502B1 (ko) 2011-05-12 2019-06-24 제넨테크, 인크. 프레임워크 시그너처 펩티드를 사용하여 동물 샘플에서 치료 항체를 검출하기 위한 다중 반응 모니터링 lc-ms/ms 방법
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
JP6104257B2 (ja) 2011-10-14 2017-03-29 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピンおよびそのコンジュゲート
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
ES2649990T3 (es) 2012-10-12 2018-01-16 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpos anti-CD22-pirrolobenzodiazepinas
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
CN104837502B (zh) 2012-10-12 2018-08-10 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
DK2906298T3 (en) 2012-10-12 2018-12-17 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
AU2013328625B2 (en) 2012-10-12 2016-12-15 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10695433B2 (en) 2012-10-12 2020-06-30 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10751346B2 (en) 2012-10-12 2020-08-25 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—anti-PSMA antibody conjugates
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
CN105189507A (zh) 2012-12-21 2015-12-23 斯皮罗根有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
SG11201507214SA (en) 2013-03-13 2015-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
NZ710746A (en) 2013-03-13 2018-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3033111B1 (en) 2013-08-12 2019-03-13 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
BR112016013258A2 (pt) 2013-12-16 2018-01-16 Genentech Inc composto conjugado anticorpo-droga, composição farmacêutica, método para tratar câncer e kit
KR20170042495A (ko) 2013-12-16 2017-04-19 제넨테크, 인크. 펩티드모방체 화합물 및 그의 항체-약물 접합체
JP6671292B2 (ja) 2013-12-16 2020-03-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
PL3086814T3 (pl) 2013-12-23 2020-12-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Koniugaty środka wiążącego (ADC) z inhibitorami KSP
JP6531166B2 (ja) 2014-09-10 2019-06-12 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016040825A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
MX2017003123A (es) 2014-09-12 2017-05-12 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados geneticamente con cisteina.
US20160074527A1 (en) 2014-09-17 2016-03-17 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
AU2015352545B2 (en) 2014-11-25 2020-10-15 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX2017007169A (es) 2014-12-03 2018-05-02 Genentech Inc Compuestos de amina cuaternaria y conjugados de anticuerpofármaco de los mismos.
WO2016161477A1 (en) * 2015-04-07 2016-10-13 Prince Henry's Institute Of Medical Research (Acn 132 025 024) A method of treating neoplasias
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
RU2751512C2 (ru) 2015-06-22 2021-07-14 Байер Фарма Акциенгезельшафт Конъюгаты антитела и лекарственного средства (adc) и конъюгаты антитела и пролекарства (apdc), содержащие ферментативно расщепляемые группы
CA2996902C (en) 2015-10-02 2020-06-02 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody drug conjugates and methods of use
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
EP3362100B1 (en) 2015-10-16 2022-06-22 Genentech, Inc. Hindered disulfide drug conjugates
EP3365025B1 (en) 2015-10-20 2020-07-15 Genentech, Inc. Calicheamicin-antibody-drug conjugates and methods of use
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
AU2017236431A1 (en) 2016-03-24 2018-09-27 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
US20170315132A1 (en) 2016-03-25 2017-11-02 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
EP3458101B1 (en) 2016-05-20 2020-12-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Protac antibody conjugates and methods of use
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
WO2017216028A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
WO2018031662A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
EP3522933B1 (en) 2016-10-05 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for preparing antibody drug conjugates
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
CN110352068A (zh) 2016-12-02 2019-10-18 南加利福尼亚大学 合成的免疫受体及其使用方法
JP7030811B2 (ja) 2016-12-21 2022-03-07 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤を有する特異的抗体－薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
CA3047491A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
JP7066714B2 (ja) 2016-12-21 2022-05-13 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト 酵素的に切断可能な基を有する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX375569B (es) 2017-02-08 2025-03-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de pirrolobenzodiazepinas y anticuerpos
PT3612537T (pt) 2017-04-18 2022-08-29 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
ES2977788T3 (es) 2017-04-20 2024-08-30 Adc Therapeutics Sa Terapia combinada con un conjugado de anticuerpo anti-AXL y fármaco
MX2019015042A (es) 2017-06-14 2020-08-06 Adc Therapeutics Sa Regimen de dosificacion.
DK3668874T3 (da) 2017-08-18 2022-02-14 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepin-konjugater
IL273387B2 (en) 2017-09-20 2023-10-01 Ph Pharma Co Ltd Thylanstatin analogs
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JOP20200268A1 (ar) 2018-06-01 2020-10-26 Eisai R&D Man Co Ltd تضفير مترافقات عقار جسم مضاد معدل وطرق استخدامها
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
JP7708662B2 (ja) 2018-10-24 2025-07-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト コンジュゲート化された化学的分解誘導物質および使用方法
EP3894427A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
PE20211473A1 (es) 2018-12-13 2021-08-05 Eisai Randd Man Co Ltd Conjugados de anticuerpo-farmaco de herboxidieno y metodos de uso
CA3120800A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Revitope Limited Twin immune cell engager
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
KR102890251B1 (ko) 2019-03-15 2025-11-25 메드임뮨 리미티드 암의 치료에 사용하기 위한 아제티도벤조디아제핀 이량체 및 이를 포함하는 컨쥬게이트
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
CN117980327A (zh) 2021-11-03 2024-05-03 杭州多禧生物科技有限公司 抗体的特异性偶联
EP4637833A2 (en) 2022-12-23 2025-10-29 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof
EP4698230A2 (en) 2023-04-17 2026-02-25 Peak Bio, Inc. Antibodies and antibody-drug conjugates and methods of use and synthetic processes and intermediates
WO2025132978A1 (en) * 2023-12-19 2025-06-26 BioNTech SE Cfc1 binding molecule
WO2025132976A1 (en) * 2023-12-19 2025-06-26 BioNTech SE Cfc1 binding molecule
WO2026006688A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Degrader antibody conjugates and uses thereof
WO2026006689A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Bcl-xl degrader antibody conjugates and uses thereof

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207394A (en) * 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5780029A (en) 1989-11-14 1998-07-14 New York Medical College Antidiotypic monoclonal antibodies for treatment of melanoma
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5264557A (en) 1991-08-23 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3
US6063379A (en) 1993-12-09 2000-05-16 Centro De Inmunologia Molecular Anti-idiotypic monoclonal antibodies and compositions including the anti-idiotypic monoclonal antibodies
US5981215A (en) * 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
DK0912738T3 (da) * 1996-05-22 2008-11-17 Viventia Biotech Inc Antigen-bindende-fragmenter der specifikt detekterer cancerceller, nukleotider der koder fragmenterne og anvendelse deraf til profylakse og detektion af cancere
IL125608A0 (en) 1998-07-30 1999-03-12 Yeda Res & Dev Tumor associated antigen peptides and use of same as anti-tumor vaccines
DK1141028T3 (da) 1998-12-23 2010-05-25 Pfizer Humane monoklonale antistoffer til CTLA-4
US6335170B1 (en) 1999-02-22 2002-01-01 Torben F. Orntoft Gene expression in bladder tumors
DK1167537T3 (da) 1999-03-30 2008-11-10 Japan Tobacco Inc Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof
EP1179178A1 (en) * 1999-04-20 2002-02-13 William J. Kokolus Improved method of identifying and locating immunobiologically-active linear peptides
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
JP2001046066A (ja) 1999-08-03 2001-02-20 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規な相補性決定領域を有するヒトｖｅｇｆ受容体ｋｄｒに対する抗体
AU778199B2 (en) 1999-10-29 2004-11-25 Genentech Inc. Anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibody compositions and methods of use
US6663613B1 (en) 2000-01-25 2003-12-16 Bacchus Vascular, Inc. System and methods for clot dissolution
CN100455599C (zh) * 2000-03-03 2009-01-28 协和发酵工业株式会社 基因重组抗体及其抗体片段
US6333410B1 (en) * 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
GB0020953D0 (en) 2000-08-24 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2422814A1 (en) 2000-09-18 2002-03-21 Biogen, Inc. Cripto mutant and uses thereof
ES2278899T3 (es) 2001-01-26 2007-08-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Deteccion y cuantificacion de cripto-1.
BR0206985A (pt) 2001-01-29 2005-04-19 Idec Pharma Corp Anticorpos modificados e métodos de uso
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
AUPR395801A0 (en) 2001-03-26 2001-04-26 Austin Research Institute, The Antibodies against cancer
PT1390389E (pt) 2001-04-26 2009-04-03 Biogen Idec Inc Anticorpos que bloqueiam o cripto e as utilizações dos mesmos
US7582299B2 (en) * 2001-04-26 2009-09-01 Biogen Idec Ma Inc. Cripto-specific antibodies
EP1487877B1 (en) * 2001-09-18 2010-10-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis of tumors
US20040014690A1 (en) 2002-02-13 2004-01-22 Zhenkun Ma Macrolides with activity against methicillin-resistant staphylococcus aureus
JP2005520566A (ja) * 2002-03-22 2005-07-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体
CA2539116C (en) * 2003-09-15 2014-11-18 Research Development Foundation Cripto antagonism of activin and tgf-b signaling
ES2408704T3 (es) 2005-01-05 2013-06-21 Biogen Idec Ma Inc. Moléculas de unión a Cripto
AU2007243181A1 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Composition and methods for the detection of Cripto-3

Also Published As

Publication number Publication date
AR077759A2 (es) 2011-09-21
EP1390389A2 (en) 2004-02-25
EA007469B1 (ru) 2006-10-27
PT1390389E (pt) 2009-04-03
JP2004534020A (ja) 2004-11-11
PL373513A1 (en) 2005-09-05
ES2321065T3 (es) 2009-06-02
RS51635B (sr) 2011-08-31
CN100352501C (zh) 2007-12-05
JP4575983B2 (ja) 2010-11-04
EA200301158A1 (ru) 2005-06-30
US20090286265A1 (en) 2009-11-19
NO20034805D0 (no) 2003-10-27
US20100202962A1 (en) 2010-08-12
EP1390389A4 (en) 2004-09-22
BR0209254A (pt) 2006-10-03
EE200300528A (et) 2004-08-16
US8003763B2 (en) 2011-08-23
MY157382A (en) 2016-06-15
EP1974749A1 (en) 2008-10-01
MXPA03009797A (es) 2004-01-29
US20080166341A1 (en) 2008-07-10
TR200301846T2 (tr) 2006-10-26
AR072554A2 (es) 2010-09-08
EP1390389B1 (en) 2009-01-14
WO2002088170A3 (en) 2003-12-24
RS20110024A (sr) 2011-08-31
DK1390389T3 (da) 2009-04-20
CN1606453A (zh) 2005-04-13
JP2005314436A (ja) 2005-11-10
US7888052B2 (en) 2011-02-15
JP2010163438A (ja) 2010-07-29
EP2316486A2 (en) 2011-05-04
PL207087B1 (pl) 2010-10-29
IS2662B (is) 2010-08-15
US7531174B2 (en) 2009-05-12
US20040146940A1 (en) 2004-07-29
GEP20074091B (en) 2007-04-25
US20120195912A1 (en) 2012-08-02
ATE533508T1 (de) 2011-12-15
HK1058935A1 (en) 2004-06-11
KR100592357B1 (ko) 2006-06-22
EP2316486A3 (en) 2011-09-07
JP2009108100A (ja) 2009-05-21
CY1108960T1 (el) 2014-07-02
CZ20033208A3 (en) 2004-03-17
CA2443840C (en) 2010-10-26
SK14432003A3 (sk) 2004-07-07
AR037223A1 (es) 2004-11-03
DE60230868D1 (de) 2009-03-05
CL2009002199A1 (es) 2010-05-07
US7674462B2 (en) 2010-03-09
SG157951A1 (en) 2010-01-29
KR20040028744A (ko) 2004-04-03
IS6999A (is) 2003-10-24
MY150237A (en) 2013-12-31
ATE420659T1 (de) 2009-01-15
HUP0501113A2 (en) 2007-05-02
US8673303B2 (en) 2014-03-18
HUP0501113A3 (en) 2007-12-28
SI1390389T1 (sl) 2009-06-30
JP4307845B2 (ja) 2009-08-05
CA2715570A1 (en) 2002-11-07
WO2002088170A2 (en) 2002-11-07
EP1974749B1 (en) 2011-11-16
YU84903A (sh) 2006-05-25
NO20034805L (no) 2003-12-23
CA2443840A1 (en) 2002-11-07
NZ566268A (en) 2009-09-25
US20090285818A1 (en) 2009-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7888052B2 (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
JP2005520566A (ja) Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体
AU2007200809B2 (en) Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof
AU2002303364A1 (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
ZA200606338B (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
AU2010202840A1 (en) Cripto Blocking Antibodies and Uses Thereof
NZ578287A (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
HK1058935B (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
HK1122509A (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof
HK1155081A (en) Cripto blocking antibodies and uses thereof